專利名稱：線蟲卵活體純化提取劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提取劑及其使用方法。
背景技術(shù)：
線蟲屬于線形動(dòng)物門(Nematoda)，已知1. 5萬種，為地球上數(shù)量最大的動(dòng)物類群。 線蟲生境廣布，營養(yǎng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生活史周期短，且分離方法簡便高效，并易于分類鑒定，在分子生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛而深入研究，因其具備作為指示生物的優(yōu)勢和潛質(zhì)可在農(nóng)學(xué)和環(huán)境生態(tài)學(xué)領(lǐng)域被應(yīng)用為生物標(biāo)志物。線蟲作為模式生物和進(jìn)行室內(nèi)模擬試驗(yàn)，要求對(duì)目標(biāo)線蟲進(jìn)行種源維持、繼代和同齡化培養(yǎng)。作為線蟲室內(nèi)研究的基礎(chǔ)，獲取足量且高質(zhì)的線蟲蟲卵以進(jìn)行控制培養(yǎng)的方法一直在不斷探究。線蟲蟲卵的獲取多是利用物理工具或單一化學(xué)藥品，尚缺乏輔以生物化學(xué)試劑的蟲卵提取配劑。如植物根結(jié)線蟲一般用針挑法在線蟲附著物上直接獲取蟲卵；土壤線蟲蟲卵常用網(wǎng)篩過濾獲得；秀麗隱桿線蟲蟲卵常用高濃度堿液和氧化劑獲得，并逐漸應(yīng)用于其他種屬線蟲蟲卵的獲取。目前，常用線蟲蟲卵獲取方法存在很多不足，首先，針挑法和篩選法雖然可保證線蟲蟲卵的大量獲取，但由于線蟲種類繁多生態(tài)位相近而不同種屬線蟲卵差異較小，無法保證純種線蟲蟲卵的獲取，且線蟲蟲卵通過針挑或篩觸容易受到損傷，難以保證正常發(fā)育。因此傳統(tǒng)的針挑法和篩選法不能高質(zhì)量和高效率的獲取純種線蟲蟲卵；其次，利用秀麗隱桿線蟲蟲卵提取方法進(jìn)行其他種類的線蟲蟲卵獲取，當(dāng)裂解液濃度過高會(huì)傷及蟲卵，使得獲取的蟲卵不萌發(fā)；而裂解液濃度過低，用時(shí)可長達(dá)幾十個(gè)小時(shí)，且蟲體分解不完全，不能保證足量蟲卵的獲得，且無法分離的大量殘?bào)w會(huì)影響卵的萌發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有線蟲蟲卵獲取方法存在雜種培養(yǎng)、卵萌發(fā)率低、殘?bào)w和雜菌干擾、工作量大、用時(shí)長和效率低的問題，而提供線蟲卵活體純化提取劑及其使用方法。線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由0. 3 0. 4g的氯化鈉、1 1. 5g的氫氧化鈉、0. 3 0. 5g的磷酸氫二鈉、1 1. 5g的次氯酸鈉、0. 005 0. 02g 的硫酸鎂、1 1. 5g的氫氧化鉀、0. 1 0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B 由0. 3 0. 4g的氯化鉀、0. 2 0. 3g的氯化鈉、2 3g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成。線蟲卵活體純化提取劑的使用方法如下一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A中，震蕩3 lOmin，然后以9000 13000r/min的轉(zhuǎn)速離心1 3min，棄上清液留沉淀；二、向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B，然后以9000 13000r/min的轉(zhuǎn)速離心1 3min，重復(fù)離心1 4次后取沉淀，即完成線蟲卵活體純化提取劑的使用；其中步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由 0. 3 0. 4g的氯化鈉、1 1. 5g的氫氧化鈉、0. 3 0. 5g的磷酸氫二鈉、1 1. 5g的次氯酸鈉、0. 005 0. 02g的硫酸鎂、1 1. 5g的氫氧化鉀、0. 1 0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL 的蒸餾水組成；試劑B由0. 3 0. 4g的氯化鉀、0. 2 0. 3g的氯化鈉、2 3g的磷酸鈉和 IOOmL的蒸餾水組成；步驟一中試劑A的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲；步驟一中試劑B的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲。本發(fā)明已在科研工作中進(jìn)行了應(yīng)用，通過對(duì)國家自然科學(xué)基金“線蟲HSPs對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制”的研究中進(jìn)行的實(shí)際操作，取得了較好的試驗(yàn)效果。本發(fā)明與傳統(tǒng)的線蟲蟲卵獲取方法相比，工作效率大幅度提高，線蟲用量減少了 50%。經(jīng)過對(duì)提取蟲卵的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明，蟲卵獲取率平均提高30%。線蟲蟲卵萌發(fā)率平均提高了 20%以上。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)的線蟲蟲卵獲取方法中雜種培養(yǎng)、卵萌發(fā)率低、殘?bào)w和雜菌干擾、工作量大、用時(shí)長、效率低的問題。本發(fā)明中的線蟲卵活體純化提取劑及提取方法以單種甚至單條成熟雌性線蟲為裂解對(duì)象，短時(shí)間內(nèi)可對(duì)成蟲進(jìn)行充分高效的裂解，而不傷及腹內(nèi)蟲卵。本發(fā)明線蟲卵活體純化提取劑中的堿劑、氧化劑和緩沖劑比例適當(dāng)，對(duì)線蟲表皮和肌體進(jìn)行充分裂解而不傷害蟲卵，而蟲卵獲取率高達(dá)自然繁殖的60%。在線蟲裂解過程中，成蟲蟲體裂解完全，對(duì)后期卵的孵化無干擾，解決了母體殘留出現(xiàn)的腐爛、生長雜菌等情況；而對(duì)從成蟲體內(nèi)裂解出的蟲卵損傷極小，蟲卵孵化率達(dá)92. 6%，與線蟲自然產(chǎn)卵孵化率相當(dāng)。傳統(tǒng)方法對(duì)線蟲的裂解需要過夜，本發(fā)明用時(shí)短，操作便捷，提高了線蟲蟲卵的獲取效率和質(zhì)量。


圖1為具體實(shí)施方式
十一中每條成熟雌性線蟲產(chǎn)卵個(gè)數(shù)的柱狀圖；圖2為具體實(shí)施方式
十一中獲得線蟲卵的萌發(fā)率的柱狀圖；圖3為具體實(shí)施方式
十二中每條成熟雌性線蟲產(chǎn)卵個(gè)數(shù)的柱狀圖；圖4為具體實(shí)施方式
十二中獲得線蟲卵的萌發(fā)率的柱狀圖；圖5為具體實(shí)施方式
十三中每條成熟雌性線蟲產(chǎn)卵個(gè)數(shù)的柱狀圖；圖6為具體實(shí)施方式
十三中獲得線蟲卵的萌發(fā)率的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由0. 3 0. 4g的氯化鈉、1 1. 5g的氫氧化鈉、0. 3 0. 5g的磷酸氫二鈉、1 1. 5g的次氯酸鈉、0. 005 0. 02g的硫酸鎂、1 1. 5g的氫氧化鉀、0. 1 0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3 0. 4g的氯化鉀、0. 2 0. 3g的氯化鈉、2 3g 的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由0. 3g的氯化鈉、Ig的氫氧化鈉、0. 3g的磷酸氫二鈉、 Ig的次氯酸鈉、0. 005g的硫酸鎂、Ig的氫氧化鉀、0. Ig的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3g的氯化鉀、0. 2g的氯化鈉、2g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由0. 4g的氯化鈉、1. 5g的氫氧化鈉、0. 5g的磷酸氫二鈉、1. 5g的次氯酸鈉、0. 02g的硫酸鎂、1. 5g的氫氧化鉀、0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 4g的氯化鉀、0. 3g的氯化鈉、3g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成。
其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由0. 33g的氯化鈉、1. IOg的氫氧化鈉、0. 40g的磷酸氫二鈉、1. Ilg的次氯酸鈉、0. Olg的硫酸鎂、1. 34g的氫氧化鉀、0. 20g的磷酸二氫鉀和IOOmL 的蒸餾水組成；試劑B由0. 30g的氯化鉀、0. 25g的氯化鈉、2. 68g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾
水組成。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式線蟲卵活體純化提取劑的使用方法如下一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A中，震蕩3 lOmin，然后以9000 13000r/min的轉(zhuǎn)速離心1 3min，棄上清液留沉淀；二、向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B，然后以9000 13000r/min的轉(zhuǎn)速離心1 3min，重復(fù)離心1 4次后取沉淀， 即完成線蟲卵活體純化提取劑的使用；其中步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成，試劑A由0. 3 0. 4g的氯化鈉、1 1. 5g的氫氧化鈉、0. 3 0. 5g的磷酸氫二鈉、1 1. 5g的次氯酸鈉、0. 005 0. 02g的硫酸鎂、1 1. 5g的氫氧化鉀、0. 1 0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3 0. 4g的氯化鉀、0. 2 0. 3g的氯化鈉、 2 3g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成；步驟一中試劑A的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲；步驟一中試劑B的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟一中震蕩 3min，然后以9000r/min的轉(zhuǎn)速離心:3min。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟一中震蕩 lOmin，然后以13000r/min的轉(zhuǎn)速離心lmin。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟一中震蕩 4 9min，然后以10000 12000r/min的轉(zhuǎn)速離心1. 5 2. 5min。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟一中震蕩 5min，然后以llOOOr/min的轉(zhuǎn)速離心aiiin。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至九之一不同的是步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成，試劑A由0. 35g的氯化鈉、1. 3g的氫氧化鈉、 0. 38g的磷酸氫二鈉、1. 4g的次氯酸鈉、0. 015g的硫酸鎂、1. 2g的氫氧化鉀、0. 2g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 35g的氯化鉀、0. 25g的氯化鈉、2. 5g的磷酸鈉和 IOOmL的蒸餾水組成。其它與具體實(shí)施方式
一至九之一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式線蟲卵活體純化提取劑的使用方法如下一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A中，震蕩5min，然后以13000r/ min的轉(zhuǎn)速離心aiiin，棄上清液留沉淀；二、向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B， 然后以13000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，重復(fù)離心2次后取沉淀，即完成線蟲卵活體純化提取劑的使用；其中步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成，試劑A由0. 33g的氯化鈉、1. Ig的氫氧化鈉、0. 4g的磷酸氫二鈉、1. Ilg的次氯酸鈉、0. Olg的硫酸鎂、1. 34g的氫氧化鉀、0. 2g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3g的氯化鉀、0. 25g的氯化鈉、2. 68g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成；步驟一中試劑A的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲；步驟一中試劑B的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲。本實(shí)施方式中結(jié)果如圖1所示，線蟲表皮和肌體充分裂解，蟲卵獲取率高達(dá)自然繁殖的60% ；在線蟲裂解過程中，成蟲蟲體裂解完全，對(duì)后期卵的孵化無干擾，解決了母體殘留出現(xiàn)的腐爛、生長雜菌等情況；而對(duì)從成蟲體內(nèi)裂解出的蟲卵損傷極小，蟲卵孵化率達(dá) 92.6%，與線蟲自然產(chǎn)卵孵化率相當(dāng)(見圖2)。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式線蟲卵活體純化提取劑的使用方法如下一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A中，震蕩lOmin，然后以13000r/ min的轉(zhuǎn)速離心3min，棄上清液留沉淀；二、向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B， 然后以13000r/min的轉(zhuǎn)速離心3min，重復(fù)離心4次后取沉淀，即完成線蟲卵活體純化提取劑的使用；其中步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成，試劑A由0. 35g的氯化鈉、1. 2g的氫氧化鈉、0. 4g的磷酸氫二鈉、1. 2g的次氯酸鈉、0. Olg的硫酸鎂、1. 2g的氫氧化鉀、0. 2g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 35g的氯化鉀、0. 25g的氯化鈉、2. 5g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成；步驟一中試劑A的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲；步驟一中試劑B的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲。本實(shí)施方式中結(jié)果如圖3所示，線蟲表皮和肌體充分裂解，蟲卵獲取率高達(dá)自然繁殖的60% ；在線蟲裂解過程中，成蟲蟲體裂解完全，對(duì)后期卵的孵化無干擾，解決了母體殘留出現(xiàn)的腐爛、生長雜菌等情況；而對(duì)從成蟲體內(nèi)裂解出的蟲卵損傷極小，蟲卵孵化率達(dá) 92.6%，與線蟲自然產(chǎn)卵孵化率相當(dāng)(見圖4)。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式線蟲卵活體純化提取劑的使用方法如下一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A中，震蕩8min，然后以13000r/ min的轉(zhuǎn)速離心3min，棄上清液留沉淀；二、向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B， 然后以9000r/min的轉(zhuǎn)速離心3min，重復(fù)離心3次后取沉淀，即完成線蟲卵活體純化提取劑的使用；其中步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成，試劑A由0. 33g的氯化鈉、1. Ig的氫氧化鈉、0. 4g的磷酸氫二鈉、1. Ilg的次氯酸鈉、0. Olg的硫酸鎂、1. 34g的氫氧化鉀、0. 2g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3g的氯化鉀、0. 25g的氯化鈉、2. 68g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成；步驟一中試劑A的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲；步驟一中試劑B的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲。本實(shí)施方式中結(jié)果如圖5所示，線蟲表皮和肌體充分裂解，蟲卵獲取率高達(dá)自然繁殖的60% ；在線蟲裂解過程中，成蟲蟲體裂解完全，對(duì)后期卵的孵化無干擾，解決了母體殘留出現(xiàn)的腐爛、生長雜菌等情況；而對(duì)從成蟲體內(nèi)裂解出的蟲卵損傷極小，蟲卵孵化率達(dá) 92.6%，與線蟲自然產(chǎn)卵孵化率相當(dāng)(見圖6)。
權(quán)利要求
1.線蟲卵活體純化提取劑，其特征在于線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成； 其中試劑A由0. 3 0. 4g的氯化鈉、1 1. 5g的氫氧化鈉、0. 3 0. 5g的磷酸氫二鈉、1 1. 5g的次氯酸鈉、0. 005 0. 02g的硫酸鎂、1 1. 5g的氫氧化鉀、0. 1 0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3 0. 4g的氯化鉀、0. 2 0. 3g的氯化鈉、2 3g 的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線蟲卵活體純化提取劑，其特征在于線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由0. 33g的氯化鈉、1. IOg的氫氧化鈉、0. 40g的磷酸氫二鈉、1. Ilg的次氯酸鈉、0. Olg的硫酸鎂、1. 34g的氫氧化鉀、0. 20g的磷酸二氫鉀和IOOmL 的蒸餾水組成；試劑B由0. 30g的氯化鉀、0. 25g的氯化鈉、2. 68g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成。
3.權(quán)利要求1所述的線蟲卵活體純化提取劑的使用方法，其特征在于線蟲卵活體純化提取劑的使用方法如下一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A 中，震蕩3 lOmin，然后以9000 13000r/min的轉(zhuǎn)速離心1 3min，棄上清液留沉淀；二、 向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B，然后以9000 13000r/min的轉(zhuǎn)速離心1 3min，重復(fù)離心1 4次后取沉淀，即完成線蟲卵活體純化提取劑的使用；其中步驟一中線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成，試劑A由0. 3 0. 4g的氯化鈉、1 1. 5g的氫氧化鈉、0. 3 0. 5g的磷酸氫二鈉、1 1. 5g的次氯酸鈉、0. 005 0. 02g的硫酸鎂、1 1. 5g的氫氧化鉀、0. 1 0. 3g的磷酸二氫鉀和IOOmL的蒸餾水組成；試劑B由0. 3 0. 4g 的氯化鉀、0. 2 0. 3g的氯化鈉、2 3g的磷酸鈉和IOOmL的蒸餾水組成；步驟一中試劑A 的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲；步驟一中試劑B的用量為ImL處理100只同種成熟雌性線蟲。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的線蟲卵活體純化提取劑的使用方法，其特征在于步驟一中震蕩4 9min，然后以10000 12000r/min的轉(zhuǎn)速離心1. 5 2. 5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的線蟲卵活體純化提取劑的使用方法，其特征在于步驟一中震蕩5min，然后以11000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min。
全文摘要
線蟲卵活體純化提取劑及其使用方法。它解決了現(xiàn)有線蟲蟲卵獲取方法存在卵萌發(fā)率低、用時(shí)長和效率低的問題。線蟲卵活體純化提取劑由試劑A和試劑B組成；其中試劑A由氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、次氯酸鈉、硫酸鎂、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀和蒸餾水組成；試劑B由氯化鉀、氯化鈉、磷酸鈉和蒸餾水組成。方法一、取同種成熟雌性線蟲加入到線蟲卵活體純化提取劑的試劑A中，震蕩后離心，棄上清液留沉淀；二、向沉淀中加入線蟲卵活體純化提取劑的試劑B，離心后取沉淀即完成。本發(fā)明線蟲用量減少了50％，蟲卵獲取率平均提高30％，線蟲蟲卵萌發(fā)率平均提高了20％以上；本發(fā)明蟲卵獲取率高達(dá)自然繁殖的60％；蟲卵孵化率達(dá)92.6％。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102433295SQ20111024356
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者吳東輝, 武海濤, 王云彪 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所