專利名稱：癌癥轉(zhuǎn)移變前期WWP2的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與癌前變及轉(zhuǎn)移有關(guān)的mRNA表達改變(病理演變過程)的相關(guān)檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)260萬，死亡人數(shù)近210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達地區(qū)可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，每年的花費是I. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有I萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點是提前做到預(yù)防性篩查，然后及時介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計思路不完善(動物模型設(shè)計不科學(xué))等。同時，該報告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術(shù))指標來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標記物。傳統(tǒng)臨床觀念認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴謹?shù)?，從細胞學(xué)角度來分析，I公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實這時已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標本(癌癥病人、高危人群、正常對照)，對WWP2基因與癌癥轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警進行檢測分析。英國科學(xué)家表示，他們已經(jīng)在腫瘤是如何在體內(nèi)擴散的問題上取得新突破。他們發(fā)現(xiàn)一種流氓基因，只要利用對癥藥物減弱該基因的活性，就能有效阻止腫瘤擴散。這種基因被稱作WWP2，它主要攻擊和分解體內(nèi)的一種可阻止腫瘤細胞擴散的天然抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，阻止WWP2基因起作用，可有效提高這種天然抑制劑的水平，腫瘤細胞會在這種抑制劑的作用下進入休眠狀態(tài)。如果能研發(fā)出可使WWP2失去作用的藥物，治療腫瘤將不再需要常規(guī)療法和手術(shù)，這會大大降低腫瘤患者的風(fēng)險。研究者表示，這一發(fā)現(xiàn)將促使科學(xué)家在未來10年研發(fā)出新一代藥物，可以有效阻止大部分類型的腫瘤擴散，其中有乳腺癌、腦癌、結(jié)腸癌和皮膚癌。他說“腫瘤晚期涉及到癌細胞轉(zhuǎn)移，這是腫瘤發(fā)展的重要階段，目前還無法治療或阻止該過程?，F(xiàn)在面臨的一大挑戰(zhàn)是確定一種可進入腫瘤細胞，摧毀流氓基因的活性 的有效藥物。研究人員報告說，一般情況下，人體某處組織發(fā)生癌變后，人體內(nèi)會產(chǎn)生一種抑制蛋白，阻止癌細胞擴散。研究人員發(fā)現(xiàn)，癌細胞中存在一種名為WWP2的基因。這種基因會攻擊并破壞這種抑制蛋白，使癌細胞能夠擴散到人體其他部位。研究人員設(shè)法限制WWP2基因活動，隨后發(fā)現(xiàn)抑制蛋白水平大幅上升，而癌細胞沒有出現(xiàn)擴散。研究人員稱他們證實一個過去較少研究的蛋白WWP2可通過與腫瘤抑制蛋白PTEN結(jié)合，使其連接上泛素標記，從而促進蛋白酶體降解PTEN蛋白。PTEN基因(磷酸酶基因)是繼p53基因后另一個較為廣泛地與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的抑癌基因。PTEN在細胞周期調(diào)控及細胞快速生長抑制中起著重要的作用。大量的研究表明在多種類型的癌癥中存在PTEN基因突變或缺失。PTEN蛋白的異常表達與癌細胞的生長、凋亡、粘附、遷移、浸潤等過程密切相關(guān)?？茖W(xué)家們一直在致力尋找PTEN的調(diào)控因子。當(dāng)發(fā)現(xiàn)WWP2蛋白與NEDD4-1蛋白(一直被科學(xué)家視為PTEN功能的重要調(diào)控因子)非常相似時，這引起了研究人員的高度注意。WWP2是NEDD4樣蛋白家族中的一種E3泛素連接酶。它可將泛素連接到靶蛋白上，促使蛋白酶體降解靶蛋白。NEDD4樣蛋白在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、胚胎干細胞、細胞轉(zhuǎn)運及T細胞活化中起著重要的調(diào)控作用。在小鼠中敲除NEDD4-1基因時，并沒有觀察到PTEN蛋白水平發(fā)生明顯的改變。這些結(jié)果表明有可能還存在其它的PTEN的調(diào)控因子，由于WWP2是NEDD4樣蛋白家族成員，有可能是PTEN的真正調(diào)控因子，在進一步的研究中，研究人員嘗試在癌細胞中敲除了 WWP2，發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白的水平相應(yīng)顯著增高。而當(dāng)WWP2過表達時PTEN水平則顯著降低。這些結(jié)果表明WWP2有可能參與了對PTEN穩(wěn)定性的調(diào)控?！?br> 此外，獲得的研究數(shù)據(jù)還表明WWP2可能是一個潛在的致癌基因，參與推動了腫瘤的形成和生長。在一項實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)在注入前列腺癌細胞9周后，正常表達WWP2的小鼠生成的腫瘤大小比WWP2沉默小鼠的腫瘤體積要大出三倍多。本發(fā)明利用WWP2基因在癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移病理演變過程中表達變化，將它作于臨床早期癌癥轉(zhuǎn)移的篩查指標，并采用核酸原位雜交和組化免疫方法，開發(fā)出用于癌癥早期篩查的試劑盒。目前對WWP2基因的研究都采用高通量基因芯片技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，特別是個性化的應(yīng)用在我國現(xiàn)階段條件尚不成熟。根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料WWP2基因mRNA水平的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計了不同數(shù)據(jù)例組(癌癥轉(zhuǎn)移患者、高危人群、正常對照人)例組，用原位雜交技術(shù)進行檢測，結(jié)果表明以上癌癥轉(zhuǎn)移癥病人WWP2基因高表達，高危人群有不同程度表達15-25%，正常人都是低表達。表明WWP2基因癌癥轉(zhuǎn)移變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學(xué)方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果沒有影響(因為，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上)。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與癌癥轉(zhuǎn)移病變前期篩查及術(shù)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針如SEQ ID NO. I所示序列，是WWP2基因序列中間一段堿基序列，從500到1300bp,WWP2基因序列號NM-007014. 3，序列如SEQ ID NO. 2所示，核苷酸序列長度是4527bp，⑶S :90……2702bp，位于染色體16q22. 1〃上。(在探針標記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp以上，我們會用⑶S的序列來設(shè)計探針，如果⑶S的序列也超過IOOObp以上，會采用基因的 中間一段堿基序列來合成探針，堿基序列不少于500bp，探針合成后要做序列檢測，并對功能進行臨床意義的分析)。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。 本發(fā)明的癌變前期WWP2基因篩查試劑盒應(yīng)用價值在于，能在mRNA水平，對癌癥轉(zhuǎn)移病變前期篩查，及癌變后或術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴散發(fā)生的預(yù)警，進一步配合臨床治療。本發(fā)明還提供一種WWP2基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和
(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優(yōu)選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自癌癥轉(zhuǎn)移患者、癌癥轉(zhuǎn)移高危人群、健康人。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的癌癥高危人群、癌癥好發(fā)家族、癌癥轉(zhuǎn)移患者。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以WWP2基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA為檢測對象，合成探針是WWP2基因的RNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供WWP2基因的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常人WWP2基因低表達或I表達，即小量顯色或不顯色，WWP2基因在癌癥病人和正常人有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都高。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以WWP2基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細胞中的WWP2基因表達量，用來確定癌變前期的mRNA變化量，預(yù)警癌癥轉(zhuǎn)移變化是否發(fā)生及癌癥轉(zhuǎn)移患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。因為WWP2基因在正常人中低表達，如果WWP2基因表達量高，說明有患癌的風(fēng)險，說明癌癥轉(zhuǎn)移已發(fā)生，或癌癥病人術(shù)后已經(jīng)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，從而獲得癌癥轉(zhuǎn)移早期信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
如上所述，當(dāng)檢測到WWP2基因的表達量高于正常對照時，則可預(yù)測受試者為癌癥轉(zhuǎn)移病理過程已發(fā)生。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測癌癥轉(zhuǎn)移變發(fā)生和病理演變過程中WWP2基因mRNA表達量的變化，預(yù)警癌癥轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因轉(zhuǎn)錄的一級功能產(chǎn)物mRNA水平檢測WWP2基因異常表達，在影像醫(yī)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶復(fù)發(fā)之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的早期診斷以及治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及早預(yù)測。這樣才有可能實施癌癥的早期篩查、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治癌癥轉(zhuǎn)移惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖I是本發(fā)明WWP2基因原位雜交技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明實施例中癌癥轉(zhuǎn)移癥病人WWP2表達降低圖片。圖3是高位人群圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人WWP2表達圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例I
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以WWP2基因的mRNA為檢測目的基因設(shè)計的雜交探針、標記物、說明書，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所不的序列。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種WWP2基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權(quán)利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細胞標本選自癌癥、高危人群、正常人標本。
10.WWP2基因在制備檢測癌癥轉(zhuǎn)移原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與癌癥轉(zhuǎn)移早期病理演變有密切相關(guān)的E3泛素連接酶(WWP2)基因與的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測WWP2基因的表達量，比影像醫(yī)學(xué)和現(xiàn)有的臨床生化檢測指標更早期，能實現(xiàn)真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102618631SQ20111044293
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司