專(zhuān)利名稱(chēng)：純化衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供利用獨(dú)特的表面標(biāo)記物對(duì)被分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行表征的方法。本發(fā)明還提供富集或分選表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供清除可能污染由本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的細(xì)胞、從而降低移植后體內(nèi)腫瘤形成的發(fā)生率的方法。
背景技術(shù)：
多能干細(xì)胞具有產(chǎn)生構(gòu)成所有體細(xì)胞組織和器官的分化細(xì)胞類(lèi)型的潛能。大量能夠發(fā)揮類(lèi)似于人類(lèi)胰島作用的細(xì)胞的生產(chǎn)有利于使用細(xì)胞療法治療糖尿病。因此，需要生產(chǎn)這些衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞，以及純化此類(lèi)細(xì)胞的可靠方法。多能干細(xì)胞和衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞群上存在的蛋白質(zhì)與其他細(xì)胞表面標(biāo)記物，可用于制備分離和離析這些群體的試劑。細(xì)胞表面標(biāo)記物還可用于這些細(xì)胞的進(jìn)一步表征。在一個(gè)例子中，W02009131568公開(kāi)了純化腸道內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，該方法包括a)將衍生自多能干細(xì)胞的包含腸道內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群暴露于能結(jié)合腸道內(nèi)胚層細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記物的配體，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記物選自⑶49e、⑶99、⑶165和CD334 ;以及b)將腸道內(nèi)胚層細(xì)胞與不能結(jié)合該配體的衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞分離，從而純化所述腸道內(nèi)胚層細(xì)胞。又如，W02010000415公開(kāi)了將能結(jié)合抗原TNAP的抗體或該抗體的功能片段單獨(dú)使用，或與能結(jié)合CD56的抗體或該抗體的功能片段聯(lián)合使用，來(lái)分離具有脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和胰腺細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞。又如，US7371576公開(kāi)了一種選擇性細(xì)胞表面標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記物使得可以選擇具有很高的分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞或產(chǎn)胰島素細(xì)胞團(tuán)的傾向的獨(dú)特胰腺干細(xì)胞亞群。又如，US7585672公開(kāi)了從衍生自人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物中富集內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的未受損集落以形成完整的、未受損的被臟層卵黃囊(VYS)細(xì)胞圍繞的胚狀體，其中人類(lèi)胚胎干細(xì)胞表達(dá)Oct-4、表面階段特異性胚胎抗原-3/4 (SSEA 3/4)和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM) ； (b)在允許胚狀體細(xì)胞分化為包含內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的細(xì)胞群的條件下培養(yǎng)步驟(a)的胚狀體；(c)將步驟(b)的細(xì)胞群分散為單細(xì)胞；(d)對(duì)SSEA 3/4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇以從步驟(c)的細(xì)胞中清除未分化細(xì)胞；(e)對(duì)SSEA-I表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇以從步驟(d)的剩余細(xì)胞中清除VYS細(xì)胞；以及(f)在步驟(e)剩余細(xì)胞中選擇EpCAM表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞以富集內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞。US7585672還公開(kāi)了從衍生自人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物中富集內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的未受損集落以形成完整的、未受損的被臟層卵黃囊(VYS)細(xì)胞圍繞的胚狀體，其中人類(lèi)胚胎干細(xì)胞表達(dá)Oct-4、表面階段特異性胚胎抗原_3/4(SSEA3/4)和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM) ； (b)在允許胚狀體細(xì)胞分化為包含內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的細(xì)胞群的條件下培養(yǎng)步驟(a)的胚狀體；(c)用有效量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子IO(FGFlO)處理步驟(b)的細(xì)胞群；以及(d)將步驟(c)的細(xì)胞群分散為富含內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的單細(xì)胞；(e)對(duì)SSEA-3/4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇以從步驟⑷的細(xì)胞中清除未分化干細(xì)胞；(f)對(duì)SSEA-I表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇以從步驟(e)的細(xì)胞中清除VYS細(xì)胞；以及(g)在步驟(f)的剩余細(xì)胞中選擇EpCAM表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞以富集內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞。US7585672還公開(kāi)了用于構(gòu)建沒(méi)有致瘤能力的干細(xì)胞衍生細(xì)胞群的富集方法，該
方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的未受損集落以形成完整的、未受損的被臟層卵黃囊(VYS)細(xì)胞圍繞的胚狀體，其中人類(lèi)胚胎干細(xì)胞表達(dá)Oct-4、表面階段特異性胚胎抗原-3/4(SSEA 3/4)和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM) ； (b)在允許胚狀體細(xì)胞分化為包含內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的細(xì)胞群的條件下培養(yǎng)步驟(a)的胚狀體；(c)將步驟(b)的細(xì)胞群分散為單細(xì)胞；(d)對(duì)SSEA 3/4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇以從步驟(c)的細(xì)胞中清除未分化細(xì)胞；(e)對(duì)SSEA-I表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇以從步驟⑷的細(xì)胞中清除VYS細(xì)胞；以及(f)在步驟(e)的剩余細(xì)胞中選擇EpCAM表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，由此得到的細(xì)胞注入免疫低下小鼠時(shí)不形成畸胎瘤。又如，US20050260749公開(kāi)了從衍生自干細(xì)胞的培養(yǎng)物中富集內(nèi)胚層和胰腺譜系細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟培養(yǎng)干細(xì)胞到形成胚狀體；以及在胚狀體中選擇物種相應(yīng)(appropriate)細(xì)胞表面階段特異性胚胎抗原的表達(dá),并且僅培養(yǎng)不表達(dá)細(xì)胞表面階段特異性抗原的胚狀體以分化為內(nèi)胚層和胰腺細(xì)胞。又如，US20100003749公開(kāi)了分離的胰腺干細(xì)胞群，其中胰腺干細(xì)胞群富含CD133+CD49f+胰腺干細(xì)胞。US20100003749還公開(kāi)了從原代胰腺組織中分離胰腺干細(xì)胞，通過(guò)以下步驟進(jìn)行從胰腺細(xì)胞、胰腺衍生細(xì)胞或胃腸衍生細(xì)胞群中選擇⑶133+、⑶49f+或⑶133+⑶49f+的細(xì)胞；清除CD15+的細(xì)胞，其中剩余的細(xì)胞為CD15-;將剩余的細(xì)胞引入包含一種或多種生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基；以及使剩余細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖。又如，Dorrell等人闡述道“我們研發(fā)了一組新型的用于分離和研究人類(lèi)胰腺所有主要細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞表面標(biāo)記物。在用未受損的或解離的人類(lèi)胰島對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行消減免疫后選擇雜交瘤細(xì)胞，并且通過(guò)免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀來(lái)評(píng)估細(xì)胞型特異性與細(xì)胞表面反應(yīng)性。通過(guò)胰島(泛內(nèi)分泌(panendocrine)或α特異性的)和非胰島類(lèi)胰腺細(xì)胞亞群(外分泌與腺管)上的表面抗原的特異性結(jié)合來(lái)鑒定抗體。這些抗體單獨(dú)或結(jié)合使用，以通過(guò)FACS從原代人類(lèi)胰腺分離α、β、外分泌腺或腺管細(xì)胞群，并且表征人類(lèi)胰腺制品的詳細(xì)細(xì)胞組成。它們也用于證實(shí)人類(lèi)胰島擴(kuò)增培養(yǎng)物源于非內(nèi)分泌細(xì)胞，并且胰島素表達(dá)水平可以通過(guò)亞群體分選和轉(zhuǎn)錄因子Pdx-I與ngn3過(guò)表達(dá)而增加至最高達(dá)正常胰島細(xì)胞的1%，這相對(duì)于之前采用此培養(yǎng)體系得到的結(jié)果是個(gè)進(jìn)步。這些方法使得可以分析和分離功能上不同的、具有細(xì)胞治療潛力的胰腺細(xì)胞群?！?Stem Cell Research,VolumeI, Issue 3, September 2008,Pages 155-156 (《干細(xì)胞研究》,第 I 卷，第 3 期，2008 年 9 月，第 155-156 頁(yè)))。又如，Sugiyama等人闡述道“我們最終鑒定了兩種抗原，分別稱(chēng)為⑶133和⑶49f，可用于從小鼠中純化NGN3+細(xì)胞。⑶133(又稱(chēng)prominin-Ι)為功能未知的跨膜蛋白，并且是造血祖細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的已知標(biāo)記物。⑶49f又稱(chēng)α6整聯(lián)蛋白，并且是層粘連蛋白的受體亞基。通過(guò)聯(lián)合使用能識(shí)別CD133和CD49f的抗體，我們分級(jí)分離了四種不同的胰腺細(xì)胞群。免疫染色和RT-PCR表明CD49fhigh CD133+細(xì)胞群(“級(jí)分I”，占投入的50% )主要包含表達(dá)CarbA的分化外分泌細(xì)胞。⑶49flow⑶133-級(jí)分(“級(jí)分III”，占投入的10% )包含表達(dá)內(nèi)分泌產(chǎn)物(如胰島素和胰高血糖素)的激素+細(xì)胞。相反，⑶49flow⑶133+級(jí)分(“級(jí)分II”，占投入的13% )包含NGN3+細(xì)胞，而不是激素+細(xì)胞。級(jí)分II細(xì)胞的大約8%產(chǎn)生了可免疫染色的NGN3。在⑶49f-⑶133-級(jí)分中(“級(jí)分IV”，占投入的25% )，我們沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)NGN3、CarbA或胰島激素的細(xì)胞?！?Diabetes，Obesity and Metabolism, Volume 10, Issue s4, Pages 179-185 (《糖尿病、肥胖癥和代謝》，第 10 卷，第s4 期，第 179-185 頁(yè)))。又如，F(xiàn)ujikawa等人闡述道“當(dāng)分選 CD45-TER119-side_scatterlow GFPhigh 細(xì)胞時(shí)，具有高生長(zhǎng)潛能的甲胎蛋白陽(yáng)性的未成熟內(nèi)胚層特征性細(xì)胞存在于此群體中?？寺》治龊碗娮语@微鏡評(píng)估揭示，此群體的每個(gè)單細(xì)胞不僅可以分化為肝細(xì)胞，而且還可以分化為膽管上皮細(xì)胞，表明了其具有雙譜系分化活性。當(dāng)分析表面標(biāo)記物時(shí)，它們?yōu)檎?lián)蛋白-α 6 和-β I 陽(yáng)性,卻為 c-Kit 和 Thyl. I 陰性。(Journal of Hepatology, Vol 39, pages162-170 (《肝臟病雜志》，第39卷，第162-170頁(yè)))。又如，Zhao等人闡述道“在本研究中，我們首先鑒定了 N-鈣黏著蛋白為用于從hES細(xì)胞衍生物中純化肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞的表面標(biāo)記物，并且通過(guò)與小鼠胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)(STO)細(xì)胞共培養(yǎng)從純化的肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生了肝臟祖細(xì)胞。這些肝臟祖細(xì)胞可擴(kuò)增并傳代超過(guò)100天。有趣的是，它們共表達(dá)了早期肝臟標(biāo)記物AFP和膽道譜系標(biāo)記物KRT7，表明它們?yōu)楦渭?xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的共同祖先。此外，這些祖細(xì)胞可大量擴(kuò)增，同時(shí)仍保持雙向分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞樣細(xì)胞的潛能，如基因表達(dá)和功能分析所驗(yàn)證。因此，這項(xiàng)工作提供研究肝臟發(fā)育的新體外模型，以及基于肝臟祖細(xì)胞的細(xì)胞療法新來(lái)源?！?(PLoS ONE 4(7) e6468. doi :10. 1371/joumal. pone. 0006468)。又如，Cai等人闡述道“為了進(jìn)一步提高I3DXl+細(xì)胞純度，我們使用CXCR4…分選了激活蛋白A-誘導(dǎo)的細(xì)胞，CXCR4為ES細(xì)胞衍生的內(nèi)胚層細(xì)胞的標(biāo)記物。用CXCR4進(jìn)行分選富集了內(nèi)胚層細(xì)胞群，因?yàn)镃XCR4+細(xì)胞群中幾乎所有細(xì)胞對(duì)內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記物S0X17均呈陽(yáng)性，并且> 90% 的細(xì)胞對(duì) F0XA2 呈陽(yáng)性?！?Journal of Molecular Cell Biology (《分子細(xì)胞生物學(xué)雜志》)，最早于2009年11月12日在線先行出版。Journal of MolecularCell Biology 20102(1) :50-60 (《分子細(xì)胞生物學(xué)雜志》，2010年，第2卷，第I期，第50-60頁(yè))；doi 10.1093/jmcb/mjp037)。又如，Koblas等人闡述道“我們發(fā)現(xiàn)人類(lèi)⑶133-陽(yáng)性胰腺細(xì)胞群包含表達(dá)神經(jīng)發(fā)生素-3的內(nèi)分泌祖細(xì)胞和表達(dá)人類(lèi)端粒酶、ABCG2、Oct-3/4、Nanog以及Rex-I (多能干細(xì)胞的標(biāo)記物)的細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠在體外分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞，并且以葡萄糖依賴(lài)性方式分泌C肽。基于我們的結(jié)果，我們認(rèn)為⑶133分子代表另一種適于鑒定和分離胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物。"(Transplant Proc. 2008 Mar ；40(2) :415-8 (《移植學(xué)報(bào)》，2008年3月，第40卷，第2期，第415-418頁(yè)))。又如，Sugiyama等人闡述道“我 們發(fā)現(xiàn)⑶133由NGN3+細(xì)胞所表達(dá)。⑶133似乎定位于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的頂膜?！?PNAS 2007 104:175-180(《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，2007年，第104卷，第175-180頁(yè))；印刷前在線發(fā)表于2006年12月26 H, doi :10. 1073/pnas. 0609490104)。又如，Kobayashi等人闡述道“已知胚胎胰腺上皮和后來(lái)的導(dǎo)管上皮會(huì)產(chǎn)生發(fā)育中的胰腺的內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞，但是還沒(méi)有鑒定出這些細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物。在此，我們利用二花豆凝集素(Dolichos Biflorus Agglutinin, DBA)作為發(fā)育中小鼠胰腺中的這些上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。由使用熒光素DBA和胰腺特異性細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行的免疫熒光研究的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)DBA能特異性檢測(cè)上皮細(xì)胞，但既不能區(qū)分內(nèi)分泌細(xì)胞也不能區(qū)分腺泡細(xì)胞。我們還在免疫磁性分離系統(tǒng)(Dynabead系統(tǒng))中應(yīng)用了此標(biāo)記物，以從混合的發(fā)育中胰腺細(xì)胞群純化這些假定的多能細(xì)胞。此程序可應(yīng)用于研究發(fā)育中胰腺中的分化和細(xì)胞譜系選擇，還可應(yīng)用于為潛在的細(xì)胞工程選擇胰腺前體細(xì)胞?！?(Biochemicaland Biophysical Research Communications, Volume 293, Issue 2,3May 2002, Pages691-697 (《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》，第293卷，第2期，2002年5月3日，第691-697頁(yè)))。對(duì)衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞所表達(dá)的標(biāo)記物進(jìn)行鑒定將增進(jìn)對(duì)這些細(xì)胞的認(rèn)識(shí)，有助于其體內(nèi)和體外鑒定，并將使它們能在體外進(jìn)行陽(yáng)性富集供研究和利用。因此，仍需要可用于分離和表征衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞(尤其是表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞)的手段。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供將多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞群，b.使該多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，c.使該表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，d.使該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，以及e.使該表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施例中，將表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群移植入動(dòng)物體內(nèi)，其中表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞形成產(chǎn)胰島素細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)在移植前富集細(xì)胞群中表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，來(lái)提高產(chǎn)胰島素細(xì)胞的形成效率。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)在移植后測(cè)量C肽的表達(dá)達(dá)到可檢測(cè)水平所需時(shí)間，來(lái)確定產(chǎn)胰島素細(xì)胞的形成效率。在一個(gè)替代實(shí)施例中，該富集可降低在移植后移植細(xì)胞形成畸胎瘤的能力。


圖I顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3(小圖b)、PDXl (小圖C)、NKX6. I (小圖 d)、NKX2. 2 (小圖 e)和 PAX4 (圖 f)在 CD56+CD13' CD56XD13-和 CD56TD13+細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖2顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3(小圖b)、PDXl (小圖C)、NKX6. I (小圖d)、NKX2. 2(小圖e)和PAX4(小圖f)在用CD133抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖3顯示7通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3 (小圖b)、PDXl (小圖c) 和NKX6. I (小圖d)在用⑶49c抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所不表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖4顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3 (小圖b) ,PDXl (小圖c)、NKX6. I (小圖d)、胰島素(小圖e)和胰高血糖素(小圖f)在用CD56和CD15抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖5顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3(小圖b)、PDXl (小圖C)、NKX6. I (小圖d)、NKX2. 2(小圖e)、PAX_4(小圖f)、胰高血糖素(小圖g)和胰島素(小圖h)在用CD15抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖6顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3(小圖b)、PDXl (小圖C)、NKX6. I (小圖d)、NKX2. 2 (小圖e)、胰島素(小圖f)和胰高血糖素(小圖g)在用CD56和CD57抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖7顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的ZICl (小圖a)、白蛋白(小圖b)、⑶X2 (小圖c)、NGN3 (小圖 d)、PAX4 (小圖 e)、NEUROD (小圖 f)、NKX6. I (小圖 g)、PTFl α (小圖 h)和PDXl (小圖i)在用⑶56和⑶184抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖8顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD(小圖a)、NGN3(小圖b)、胰島素(小圖c)和胰高血糖素(小圖d)在用CD98抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖9顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的NEUROD (小圖a)、NGN3(小圖b)、PDXl (小圖C)、NKX6. 1(小圖d)、NKX2. 2(小圖e)和PAX4(小圖f)在用CD47抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖10顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的PDX-I (小圖a)、ΝΚΧ6· I (小圖b)、ΝΚΧ2· 2(小圖c)、PAX-4 (小圖d)、PTFl α (小圖e)、NGN3 (小圖f)、胰島素(小圖g)和胰高血糖素(小圖h)在用CD47抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖11顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的HNF4 α (小圖a)和LIF受體(小圖b)在用LIF受體的抗體分選的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于實(shí)例I中概述的分化方案的第II階段第2天的未分選細(xì)胞而言的。圖12顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的0CT4(小圖a)、NANOG (小圖b)、S0X2(小圖c)和goosecoid(小圖d)在用磁珠去除了表達(dá)SSEA4的細(xì)胞的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。圖13顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的0CT4(小圖a)、NANOG (小圖b)、S0X2(小圖c)和goosecoid(小圖d)在用FACS去除了表達(dá)SSEA4的細(xì)胞的細(xì)胞群中的表達(dá)。所示表達(dá)倍數(shù)是相對(duì)于未分化Hl胚胎干細(xì)胞而言的。
具體實(shí)施例方式為了清晰說(shuō)明本公開(kāi)內(nèi)容，以非限制性方式將本發(fā)明的具體實(shí)施方式
分成下列描述或闡明本發(fā)明某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用的小節(jié)。
定義“ β -細(xì)胞譜系”是指對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子rox-i和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種具有陽(yáng)性基因表達(dá)的細(xì)胞NGN3、NKX2. 2、NKX6. K NEUROD, ISL1、HNF_3P、MAFA、PAX4 和 PAX6。表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括β細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種如下標(biāo)記物的細(xì)胞S0X17、GATA4、HNF-3 β、GSC、CERU Nodal、FGF8、Brachyury, Mix 樣同源盒蛋白、FGF4、CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CD184、C-Kit, CD99 或 0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。“表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種如下標(biāo)記物的細(xì)胞HNF-I β 或 HNF-4 α。如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種如下標(biāo)記物的細(xì)胞PDX1、HNF-I β、PTF-I α、HNF6或ΗΒ9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種如下標(biāo)記物的細(xì)胞NGN3、NEUROD, ISLU PDXU NKX6. I、PAX4、NGN3 或 PTF-I α。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞和胰腺激素分泌細(xì)胞以及β_細(xì)胞譜系的細(xì)胞。如本文所用，“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過(guò)程中從上胚層產(chǎn)生的細(xì)胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)記物CD184、HNF-3P 、GATA4、S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、c_Kit、CD99 和 Mixll。如本文所用，“標(biāo)記物”是在所關(guān)注的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。就此而論，差異表達(dá)意指陽(yáng)性標(biāo)記物的水平增加，而陰性標(biāo)記物的水平降低。標(biāo)記物核酸或多肽的可檢測(cè)水平在所關(guān)注細(xì)胞中充分地高于或低于在其他細(xì)胞中，使得可使用多種本領(lǐng)域公知的方法中的任何一種將所關(guān)注細(xì)胞與其他細(xì)胞鑒別和區(qū)分開(kāi)來(lái)。如本文所用，“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”指能夠表達(dá)至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰腺多肽。如本文所用，“胰腺激素分泌細(xì)胞”指能夠分泌至少一種以下激素的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。如本文所用，“前原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)記物的細(xì)胞Nodal或FGF8。如本文所用原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)記物的細(xì)胞Brachyury、Mix樣同源盒蛋白或FGF4。干細(xì)胞是由它們?cè)趩渭?xì)胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細(xì)胞的能力來(lái)定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和末端分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞，以及在移植后產(chǎn)生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上促成大多數(shù)(如果不是所有的話)組織的能力。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為(i)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類(lèi)型；(ii)多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類(lèi)型；(iii)專(zhuān)能，指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的亞群，但所有細(xì)胞譜系都只分布于特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)(例如造血干細(xì)胞(HSC)可產(chǎn)生 的后代細(xì)胞包括HSC(自我更新)、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞以及作為血液正常組分的所有細(xì)胞類(lèi)型和成分(例如血小板));(iv)寡能，指能夠產(chǎn)生比專(zhuān)能干細(xì)胞更局限的細(xì)胞譜系亞群；以及(V)單能，指能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(如生精干細(xì)胞)。分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過(guò)程。分化的細(xì)胞或分化誘導(dǎo)的細(xì)胞是已經(jīng)在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“定向的”當(dāng)應(yīng)用于分化過(guò)程時(shí)，指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞在正常環(huán)境下，它會(huì)繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞類(lèi)型亞群，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細(xì)胞類(lèi)型或回復(fù)到分化程度較低的細(xì)胞類(lèi)型。去分化是指細(xì)胞回復(fù)至細(xì)胞譜系內(nèi)特化(或定向)程度較低的位置的過(guò)程。如本文所用，細(xì)胞譜系限定了細(xì)胞遺傳性，也就是說(shuō)，它來(lái)自哪些細(xì)胞和它能夠產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計(jì)劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)記物指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞的表型明確相關(guān)的特征，可用來(lái)評(píng)估未定向細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化。有多個(gè)術(shù)語(yǔ)用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞。“維持”一般是指將細(xì)胞放置在處于這樣的條件的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述條件有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂，會(huì)或不會(huì)產(chǎn)生更大的細(xì)胞群?！皞鞔敝笇⒓?xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)容器移除并將它們放置在處于有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂的條件下的第二個(gè)培養(yǎng)容器中的過(guò)程。細(xì)胞的特定群體或細(xì)胞系，有時(shí)由它已被傳代的次數(shù)來(lái)指稱(chēng)或表征。例如，已傳代十次的培養(yǎng)細(xì)胞群可以稱(chēng)為Pio培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物(即，細(xì)胞從組織分離后的首次培養(yǎng)物)被指定為PO。在第一次繼代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為次代培養(yǎng)物(Pl或第I代)。在第二次繼代培養(yǎng)后，細(xì)胞變成三代培養(yǎng)物(P2或第2代)，依此類(lèi)推。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在傳代期間可能有許多次群體倍增；因此培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)目大于傳代數(shù)目。細(xì)胞在傳代間隔的時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)增(即，群體倍增數(shù))取決于多種因素，包括(但不限于)接種密度、基材、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件和傳代間隔的時(shí)間。表汰胰腺內(nèi)分泌譜系特征件標(biāo)記物的細(xì)胞的富集在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供將多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞群，
b.使該多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，c.使該表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，d.使該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，以及e.使該表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施例中，將表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群移植入動(dòng)物體內(nèi)，其中表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞形成產(chǎn)胰島素細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)在移植前富集表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，來(lái)提高產(chǎn)胰島素細(xì)胞的形成效率。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)在移植后測(cè)量C肽表達(dá)達(dá)到可檢測(cè)水平所需時(shí)間，來(lái)確定 產(chǎn)胰島素細(xì)胞的形成效率。在一個(gè)替代實(shí)施例中，富集降低了在移植后移植細(xì)胞形成畸胎瘤的能力。通過(guò)細(xì)胞表面上存在的抗原結(jié)合到特異性結(jié)合該細(xì)胞表面抗原的試劑，來(lái)鑒定或選擇表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系標(biāo)記物的細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞在移植入動(dòng)物體內(nèi)之前進(jìn)一步分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞表面上存在的抗原結(jié)合到特異性結(jié)合該細(xì)胞表面抗原的試劑，來(lái)鑒定或選擇產(chǎn)胰島素細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明提供使多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞群，b.使該多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，c.使該表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，d.富集該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，e.使該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，以及f.使該表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施例中，將表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群移植入動(dòng)物體內(nèi)，其中表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞形成產(chǎn)胰島素細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)在移植前富集該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，來(lái)提高產(chǎn)胰島素細(xì)胞的形成效率。通過(guò)細(xì)胞表面上存在的抗原結(jié)合到特異性結(jié)合該細(xì)胞表面抗原的試劑，來(lái)鑒定或選擇表達(dá)原腸管譜系標(biāo)記物的細(xì)胞。有利于富集表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的表面抗原在一個(gè)實(shí)施例中，移植進(jìn)入動(dòng)物之前，將表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群用至少一種能夠結(jié)合選自CD9、⑶13、⑶15、⑶47、⑶56、⑶73、⑶117、⑶133、⑶184、CD200、CD318、CD326和SSEA4的標(biāo)記物的試劑處理。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈⑶56表達(dá)陽(yáng)性，標(biāo)記物⑶13表達(dá)陰性。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈⑶56表達(dá)陽(yáng)性，標(biāo)記物⑶15表達(dá)陰性。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈⑶133表達(dá)陰性。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈⑶15表達(dá)陰性。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的 細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈⑶184表達(dá)陽(yáng)性。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈SSEA4表達(dá)陰性。有利于富集產(chǎn)胰島素細(xì)胞的表面抗原在一個(gè)實(shí)施例中，移植進(jìn)入動(dòng)物前，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群進(jìn)一步分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞群。將產(chǎn)胰島素細(xì)胞群用至少一種能夠結(jié)合選自CD47、CD56、⑶57、⑶98和SSEA4的標(biāo)記物的試劑處理。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到產(chǎn)胰島素細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈⑶56和⑶57表達(dá)陽(yáng)性。作為另外一種選擇，產(chǎn)胰島素細(xì)胞群可呈⑶98表達(dá)陽(yáng)性。作為另外一種選擇，產(chǎn)胰島素細(xì)胞群可呈⑶47表達(dá)陰性。在一個(gè)實(shí)施例中，用至少一種試劑處理得到產(chǎn)胰島素細(xì)胞群，所述細(xì)胞呈標(biāo)記物SSEA4表達(dá)陰性。⑶13在大多數(shù)外周血單核細(xì)胞和粒細(xì)胞上表達(dá)。它也通過(guò)骨髓胚細(xì)胞危象(myeloid blast crisis)中的的大多數(shù)急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病，少數(shù)淋巴性白血病和骨髓細(xì)胞系而被表達(dá)。CD13也存在于若干種類(lèi)型的非造血細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，并且以可溶形式存在于血漿中。CD13不在B細(xì)胞、T細(xì)胞、血小板或紅血球上表達(dá)。⑶13在生物活性肽代謝、生長(zhǎng)和分化控制、吞噬作用和殺菌/殺腫瘤活性中發(fā)揮作用。CD13還作為人冠狀病毒(HCV)的受體。⑶15是可在糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖上表達(dá)的糖粘附分子。⑶15介導(dǎo)可見(jiàn)于中性粒細(xì)胞上的吞噬作用和趨化作用；在霍奇金病、一些B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病和大多數(shù)急性非淋巴細(xì)胞性白血病患者中表達(dá)。它也稱(chēng)為L(zhǎng)ewis X和SSEA-I (階段特異性胚胎抗原I)，并且代表鼠科多能干細(xì)胞的標(biāo)記物，其中它在植入前胚胎中的細(xì)胞的粘附和遷移中具有重要作用。CD47是膜蛋白，它與細(xì)胞粘附于胞外基質(zhì)時(shí)發(fā)生的胞內(nèi)鈣濃度增加有關(guān)。該蛋白也是血小板反應(yīng)蛋白的C-端細(xì)胞結(jié)合域的受體，并且可在膜轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。⑶56也稱(chēng)為神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)，它是在神經(jīng)元、膠質(zhì)、骨骼肌和自然殺傷細(xì)胞的表面上表達(dá)的嗜同性結(jié)合糖蛋白。已指出NCAM在細(xì)胞-細(xì)胞粘附、神經(jīng)突長(zhǎng)出、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮作用。⑶57也稱(chēng)為HNK-I或Leu_7，它是某些細(xì)胞類(lèi)型的胞外蛋白上檢測(cè)到的抗原性低聚糖部分。在血液中，⑶57存在于15-20%的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell)中，包括NK和T細(xì)胞亞群，但不存在于紅細(xì)胞、單核細(xì)胞(monocyte)、粒細(xì)胞或血小板中。另外，⑶57表達(dá)可見(jiàn)于多種神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型上。⑶98是包含大型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LATl)輕亞基的糖蛋白。LATl是優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)中性支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)和芳族氨基酸(色氨酸、酪氨酸)的異型二聚體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。⑶133是糖蛋白，在人和嚙齒動(dòng)物中也稱(chēng)為Prominin I (PROMl)。它是五次跨膜糖蛋白(5次跨膜，5-TM)成員，特異性地定位于細(xì)胞突起。⑶133在造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)元和膠質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)。參見(jiàn)Corbeil et al, Biochem Biophys ResCommun 285(4) =939-44,2001 (Corbeil等人，《生物化學(xué)和生物物理研究通訊》，第285卷，第 4 期，第 939-944 頁(yè)，2001 年)。doi 10. 1006/bbrc. 2001. 5271. PMIDl 1467842 有利于富集表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的表面抗原 在一個(gè)替代實(shí)施例中，本發(fā)明提供使多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞群，b.使該多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，c.使該表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，d.富集該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，e.使該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，以及f.使該表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施例中，將表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群移植入動(dòng)物體內(nèi)，其中表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞形成產(chǎn)胰島素細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)在移植前富集該表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，來(lái)提高產(chǎn)胰島素細(xì)胞的形成效率。將表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群用至少一種能夠結(jié)合LIF受體的試劑處理?？梢愿患?、清除、離析、分離、分選和/或純化表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞、表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞或產(chǎn)胰島素細(xì)胞，如實(shí)例中進(jìn)一步描述。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“富集”或“純化”或由于清除其他已知細(xì)胞群而富集或純化，表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)了某種選擇過(guò)程，從而使群體得到富集和/或純化。另外，受試細(xì)胞也被視為相對(duì)富集的和/或純化的，即與另一個(gè)細(xì)胞群相比，或與“富集”或“純化”前的多能干細(xì)胞相比，或與原來(lái)或初始的細(xì)胞培養(yǎng)物相比，明顯存在更多的特定的分化細(xì)胞群。富集或純化給定的分化細(xì)胞類(lèi)型可以涉及從另一種細(xì)胞類(lèi)型中“清除”或“分離”或“分選”一種或多種已知的細(xì)胞類(lèi)型。在一個(gè)實(shí)施例中，可以通過(guò)清除不期望的分化細(xì)胞類(lèi)型來(lái)純化細(xì)胞群?？赡苡欣氖?，通過(guò)清除已知或未知細(xì)胞類(lèi)型的培養(yǎng)物來(lái)富集和純化表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。這樣，富集或純化的細(xì)胞群不會(huì)有結(jié)合或連接的抗體。因?yàn)椴恍枰獜募兓娜后w去除抗體，所以可改善富集或純化的細(xì)胞在細(xì)胞治療中的用途。富集、清除、離析、分離、分選和/或純化的方法可以包括例如選擇性培養(yǎng)條件，其中所述培養(yǎng)條件不利于任何不期望的細(xì)胞類(lèi)型。富集、清除、離析、分離、分選和/或純化的方法也可以包括例如抗體包被的磁珠、親和色譜法和用附著在固體基質(zhì)或固相捕獲介質(zhì)(如平板、色譜柱)的抗體“淘選”或其他簡(jiǎn)便且可用的技術(shù)。提供準(zhǔn)確分離的技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)方法，這類(lèi)方法可用于測(cè)量細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)參數(shù)，以及形態(tài)變化和顆粒度，并且用于分析用作抗體或探針連接試劑的磁珠。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的讀出值包括(但不限于)與各個(gè)熒光抗體檢測(cè)細(xì)胞表面分子或細(xì)胞因子相關(guān)的平均熒光，或者平均熒光強(qiáng)度、中值熒光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度變化，或者它們之間的某種關(guān)系。在包括涉及流式細(xì)胞術(shù)的分析步驟的實(shí)施例的一些方面，磁珠的最小參數(shù)或特性是散射(FS和/或SS)和至少一個(gè)熒光波長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)可用于定量參數(shù)，例如細(xì)胞表面
蛋白或其構(gòu)象或翻譯后修飾的存在；細(xì)胞內(nèi)蛋白或分泌蛋白，其中透化作用允許抗體(或探針)進(jìn)入等等。流式細(xì)胞術(shù)方法在本領(lǐng)域是已知的，并且在如下文獻(xiàn)中有描述=FlowCytometry and Cell Storing(Springer Lab Manual), Radbruch, Ed. , Springer Verlag,2000 (《流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選(施普林格實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))》，Radbruch編輯，施普林格出版社，2000 年)；Ormerod, Flow Cytometry, Springer Verlag, 1999 (Ormerod,《流式細(xì)胞術(shù)》，施普林格出版社，1999年)；Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology, No91), Jaroszeski and Heller, Eds. , Humana Press, 1998(《流式細(xì)胞術(shù)方案(分子生物學(xué)方法，第91卷)》,Jaroszeski和HelIer編輯,胡馬納出版社，1998年)；Current Protocolsin Cytometry, Robinson et al. , eds, John Wiley & Sons, New York, N. Y. , 2000 (《流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)室指南》，Robinson等人編輯,約翰 威利父子出版公司，紐約州紐約市,2000年)。細(xì)胞的染色強(qiáng)度可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)，其中激光檢測(cè)熒光染料的定量水平(該水平與特異性試劑(如抗體)所結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物的量成比例)。流式細(xì)胞術(shù)或FACS也可用于根據(jù)結(jié)合特異性試劑的強(qiáng)度，以及其他參數(shù)如細(xì)胞大小和光散射來(lái)分離細(xì)胞群。雖然絕對(duì)染色水平可隨著具體熒光染料和試劑制備物而有所差別，但數(shù)據(jù)可以歸一化到對(duì)照。為了將分布?xì)w一化到對(duì)照，將每個(gè)細(xì)胞記錄為具有具體染色強(qiáng)度的數(shù)據(jù)點(diǎn)。為了將分布?xì)w一化到對(duì)照，將每個(gè)細(xì)胞記錄為具有具體染色強(qiáng)度的數(shù)據(jù)點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)點(diǎn)可以根據(jù)對(duì)數(shù)標(biāo)尺顯示，其中度量單位為任意染色強(qiáng)度。在一個(gè)例子中，把細(xì)胞群中最亮的細(xì)胞指定為強(qiáng)度比最低染色水平的細(xì)胞大4個(gè)對(duì)數(shù)。當(dāng)這樣顯示時(shí)，顯而易見(jiàn)的是，落入最高染色強(qiáng)度對(duì)數(shù)范圍的細(xì)胞是明亮的，而最低強(qiáng)度的細(xì)胞是陰性的。落入染色強(qiáng)度的2-3個(gè)對(duì)數(shù)范圍的“低”染色細(xì)胞可具有不同于陰性和陽(yáng)性細(xì)胞的特性。另選的對(duì)照可以利用其表面上具有確定密度的標(biāo)記物的基材，例如提供強(qiáng)度陽(yáng)性對(duì)照的制造磁珠或細(xì)胞系?！暗汀睒?biāo)識(shí)表示染色水平大于同種型匹配對(duì)照的亮度，但強(qiáng)度不如通常存在于群體中的最亮的染色細(xì)胞。所選參數(shù)的讀出值能夠同時(shí)讀取，或在單次分析期間依次讀取，例如通過(guò)使用細(xì)胞表面分子的熒光抗體。作為一個(gè)例子，這些分子可以被不同的熒光染料、熒光磁珠、標(biāo)簽(如量子點(diǎn))等標(biāo)記，使得可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)分析多達(dá)4種或更多種的熒光色。例如，陰性標(biāo)識(shí)表示染色水平等于或低于同種型匹配陰性對(duì)照的亮度；而暗淡標(biāo)識(shí)表示染色水平可接近陰性染色的水平，但也可比同種型匹配對(duì)照要亮。各個(gè)細(xì)胞(例如不同細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞類(lèi)型變體)的標(biāo)識(shí)符可以是熒光的，例如用不同水平的熒光化合物標(biāo)記不同單位細(xì)胞類(lèi)型，及上文所述的類(lèi)似標(biāo)識(shí)符。在要混合兩種細(xì)胞類(lèi)型的實(shí)施例的一些方面，一種細(xì)胞類(lèi)型是經(jīng)標(biāo)記的，而另一種是未標(biāo)記的。在要包括三種或更多種細(xì)胞類(lèi)型的實(shí)施例的一些方面，每種細(xì)胞類(lèi)型可以通過(guò)與不同濃度的標(biāo)記化合物溫育，或溫育不同的時(shí)間而標(biāo)記上不同水平的熒光。作為大量細(xì)胞的標(biāo)識(shí)符，可以使用兩種或更多種不同的熒光顏色的熒光標(biāo)記強(qiáng)度矩陣，使得被標(biāo)識(shí)的不同單位細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)量為一種顏色(如羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE))的熒光水平的數(shù)量乘以第二種顏色(如四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)等等)采用的熒光水平的數(shù)量乘以第三種顏色水平的數(shù)量等等。作為另外一種選擇，不同細(xì)胞類(lèi)型的固有光散 射特性或在分析中所包括的測(cè)試參數(shù)的BioMAP特性,可作為熒光標(biāo)簽的補(bǔ)充來(lái)使用或者取代熒光標(biāo)簽來(lái)使用，作為單位細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)識(shí)符。在另一方面，可以使用常規(guī)的親和或抗體技術(shù)富集、清除、分離、分選和/或純化細(xì)胞。例如，配體和/或抗體可以與如下標(biāo)簽綴合，以使特定細(xì)胞類(lèi)型的分離變得容易如磁珠；生物素，其與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白以高親和力結(jié)合；熒光染料，其可用于熒光激活細(xì)胞分選儀；半抗原等等。在一個(gè)實(shí)施例中，本文所述的配體、試劑和/或抗體可以直接或間接綴合到磁性試劑，例如超順磁性微粒(微粒)。與磁性顆粒的直接綴合可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的各種化學(xué)連接基團(tuán)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，抗體通過(guò)側(cè)鏈氨基或巰基和雜官能團(tuán)交聯(lián)試劑連接到微粒。有大量雜官能團(tuán)化合物可用于連接到實(shí)體(entity)。例如，至少可以使用在抗體上具有活性巰基并且在磁性顆粒上具有活性氨基的3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(STOP)或4-(N_馬來(lái)酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-I-甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMCC)。磁性分離裝置的例子在WO 90/07380、PCT/US96/00953和EP 438，520中有描述，這些專(zhuān)利全文以引用方式并入本文。純化的細(xì)胞群可以收集在任何適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基可以包括例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dMEM)、漢克氏基本鹽溶液(HBSS)、達(dá)爾伯克氏磷酸鹽緩沖鹽水(dPBS)、RPMI、伊斯考夫改良達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(MDM)、含5mM EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)等等，通常補(bǔ)充有胎牛血清(FCS)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和StemPro hESC SFM。在一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞通過(guò)用至少一種能選擇不表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的試劑進(jìn)行處理來(lái)富集。在一個(gè)替代實(shí)施例中，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞通過(guò)用至少一種能選擇產(chǎn)胰島素細(xì)胞的試劑進(jìn)行處理來(lái)富集。與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，使用本文所述的方法，細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物可以在細(xì)胞含量上富集至少約2至約1000倍。在一些實(shí)施例中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可以富集至少約5至約500倍。在其他實(shí)施例中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可以富集至少約10至約200倍。在其他實(shí)施例中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可以富集至少約20至約100倍。在其他實(shí)施例中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可以富集至少約40至約80倍。在某些實(shí)施例中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可以富集至少約2至約20倍。衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞的表征可以通過(guò)測(cè)定給定分化細(xì)胞類(lèi)型特征性標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)確定分化細(xì)胞從多能干細(xì)胞的形成。在一些實(shí)施例中，通過(guò)某個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)或超過(guò)一個(gè)標(biāo)記物的不同表達(dá)水平和模式來(lái)進(jìn)行分化細(xì)胞的鑒定和表征。具體地講，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物存在與否、高或低表達(dá)可代表和鑒定細(xì)胞類(lèi)型。另夕卜，某些標(biāo)記物可以具有瞬時(shí)表達(dá)，因此標(biāo)記物在發(fā)育的一個(gè)階段高表達(dá)，而在發(fā)育的另一個(gè)階段低表達(dá)。某些標(biāo)記物的表達(dá)可以通過(guò)測(cè)量標(biāo)記物存在于細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞中的、與標(biāo)準(zhǔn)化或歸一化對(duì)照標(biāo)記物相比的水平來(lái)確定。在這種過(guò)程中，標(biāo)記物表達(dá)的測(cè)量可以是定性的或定量的。一種定量標(biāo)記物基因所產(chǎn)生的標(biāo)記物的表達(dá)的方法是通過(guò)使用定量PCR(Q-PCR)。Q-PCR的操作方法是本領(lǐng)域熟知的。還可使用本領(lǐng)域已知的其他方法定量標(biāo)記物基因的表達(dá)。例如，標(biāo)記物基因廣物的表達(dá)可以使用對(duì)所關(guān)注的標(biāo)記物基因廣物具有特異性的抗體來(lái)檢測(cè)(如蛋白質(zhì)印跡、流式細(xì)胞術(shù)分析等等)。在某些實(shí)施例中，可以確定分化細(xì)胞特征性標(biāo)記物基因的表達(dá)，以及分化細(xì)胞特征性標(biāo)記物基因的明顯表達(dá)的缺失。組織特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)也可以通過(guò)RNA印跡分析、斑點(diǎn)印跡雜交分析，或通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)(使用序列特異性引物，以標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法進(jìn)行)在mRNA水平上檢測(cè)。更多細(xì)節(jié)見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5，843，780。本公開(kāi)說(shuō)明書(shū)中列出的具體標(biāo)記物的序列數(shù)據(jù)可以從公用數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank獲得。多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4中的一種或多種以及可用稱(chēng)為 Tra-1-60 和 Tra-1-81 的抗體檢測(cè)的標(biāo)記物(Thomson et al.，Science 282 :1145,1998 (Thomson等人，《科學(xué)》，第282卷，第1145頁(yè)，1998年))。多能干細(xì)胞體外分化導(dǎo)致喪失SSEA-4、Tra 1-60和Tra 1-81的表達(dá)(如果存在的話)，并且增加SSEA-1的表達(dá)。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過(guò)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用Vector Red作為底物顯影來(lái)檢測(cè)，如生產(chǎn)商所描述(加州伯林蓋姆媒介實(shí)驗(yàn)室(VectorLaboratories, Burlingame Calif))。未分化的多能干細(xì)胞通常也表達(dá)0CT4和TERT,這通過(guò)RT-PCR檢測(cè)。胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物選自PDXUHNF1 β ,PTFl a、HNF6、HB9和PR0X1。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物選自S0X17、GATA4、HNF3 β、GSC、CERU Nodal、FGF8、Brachyury、MiX 樣同源盒蛋白、FGF4、CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、⑶184、C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為原條前體細(xì)、胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物選自NGN3、NEUR0D、ISLl、PDXl、NKX6. 1、PAX4、NGN3和PTF-I α。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)以下激素中的至少一種胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可為表達(dá)胰腺激素的細(xì)胞。作為另外一種選擇，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可為分泌胰腺激素的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可表達(dá)I3DXl和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子NGN3、NKX2. 2、NKX6. 1、NEUR0D、ISL1、HNF3 β、MAFA、PAX4 和 PAX6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá) β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞是β細(xì)胞。
多能干細(xì)胞多能干細(xì)胞的表征多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特異性胚胎抗原(SSEA) 3和4中的一種或多種以及可用稱(chēng)為 Tra-1-60 和 Tra-1-81 的抗體檢測(cè)的標(biāo)記物(Thomson et al.，Science 282 :11451998 (Thomson等人，《科學(xué)》，第282卷，第1145頁(yè)，1998年))。多能干細(xì)胞體外分化導(dǎo)致喪失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表達(dá)(如果存在的話)，并且增加SSEA-1的表達(dá)。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過(guò)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用Vector Red作為底物顯影來(lái)檢測(cè)，如生產(chǎn)商所描述(加州伯林蓋姆媒介實(shí)驗(yàn)室(VectorLaboratories, Burlingame Calif))。未分化的多能干細(xì)胞還通常表達(dá)0ct_4和TERT,這通過(guò)RT-PCR檢測(cè)。增殖的多能干細(xì)胞的另一理想表型是分化成所有三個(gè)胚層即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織的細(xì)胞的潛能?？梢岳缤ㄟ^(guò)如下方式來(lái)確認(rèn)干細(xì)胞的多能性將細(xì)胞注射入重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4%的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，找出來(lái)自三個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型的證據(jù)。作為另外一種選擇，可以通過(guò)產(chǎn)生胚狀體并評(píng)估胚狀體中三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)記物的存在來(lái)確定多能性?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)G帶技術(shù)并與已公布的相應(yīng)靈長(zhǎng)類(lèi)物種的核型相比較來(lái)分析增殖的多能干細(xì)胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，其意指細(xì)胞為整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒(méi)有明顯的改變。多能干細(xì)胞的來(lái)源可使用的多能干細(xì)胞的類(lèi)型包括從妊娠后形成的組織衍生而來(lái)的確立多能細(xì)胞系，包括在妊娠期間任何時(shí)間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時(shí)間通常是但不一定是在大約10-12周妊娠前。非限制性的例子是人胚胎干細(xì)胞或人胚胎生殖細(xì)胞的確立細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系H1、H7和H9 (WiCell)。也可設(shè)想的是，在此類(lèi)細(xì)胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開(kāi)的組合物，在此情況下，源細(xì)胞將是直接取自源組織的原代多能細(xì)胞。取自已經(jīng)在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群以及已經(jīng)在存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群的細(xì)胞也是合適的。同樣合適的是突變型人胚胎干細(xì)胞系，例如BG01v(喬治亞州雅典BresaGen(BresaGen,Athens,GA))。來(lái)源于成人體細(xì)胞的細(xì)胞也是合適的，例如，在 Takahashi et al, Cell 131 :1_12 (2007) (Takahashi 等人，《細(xì)胞》，第131卷，第1-12頁(yè)，2007年)中公開(kāi)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，人胚胎干細(xì)胞如Thomson等人所述進(jìn)行制備(美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998(《科學(xué)》，第 282 卷，第 1145 頁(yè)，1998 年)；Curr.Top. Dev. Biol. 38 :133 ff.，1998 (《發(fā)育生物學(xué)當(dāng)前主題》，第38卷，第133頁(yè)及以后，1998年)；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :7844,1995 (《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第 92 卷，第 7844頁(yè)，1995 年))。還設(shè)想到衍生自體細(xì)胞的多能干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)Takahashi等人(Cell 126 :663-676,2006(《細(xì)胞》，第126卷，第663-676頁(yè)，2006年))所述的方法衍生。在一個(gè)替代實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)Li等人(Cell StemCell 4 :16-19,2009(《細(xì)胞干細(xì)胞》，第4卷，第16-19頁(yè)，2009年))所述的方法衍生。
在一個(gè)替代實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)Maherali等人(CellStem Cell I :55-70,2007(《細(xì)胞干細(xì)胞》，第I卷，第55-70頁(yè)，2007年))所述的方法衍生。在一個(gè)替代實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)Stadtfeld等人(Cell Stem Cell 2 :230-240(《細(xì)胞干細(xì)胞》，第2卷，第230-240頁(yè)))所述的方法衍生。在一個(gè)替代實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)Nakagawa等人(Nature Biotechnology 26 :101-106，2008 (《自然生物技術(shù)》，第 26 卷，第 101-106 頁(yè)，2008年))所述的方法衍生。在一個(gè)替代實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)Takahashi等人(Cell 131 :861-872,2007(《細(xì)胞》，第131卷，第861-872頁(yè)，2007年))所述的方法衍生。在一個(gè)替代實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞可以根據(jù)轉(zhuǎn)讓給CentocorR&D，Inc.公司的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)61/256，149中所述的方法衍生。多能干細(xì)胞的培養(yǎng)在一個(gè)實(shí)施例中，在按照本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)之前，將多能干細(xì)胞在以各種方式支持多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層或胞外基質(zhì)蛋白上培養(yǎng)。例如，將多能干細(xì)胞在支持多能干細(xì)胞增殖而不進(jìn)行大量分化的飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)。多能干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞層上生長(zhǎng)而不分化是利用如下來(lái)支持的(i)獲得含有飼養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)容器；以及(ii)通過(guò)先前用另一細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基，或者(例如)不含血清的或者甚至是化學(xué)成分確定的未經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基。又如，將多能干細(xì)胞在基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞、但支持多能干細(xì)胞增殖而不進(jìn)行大量分化的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。多能干細(xì)胞在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)而不進(jìn)行分化是利用以下條件來(lái)支持的(i)固體基材表面上具有一種或多種胞外基質(zhì)蛋白的吸附層(adlayer);和(ii)通過(guò)先前用另一細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基或者未經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基(例如不含血清的培養(yǎng)基或甚至是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基)。在一個(gè)替代實(shí)施例中，將多能干細(xì)胞在含有至少約0. 5%的N、O和N的總數(shù)大于或等于17. 2%并且接觸角為至少約13. 9度的表面改性板上，在通過(guò)預(yù)先用另一細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基或未經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基(例如不含血清的培養(yǎng)基或甚至是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)基適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的一個(gè)例子可見(jiàn)于US20020072117。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于US6642048。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于W02005014799。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于Xu等人(StemCells 22:972-980,2004(《干細(xì)胞》，第22卷，第972-980頁(yè)，2004年))。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于US20070010011。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于 Cheon 等人(BioReprod DOI 10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ；190ct 2005(《生殖生物學(xué)》，DOI 10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ;2005 年 10 月 19 曰))。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006(《干細(xì)胞》，第24卷，第568-574頁(yè)，2006年))。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于US20050148070。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于US20050233446。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于US6800480。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于US20050244962。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于W02005065354。適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另一例子可見(jiàn)于W02005086845。
·
合適的培養(yǎng)基也可以由下列組分制成，例如，達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，Gibco#l 1965-092 ;敲除的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(K0 DMEM)，Gibco#10829-018 ；Ham ' s F12/50 % DMEM 基本培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027 ;非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β -巰基乙醇，Sigma#M7522 ;人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，Gibco#13256029。多能干細(xì)胞的分化在一個(gè)實(shí)施例中，使多能干細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖，然后以可促進(jìn)其分化為另一細(xì)胞類(lèi)型的方式處理多能干細(xì)胞。例如，可根據(jù)W02007030870中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)祖細(xì)胞或心肌細(xì)胞。又如，可根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利6，458，589中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D’Amour 等人在 Nature Biotechnology 23,1534-1541 (2005)(《自然生物技術(shù)》，第23卷，第1534-1541頁(yè)，2005年)中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)Shinozaki 等人在 Development 131,1651-1662(2004)(《發(fā)育》，第131卷，第1651-1662頁(yè)，2004年)中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)McLean等人在Stem Cells 25，29-38 (2007)(《干細(xì)胞》，第25卷，第29-38頁(yè)，2007年)中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D’Amour 等人在 Nature Biotechnology 24,1392-1401 (2006)(《自然生物技術(shù)》，第24卷，第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/736，908中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/779，311中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。
又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)12/493，741中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)12/494，789中公開(kāi)的方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的形成可通過(guò)在進(jìn)行特定方案之前或之后檢測(cè)該標(biāo)記物的存在來(lái)確定。多能干細(xì)胞通常不表達(dá)這類(lèi)標(biāo)記物。因而，當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)它們時(shí)即檢測(cè)到多能細(xì)胞的分化。使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層i普系特征性標(biāo)記物的
MM可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D’Amour 等人在 Nature Biotechnology 24,1392-1401 (2006)(《自然生物技術(shù)》，第24卷，第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)的方法，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，還通過(guò)下述方式，將根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑KAAD-環(huán)巴胺處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，然后除去含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞在含有視黃酸、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。此方法的一個(gè)例子在 Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)(《自然生物技術(shù)》，第 24 卷，第 1392-1401頁(yè)，2006年)中進(jìn)行了公開(kāi)。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/736，908中公開(kāi)的方法，通過(guò)用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞一段時(shí)間，來(lái)使所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,通過(guò)用視黃酸(密蘇里州西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich, MO))和毒蜥外泌肽4處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，然后移除含有DAPT (密蘇里州西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，M0))和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，隨后在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，可使所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。
此方法的一個(gè)例子在Nature Biotechnology 24,1392-1401 (2006)(《自然生物技術(shù)》，第24卷，第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)。例如，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，并且隨后將細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽I、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在D’Amour等人,Nature Biotechnology, 2006 (《自然生物技術(shù)》，2006年)中公開(kāi)。例如，通過(guò)在含有DAPT(密蘇里州西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，MO))和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology,2006(《自然生物技術(shù)》，2006年)中公開(kāi)。例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)根據(jù)本發(fā)明方法得到的胰腺內(nèi) 胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在D’Amour等人,NatureBiotechnology, 2006(《自然生物技術(shù)》，2006年)中公開(kāi)。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/736，908中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/779，311中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/953，178中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/990，529中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化成表汰胰腺內(nèi)分泌譜系特征件標(biāo)記物的細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法，使采用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，并且隨后將細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽I、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在D’Amour等人,Nature Biotechnology, 2006 (《自然生物技術(shù)》，2006年)中公開(kāi)。例如，通過(guò)在含有DAPT(密蘇里州西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，MO))和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology,2006(《自然生物技術(shù)》，2006年)中公開(kāi)。例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在D’Amour等人,NatureBiotechnology, 2006(《自然生物技術(shù)》，2006年)中公開(kāi)。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/736，908中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)11/779，311中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/953，178 中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如,根據(jù)轉(zhuǎn)讓給理康公司(LifeScan, Inc.)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/990，529中公開(kāi)的方法，通過(guò)用抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子處理根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞，使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不受限于以下實(shí)例。SM實(shí)例I在不存在胎牛血·清的情況下將細(xì)胞系Hl的人胚胎干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞使用如下的多步方案，將各代(p40至p52)的人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞在MATRIGELd 30稀釋)包被的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)并分化成胰腺譜系a.第I階段(定形內(nèi)胚層)將人胚胎干細(xì)胞在補(bǔ)充有2%無(wú)脂肪酸的BSA(目錄號(hào)68700，艾奧瓦州普羅利恩特公司(Proliant，IA))和100ng/ml激活蛋白A(明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems, MN))加上20ng/ml WNT_3a(目錄號(hào)1324-WN-002，明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems,MN))加上8ng/ml bFGF (目錄號(hào)100-18B,新澤西州派普泰克公司(P印roTech，NJ))的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。然后用補(bǔ)充有2% BSA和100ng/ml激活蛋白A加上8ng/ml bFGF的RPMI培養(yǎng)基再處理細(xì)胞兩天，接下來(lái)
b.第II階段(原腸管)將細(xì)胞用RPMI+2%無(wú)脂肪酸的BSA和50ng/ml FGF7和
O.25 μ M SANT-I (#S4572，密蘇里州西格瑪公司(Sigma，MO))處理二至三天，接下來(lái)c.第III階段(后前腸)將細(xì)胞用補(bǔ)充有I : 200稀釋的ITS-X(加州英杰公司(Invitrogen, CA))和 O. I % BSA (富含脂質(zhì))(加州英杰公司(Invitrogen, Ca),No. 11021-045)、50ng/ml FGF7、0. 25 μ M SANT-U2 μ M 視黃酸(RA)(密蘇里州西格瑪公司(Sigma,M0))、100ng/ml成頭蛋白(明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems,MN))和2Ong/ml激活蛋白A的DMEM/高葡萄糖處理四天；在某些變型方案中，成頭蛋白替換為2 μ M濃度的AMPK抑制劑6-[4-(2-哌啶-I-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[l，5_a]嘧啶(西格瑪(Sigma), No. P5499) 0在其他變型方案中，加入2. 5 μ M Ρ38抑制劑(4-[4-(4-氟苯基)-I-(3-苯基丙基)-5-吡啶-4-基-IH-咪唑-2-基]丁 -3-炔-I-醇)(在美國(guó)專(zhuān)利6，521655中公開(kāi))，接下來(lái)
d.第IV階段(胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞)將細(xì)胞用補(bǔ)充有I : 200稀釋的ITS-X (力口州英杰公司(Invitrogen, CA))和 0. 1% BSA (加州英杰公司(Invitrogen, Ca))、100ng/ml成頭蛋白、ΙμΜ ALK5 抑制劑(SD-208，在 Molecular Pharmacology 200772 :152-161 (《分子藥理學(xué)》，2007年，第72卷，第152-161頁(yè))中公開(kāi))的DMEM/高葡萄糖處理三天，接下來(lái)e.第V階段(胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞)將細(xì)胞用補(bǔ)充有I : 200稀釋的ITS_X(加州英杰公司(Invitrogen, CA))、0· I % BSA (加州英杰公司(Invitrogen, Ca)) > I μ M ALK5 抑制劑ΙΙ(目錄號(hào)616452,加州Calbiochem公司(Calbiochem, Ca))的DMEM/高葡萄糖處理七天，接下來(lái)f.第VI階段(成熟胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞)將細(xì)胞用補(bǔ)充有I : 200稀釋的ITS-X(力口州英杰公司(Invitrogen, CA))、0· I % BSA (加州英杰公司(Invitrogen, Ca))的 DMEM/高葡萄糖處理七天，每隔一天更換培養(yǎng)基。實(shí)例 2富集的各種胰腺細(xì)胞譜系的流式細(xì)胞術(shù)表征和分選為了促進(jìn)實(shí)例I中所概述分化過(guò)程的各個(gè)階段的新型細(xì)胞群的分離和表征，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)詳細(xì)表征了從各個(gè)階段獲得的細(xì)胞。在各個(gè)分化階段使用的抗體和表面標(biāo)記物表達(dá)水平的完整列表在表I中示出。使用實(shí)例I中描述的方案，將各代(p40至p52)的人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞在MATRIGEL包被的平板上培養(yǎng)并分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。將不同成熟階段的細(xì)胞(后前腸(第III階段)、內(nèi)分泌前體細(xì)胞(第IV階段)、胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞(第V階段)或成熟胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞(第VI階段))通過(guò)在TrypLEExpress (加州英杰公司(Invitrogen, CA), #12604)中在37°C下溫育2-3分鐘進(jìn)行溫和解離，用含2% BSA的BD FACS染色緩沖液(加州碧迪公司(BD,CA),#554657)洗滌兩次。將大約0. 5-1 X IO6個(gè)細(xì)胞重懸于100-200 μ I封閉緩沖液(以I : 4稀釋于染色緩沖液(加州碧迪公司(BD，CA))中的0.5%人Y-球蛋白)中，用于染色。對(duì)于用直接綴合的一抗染色，將適當(dāng)?shù)目贵w加入細(xì)胞中，最終稀釋率為I : 20，并在4°C下溫育細(xì)胞30分鐘。對(duì)于未綴合的抗體，將一抗以I : 50-1 100稀釋率加入細(xì)胞，并在4°C下溫育細(xì)胞30分鐘，然后在染色緩沖液中洗滌兩次。然后將細(xì)胞以I : 500稀釋率在適當(dāng)?shù)亩怪袦赜?。將染色的?xì)胞重懸于300 μ I的染色緩沖液中，并在BD FACS Canto II上分析前，加入5-10 μ I 7AAD區(qū)分活/死細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞分選，以類(lèi)似于流式細(xì)胞術(shù)分析的方式處理大約3-4千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。用適當(dāng)?shù)目贵w給細(xì)胞染色，如表II所示。細(xì)胞分選為兩個(gè)或三個(gè)亞群，如表II所總結(jié)。基于同種型匹配對(duì)照來(lái)設(shè)定細(xì)胞分選門(mén)。在分選后，分析所分選細(xì)胞等分試樣的純度，然后通過(guò)PCR分析關(guān)鍵胰腺標(biāo)記物的表達(dá)。使用Rneasy Mini Kit試劑盒(加州凱杰公司(Qiagen,CA))從分選前樣品和各個(gè)級(jí)分中收集RNA。根據(jù)在實(shí)例I中概述的分化方案的不同階段所分析的細(xì)胞群中各種標(biāo)記物的表達(dá)，來(lái)選擇用于分選的細(xì)胞表面標(biāo)記物。本研究米用的標(biāo)記物在表II中公開(kāi)。簡(jiǎn)言之,表II中公開(kāi)的表面標(biāo)記物單獨(dú)或組合用于各種細(xì)胞群的分選。所分選的細(xì)胞的樣品通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的表達(dá)。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的分選抗CD56和CD13的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出三種細(xì)胞群a)⑶56+⑶13'b)⑶56TD13-和c)⑶56TD13+細(xì)胞群。分選后，⑶56+CD13_細(xì)胞群富集大約I. 3倍，并且與第IV階段未分選的細(xì)胞、或⑶56_CD13_細(xì)胞群、或⑶56TD13+細(xì)胞群相比，高度富集了表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物(包括NEUR0D、NGN3、H)X1、NKX6. 1、NKX2. 2和PAX-4)的分選細(xì)胞。參見(jiàn)圖I的小圖a_f。在第二系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD133的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出兩種細(xì)胞群a)⑶133+和b)⑶133_細(xì)胞群。分選后，⑶133_細(xì) 胞群富集大約I. 9倍，并且與第IV階段未分選的細(xì)胞或CD133+細(xì)胞群相比，高度富集了表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物(包括NEUROD、NGN3、PDXU NKX6. I、NKX2. 2和PAX-4)的分選細(xì)胞。參見(jiàn)圖2的小圖a-f。在第三系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD49c的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出兩種細(xì)胞群a)⑶49cHI和b)⑶49Cl°細(xì)胞群。分選后，⑶49(3ω細(xì)胞富集大約3. I倍，并且與未分選的細(xì)胞或CD49chi細(xì)胞相比，高度富集了表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物(包括NEUR0D、NGN3、H)X1和NKX6. I)的分選細(xì)胞。參見(jiàn)圖3的小圖a-do在第四系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD56和CD15的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出如下細(xì)胞群&)^56+^15'13)^56+^151!1、(3)^15+和d)⑶15_細(xì)胞群。分選后，⑶15_細(xì)胞群富集了大約I. I倍。與未分選的細(xì)胞或⑶56+CD15hi細(xì)胞群相比，高度富集了表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物(包括NEUROD、NGN3、PDXUNKX6. I、胰島素和胰高血糖素)的⑶56+00151°細(xì)胞群。參見(jiàn)圖4的小圖a_f。相似地，與未分選的細(xì)胞或CD15+細(xì)胞群相比，高度富集了使用單個(gè)標(biāo)記物分選的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物(包括NEUR0D、NGN3、roXl、NKX6. 1、ΝΚΧ2· 2、PAX_4、胰高血糖素和胰島素)的⑶15_細(xì)胞群。參見(jiàn)圖5的小圖a-h。在第五系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD56和CD57的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出兩種細(xì)胞群a)⑶56+⑶57+和b)⑶56+⑶57_細(xì)胞群。分選后，⑶56+CD57+細(xì)胞群富集了大約I. 9倍。與未分選的細(xì)胞或⑶56+⑶57_細(xì)胞群相比，高度富集了表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物(包括NEUROD、NGN3、PDXI.NKX6. I、NKX2. 2以及胰島素和胰高血糖素)的⑶56+⑶57+細(xì)胞。參見(jiàn)圖6的小圖a-g。使用抗⑶56和⑶57的抗體分選實(shí)例I中概述的分化方案的第V階段的細(xì)胞群時(shí)，也觀察到相似的結(jié)果。在第六系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD56和CD184的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出三種細(xì)胞群a)⑶184+、b)⑶184_和(3)⑶56+⑶184_細(xì)胞群。表IV匯總了富集前和富集后細(xì)胞中⑶184的表達(dá)。富集了表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物(包括PAX4、NEUROD、NKX6. UPDXl和PTFl α )的CD184.細(xì)胞群。ZIC1、白蛋白和⑶X2的表達(dá)下降。參見(jiàn)圖7的小圖a-i。產(chǎn)胰島素細(xì)胞的分選將抗CD98的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第VI階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出兩種細(xì)胞群a)⑶98+(Hi)和b)⑶98_α°)細(xì)胞群。分選后，⑶98+(Hi)細(xì)胞群富集了大約I. 6倍。富集了表達(dá)NEUROD、NGN3、胰島素和胰高血糖素的⑶98+(m)細(xì)胞。參見(jiàn)圖8的小圖a-d。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD47的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第V階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出兩種細(xì)胞群a)⑶47Hi(+)和b)⑶471°(_)細(xì)胞群。分選后，⑶47l°h細(xì)胞富集了大約 3. 3 倍。富集了表達(dá)NEUR0D、NGN3、PDX1、NKX6. 1、NKX2. 2 和 PAX4 的 CD47L°H細(xì)胞。參見(jiàn)圖9的小圖a-f。在另一系列實(shí)驗(yàn)中，將抗CD47的抗體用于分選從實(shí)例I中概述的分化方案的第VI階段獲得的細(xì)胞群。鑒定出兩種細(xì)胞群a)⑶47HiW和b)⑶471°(_)細(xì)胞群。富集了表達(dá)PDX-UNKX6. UNKX2. 2、PAX_4、PTFla、NGN3、胰島素和胰高血糖素的CD47L°H細(xì)胞。參見(jiàn)圖10的小圖a-h ο實(shí)例 3原腸管階段(第2階段)的Lif受體陽(yáng)性細(xì)胞的分選使用如下方案，將第44傳代的人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞在MATRIGEL包被的平板上培養(yǎng)并分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞a.用補(bǔ)充有2%無(wú)脂肪酸的BSA(目錄號(hào)68700，艾奧瓦州普羅利恩特公司(Proliant, IA))和100ng/ml激活蛋白A(明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems, MN))加上20ng/ml WNT_3a(目錄號(hào)1324-WN-002，明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems7MN))加上8ng/ml bFGF(目錄號(hào)100-18B，新澤西州派普泰克公司(PeproTech, NJ))的RPMI培養(yǎng)基處理一天，然后用補(bǔ)充有2% BSA和100ng/ml激活蛋白A加上8ng/ml bFGF的RPMI培養(yǎng)基再處理兩天(第I階段)，接下來(lái)b.用 RPMI+2% BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M SANT-I (#S4572，密蘇里州西格瑪公司(Sigma, MO))處理三天(第2階段)，接下來(lái)c.用DMEM/高葡萄糖+1 200稀釋的ITS-X(加州英杰公司(Invitrogen,CA) )+0. I % BSA (加州英杰公司(Invitrogen, Ca))+50ng/ml FGF7 (新澤西州派普泰克公司(Peprotech, NJ)) +0. 25 μ M SANT-1+2 μ M 視黃酸(RA)(密蘇里州西格瑪公司(Sigma,M0))+100ng/ml成頭蛋白(明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems,MN))和20ng/ml激活蛋白A處理四天(第3階段)，接下來(lái)d.用DMEM/高葡萄糖+1 200稀釋的ITS-X(加州英杰公司(Invitrogen,CA) )+0. I % BSA (加州英杰公司(Invitrogen, Ca))+100ng/ml 成頭蛋白+1 μ M ALK5 抑制劑(SCI0120) +處理三天(第4階段)。
使用TrypLE Express (加州卡爾斯巴德英杰公司(Invitrogen, Carlsbad, CA))將第2階段的細(xì)胞分散為單細(xì)胞，并在第4階段的基本培養(yǎng)基(DM-Hg+ITS-X+BSA)中洗滌。將解離的細(xì)胞離心，并將所得的細(xì)胞沉淀懸浮于由溶于PBS的2% BSA、0. 05%疊氮化鈉組成的染色緩沖液(密蘇里州西格瑪公司(Sigma,MO))中。如適當(dāng),用O. 1% γ-球蛋白(西格瑪(Sigma))溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Fe-受體封閉15分鐘。用Lif受體-藻紅蛋白(PE)(明尼蘇達(dá)州安迪生物公司(R&D Systems，MN))綴合的單克隆抗體(5 μ I抗體/IO6個(gè)細(xì)胞)溫育等分試樣(大約IO5個(gè)細(xì)胞)。對(duì)照包括適當(dāng)?shù)耐N型匹配抗體和未染色的細(xì)胞。所有的與抗體的溫育都是在4°C下進(jìn)行30分鐘，之后將細(xì)胞用染色緩沖液進(jìn)行洗滌。在FACS Aria(加州碧迪公司(BD，Ca))上分選染色的細(xì)胞。從分選前的樣品、Lif受體+級(jí)分和Lif受體-級(jí)分收集RNA (Rneasy Mini Kit試劑盒,加州凱杰公司(Qiagen, CA))。 Lif受體表達(dá)水平和模式匯總于表III中。表III匯總了第2階段第2和3天的Lif受體的表達(dá)。到第2階段第3天為止，大約70%的細(xì)胞表達(dá)了 Lif受體。如表III中所匯總，Lif受體只在第2階段細(xì)胞中高表達(dá)，而第3和4階段細(xì)胞顯示出Lif受體的表達(dá)極低。如圖11的小圖a-b所示出，與未分選的細(xì)胞或Lif受體陰性細(xì)胞相比，富集Lif受體的第2階段細(xì)胞顯示出HNF4 α的表達(dá)顯著增加。如實(shí)時(shí)PCR所測(cè)量，在包含Lif-受體陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分中，Lif受體mRNA的表達(dá)也增加。實(shí)例 4用磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選，清除SSEA-4+細(xì)胞，以減少體內(nèi)腫瘤的形成SSEA4抗原的表達(dá)是人胚胎干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵指標(biāo)，并且這個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)在分化過(guò)程期間大大下調(diào)。然而，殘余的SSEA-4陽(yáng)性細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致在部分分化的細(xì)胞移植后所觀察到的腫瘤和/或畸胎瘤。為了減少畸胎瘤的形成，開(kāi)發(fā)了在移植前從分化的細(xì)胞清除污染性SSEA4+細(xì)胞的方法。將人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞(第40-52次傳代)分化到實(shí)例I中概述的分化方案的各階段。為了測(cè)試SSEA-4清除的概念驗(yàn)證和功效，本研究首先用僅分化到原腸管階段(實(shí)例I中概述的分化方案的第2階段)的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，以確保細(xì)胞仍然保持高水平的SSEA-4表達(dá)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)SSEA-4的細(xì)胞從實(shí)例I中概述的分化方案的第4階段分化的細(xì)胞群清除。觀察的結(jié)果參見(jiàn)表V。細(xì)胞通過(guò)在TrypLE Express (加州英杰公司(Invitrogen, CA), #12604)中在37°C下溫育2_3分鐘而溫和解離成單細(xì)胞。為了增強(qiáng)清除期間細(xì)胞存活和活力，在收集前的細(xì)胞和在所有分離緩沖液中加入包括10 μ MΥ-27632(目錄號(hào)Y 0503，密蘇里州圣路易斯西格瑪公司(Sigma，St Louis，MO))或O. 5 μ MThiazovivin (目錄號(hào) 04-0017,加州圣地亞哥 Stemgent 公司(Stemgent, San Diego, CA))的抗凋亡劑。用包含無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、補(bǔ)充有O. I % BSA和2mM EDTA的分離緩沖液洗滌細(xì)胞。將10-100 X IO6個(gè)的細(xì)胞重懸于分離緩沖液中，最終細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)細(xì)胞/500 μ I。每500 μ I細(xì)胞加入25 μ 1SSEA-4抗體，室溫下將細(xì)胞在輕緩的振動(dòng)器(確保連續(xù)混合)上溫育15-20分鐘。通過(guò)300 X g離心8分鐘使細(xì)胞在分離緩沖液中進(jìn)行洗滌。移除上清液并將細(xì)胞重懸于原始緩沖液體積中，每500 μ I細(xì)胞懸浮液加入50 μ I預(yù)洗漆的 SSEA-4 清除磁珠(DynaBeads^SSEA-l 英杰公司(Invitrogen), #11160D)。將細(xì)胞和磁珠混合，在室溫下溫育15-20分鐘，同時(shí)持續(xù)地輕緩傾斜旋轉(zhuǎn)。通過(guò)輕緩抽吸來(lái)混合細(xì)胞，并在磁體上放置5分鐘。將包含SSEA-4陰性細(xì)胞的上清液轉(zhuǎn)移至新試管中，重復(fù)該過(guò)程2-3次，以移除殘余的磁珠。使磁珠結(jié)合的SSEA4+細(xì)胞從磁場(chǎng)釋放，對(duì)兩種細(xì)胞群進(jìn)行計(jì)數(shù)和處理，以作FACS和PCR分析。SSEA4在未分化Hl細(xì)胞、原腸細(xì)胞和第IV階段細(xì)胞中，在分選前和分選后細(xì)胞級(jí)分中的表達(dá)水平匯總于表V中。在實(shí)例I中概述的分化方案的第II階段分離的細(xì)胞群中，在分選前20. 5%的細(xì)胞表達(dá)了 SSEA4標(biāo)記物。相比之下，在分選后只有I. 8%的細(xì)胞表達(dá)了 SSEA4(表V)。清除導(dǎo)致移除了 91. 2%的SSEA-4陽(yáng)性細(xì)胞。在另一個(gè)使用內(nèi)分泌前體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，在清除前25. 3%的細(xì)胞表達(dá)了 SSEA-4，但清除后只有O. 9%表達(dá)了 SSEA-4，導(dǎo)致移除了 95. 5%的SSEA-4陽(yáng)性細(xì)胞(表V)。與分化的細(xì)胞相反，91. 2%的未分化胚胎干細(xì)胞群表達(dá)了 SSEA4。高度富集了表達(dá)多能標(biāo)記物(包括0CT4、NAN0G、S0X2和goosecoid)的分選SSEA4+細(xì)胞(圖12的小圖a-d)。
實(shí)例5通討FACS 分詵 SSEAAiiffll 和 SSEAAz1m 細(xì)朐為了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)研究和確認(rèn)從分化細(xì)胞中清除了富含多能標(biāo)記物(SSEA-4+)的細(xì)胞，如實(shí)例I中所述將細(xì)胞分化至第VI階段。使用TrypleEExpress細(xì)胞解離緩沖液將細(xì)胞從培養(yǎng)物中解離，并如實(shí)例2中所述制備用于分選的細(xì)胞。將SSEA-4抗體(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯安迪生物公司(R&D Systems,Minneapolis,MN),目錄號(hào)FAB1435P)用于分離被鑒定為SSEA-4(+)Hi和SSEA-4(-)Lo細(xì)胞的兩個(gè)細(xì)胞級(jí)分。如實(shí)例4中所述，通過(guò)RT-PCR分析分離的細(xì)胞級(jí)分的多能標(biāo)記物表達(dá)。類(lèi)似于實(shí)例5中所述使用磁珠分離獲得的SSEA-4清除和富集級(jí)分，高度富集了表達(dá)多能標(biāo)記物0CT4、NANOG、S0X2和goosecoid的分選SSEA-4(+)Hi細(xì)胞，這與SSEA-4(-)Lo細(xì)胞不同。參見(jiàn)圖13的小圖a_d。實(shí)例 6清除了 SSEA-4的細(xì)胞群的體內(nèi)移棺在預(yù)試驗(yàn)中，使清除了 SSEA-4的細(xì)胞分化至實(shí)例I中概述的分化方案的第IV階段，然后移植至小鼠的腎包膜中以測(cè)試細(xì)胞存活和移入。移植小鼠的數(shù)據(jù)匯總于表VI中。從Taconic Farms 購(gòu)買(mǎi)五至六周齡的雄性 scid-beige 小鼠(C. B-Igh-Ib/GbrnsTac-Prkdescld-Lystbg N7)。將小鼠圈養(yǎng)在微隔離籠(microisolator cage)中，自由獲得無(wú)菌食物和水。在手術(shù)準(zhǔn)備中，小鼠通過(guò)耳部加標(biāo)簽來(lái)辨別，稱(chēng)量其體重，并使用手持式血糖儀(One Touch,LifeScan)來(lái)測(cè)定其血糖。用異氟燒和氧氣的混合物麻醉小鼠，用小型動(dòng)物剪毛剪給手術(shù)部位剃毛。在手術(shù)前經(jīng)皮下給予小鼠0. lmg/kg Buprenexο通過(guò)用70%異丙醇、10%聚維酮-碘和70%異丙醇連續(xù)洗滌來(lái)準(zhǔn)備手術(shù)部位，并且產(chǎn)生穿透皮膚和肌肉層的左側(cè)切口。使左腎暴露于外并用0.9%氯化鈉保持潤(rùn)濕。將24GX3/4"靜脈導(dǎo)管用于穿透腎包膜，并且移除針頭。然后在腎包膜下推進(jìn)導(dǎo)管至腎臟的遠(yuǎn)極。在小鼠的手術(shù)前準(zhǔn)備期間，將細(xì)胞在I. 5mL微量離心管中離心，移除大部分上清液，留下的量剛好足以收集細(xì)胞沉淀物。將細(xì)胞收集進(jìn)RaininPos-D正位移移液器中，并倒置該移液器以讓細(xì)胞通過(guò)重力沉降。棄去過(guò)量的培養(yǎng)基，留下用于移植的濃集細(xì)胞制品。對(duì)于移植，將Pos-D移液槍頭牢固置于導(dǎo)管的插孔(hub)中，將細(xì)胞從移液器通過(guò)腎包膜下的導(dǎo)管分配，并遞送至腎臟的遠(yuǎn)極。將導(dǎo)管的內(nèi)腔用少量的培養(yǎng)基沖洗以遞送剩余的細(xì)胞，并抽回導(dǎo)管。通過(guò)低溫?zé)贫忾]腎包膜，使腎回復(fù)至其初始解剖位置。通過(guò)用5-Ovicryl縫線連續(xù)縫合來(lái)閉合肌肉，并用傷口夾閉合皮膚。在手術(shù)后經(jīng)皮下給予小鼠
I.Omg/kg Metacam。使小鼠脫離麻醉并讓其完全恢復(fù)。在移植之后，每周稱(chēng)重小鼠一次，每周測(cè)量血糖兩次。在移植之后的多個(gè)時(shí)間間隔，在經(jīng)腹膜內(nèi)給予小鼠3g/kg葡萄糖，并在注射葡萄糖后 60分鐘經(jīng)由眶后竇抽取血液到裝有少量肝素的微量離心管中。將血液離心，將血漿置于第二微量離心管中，在干冰上冷凍，然后在-80 V下保存直至進(jìn)行人c肽測(cè)定。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用Mercodia/ALPCO診斷超敏C肽ELISA來(lái)測(cè)定人C肽水平。到處死時(shí)，如上所述收集血液并使小鼠安樂(lè)死。從腎包膜收獲移植物，通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR、免疫組織化學(xué)和病理學(xué)進(jìn)行分析。三組小鼠移植了約330萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，每組包含i)細(xì)胞簇、ii)單細(xì)胞(未清除)和iii)清除了 SSEA4的單細(xì)胞。將分化至第IV階段的細(xì)胞通過(guò)輕輕刮取以形成小細(xì)胞簇來(lái)解離，或用TrypleE解離為單細(xì)胞，以用于SSEA-4清除。如實(shí)例5中概述，在SSEA-4清除后，移植前將細(xì)胞簇和單細(xì)胞制品二者都重新接種于含前體(第IV階段)細(xì)胞分化培養(yǎng)基的低附著平板(Costar,紐約州康寧公司(Corning Incorporated, NY),目錄號(hào)3471)中過(guò)夜。向培養(yǎng)物中加入10 μ M濃度的rock抑制劑Y-27632 二鹽酸一水合物(西格瑪(Sigma)，目錄號(hào)Y0503)過(guò)夜。移植后，如上所述監(jiān)測(cè)小鼠最多12周。接受單細(xì)胞的小鼠(清除的或未清除的)中未明顯表現(xiàn)出移植物的存活，但接受細(xì)胞簇的5只小鼠中有2只表現(xiàn)出移植物的存活。接受細(xì)胞簇的5只小鼠中有I只在移植后12周具有可檢測(cè)的C-肽水平。移植物存活率低是由于預(yù)試驗(yàn)中細(xì)胞質(zhì)量減低以及移植的細(xì)胞數(shù)量少。人胚胎細(xì)胞通過(guò)幾個(gè)中間步驟(包括定形內(nèi)胚層(DE)、胰腺內(nèi)胚層(PE)和胰腺前體細(xì)胞)向成熟胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的多步驟分化與表面標(biāo)記物表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)。雖然分化方案可以產(chǎn)生多個(gè)譜系的仍不確定的異質(zhì)細(xì)胞群(包括外胚層和中胚層細(xì)胞類(lèi)型)，但跟蹤胰腺分化培養(yǎng)基中表面標(biāo)記物表達(dá)的變化可鑒定在細(xì)胞富集和純化中有潛在用處的標(biāo)記物。表VII示出了表面標(biāo)記物的匯總，這些標(biāo)記物表現(xiàn)出表達(dá)的增加或減少，并可用于胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的陰性或陽(yáng)性選擇。在分化過(guò)程期間表達(dá)減少的標(biāo)記物包括CD117、CD133、CD181、CD184、CD200、CD221、CD326、CD55、CD57、CD9 和 CD98。在分化過(guò)程期間表達(dá)增加的標(biāo)記物包括 CD13、CD141、CD15、CD318、CD46、CD47、CD49c、CD49e、CD56 和 CD73。這些標(biāo)記物可以單個(gè)地或以各種組合用于純化富集了胰腺內(nèi)胚層和前體細(xì)胞的細(xì)胞群。實(shí)例7流式細(xì)胞術(shù)分詵稈序不同成熟階段的細(xì)胞通過(guò)在TiypLE Express (加州英杰公司(Invitrogen, CA),#12604)中在37°C下溫育2-3分鐘進(jìn)行溫和解離，并且在包含2% BSA的BD FACS染色緩沖液(加州碧迪公司(BD, CA)，#554657)中洗滌兩次?；诩?xì)胞收率，將20-50 X IO6個(gè)單細(xì)胞重懸于2-3ml封閉緩沖液(以I : 4稀釋于染色緩沖液(加州碧迪公司(BD，CA))中的
0.5%人Y-球蛋白)中用于染色。將熒光團(tuán)綴合的一抗加入細(xì)胞中，最終稀釋率為I : 20，并將細(xì)胞在4°C下溫育30分鐘。洗滌后，將染色的細(xì)胞重懸于2-3ml染色緩沖液中，在分析和細(xì)胞分選前加入50-60 μ I的7AAD以區(qū)分活/死細(xì)胞。同種型匹配對(duì)照IgG抗體用于陰性對(duì)照染色。為了在分選前計(jì)算熒光團(tuán)補(bǔ)償值，將細(xì)胞保持未染色，或用異硫氰酸熒光素酯(FITC)、藻紅蛋白(PE)或別藻藍(lán)蛋白(APC)、核染料7-氨基放線菌素D(7-AAD)的單個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行染色。細(xì)胞分選使用BD FACSAria細(xì)胞分選儀和BD FACSDiva軟件進(jìn)行。同種型匹配對(duì)照細(xì)胞用于設(shè)定每個(gè)細(xì)胞分選的陰性門(mén)。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，使用適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)補(bǔ)償值調(diào)整光電倍增器(PMT)電壓設(shè)置，以產(chǎn)生明亮的細(xì)胞群(陽(yáng)性(+)或Hi)和暗淡的細(xì)胞群或細(xì)胞亞群(陰性(_)或Lo)。通常，陽(yáng)性細(xì)胞群(+或Hi)為4個(gè)數(shù)量級(jí)或更多(104)，而陰性細(xì)胞群為2-3個(gè)數(shù)量級(jí)(IO2-IO3)。使用設(shè)定的門(mén)，用100 μ M噴嘴和I. O的流速分選細(xì)胞。分選后，分析細(xì)胞的小等分試樣，以評(píng)估分選的細(xì)胞亞群的純度。使用Rneasy Mini Kit試劑盒(加州凱杰公司(Qiagen，CA))從分選前和分選后的細(xì)胞中收集RNA，用于RT-PCR分析。本文通篇中引用的出版物以引用方式全文并入。盡管上文已結(jié)合實(shí)例和優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍不受以上描述內(nèi)容的限定，而受以下在專(zhuān)利法原則下恰當(dāng)理解的權(quán)利要求書(shū)的限定。 表I.利用流式細(xì)胞術(shù)表征內(nèi)胚層/胰腺分化的不同階段的表面標(biāo)記物表達(dá)表解ND=不確定；+/_ = 0-10% ；+ = 10-50% ；++ = 50-85% ；+++ = 85-100%
權(quán)利要求
1.一種提高產(chǎn)胰島素細(xì)胞從表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的生成的方法，所述方法包括如下步驟 a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞群， b.使所述多能干細(xì)胞群分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群， c.使所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的所述細(xì)胞群分化為表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞， d.使所述表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群， e.使所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群，以及 f.將至少一些所述表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群被富集。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述表達(dá)原腸管特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群是通過(guò)將所述表達(dá)原腸管譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群與能夠結(jié)合所述Lif受體的試劑接觸來(lái)富集。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中使所述表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群與至少一種能夠結(jié)合選自如下的標(biāo)記物的試劑接觸⑶9、⑶13、⑶15、⑶47、⑶56、CD73、CD117、CD133、CD184、CD200、CD318、CD326 和 SSEA4。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供采用獨(dú)特的表面標(biāo)記物對(duì)被分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行表征的方法。本發(fā)明還提供對(duì)表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)行富集或分選的方法。本發(fā)明還提供對(duì)可能污染由本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行清除，從而降低移植后體內(nèi)腫瘤形成發(fā)生率的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102791851SQ201180011846
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者A.雷扎尼亞, F.卡拉努 申請(qǐng)人:詹森生物科技公司