專利名稱：L-蘇氨酸的分析方法和l-蘇氨酸脫氫酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及L-蘇氨酸的分析方法和可用于該分析方法中的L-蘇氨酸脫氫酶。
背景技術：
L-蘇氨酸是必需氨基酸，必須從食物中獲取。L-蘇氨酸對于保持體內(nèi)的氮平衡是必需的，并促進正常的生長發(fā)育。此外，它對于保持心血管、肝臟、中樞神經(jīng)、腸、免疫系統(tǒng)的功能也有作用。 由于缺乏維生素B12、II型瓜氨酸血癥、敗血癥、氨基酸或氮失衡，可導致血液中的蘇氨酸含量不足。此外，素食主義者由于食用缺少蘇氨酸含量的谷類，可以導致蘇氨酸不足。對于各種疾病或先天性代謝異常的診斷、患者的長期營養(yǎng)補充、氨基酸代謝異常疾病的相關研究等而言，L-蘇氨酸的定量是必須的。已報道過多種L-蘇氨酸的定量方法。通過四乙酸鉛使蘇氨酸變?yōu)橐胰?，用濃聚硫酸吸收，檢測乙醛與對羥基聯(lián)苯縮合的色素，來測量蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、明膠、血清中的蘇氨酸，可以通過HPLC、質(zhì)譜、氨基酸分析裝置等定量。這些方法存在操作危險，需要多個步驟，使用昂貴的儀器，不適合操作多個樣品的大規(guī)模篩選方法的問題。作為酶學手段，有使用蘇氨酸脫氨酶(EC 4.2. I. 16)的方法。報道了該酶將L-蘇氨酸分解為α-酮基丁酸和氨，所生成的α-酮基丁酸變成腙衍生物的方法(非專利文獻I)。一個例子是用過碘酸氧化大鼠血漿中的蘇氨酸，用醛脫氫酶(EC1. 2. I. 5)定量所生成的醛。通過添加D-半乳糖消耗多余的過碘酸(非專利文獻2)。通過醛脫氫酶的作用，乙醛還原NAD+，生成NADH+，進一步通過使用熒光色素的方法進行定量。現(xiàn)有技術文獻非專利文獻非專利文獻I :Watanabe K, Itoh N, Tanaka A, Fukui S. Application of animmobilized Escherichia coli cell tube in analysis of L-threonine. Agric. Biol.Chem. (1982) 46:119-126非專利文獻2:Nishida T，Kume S，Saito M，Suda M. A specific method for thedetermination of threonine in rat blood plasma using aldehyde dehydrogenase. JBiochem. (1977) 81:1085-1090上述非專利文獻I和2的全文記載經(jīng)特別明示援引到本文中
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題但是，在非專利文獻I記載的方法中，蘇氨酸脫氨酶不僅對L-蘇氨酸有活性，而且對L-絲氨酸、D-絲氨酸也有活性，因此該方法不適用于定量含有L-絲氨酸的樣品。此外，非專利文獻2記載的方法必需添加D-半乳糖消化多余的過碘酸，不是借助單一的酶的定量方法。因此，本發(fā)明的目的是提供可以借助單一的酶定量L-蘇氨酸的分析方法，提供可用于該分析方法的新型L-蘇氨酸脫氫酶(TDH ；EC I. I. I. 103)及用于制備該酶的基因等和酶的制備方法，此外，提供用于上述L-蘇氨酸分析的試劑盒、酶制品。尚未報道過使用TDH定量L-蘇氨酸。本發(fā)明人研究了適用于L-蘇氨酸的分析方法的新型TDH，結果發(fā)現(xiàn)了來自鉤蟲貪銅菌的新型TDH，并發(fā)現(xiàn)使用該TDH的L-蘇氨酸的酶 學定量方法是可能的，從而完成了本發(fā)明。為了解決課題的手段本發(fā)明如下。[I]、被分析物中包含的L-蘇氨酸的分析方法，其中，將含有被分析物的樣品與來源于鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)的L-蘇氨酸脫氫酶或者具有下述(I) - (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)以及輔酶NAD+混合，經(jīng)過預定的時間后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量，( I)序列表的序列號I記載的氨基酸序列；(2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加廣30個氨基酸而得到的氨基酸序列；(3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。[2]、[I]記載的分析方法，其中，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。[3]、[1]或[2]記載的分析方法，其中，所述NADH的量的分析是通過測定340nm處的吸光度(A340 )、色素生成、或變換為熒光來進行的。[4]、[I]或[2]記載的分析方法，其中，所述2-氨基-3-氧代丁酸的量的分析是通過將自2-氨基-3-氧代丁酸生成的氨基丙酮用單胺氧化酶氧化，并測定所產(chǎn)生的氨或過氧化氫來進行的。[5]、來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶。[6]、[5]記載的L-蘇氨酸脫氫酶，其中，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。[7]、具有下述(I)- (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)( I)序列表的序列號I記載的氨基酸序列；(2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加廣30個氨基酸而得到的氨基酸序列；(3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。[8]、來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶，其具有以下物理性質(zhì)和特性
分子量(SDS-PAGE):79400亞基分子量(SDS-PAGE):37200最適pH :10.0最適溫度75°C底物特異性僅對L-蘇氨酸脫氫酶顯示出活性輔酶NAD+ (對NADP+為非活性)抑制劑被碘乙酰胺、PMS、NEM抑制。[9]、編碼[7]記載的蛋白質(zhì)的基因。
[10]、重組載體，其是攜帶了 [7]記載的基因的載體。[11]、用[9]記載的基因或[10]記載的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化體。[12]、具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括在載體上攜帶記載的基因，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細胞后，培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞從而在培養(yǎng)物中積累由所述基因編碼的蛋白質(zhì)，收集所積累的蛋白質(zhì)。[13]、一種L-蘇氨酸分析用試劑盒，其包含下述的(A)或(B)(A)來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶或者具有下述(I) - (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，和(B)輔酶 NAD+;( I)序列表的序列號I記載的氨基酸序列；(2)序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f 30個氨基酸而得到的氨基酸序列；(3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。[14]、[13]記載的試劑盒，其中，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。[15]、[13]記載的試劑盒，其還包括用于分析NADH的量的色素和/或酶。[16]、L-蘇氨酸分析用酶制劑，其是通過使緩沖液中包含來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶或具有下述(I) - (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)而成的( I)序列表的序列號I記載的氨基酸序列；(2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f 30個氨基酸而得到的氨基酸序列；(3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。[17]、[16]記載的酶制劑，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC 102504。[18]、用于定量L-蘇氨酸的酶傳感器，其特征在于，在檢測用電極上直接或間接地固定或布置了來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶或具有下述(I)- (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)( I)序列表的序列號I記載的氨基酸序列；(2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加廣30個氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
_3] 發(fā)明的效果通過本發(fā)明，由TDH將樣品中的L-蘇氨酸脫氫，還原輔酶NAD+，定量生成NADH，通過直接或間接的定量NADH，可以定量樣品中的L-蘇氨酸濃度。通過本發(fā)明的方法，可以通過單個步驟進行分析。或者也可以在上述酶促反應中定量從L-蘇氨酸生成的2-氨基_3_氧代丁酸來定量L-蘇氨酸濃度。


圖I:圖I示出了來源于鉤蟲貪銅菌NBRC 102504的TDH的SDS-PAGE。泳道M，分子量標準s ;1，無細胞提取液；2，硫酸魚精蛋白；3，30-60%硫酸銨級分；4，DEAE-T0Y0PEARL ;5，丁基-T0Y0PEARL ;6，Gigapite ;7，Superdex_G200。
圖2 :圖2示出了 TDH的分子量確定結果。標準蛋白質(zhì)(·)，TDH (O)。圖3 :圖3示出了 TDH在不同pH下的活性。(Λ):乙酸鈉緩沖液(pH5. 0-6. O); (▲):磷酸鉀緩沖液(pH 6. 0-7. 5) ； (□) =HEPES 緩沖液(ρΗ7· 0-8. O) ； (B) =Tris-HCl 緩沖液(pH7. 5-9. O) ； (O) =Na2CO3-NaHCO3 緩沖液(pH 9. 0-11. 5) ； (·):甘氨酸-KC1-K0H 緩沖液(pH10. 0-12. O)。圖4 :圖4示出了在各種緩沖液中的TDH的pH穩(wěn)定性。(Λ):乙酸鈉緩沖液(pH4. 0-6. O) ;(▲):磷酸鉀緩沖液(pH 6. 0-7. 5) ； CD), Tri s-HCl 緩沖液(pH 7. 0-9.0)；(〇)，Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9. 0-11. O); (·)，甘氨酸-KC1-K0H緩沖液(pH 10.0-12.0)。圖5 :圖5示出了 pH對TDH活性的影響。圖6 :圖6示出了溫度對酶穩(wěn)定性的影響。圖7 :圖7示出了本發(fā)明的TDH對L-蘇氨酸的Lineweaver Burk作圖。圖8 :圖8不出了本發(fā)明的TDH對NAD+的Lineweaver Burk作圖。圖9 :圖9示出了本發(fā)明的TDH的基因序列和氨基酸序列。圖10 :圖10示出了從含有CnTDHpET15b質(zhì)粒的大腸桿菌純化的TDH-His的SDS-PAGE。泳道M :低分子量標記物；泳道I :大腸桿菌BL21 (DE3)的無細胞提取液；泳道
2:來自大腸桿菌BL21 (DE3)的CnTDH-His的無細胞提取液；泳道3 :純化的基因重組的TDH-His 酶。圖11 :圖11示出了使用TDH對L-蘇氨酸的酶定量的標準曲線。圖12 :圖12示出了人血液中的L-蘇氨酸濃度的測量結果。使用TDH的酶的微量滴定板測定(□)、通過UPLC的定量(_)。樣品A，人血清A ;B，人血清B ;C，人匯合血清；D，人血漿D ；E,人血漿E ；F,人匯合血漿。圖13 :圖13示出了向人血漿中添加已知量的TDH時，L-蘇氨酸酶的定量結果。發(fā)明的
具體實施例方式L-蘇氨酸脫氫酶L-蘇氨酸脫氫酶(TDH ；EC I. I. I. 103)是在微生物和動物中異化L-蘇氨酸的重要的關鍵酶(參考文獻1，2)。TDH催化L-蘇氨酸到2-氨基-3-氧代丁酸的氧化反應。2-氨基-3-氧代丁酸經(jīng)過非酶促的脫羧反應，分解為氨基丙酮和二氧化碳。再通過CoA-依賴性的2-氨基-3-氧代丁酸CoA裂合酶(EC2. 3. I. 29)的作用將氨基丙酮分解為甘氨酸和乙酰-CoA (參考文獻3)。化學式I
O,Q,
> OHV OH
HjM. (* NAD'———…·■ H1K—<* MADH * H·
)=tOH)=0
*氨基*|1丁_醆
I蘇氨醆
O
Η#* CO2
氟纂觸圖IL-蘇氨酸脫氫酶催化的反應在微生物中發(fā)現(xiàn)了來源于微生物的TDH (表I)。所述微生物是節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)、大腸桿菌(Escherichia coli) K12、卩遼纖維菌(Cytophaga sp.)KUC-1、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、Thermococcus kodakaraensis,和鏈霉菌 139 (參考文獻4-10)。后四種的TDH基因已經(jīng)克隆，解析了基因序列，并在大腸桿菌中表達了酶。大腸桿菌(E. coli)、堀越氏熱球菌和T. kodakaraensis的TDH需要NAD+和鋅作為輔酶，屬于含鋅的中鏈醇脫氫酶超家族(參考文獻8、11、12)。來源于噬纖維菌的TDH需要NAD+，其結構屬于與UDP-葡萄糖-4-差向異構酶相似的短鏈脫氫酶還原酶超家族。已知將來源于大腸桿菌的TDH中導入到異種宿主中，可有效的生產(chǎn)L-蘇氨酸。本發(fā)明人從鉤蟲貪銅菌發(fā)現(xiàn)了新的NAD+依賴性L-TDH(下文簡稱為CnTDH)。純化了均一狀態(tài)的該酶，明確了其各種酶化學性質(zhì)。該酶以NAD+為輔酶，催化L-蘇氨酸特異性的脫氫反應。該酶不需要金屬離子作為輔助因子。在克隆該酶的基因分析序列時，表現(xiàn)出與曬纖維菌KUC-1 (現(xiàn)在的Flavobacterium frigidimaris)的TDH基因僅有57%的同一性。與作為來源于好熱性細菌和E. coli的TDH報道的基因幾乎沒有同一性。該酶可以在大腸桿菌良好的表達。大量地表達了在N-末端添加了 His-tag的該酶，并進行了高效的純化。表I.來源于各種微生物的L-蘇氨酸脫氫酶及其用途
權利要求
1.被分析物中包含的L-蘇氨酸的分析方法，其中，將含有被分析物的樣品與來源于鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)的L-蘇氨酸脫氫酶或者具有下述(I) - (3)中的任ー氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)以及輔酶NAD+混合，經(jīng)過預定的時間后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量， (1)序列表的序列號I記載的氨基酸序列； (2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30個氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
2.權利要求I記載的分析方法，其中，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。
3.權利要求I或2記載的分析方法，其中，所述NADH的量的分析是通過測定340nm處的吸光度(A340 )、色素生成、或變換為熒光來進行的。
4.權利要求I或2記載的分析方法，其中，所述2-氨基-3-氧代丁酸的量的分析是通過將自2-氨基-3-氧代丁酸生成的氨基丙酮用單胺氧化酶氧化，并測定所產(chǎn)生的氨或過氧化氫來進行的。
5.來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶。
6.權利要求5記載的L-蘇氨酸脫氫酶，其中，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。
7.具有下述(I)- (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì) (1)序列表的序列號I記載的氨基酸序列； (2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30個氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
8.來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶，其具有以下物理性質(zhì)和特性 分子量(SDS-PAGE) 79400 亞基分子量(SDS-PAGE) 37200最適 pH 10. O 最適溫度75°C 底物特異性僅對L-蘇氨酸顯示出活性 輔酶NAD+ (對NADP+為非活性) 抑制劑被碘こ酰胺、PMS、NEM抑制。
9.編碼權利要求7記載的蛋白質(zhì)的基因。
10.重組載體，其是攜帶了權利要求6記載的基因的載體。
11.用權利要求9記載的基因或權利要求10記載的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
12.具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括在載體上攜帶權利要求 9記載的基因，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細胞后，培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞從而在培養(yǎng)物中積累由所述基因編碼的蛋白質(zhì)，收集所積累的蛋白質(zhì)。
13.—種L-蘇氨酸分析用試劑盒，其包含下述的(A)或(B) (A)來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶或者具有下述(I) - (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，和(B)輔酶 NAD+ ； (1)序列表的序列號I記載的氨基酸序列； (2)序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30個氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
14.權利要求13記載的試劑盒，其中，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。
15.權利要求14記載的試劑盒，其還包括用于分析NADH的量的色素和/或酶。
16.L-蘇氨酸分析用酶制劑，其是通過使緩沖液中包含來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶或具有下述(I)_ (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)而成的 (1)序列表的序列號I記載的氨基酸序列； (2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30個氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
17.權利要求16記載的酶制劑，所述鉤蟲貪銅菌是鉤蟲貪銅菌NBRC102504。
18.用于定量L-蘇氨酸的酶傳感器，其特征在于，在檢測用電極上直接或間接地固定或布置了來源于鉤蟲貪銅菌的L-蘇氨酸脫氫酶或具有下述(I)- (3)中的任一氨基酸序列且具有L-蘇氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì) (1)序列表的序列號I記載的氨基酸序列；(2)在序列表的序列號I記載的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30個氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相對于序列表的序列號I記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含在被分析物中的L-蘇氨酸的分析方法，將含有被分析物的樣品與來源于鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)的L-蘇氨酸脫氫酶以及輔酶NAD+混合，經(jīng)過預定的時間后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量；可用于該分析方法中的新型L-蘇氨酸脫氫酶(TDH；EC 1.1.1.103)——來源于鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)的L-蘇氨酸脫氫酶；用于制備該酶的基因等和酶的制備方法；還提供了包括(A)上述L-蘇氨酸脫氫酶和(B)輔酶NAD+的用于分析L-蘇氨酸脫氫酶的試劑盒，其是在緩沖液中含有上述L-蘇氨酸脫氫酶且用于分析L-蘇氨酸脫氫酶的酶制品；使用上述L-蘇氨酸脫氫酶的酶傳感器。
文檔編號C12N5/10GK102834516SQ20118001237
公開日2012年12月19日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權日2010年3月4日
發(fā)明者淺野泰久, T.尤特農(nóng)奇特 申請人:富山縣, 味之素株式會社