專利名稱：檢測(cè)胞內(nèi)病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及研究生物樣品中的胞內(nèi)病原體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及研究含超過一種胞內(nèi)病原體的生物樣品的方法，和在第二胞內(nèi)病原體存在下觀察或檢測(cè)第一胞內(nèi)病原體存在的方法。
背景技術(shù)：
可能有興趣研究同一生物樣品中，例如從病人或從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的樣品中的兩種不同胞內(nèi)病原體，或在其他胞內(nèi)病原體存在下觀察一種胞內(nèi)病原體。然而 ，一種此類病原體的存在常常干擾其他病原體的觀察。例如，當(dāng)在導(dǎo)致一般表型結(jié)果的試驗(yàn)(“表型試驗(yàn)”)中研究胞內(nèi)病原體的效應(yīng)時(shí)，觀察值不一定是特定病原體特異性的。例如在病毒學(xué)上，如果還存在能引起同類噬斑的其他病原體，則在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的曬斑不一定能歸因于給定的病毒。然而，常常需要應(yīng)用一般表型試驗(yàn)。觀察病原體的其他更特異的方法有不同的缺點(diǎn)。其他更特異方法的進(jìn)行不夠簡(jiǎn)易或快速。這樣的其他方法可能還需要特異性試劑，造成更多限制。例如，免疫學(xué)試驗(yàn)需要能購(gòu)得的抗體。當(dāng)抗體對(duì)可能存在于該樣品中的多個(gè)病原體有交叉反應(yīng)性時(shí)，免疫學(xué)方法的實(shí)用性可能進(jìn)一步受限。對(duì)于某些診斷目的，抗體對(duì)相關(guān)病原體的廣譜交叉反應(yīng)性可以是需要的。另一方面，這樣的交叉反應(yīng)性可能造成無法通過免疫學(xué)方法獨(dú)立研究相關(guān)且共存的病原體?；赑CR的病原體檢測(cè)可以是更特異的。然而，對(duì)于每一感興趣的病原體，基于PCR的方法需要已知其基因組序列。必須對(duì)于每一感興趣的病原體設(shè)計(jì)且優(yōu)化引物。特異性抗體或引物的需求限制了免疫學(xué)方法和基于PCR的方法兩者的靈活性，特別是這些方法在未知病原體性質(zhì)時(shí)用于觀察該病原體的實(shí)用性。這些特異性方法的實(shí)用性在病原體快速進(jìn)化(如某些病毒)的情況下可能更加受限，這是因?yàn)橥蛔兛砂l(fā)生在抗體所識(shí)別的表位或PCR弓丨物所識(shí)別的序列中。本發(fā)明旨在提供另外的且改進(jìn)的方法，用以獨(dú)立于其他胞內(nèi)病原體地研究生物樣品中感興趣的胞內(nèi)病原體。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了檢測(cè)生物樣品中的第一胞內(nèi)病原體的方法，包括以下步驟(i)使樣品在抑制性試劑存在下接觸細(xì)胞群樣品，其中所述試劑抑制第二胞內(nèi)病原體增殖；(ii)在允許所述第一胞內(nèi)病原體增殖的條件孵育所述細(xì)胞；和(iii)檢測(cè)步驟(ii)中所產(chǎn)生物質(zhì)中的所述第一胞內(nèi)病原體。根據(jù)本發(fā)明的方法，可快速檢測(cè)生物樣品。本發(fā)明允許以簡(jiǎn)單、直接的方式，例如，通過一般表型試驗(yàn)，檢測(cè)生物樣品中的胞內(nèi)病原體。優(yōu)選方法允許獨(dú)立于該樣品中(確實(shí)或疑似)存在的另一胞內(nèi)病原體來研究感興趣的胞內(nèi)病原體，所述另一病原體將在此類試驗(yàn)中導(dǎo)致相同的、等效的或相似的結(jié)果。
本發(fā)明也允許在以下情形中檢測(cè)生物樣品中的胞內(nèi)病原體-其中一種或多種胞內(nèi)病原體(例如上述和權(quán)力要求所定義方法中所述第一胞內(nèi)病原體)在該樣品中的存在是未知的，和/或-其中該樣品中的一種或多種胞內(nèi)病原體(例如上述和權(quán)力要求所定義方法中所述第一胞內(nèi)病原體)的基因組序列是未知的，和/或-其中該樣品中的一種或多種胞內(nèi)病原體(例如上述和權(quán)力要求所定義方法中所述第一或第二胞內(nèi)病原體)的抗體不能獲得，和/或-第二胞內(nèi)病原體的抗體不被應(yīng)用，-其中該樣品中的兩種或更多種胞內(nèi)病原體的抗體是交叉反應(yīng)性的，和/或
-需要快速獲得檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的方法包括在12個(gè)月內(nèi)，例如9個(gè)月、8個(gè)月、7個(gè)月、6個(gè)月、5個(gè)月、4個(gè)月、3個(gè)月、2個(gè)月、I個(gè)月、4周、3周、2周、I周、6天、5天、4天、3天、2天、I天內(nèi)或立即獲得步驟(iii)所述檢測(cè)結(jié)果的實(shí)施方式。本發(fā)明方法的胞內(nèi)病原體本發(fā)明方法的第一和第二胞內(nèi)病原體可包括一種或多種胞內(nèi)病原體，其選自原核生物(即某細(xì)菌/某些細(xì)菌)、真核生物(包括某原蟲/某些原蟲或某真菌/某些真菌)和/或某病毒/某些病毒。所述第一胞內(nèi)病原體不同于第二胞內(nèi)病原體。第一和第二胞內(nèi)病原體可在使得它們能受差別抑制的任意方面有不同。例如，它們可在目、科、屬、種、亞種和/或株上不同。所述第一胞內(nèi)病原體可以是原核生物、真核生物和/或病毒。優(yōu)選所述第一胞內(nèi)病原體是病毒。所述第二胞內(nèi)病原體可以是原核生物、真核生物和/或病毒。優(yōu)選所述第二胞內(nèi)病原體是病毒。本發(fā)明包括各類試驗(yàn)，例如，在一種實(shí)施方式中，第一胞內(nèi)病原體包括原核生物(例如一種或多種下列優(yōu)選的原核生物)，真核生物(例如一種或多種下列優(yōu)選的真核生物)和/或病毒(例如一種或多種下列優(yōu)選的病毒)，且第二胞內(nèi)病原體包括原核生物(例如一種或多種下列優(yōu)選的原核生物)。在另一實(shí)施方式中，第一胞內(nèi)病原體包括原核生物(例如一種或多種下列原核生物)、真核生物(例如一種或多種下列真核生物)和/或病毒(例如一種或多種下列病毒)，且第二胞內(nèi)病原體包括真核生物(例如一種或多種下列優(yōu)選的真核生物)。在另一實(shí)施方式中，第一胞內(nèi)病原體包括原核生物(例如一種或多種下列原核生物)、真核生物(例如一種或多種下列真核生物)和/或病毒(例如一種或多種下列優(yōu)選的病毒，例如副流感病毒和/或例如流感病毒、鼻病毒、輪狀病毒、腸道病毒、人免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒和/或諾羅病毒(norovirus)),且第二胞內(nèi)病原體包括病毒(例如一種或多種下列優(yōu)選的病毒，例如流感病毒，和/或例如鼻病毒、輪狀病毒、腸道病毒、人免疫缺陷病毒或猴免疫缺陷病毒、和/或諾羅病毒，和/或例如副流感病毒)。根據(jù)本發(fā)明，原核生物可包括選自下組的胞內(nèi)病原體其巴爾通體屬(Bartonella)、博德特菌屬(Bordetella)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、衣原體目(Chlamydiales)、衣原體科(Chlamidiacae)、衣原體屬(Chlamydiae)、嗜衣原體屬(Chlamydophila)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、李斯特氏菌屬(Listeria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、立克次體科(Rickettsiae)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)。具體地，原核生物可包括選自下組的胞內(nèi)病原體格雷厄姆氏巴爾通氏體(Bartonella grahamii)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、布魯菌屬某些種(Brucella spp.)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae)、獸類嗜衣原體(Chlamydophila pecorum)、嬰I 鶴熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci)、流產(chǎn)嗜衣原體(Chlamydophila abortus)、貓嗜衣原體(Chlamydophila felis)、豚鼠嗜衣原體(Chlamydophila caviae)、恰菲埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、立克次體屬(Rickettsiae)、鼠傷寒血清型腸道沙門氏 菌(Salmonellaenterica Serovar Typhimurium)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。根據(jù)本發(fā)明，真核生物可包括選自下組的胞內(nèi)病原體巴倍蟲屬(Babesia)、隱球菌屬(Cryptococcus)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、艾美耳球蟲屬(Eimeria)、組織胞衆(zhòng)菌屬(Histoplasma)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、癥原蟲屬(Plasmodium)、泰勒蟲屬(Theileria)、弓形蟲屬(Toxoplasma)、維蟲屬(Trypanosoma)。具體地，真核生物可包括巴倍蟲屬某些種、新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)、微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、艾美耳球蟲屬某些種、莢膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasma capsulatum)、墨西哥利什曼原蟲(Leishmania mexicana)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、伯氏癥原蟲(Plasmodium berghei)、約氏癥原蟲(Plasmodium yoelii)、泰勒蟲屬某些種、弓形蟲(Toxoplasma gondii)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)。根據(jù)本發(fā)明，病毒可包括-肺病毒亞科(Pneumovirinae)，如肺病毒屬(Pneumovirusgenus)，包括呼吸道合胞病毒(RSV)；-副黏病毒(Paramyxoviridae)科的麻疫病毒屬(Morbillivirus)，如麻疫病毒；-微小核糖核酸病毒(Picornaviridae)科的腸道病毒屬(Enterovirus)，如柯薩奇病毒(Coxsackie virus)、?？刹《?echovirus)和腸道病毒(enterovirus)；-哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒科(Reoviridae)，具體地，正呼腸孤病毒(orthoreovirus)(例如哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒)和/或輪狀病毒；-禽呼腸孤病毒科，具體地，正呼腸孤病毒，如禽呼腸孤病毒；-副黏病毒(Paramyxoviridae)科的間質(zhì)肺炎病毒屬(Metapneumovirus)，如人間質(zhì)肺炎病毒(HMPV)；
-副黏病毒(Paramyxoviridae)科的德國(guó)麻疫病毒屬(Rubulavirus),如腿腺炎病毒；-披衣病毒科(Togaviridae),如風(fēng)疫病毒屬(Rubellavirus)；-冠狀病毒科(Coronaviridae),人冠狀病毒,如SARS冠狀病毒；-微小核糖核酸病毒(Picornaviridae)科的鼻病毒屬(Rhinovirus)；-鼻病毒的M株；-水痘帶狀皰疫病毒(VaricellaZoster virus, VZV),也稱作人皰疫病毒3(HHV3);-多瘤病毒科(Polyomaviridae)，如SV-40多瘤病毒、BK多瘤病毒、JC多瘤病毒； -豬圓環(huán)病毒(circovirus)；-豬微小核糖核酸病毒(picornavirus)；-豬水皰病病毒(swinevesicular disease virus, SVDV)；-捷申-塔凡病毒(Teschen-Talfanvirus)；-細(xì)小病毒屬(Parvoviruse),如犬細(xì)小病毒(CPV),或豬細(xì)小病毒,或博卡病毒屬(Bocavirus)，例如人博卡病毒；-正黏病毒科(Orthomyxoviridae),具體地,流感病毒,例如甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒；-副流感病毒(Parainfluenzavirus, PIV)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(paramyxovirinae)、1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒、5型副流感病毒；-抱疫病毒科(Herpesviridae)，單純抱疫病毒I和2;-腺病毒科(Adenoviridae),如腺病毒,包括人和猴腺病毒；-禽圓環(huán)病毒；-免疫缺陷病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)或猴免疫缺陷病毒(SIV)；-諾羅病毒屬；和/或-雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae),如傳染性腔上囊病病毒(也稱甘保羅病毒(gumboro virus))。因而，第一和/或第二所述第一胞內(nèi)病原體可包括選自下組的一種或多種胞內(nèi)病原體巴爾通體屬、博德特菌屬、布魯氏桿菌屬、衣原體目、埃里希氏體屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、李斯特氏菌屬、分枝桿菌屬、分枝桿菌屬、立克次體科、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、鏈球菌屬、耶爾森氏菌屬、巴倍蟲屬、隱球菌屬、隱孢子蟲屬、艾美耳球蟲屬、組織胞漿菌屬、利什曼原蟲屬、瘧原蟲屬、泰勒蟲屬、弓形蟲屬、錐蟲屬、肺病毒亞科、肺病毒屬、呼吸道合胞病毒(RSV)、副黏病毒科的麻疹病毒屬、麻疹病毒、微小核糖核酸病毒科的腸道病毒屬、柯薩奇病毒、?？刹《竞湍c道病毒、哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒科、禽呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒、輪狀病毒、副黏病毒科的間質(zhì)肺炎病毒屬、人間質(zhì)肺炎病毒(HMPV)、副黏病毒科的德國(guó)麻疫病毒屬、腿腺炎病毒、披衣病毒科、風(fēng)疫病毒屬、冠狀病毒科、人冠狀病毒、SARS冠狀病毒、微小核糖核酸病毒科的鼻病毒屬、鼻病毒的M株、水痘帶狀皰疫病毒(VZV)、人皰疫病毒3 (HHV3)、多瘤病毒科、SV-40多瘤病毒、BK多瘤病毒、JC多瘤病毒、豬圓環(huán)病毒、豬微小核糖核酸病毒、豬水皰病病毒(SVDV)、捷申-塔凡病毒、細(xì)小病毒屬、犬細(xì)小病毒(CPV)、豬細(xì)小病毒、正黏病毒科，具體地，流感病毒(例如甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒)、副流感病毒(PIV)、副黏病毒科副黏病毒亞科、I型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒、5型副流感病毒、皰疹病毒科、單純皰疹病毒I和2、腺病毒科、腺病毒、人和猴腺病毒、禽圓環(huán)病毒、人免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、諾羅病毒、雙核糖核酸病毒科，如傳染性腔上囊病病毒(也稱甘保羅病毒)。例如，第二胞內(nèi)病原體可包括或優(yōu)選為冠狀病毒(例如SARS冠狀病毒)、腸道病毒、輪狀病毒、鼻病毒、人免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、或諾羅病毒。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第二胞內(nèi)病原體可為，例如 ，流感病毒(例如甲型流感病毒或乙型流感病毒)。該方法不限于病毒的任意具體類型或毒株。例如，如果第二胞內(nèi)病原體為流感病毒或其毒株，該病毒可為甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。在本發(fā)明中，優(yōu)選的甲型流感病毒毒株包括HlNl (例如人和/或豬H1N1)、H1N2 (例如人和/或豬H1N2)、H2N2、H2N3、H3N1、H3N2 (例如人和 / 或豬 H3N2)、H5N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7 亞型的毒株。本發(fā)明方法中的病毒也可為大流行毒株(即對(duì)疫苗受體和一般人群是免疫空白的毒株)，如111(例如!1謂1)、!12、冊(cè)、!17或!19亞型的毒株(特別是甲型流感病毒)。因而，本發(fā)明方法中，甲型流感病毒可具有HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本發(fā)明可用于具有NA亞型NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的甲型流感病毒。該病毒，例如甲型流感病毒，可包括來自A/PR/8/34病毒的一個(gè)或多個(gè)RNA片段(通常來自A/PR/8/34的6個(gè)片段，帶有來自疫苗株的HA和N片段，即6:2重配株)。它還可包括來自A/WSN/33病毒或來自任意其他病毒株的一個(gè)或多個(gè)有助于為疫苗制備產(chǎn)生重配病毒的RNA片段。通常，該病毒可以是能人對(duì)人傳播的毒株，所以該毒株的基因組通常包括至少一個(gè)源于哺乳動(dòng)物(例如于人或豬)流感病毒的RNA片段。它可包括源于禽、人或豬流感病毒的NS片段。該病毒可以是減毒的。該病毒可以是溫度敏感的。該病毒可以是冷適應(yīng)的。該病毒可以是重配株，且可通過反向遺傳技術(shù)獲得(例如1-5)。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)是否存在第一胞內(nèi)病原體。就是說，待檢測(cè)生物樣品中是否存在第一胞內(nèi)病原體可以是未知的。第一胞內(nèi)病原體可存在于該生物樣品中。第一胞內(nèi)病原體同樣可不存在于該生物樣品中。第二胞內(nèi)病原體可存在或可不存在于該生物樣品。優(yōu)選地，已知第二胞內(nèi)病原體存在于該生物樣品中?；蛘?，待檢測(cè)生物樣品中是否存在第二胞內(nèi)病原體可以是未知的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第二胞內(nèi)病原體是病毒，且所述生物樣品中是否存在所述第一胞內(nèi)病原體是未知的，即本發(fā)明的方法用于在病毒存在下，檢測(cè)是否存在所述第一胞內(nèi)病原體。本發(fā)明方法的生物樣品也可包括第三、第四、第五或其它的胞內(nèi)病原體，或就此進(jìn)行檢測(cè)。任意這樣的第三或其它的胞內(nèi)病原體可以是以上就第一或第二胞內(nèi)病原體所述的那些。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該生物樣品中是否存在第三、第四、第五或另外的胞內(nèi)病原體是未知的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法用于檢測(cè)是否存在多種胞內(nèi)病原體，例如檢測(cè)第三、第四、第五或其它胞內(nèi)病原體。生物樣品
本發(fā)明能用于各種不同生物樣品。該樣品可含有，例如，作為第一和/或第二胞內(nèi)病原體的感興趣病毒。當(dāng)該樣品也含有第二胞內(nèi)病毒體(例如第二病毒)時(shí)，可檢測(cè)這樣的樣品以鑒定第一胞內(nèi)病原體(例如第一病毒)的可能存在。用本發(fā)明檢測(cè)的典型樣品包括，但不限于■實(shí)驗(yàn)室樣品?！霾勺圆∪死缱猿尸F(xiàn)感染癥狀的病人的臨床樣品，從那些人上采集呼吸道拭子以檢查可能的新病原體，例如新病毒株。該病原體可以是，例如，以上列出的任意病毒，例如腸道病毒、冠狀病毒、皰疫病毒或流感病毒?！霾《径痉N，包括母種和工作種。在它們構(gòu)成病毒生長(zhǎng)基礎(chǔ)的生物制品生產(chǎn)期間，使用并檢測(cè)這樣的毒種批次。所述病毒可以是以上列出的任意病毒，例如，腸道病毒、冠狀病毒、皰癥病毒或流感病毒。 因此，所述第二胞內(nèi)病原體的存在可以是需要的，而所述第一胞內(nèi)病原體(例如病毒)的存在是不需要的。本發(fā)明的方法可以是檢測(cè)以確認(rèn)不存在所述第一胞內(nèi)病原體。同樣地，可以已知存在所述第二病原體(例如病毒)，而所述第一胞內(nèi)病原體的存在是不需要和/或不知道的。優(yōu)選地，該樣品僅用于篩查或檢測(cè)目的，而不是用于在從所述樣品進(jìn)行制造流程內(nèi)的檢測(cè)。該方法可方便與其他已知檢測(cè)方法聯(lián)合使用。該生物樣品也可以是，或可源于含胚卵，例如含胚雞卵，包括尿囊腔，或者雞胚。該生物樣品也可以是，或獲源自，細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，例如生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或非生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。這樣的培養(yǎng)物可以是哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物來源的適當(dāng)細(xì)胞包括，但不限于，倉(cāng)鼠、牛、靈長(zhǎng)類(包括人和猴)和狗的細(xì)胞?？墒褂酶鞣N細(xì)胞類型，如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞等等。適當(dāng)倉(cāng)鼠細(xì)胞的實(shí)例是名為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。適當(dāng)?shù)暮锛?xì)胞是例如非洲綠猴細(xì)胞的腎細(xì)胞，如VeiO細(xì)胞系。適當(dāng)?shù)墓芳?xì)胞是腎細(xì)胞，例如MDCK細(xì)胞系。因而適當(dāng)?shù)募?xì)胞系包括，但不限于MDCK ;CHO ；293T ；BHK ；Vero ;MRC_5 ；PER. C6 ；WI-38 等等。優(yōu)選地,所述生物樣品包括或源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括源于Madin Darby狗腎的MDCK細(xì)胞[6_9];源自非洲綠猴(綠長(zhǎng)尾猴(Cercopithecus aethiops))腎的Vero細(xì)胞[10-12];或源自人胚胎成視網(wǎng)膜細(xì)胞的PER. C6細(xì)胞。這些細(xì)胞系廣泛可得，例如獲自美國(guó)典型細(xì)胞培養(yǎng)物(ATCC)收藏庫(kù)[14]，自Coriell細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)[15]，或自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏庫(kù)(ECACC)。例如，ATCC以目錄號(hào)CCL-81、CCL 81. 2,CRL 1586和CRL-1587供應(yīng)各種不同的Vero細(xì)胞，并以目錄號(hào)CCL 34供應(yīng)MDCK細(xì)胞。PER. C6可從ECACC以儲(chǔ)存號(hào)96022940獲得。原始MDCK細(xì)胞系是從ATCC獲得(CCL-34)，但也可用該細(xì)胞系的衍生物。例如，參考文獻(xiàn)6公開了適于在懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞系(“MDCK33016”，保藏號(hào)DSM ACC2219)。類似地，參考文獻(xiàn)16公開了懸浮生長(zhǎng)于無血清培養(yǎng)物的MDCK衍生細(xì)胞系(“B-702”，保藏號(hào)FERM BP-7449)。參考文獻(xiàn)17公開了非致瘤性的MDCK細(xì)胞，包括“MDCK-S” (ATCCPTA-6500)、“MDCK-SF101” (ATCC PTA-650I)、“MDCK-SD102” (ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103” (PTA-6503)。參考文獻(xiàn)18公開了對(duì)感染具有高敏感性的MDCK細(xì)胞系，包括“MDCK. 5F1”細(xì)胞(ATCC CRL-12042)?？墒褂眠@些MDCK細(xì)胞系的任意一種。
該樣品也可是，或獲自，禽細(xì)胞系[例如參考文獻(xiàn)19-21],包括禽胚胎干細(xì)胞[19、22]和源自鴨(例如鴨視網(wǎng)膜)或自母雞的細(xì)胞系。適當(dāng)?shù)那菖咛ジ杉?xì)胞，包括源自雞胚干細(xì)胞的Ebx細(xì)胞系、EB45、EB14和EB14-074[23]。也可用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)等等。細(xì)胞群本發(fā)明方法中，待檢測(cè)的生物樣品在體內(nèi)或體外接觸細(xì)胞群。該細(xì)胞群可以是生物體，或可包括于生物體中，所述生物體包括胚胎，例如哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔、雞或非人靈長(zhǎng)類。該細(xì)胞群也可以是培養(yǎng)物中的細(xì)胞。優(yōu)選該細(xì)胞群是細(xì)胞培養(yǎng)物(培養(yǎng)的細(xì)胞)。該細(xì)胞群也可以是，例如含胚卵，例如含胚雞卵，包括尿囊腔，或者雞胚。通常，該細(xì)胞群可以是上文就生物樣品所述的那些。因此，細(xì)胞群，或培養(yǎng)的細(xì)胞，可以是哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系。優(yōu)選所述細(xì)胞群包括或源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，生物樣品和細(xì)胞群兩者都包括，或源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
哺乳動(dòng)物來源的適當(dāng)細(xì)胞是上文就生物樣品所述的那些。這些包括MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞或PER. C6細(xì)胞。任意一種上述的與生物樣品有關(guān)的細(xì)胞系，例如任意一種上述的MDCK細(xì)胞系，都能用作細(xì)胞群。也可用上文就生物樣品所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的替代物，例如本發(fā)明方法的細(xì)胞群可以是禽細(xì)胞系。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群表達(dá)寡核苷酸或多肽，其為本發(fā)明方法的抑制性試劑。所述寡核苷酸可以是下文詳述的寡聚體化合物。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染和/或工程改造所述細(xì)胞群中的細(xì)胞以表達(dá)該抑制性試劑?？梢詮谋磉_(dá)載體來表達(dá)該抑制性試劑。本領(lǐng)域熟知在細(xì)胞中，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，表達(dá)序列的載體和方法?？梢运矔r(shí)表達(dá)該抑制性試劑。更優(yōu)選在細(xì)胞群中穩(wěn)定表達(dá)該抑制性試劑。就是說，能表達(dá)抑制性試劑的核苷酸序列如DNA序列，可以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞群中，即抑制性試劑在細(xì)胞群中的表達(dá)可以通過表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)。然而，更優(yōu)選的是，能表達(dá)抑制性試劑的核苷酸序列如DNA序列，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至細(xì)胞群中，即抑制性試劑在細(xì)胞群中的表達(dá)可以通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)，即抑制性試劑的表達(dá)是來自穩(wěn)定整合至所述細(xì)胞群的細(xì)胞基因組內(nèi)的和/或在細(xì)胞群內(nèi)穩(wěn)定增殖的編碼序列。如果生物樣品含有細(xì)胞，那么該生物樣品自身可作為細(xì)胞群。在這種情況下，本發(fā)明方法的步驟(i)將涉及用抑制性試劑接觸該生物樣品，或該生物樣品自身可如上所述表達(dá)抑制性試劑。孵育本發(fā)明涉及在允許第一胞內(nèi)病原體繁殖的條件下孵育細(xì)胞(即本發(fā)明方法的細(xì)胞群和/或生物樣品)。所述條件也可允許細(xì)胞群內(nèi)的細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、繁殖和/或分化。孵育可以在體內(nèi)或體外。第一胞內(nèi)病原體繁殖和/或允許細(xì)胞群存活、生長(zhǎng)、繁殖和/或分化的具體條件將根據(jù)正常實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而有不同。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述條件可以是以生物體作為第一胞內(nèi)病原體的孵育器的條件。當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞群為細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，本發(fā)明方法的孵育步驟優(yōu)選涉及在允許細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、繁殖和/或分化的條件下孵育(即培養(yǎng))細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的正常條件下，該細(xì)胞將能支持一種或多種上述胞內(nèi)病原體(在沒有抑制性試劑來特異性針對(duì)被允許繁殖的胞內(nèi)病原體的條件下)的繁殖。因而，進(jìn)一步培養(yǎng)該細(xì)胞的步驟允許病原體在培養(yǎng)物中繁殖。隨后可以觀察由此允許繁殖的病原體或它們?cè)谂囵B(yǎng)物中產(chǎn)生的效應(yīng)(例如對(duì)細(xì)胞群的表型影響)。根據(jù)本發(fā)明的方法，這些第一病原體的觀察可優(yōu)先于第二病原體，后者也存在于樣品中但其繁殖通過特異性針對(duì)第二病原體的抑制性試劑而被抑制。一般而言，本領(lǐng)域熟知允許病原體繁殖和/或適當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件。在從商業(yè)供應(yīng)商獲取時(shí)，允許適當(dāng)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、繁殖和/或分化的條件通常與細(xì)胞一起提供。取決于細(xì)胞類型和所需試驗(yàn)，細(xì)胞可以在懸浮、貼壁培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)中生長(zhǎng)。因而，用于本發(fā)明的細(xì)胞可適于懸浮生長(zhǎng)。一種適于懸浮培養(yǎng)方式生長(zhǎng)的適當(dāng)?shù)腗DCK細(xì)胞系是 MDCK 33016(保藏號(hào) DSM ACC 2219)。除了在血清存在下生長(zhǎng)外，細(xì)胞系可在無血清培養(yǎng)基和/或無蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在本發(fā)明中，沒有來自人源或動(dòng)物源血清的添加劑時(shí)培養(yǎng)基稱作無血清培養(yǎng)基。無蛋白 是指細(xì)胞的倍增發(fā)生在無蛋白、生長(zhǎng)因子、其他蛋白添加劑和非血清蛋白的條件下的培養(yǎng)，但可選擇包括對(duì)于支持某些病原體(即本發(fā)明的方法的第一胞內(nèi)病原體)復(fù)制可能必須的蛋白質(zhì)例如胰蛋白酶或其他蛋白酶的。生長(zhǎng)在這樣的培養(yǎng)物中的細(xì)胞自然含有它們自身的蛋白。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞群可以是在低于37° C(例如30-36° C)下孵育。觀察、檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明，對(duì)在允許細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下細(xì)胞的孵育中產(chǎn)生的物質(zhì)就第一胞內(nèi)病原體進(jìn)行檢測(cè)。通常，可對(duì)細(xì)胞自身、含細(xì)胞的培養(yǎng)液或無細(xì)胞培養(yǎng)液(例如培養(yǎng)物上清)進(jìn)行檢測(cè)。這樣的檢測(cè)包括體外和體內(nèi)檢測(cè)。例如，可進(jìn)行的一種或多種以下檢測(cè)■顯微鏡檢，包括透射電子顯微鏡檢?！鼋M織學(xué)檢測(cè)，例如細(xì)胞染色，例如組化、免疫或免疫化學(xué)染色。■逆轉(zhuǎn)錄病毒的生化檢測(cè)，如RT試驗(yàn)?！霾煌?xì)胞類型的感染性的檢測(cè)，例如檢測(cè)細(xì)胞病變效應(yīng)。■分子遺傳學(xué)檢測(cè)，如PCR?！鰟?dòng)物接種檢測(cè)，例如接種至成年小鼠、乳鼠、豚鼠、兔?！龊呗训母腥尽z測(cè)可以針對(duì)表型效應(yīng)，例如細(xì)胞病變效應(yīng)，例如細(xì)胞培養(yǎng)物中的噬斑、細(xì)胞死亡、凋亡。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，檢測(cè)可用于鑒定炎癥或任意表型或生物指示物、調(diào)節(jié)物或炎癥相關(guān)分子。通常，任何可觀察的效應(yīng)都可以是適當(dāng)?shù)?。陽性檢測(cè)結(jié)果，例如表型或細(xì)胞病變效應(yīng)的存在，可表明該生物樣品中存在第一胞內(nèi)病原體(即除第二胞內(nèi)病原體外的胞內(nèi)病原體，第二胞內(nèi)病原體由于抑制性試劑的存在而不能繁殖)于。沒有可歸因于病原體的效應(yīng)表示無第一病原體，即沒有在所施用的條件下，于繁殖時(shí)會(huì)在細(xì)胞群中導(dǎo)致可觀察效應(yīng)的胞內(nèi)病原體。一般地，本發(fā)明將伴有一種或多種對(duì)照培養(yǎng)物。例如，在一種陽性對(duì)照形式中，在無抑制性試劑和/或在已知病原體存在下，培養(yǎng)該樣品和細(xì)胞。在陰性對(duì)照的實(shí)例中，可在沒有一種或多種病原體例如第二胞內(nèi)病原體和/或第一胞內(nèi)病原體的條件下，和/或在沒有生物樣品或沒有樣品和抑制性兩者的條件下，培養(yǎng)該細(xì)胞。這樣的對(duì)照使得易于比較。抑制性試劑根據(jù)本發(fā)明，為了檢測(cè)第一胞內(nèi)病原體，在一種或多種抑制第二胞內(nèi)病原體的存活和/或繁殖的試劑存在下孵育細(xì)胞。如果所述抑制性試劑不存在，該第二胞內(nèi)病原體將在細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)致表型效應(yīng)，且所述第一和第二胞內(nèi)病原體可能不易區(qū)分。抑制性試劑的功能是抑制第二胞內(nèi)病原體在培養(yǎng)條件下的繁殖，從而允許第一胞內(nèi)病原體優(yōu)先于第二胞內(nèi)病原體繁殖。因而，根據(jù)本發(fā)明，胞內(nèi)病原體更易于區(qū)分，并且感興趣的胞內(nèi)病原體(如權(quán)利要求所述的第一胞內(nèi)病原體或另外的例如第三胞內(nèi)病原體)更易于觀察。優(yōu)選該抑制性試劑不阻止細(xì)胞群的存活、生長(zhǎng)、繁殖和/或分化?？扇菰S對(duì)細(xì)胞輕微的負(fù)面影響，但在本發(fā)明的方法中，在抑制性試劑存在的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、繁殖和/或分化仍能發(fā)生。
該抑制性試劑也不阻止該方法旨在檢測(cè)的病原體(例如權(quán)利要求所述的第一胞內(nèi)病原體，或在本文中稱為第三、第四、第五或其它的胞內(nèi)病原體的一種或多種其它胞內(nèi)病原體)的存活、倍增和/或繁殖。再次，可容許輕微的負(fù)面影響，但該方法旨在允許第一胞內(nèi)病原體(若存在于樣品中)的繁殖和檢測(cè)。在本發(fā)明的方法中，抑制性試劑對(duì)第二胞內(nèi)病原體的存活和/或繁殖的抑制程度強(qiáng)于對(duì)第一和/或其它胞內(nèi)病原體的存活和/或繁殖的抑制。就是說，該抑制性試劑特異性地、選擇性地或優(yōu)先地抑制第二胞內(nèi)病原體。優(yōu)選所述抑制性試劑不抑制或不顯著抑制第一(和/或其它的)胞內(nèi)病原體的存活、倍增和/或繁殖。最優(yōu)選該抑制性試劑完全抑制第二胞內(nèi)病原體的存活和/或繁殖。因而可在研究不同病原體時(shí)使用不同的抑制性試劑。某抑制性試劑可能抑制或優(yōu)先抑制特定的病原體，但對(duì)另外的某種或某些病原體，沒有影響，或影響小得多。在這種情況中，該抑制性試劑在本發(fā)明方法對(duì)第一胞內(nèi)病原體的存在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)適用于本發(fā)明，但因?yàn)樵撛噭┮种频诙麅?nèi)病原體的繁殖，該試劑在探索所述第二病原體時(shí)，將不再適用。根據(jù)之前的段落，本發(fā)明還包括有第二或其它試劑來抑制第三或其它胞內(nèi)病原體的繁殖的實(shí)施方式。抑制性試劑的選擇可基于待抑制的胞內(nèi)病原體的類型。例如，如果第二胞內(nèi)病原體是病毒，例如流感病毒，抑制性試劑的選擇可基于病毒類型，例如甲型流感病毒或乙型流感病毒。在這樣的實(shí)施方式中，一些試劑可針對(duì)甲型和乙型病毒兩者起作用，而另一些是特異性的。 抑制性試劑可以是抗真菌試劑。抑制性試劑也可以是抗病毒試劑或抗菌試劑。抑制性試劑可以是抗生素。抑制性試劑的選擇可基于第二胞內(nèi)病原體生命周期的已知特征。第二胞內(nèi)病原體可以是裂解性病原體，即它可導(dǎo)致細(xì)胞裂解。當(dāng)?shù)诙麅?nèi)病原體為裂解性時(shí)，抑制性試劑優(yōu)選抑制第二胞內(nèi)病原體的生命周期以阻止細(xì)胞裂解。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制性試劑抑制第二胞內(nèi)病原體中的復(fù)制或基因表達(dá)。優(yōu)選抑制性試劑祀向第二胞內(nèi)病原體的一種或多種RNA物質(zhì)，以阻止第二胞內(nèi)病原體的繁殖和/或裝配。例如，當(dāng)?shù)诙麅?nèi)病原體是流感病毒時(shí)，奧司他韋在本發(fā)明中的適用性不如其他試劑。奧司他韋在體內(nèi)有抗流感病毒活性，但該活性是在細(xì)胞外發(fā)揮的。當(dāng)流感病毒是裂解性時(shí)，在本方法的條件下，細(xì)胞培養(yǎng)物在抗病毒化合物能干擾病毒生命周期之前將經(jīng)歷大量的細(xì)胞病變效應(yīng)。通常，細(xì)胞外發(fā)揮作用的抑制性試劑(包括流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑)不是優(yōu)選的。優(yōu)選抑制性試劑抑制或阻止第二胞內(nèi)病原體在細(xì)胞內(nèi)的繁殖、生長(zhǎng)、倍增、復(fù)制、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，抑制性試劑可抑制第二胞內(nèi)病原體的基因表達(dá)。例如，抑制性試劑可在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制第二胞內(nèi)病原體的基因表達(dá)，例如通過抑制mRNA翻譯，特別是通過降解mRNA。用于本發(fā)明的優(yōu)選試劑至少能部分抑制或阻止某胞內(nèi)病原體繁殖、生長(zhǎng)、倍增、復(fù)制、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。更優(yōu)選所述抑制或阻止至少是基本完全的，最優(yōu)選完全抑制或阻止。用于本發(fā)明的優(yōu)選試劑至少能部分抑制或阻止第二胞內(nèi)病原體的表型或細(xì)胞病變效應(yīng)，例如病毒細(xì)胞病變效應(yīng)，或至少能部分抑制或阻止紅細(xì)胞吸附和/或紅細(xì)胞凝集。更優(yōu)選用于本發(fā)明的試劑至少基本完全地抑制或阻止病毒細(xì)胞病變效應(yīng)、紅細(xì)胞吸附和/或紅細(xì)胞凝集，最優(yōu)選完全抑制或阻止。適當(dāng)?shù)囊种菩栽噭┌?，但不限于，小有機(jī)物(例如分子量〈lOOODa)，寡聚體化合物，特別是干擾RNA分子和反義分子。當(dāng)?shù)诙麅?nèi)病原體為病毒時(shí)，適當(dāng)?shù)囊种菩栽噭┌ㄐ》肿涌共《舅幒碗囊种苿┤缍鞣蝽f地。優(yōu)選地，試劑包括寡聚體化合物或部分，例如核酸、寡核苷酸、核酸衍生物或寡核苷酸衍生物，包括修飾的核酸或修飾的寡核苷酸。試劑可抑制第二胞內(nèi)病原體基因組中的序列(例如基因)的表達(dá)，就是說，抑制性試劑可以是指向靶序列的。優(yōu)選試劑包括能與靶序列互補(bǔ)堿基配對(duì)的寡聚體化合物或部分。優(yōu)選試劑靶序列基本互補(bǔ)。靶序列可以是存在于、互補(bǔ)于、編碼于和/或轉(zhuǎn)錄自第二胞內(nèi)病原體基因組的核苷酸序列。優(yōu)選寡聚體化合物能與轉(zhuǎn)錄自第二胞內(nèi)病原體基因組的核苷酸序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，例如與mRNA，例如成熟mRNA互補(bǔ)配對(duì)。如果第二胞內(nèi)病原體是病毒，所述轉(zhuǎn)錄的序列也可在互補(bǔ)的RNA或DNA(cRNA或cDNA)基因組范圍內(nèi)，即互補(bǔ)基因組序列與正鏈或負(fù)鏈病毒基因組關(guān)聯(lián)。所述轉(zhuǎn)錄的序列也可以是調(diào)節(jié)性RNA分子。優(yōu)選地，寡聚體化合物與靶序列80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%互補(bǔ)。包括寡聚體化合物的試劑可以是單鏈或雙鏈的。同樣地，寡聚體化合物可以是單鏈或雙鏈的。試劑是雙鏈寡聚體化合物-即雙鏈體時(shí)，所述試劑的兩條鏈之一能與存在于和/或轉(zhuǎn)錄自第二胞內(nèi)病原體基因組的所述核酸序列互補(bǔ)堿基配對(duì)。能與靶序列互補(bǔ)堿基配對(duì)的試劑的部分或序列稱作反義于所述靶序列的所述序列。因而，試劑可以是反義寡聚體化合物。作為反義寡聚體化合物的抑制性試劑可通過基因抑制的任意基于反義的機(jī)制起作用，例如RNA酶H，RNAi (RNA干擾)機(jī)制，基于RISC的機(jī)制。在本文中，基于RISC的機(jī)制是涉及RISC復(fù)合物的機(jī)制，包括RNAi機(jī)制。本領(lǐng)域熟知通過基因抑制的基于反義的機(jī)制起作用的試劑，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可相應(yīng)地調(diào)整試劑的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選寡聚體化合物通過RNAi起作用，以抑制第二胞內(nèi)病原體的繁殖。因而，抑制性試劑可以是干擾寡聚體化合物，包括干擾RNA分子，如siRNA (短干擾RNA分子)。作為寡聚體化合物如寡核苷酸的試劑的鏈，其長(zhǎng)度可以為19-80個(gè)單體，優(yōu)選長(zhǎng)度為 19-75、19-70、19-65、19-60、19-55、19-50、19-45、19-40、19-35 或 19-30 個(gè)單體，優(yōu)選長(zhǎng)度為 19-29、19-28、19-27 或 19-26 個(gè)單體，例如長(zhǎng)度為 20-26、21-26、22-26、23_26、19-25、20-25、2卜25、22-25、23-25、19-24、20-24、2卜24、22-24、23-24、19-23、20-23、、21-23、22-23、19-22、20-22、21-22、19-21、20-21 或 19-20 個(gè)核苷酸。所述單體優(yōu)選能與核
酸互補(bǔ)堿基配對(duì)，且優(yōu)選包括核酸堿基、核苷或核苷酸，例如核糖核苷或脫氧核糖核苷酸或其衍生物。就是說，所述單體優(yōu)選能與靶序列互補(bǔ)堿基配對(duì)，其配對(duì)方式支持抑制靶序列表達(dá)的基于反義(例如RNAi)的機(jī)制。試劑可以是能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈，這借助于內(nèi)部的互補(bǔ)堿基配對(duì)，例如試劑可以是短發(fā)卡RNA。例如，本領(lǐng)域已知抑制冠狀病毒，例如SARS冠狀病毒或流感病毒復(fù)制的試劑。例如，參考文獻(xiàn)24中探討了靶向冠狀病毒的siRNA分子。參考文獻(xiàn)25公開了靶向甲型流感病毒的約20個(gè)不同siRNA分子。另外，參考文獻(xiàn)26和27公開了來自同一小組的其它siRNA工作。參考文獻(xiàn)28中靶向乙型流感病毒。另外，參考文獻(xiàn)29和30公開對(duì)流感病毒有活性的干擾RNA。優(yōu)選地，病毒被寡聚體化合物靶向的區(qū)域在病毒的不同亞型和毒株之間是保守的，例如在人、雞、鴨、馬和/或豬流感之間。流感序列可從流感序列數(shù)據(jù)庫(kù)www. flu. lanl.gov中獲得。優(yōu)選寡聚體化合物不與本發(fā)明方法中所用細(xì)胞群中的已知基因有相同性，或不干擾細(xì)胞允許所述第一胞內(nèi)病原體繁殖的能力。例如，靶向流感病毒的寡聚體化合物可抑·制一個(gè)或多個(gè)HA、NA、M、NP、NS、PA、PBl、PB2基因的表達(dá)。靶序列的選擇優(yōu)選NP、PA、PBl和/或PB2基因，特別是NP和/或PA基因是優(yōu)選的靶。本領(lǐng)域也已知有抗流感病毒復(fù)制活性的反義核酸。例如，參考文獻(xiàn)31公開了抗病毒的嗎啉基反義寡核苷酸。盡管用于體內(nèi)的抑制性試劑必須具有可接受的毒性、藥代動(dòng)力學(xué)特征、半衰期等等，這些考慮在本發(fā)明方法中并不盡重要。例如，由于不利的全身性藥學(xué)性質(zhì)，有許多強(qiáng)效抗病毒(例如抗流感)化合物被排斥于人體的常規(guī)應(yīng)用，但它們可用于本發(fā)明。類似地，與siRNA或反義分子有關(guān)的遞送問題在處理細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)不很重要。參考文獻(xiàn)25已經(jīng)報(bào)道其siRNA分子有對(duì)抗生長(zhǎng)于MDCK培養(yǎng)物的流感病毒的活性，且參考文獻(xiàn)28也著眼于培養(yǎng)的細(xì)胞。即使如此，遞送系統(tǒng)仍能用于體外工作。例如，參考文獻(xiàn)32報(bào)道利用病毒粒遞送siRNA至培養(yǎng)細(xì)胞以抑制流感病毒復(fù)制。參考文獻(xiàn)33進(jìn)而報(bào)道了使用基于多聚陽離子的系統(tǒng)來促進(jìn)其遞送入細(xì)胞。參考文獻(xiàn)34在MDCK培養(yǎng)物中使用質(zhì)粒構(gòu)建體遞送抗流感siRNA。參考文獻(xiàn)35中，在培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞中使用慢病毒載體。優(yōu)選抑制性試劑表達(dá)于本發(fā)明方法的細(xì)胞群中，例如，在培養(yǎng)的細(xì)胞系或遺傳工程改造的生物體中，如以上與細(xì)胞群有關(guān)的描述。因而，該抑制性試劑可包括細(xì)胞群中表達(dá)的單鏈和/或雙鏈寡聚核苷酸。如上所述，優(yōu)選表達(dá)抑制性試劑的核苷酸序列在所述細(xì)胞群中穩(wěn)定增殖，且該抑制性試劑在所述細(xì)胞群中穩(wěn)定表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該抑制性試劑表達(dá)為如上所述的寡聚核苷酸，例如，表達(dá)為能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈化合物(例如短發(fā)卡RNA)、能形成siRNA雙鏈體的兩條分離的鏈、單鏈干擾試劑、反義試劑、能與轉(zhuǎn)錄自第二胞內(nèi)病原體基因組的核苷酸序列互補(bǔ)堿基配對(duì)的化合物，能通過反義如RNAi機(jī)制來抑制胞內(nèi)病原體繁殖的化合物等等。優(yōu)選抑制性試劑是發(fā)卡RNA。因而，該細(xì)胞群優(yōu)選包含編碼和表達(dá)本發(fā)明方法的抑制性試劑的核苷酸序列。該抑制性試劑優(yōu)選為發(fā)卡RNA和/或包括反義RNA。例如，siRNA表達(dá)載體已經(jīng)記載于參考文獻(xiàn)34中。概述
術(shù)語“包括”涵蓋“包含”以及“由……組成”，例如“包括” X的組合物可僅由X組成或可包括附加的事物，例如X+Y。術(shù)語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可完全不含Y。在需要的時(shí)候，術(shù)語“基本上”可從本發(fā)明定義中忽略。與數(shù)值X有關(guān)的術(shù)語“約”，是指，例如，x± 10%。術(shù)語“一種或多種”涵蓋“一種”、“超過一種”、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 種…等等。術(shù)語“二種或多種”涵蓋“二種”、“超過二種”、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 種…等等。除非特別指明，包括混合二種或多種成分的步驟的過程不需要任何特定混合次 序。因而，可以任意次序混合成分。當(dāng)有三種成分時(shí)，那么兩種成分可相互合并，然后該組合可與第三種成分再合并等等。附圖
簡(jiǎn)述無附圖。實(shí)施本發(fā)明的方式
實(shí)施例在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，生物樣品源自含流感病毒的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物。在噬斑試驗(yàn)中，樣品接觸未感染(無病原體)的MDCK細(xì)胞群(檢測(cè)培養(yǎng)物)。在檢測(cè)培養(yǎng)物中，流感病毒的繁殖被RNAi抑制，這使得可觀察檢測(cè)培養(yǎng)物中的噬斑形成，并將其歸因于除流感病毒之外的病原體。該檢測(cè)培養(yǎng)物可以是在1%半固體瓊脂中的單層MDCK細(xì)胞。通過本領(lǐng)域熟知的方法將指向適當(dāng)?shù)牧鞲胁《景行蛄?，例如流感病毒核蛋?NP)或酸性聚合酶(PA基因)的適量siRNA導(dǎo)入該檢測(cè)培養(yǎng)物的細(xì)胞中(例如每I X 107MDCK細(xì)胞導(dǎo)入12. 5nmol)。該siRNA序列可以是，例如，如參考文獻(xiàn)25和27中公開的，即針對(duì)核蛋白(NP)基因的正義寡核苷酸5' GGAUCUUAUUUCUUCGGAGdTdT-3' (SEQ ID NO: I)和反義寡核苷酸 5' -dTdTCCUAGAAUAAAGAAGCCUC-3' (SEQ ID NO:2);或針對(duì)酸性聚合酶基因的正義寡核苷酸5' -GCAAUUGAGGAGUGCCUGAdTdT-3' (SEQ ID NO:3)和反義寡核苷酸5' -dTdTCGUUAACUCCUCACGGACU-3' (SEQ ID NO:4)。7-10小時(shí)后，將適量樣品(例如2倍或10倍連續(xù)稀釋液)加至檢測(cè)培養(yǎng)物?？杀O(jiān)測(cè)檢測(cè)培養(yǎng)物中的流感病毒的滴度或含量和/或被siRNA抑制的流感病毒的抑制，例如，通過使檢測(cè)培養(yǎng)物上清的連續(xù)稀釋進(jìn)行紅細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)，或運(yùn)用本領(lǐng)域熟知的方法通過RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄和PCR來監(jiān)測(cè)。在適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間如兩天后，通過結(jié)晶紫染色評(píng)價(jià)該檢測(cè)培養(yǎng)物的噬斑形成。如果該流感病毒未在孵育期間繁殖，通過染色顯現(xiàn)的任何噬斑都可歸因于除該流感病毒之外的病原體。除了上述提及的對(duì)照，還可將GFP特異性siRNA導(dǎo)入表達(dá)GFP的MDCK細(xì)胞中然后進(jìn)行病毒感染(例如用流感病毒)或添加檢測(cè)樣品。GFP表達(dá)可通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)。材料和方法通過本領(lǐng)域熟知的方法培育MDCK細(xì)胞，例如在37°C，5%C02/95%空氣環(huán)境下，在含10%熱滅活FCS、2mM I-谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM中培育。流感病毒儲(chǔ)液在37°C下生長(zhǎng)于10日齡胚胎雞蛋(查爾斯河(Charles River)實(shí)驗(yàn)室，威爾明頓，馬薩諸塞州)的尿囊腔中。病毒接種48小時(shí)后收集尿囊液，并-80°C下保存。通過紅細(xì)胞凝集或噬斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。用于siRNA的RNA寡核苷酸可商購(gòu)或可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法化學(xué)合成。為了獲得siRNA雙鏈，混合等摩爾量的互補(bǔ)寡核苷酸，加熱至95°C 5分鐘，再通過降低溫度退火，例如每30秒降1°C直至35°C，然后每分鐘1°C直至5°C。通過凝膠電泳分析siRNA雙鏈的雙鏈形成完全。siRNA抑制第二病原體如流感病毒繁殖的適用性和有效性可在MDCK細(xì)胞中分開評(píng)價(jià)。對(duì)數(shù)期MDCK細(xì)胞可用胰蛋白酶處理，洗滌，并以2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升重懸在無血清培養(yǎng)基，例如RMPI培養(yǎng)基1640中。細(xì)胞(O. 5毫升)與siRNA混合，并用基因脈沖裝置(伯樂公司(Bio-Rad))在400V和975 μ F下將其電穿孔。分散電穿孔過的細(xì)胞并在DMEM中培養(yǎng)8小時(shí)。然后去除培養(yǎng)基，并在每孔中加入在DMEM、0. 3%BSA(西格瑪公司(Sigma))、IOmM 羥乙基哌嗪乙磺酸Ofepes)、100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素中的適量病毒。室溫孵育I小時(shí)后，每孔中加入2毫升含O. 3%BSA(西格瑪公司)、10mM羥乙基哌嗪乙磺酸、100單位/暈升青霉素、100微克/暈升鏈霉素和4微克/暈升胰酶的DMEM緩沖液。然后在37°C，5%C02環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)上清中的病毒滴度。在V底96孔板中進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。將樣品的連續(xù)稀釋液(例如2倍)與等體積的O. 5%紅細(xì)胞(例如從查爾斯河實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的雞紅細(xì)胞)懸液(體積/體積)混合。冰上孵育一小時(shí)后，評(píng)價(jià)各孔的紅細(xì)胞凝集的粘附、均質(zhì)層，這表明血凝反應(yīng)。至于噬斑試驗(yàn)，將連續(xù)稀釋的樣品加在1%半固體瓊脂中的單層MDCK細(xì)胞上。兩天后，通過結(jié)晶紫染色顯現(xiàn)噬斑。應(yīng)理解，雖然僅用舉例的方式描述了本發(fā)明，但可加以改變而仍保持在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。參考文獻(xiàn)[I]Hoffmann 等·(2002)Vaccine 20:3165-3170.[2]Subbarao 等· (2003)Virology 305:192 - 200.[3]Liu 等.(2003)Virology 314:580 - 590.[4]Ozaki 等· (2004)Virology 雜志 I. 78:1851 - 1857.[5]Webby 等· (2004)Lancet 363:1099 - 1103.[6]W097/37000.[7]Brands 等· (1999)Dev Biol Stand 98:93-100.[8]Halperin 等· (2002)Vaccine 20:1240-7.[9]Tree 等.(2001)Vaccine 19:3444-50.[10]Kistner 等.(1998)Vaccine 16:960-8.[ll]Kistner 等· (1999)Dev Biol Stand :98:101-110.[12]Bruhl 等·(2000)Vaccine 19:1149-58.[13]Pau 等·(2001)Vaccine 19:2716-21.[14] http:// www. atcc. org/
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權(quán)利要求
1.在生物樣品中檢測(cè)第一胞內(nèi)病原體的方法，包括步驟 (i)在抑制性試劑存在下使所述樣品接觸細(xì)胞群，其中所述試劑抑制第二胞內(nèi)病原體的繁殖； (ii)在允許所述第一胞內(nèi)病原體繁殖的條件下孵育所述細(xì)胞；和 (iii)針對(duì)所述第一胞內(nèi)病原體，檢測(cè)步驟(ii)中產(chǎn)生的物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述第一病原體包括原核生物、真核生物和/或病毒。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述第二病原體包括原核生物、真核生物和/或病毒。
4.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述第二病原體包括病毒。
5.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述第一病原體包括一種或多種病原體，系選自巴爾通體屬、博德特菌屬、布魯氏桿菌屬、衣原體科、衣原體屬、嗜衣原體屬、埃里希氏體屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、李斯特氏菌屬、分枝桿菌屬、分枝桿菌屬、立克次體科、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、鏈球菌屬、耶爾森氏菌屬、巴倍蟲屬、隱球菌屬、隱孢子蟲屬、艾美耳球蟲屬、組織胞漿菌屬、利什曼原蟲屬、瘧原蟲屬、泰勒蟲屬、弓形蟲屬、錐蟲屬、肺病毒亞科、肺病毒屬，呼吸道合胞病毒(RSV)、副黏病毒科的麻疹病毒屬、麻疹病毒、微小核糖核酸病毒科的腸道病毒屬、柯薩奇病毒、?？刹《竞湍c道病毒、哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒科、禽呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒、輪狀病毒、副黏病毒科的間質(zhì)肺炎病毒屬、人間質(zhì)肺炎病毒(HMPV)、副黏病毒科的德國(guó)麻疹病毒屬、腮腺炎病毒、披衣病毒科、風(fēng)疹病毒屬、冠狀病毒科、人冠狀病毒、SARS冠狀病毒、微小核糖核酸病毒科的鼻病毒屬、鼻病毒的M株、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、人皰疹病毒2(HHV3)、多瘤病毒科、SV-40多瘤病毒、BK多瘤病毒、JC多瘤病毒、豬圓環(huán)病毒、豬微小核糖核酸病毒、豬水皰病病毒(SVDV)、捷申-塔凡病毒、細(xì)小病毒屬、犬細(xì)小病毒(CPV)、豬細(xì)小病毒、博卡病毒屬、正黏病毒科、特別是流感病毒，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒、副流感病毒(PIV)、副黏病毒科副黏病毒亞科、I型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒、5型副流感病毒、皰疫病毒科，單純皰疫病毒I和2、腺病毒科、腺病毒、人和猴腺病毒、禽圓環(huán)病毒、雙核糖核酸病毒科、傳染性腔上囊病病毒(也稱甘保羅病毒)。
6.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述第二病原體包括如權(quán)利要求5中列舉的病原體。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述第一胞內(nèi)病原體是否存在于待檢測(cè)生物樣品中是未知的。
8.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述第二胞內(nèi)病原體是病毒。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物樣品和所述細(xì)胞群之一或兩者包括或源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括倉(cāng)鼠、牛、靈長(zhǎng)類、人、猴和狗細(xì)胞中的一種或多種。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞中的一種或多種。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是MDCK細(xì)胞。
13.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述抑制性試劑包括寡聚體化合物。
14.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述寡聚體化合物能與存在于、編碼于和/或轉(zhuǎn)錄自所述第二胞內(nèi)病原體基因組的核苷酸序列互補(bǔ)堿基配對(duì)。
15.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述寡聚體化合物通過RNAi起作用，以抑制所述第二胞內(nèi)病原體的繁殖。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，包含所述寡聚體化合物的試劑是雙鏈的。
17.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述抑制性試劑是抗真菌試劑。
18.如前述任意權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述抑制性試劑是抗病毒試劑。
19.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抑制性試劑是抗菌試劑。
20.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(iii)所得檢測(cè)結(jié)果在12月內(nèi)獲得。
全文摘要
通過以下方法研究在可能含多于一種胞內(nèi)病原體的生物樣品中的第一胞內(nèi)病原體，所述方法包括以下步驟(i)在抑制第二胞內(nèi)病原體的試劑存在下用細(xì)胞群接觸所述樣品；(ii)在允許所述第一胞內(nèi)病原體繁殖的條件下孵育所述細(xì)胞；和(iii)檢測(cè)步驟(ii)中所產(chǎn)生物質(zhì)中的所述第一胞內(nèi)病原體。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102791860SQ201180012551
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者T·蔡 申請(qǐng)人:諾華有限公司