專利名稱：診斷前列腺癌的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于診斷領域，更具體地，屬于通過使用基因組合的方式診斷前列腺癌的領域，其中該基因在前列腺癌細胞中的表達相較于它們在正常(即非癌癥)前列腺細胞中的表達是過度表達的。
背景技術：
在西方男性群體中，前列腺癌(PCa)已經轉變成最普遍的一類癌癥，相比其他任何癌癥(除肺癌外)，它導致了更多的男性患者死亡。據估計，男性在一生中罹患這類癌癥的風險為1/6，因轉移性PCa而導致死亡的風險為1/36。盡管在上世紀80年代末，前列腺特異性抗原(PSA)檢驗的引進使得PCa的檢測獲得了大幅度提高，但是死亡率并沒有顯著下降(Jemal, A.，等，(2007).Cancer statistics, 2007.CA: a cancer journal forclinicians, 2009, June9, 57，43-66)。這主要有兩個原因:50歲以上男性群體大范圍接受的遺漏、非侵入性的早期診斷方法，和只有疾病仍限于前列腺內的情況下才可以通過根治外科手術治愈的這一事實。

因為在早期階段沒有癥狀出現(xiàn)，與70%以上的女性群體相相比，只有不到30%的男性接受必要的預防性檢查。目前，這些檢查由三部分診斷組成:(i)患者血液內PSA的定量，(ii)直腸指檢(DRE)檢查，和最后(iii)通過大概10次經直腸超聲引導的穿刺活檢(TRUS)的一套診斷方法進行的確定，該經直腸超聲引導的穿刺活檢在具有異常DRE、升高的PSA 04.0ng/mL)、具有實際傾向 >2.5ng/mL 或 PSA 速率(PSA 變化率)>0.4ng 至 0.75ng/mL/年的男性中施行。所述檢查在西半球里構成了用于PCa篩選治療的黃金標準。然而，PSA和DRE缺乏明顯的特異性，而且活檢缺乏理想的敏感度。PSA作為腫瘤標記的限制之一是其缺乏特異性，這導致高的陰性活檢率。在PSA的灰色區(qū)域內(4-1 Ong/mL),在患有早期PCa和前列腺良性癥狀如良性增生(BPH)和無癥狀慢性前列腺炎的男性患者之間，血清PSA值有大量重疊(Loeb，S.等，(2009).Exclusion of inflammation in the differential diagnosis of an elevatedprostate-specific antigen (PSA).Urol 0ncol27, 64-66;Pannek, J.,和 Partin, A.ff.(1997).Prostate-specific antigen:what’s new inl997.0ncology(ffilliston Park)II, 1273-1278;discussionl279-1282)。已經作出多種嘗試以克服PSA篩選的限制。這些嘗試包括使用年齡校正的PSA截止點、游離PSA、PSA密度、PSA速率、PSA斜度和PSA倍增時間。所有這些方法都已經被提出以作為改善“臨床重要的"PCa實例檢測的方式。然而，沒有證據表明，這些檢測策略的任
何一種能改善健康結果。作為目前篩選參數(shù)的結果，歐洲每年進行的大概390，000活檢的約2/3都是不必要的(Catalona，WJ.等，Measurement of prostate-specific antigen in serum as ascreening test for prostate cancer.N Engl J Med324:1156-61, (1991);Makinen, T.等，Second round results of the Finnish population-based PCa screening trial.Clin Cancer ReslO: 2231-6 (2004) )0活檢的假陽性率大約為零，但是第一次活檢中的假陰性率可能在12%至30%之間浮動。因此，很多具有陰性活檢結果的男性經受重復活檢以排除 PCa。需要更準確的檢驗以幫助鑒定哪些患者具有罹患PCa的高風險，以及對哪些患者實施強制性重復前列腺活檢。因此，迫切需要使用非侵入性程序在早期階段檢測出PCa。已經鑒定出大范圍的有希望的PCa生物標記，其不僅具有前列腺特異性，而且還在前列腺腫瘤中過度表達，其已被鑒定，包括GSTPI的CpG超甲基化、TMPRSS2: ERG基因融合和 RNA 生物標記 PCA3 (Marks, L.S.，和 Bostwick, D.G.(2008).ProstateCancer Specificity of PCA3Gene Testing!Examples from Clinical Practice.RevUrol10，175-181;Saramaki 等(2008).TMPRSS2:ERG fusion identifies a subgroup ofprostate cancers with a favorable prognosis.Clin Cancer Resl4, 3395—3400;Vener等(2008).Development of a multiplexed urine assay for prostate cancerdiagnosis.Clin Chem54, 874-882)。因為在具有PCa的男性的尿液中可以檢測出前列腺細胞，基于尿液的診斷檢驗具有非侵入性或最小侵入性的優(yōu)勢，從而將被更大范圍的男性群體接受。盡管已經在大型 篩選程序中證明了對PCA3表達和GSTPl甲基化作用的基于尿液的檢驗，但是只有兩個基于診斷特征的研究考慮到癌癥發(fā)展的異質性，一個使用RNA而另一個使用基因組 DNA (Laxman 等(2008).Cancer Res68, 645-649)。W003/009814公開了評估患者是否罹患PCa的方法，其包含將選自患者樣本中的一套標記的標記表達水平與對照的非PCa樣本中所述標記的正常表達水平作比較，其中在患者樣本中所述標記的表達水平顯著高于正常水平表明患者罹患PCa。所述一套標記包括PCA3((M381)、PSMA (F0LH1)和 PSGR (M311)標記；然而，W003/009814 沒有公開所述 PCA3、PSMA和PSGR標記的特異性組合作為特異性三基因組用于PCa的早期檢測。DE102006032394公開了用于診斷PCa的方法，其包含比較選自患者樣本中的標記 ZIP/CREB3L4、AMACR、DD3/PCA3、D-GPCR、EZH2、PCGEMl、PDEF,前列腺特異性蛋白(prostein),PSGR/0R51E2,PSMA/F0LH1,TMPRSS2 和 TRPM8 的組的至少兩個標記的表達。然而，通過邏輯回歸分析進行數(shù)據分析。此外，沒有一個DE102006032394中提到的優(yōu)選的標記組合由PCA3、PSMA和PSGR標記的特異性組合組成。另外，W02008/121132公開了評估患者是否罹患PCa的方法，其包含將選自患者樣本中一套標記的一個標記的表達水平和參考值作比較。所述一套標記包括PCA3、PSMA和PSGR標記；然而，W02008/121132沒有公開所述PCA3、PSMA和PSGR標記的特異性組合作為特異性三基因組用于PCa的早期檢測。盡管事實上與DRE和TRUS結合的PSA血清測量在西半球中構成了 PCa篩選治療的黃金標準，PSA和DRE明顯缺乏特異性，而且活檢缺乏理想的敏感度(12%至30%假陰性)。用于PCa診斷的最普遍的標記之一是在尿液樣中確定PCA3。Van Gils等(vanGils MP,等 Clin Cancer Resl3:939-43 (2007))報道了 534 個患者(血清 PSA 在 3ng/mL和15ng/mL之間)中PCA3敏感度為65%，特異性為66% (AUC0.66)，其包括具有癌陽性活檢的 174 個男性(33%)。Hessels 等(Hessels D,等，Eur Urol44:8-15; discuss ion 15-6 (2003))觀察到在108個患者的群體研究中敏感度為67%，特異性為83% (AUC0.72)。Marks等(Marks LS,等；Urology69:532-5 (2007))觀察到在重復活檢后具有27%癌癥表征的233個患者(PSA彡2.5ng/L)的群體研究中敏感度為58%，特異性為72% (AUC0.68)。Groskopf等(Groskopf J,等；Clin Chem52:1089-95 (2006))觀察到在70個患者的群體研究中敏感度為 69%，特異性為 79% (AUC0.75)ο Haese 等(Haese A,等;Eur Urol54:1081-8 (2008))報道了在463個患者研究中截止為35時PCA3敏感度為47%，特異性為72% (AUC0.66)，該研究用于鑒別具有陽性重復活檢高風險性的患者。目前，活檢策略可能遺漏了異質性腫瘤病灶，而基于尿液的試驗將具有很大優(yōu)勢，因為可以將來自整個前列腺的多個病灶細胞釋放入尿液中并在尿液中收集(Laxman B,等，Neoplasia2006;8:885-8)。然而，如果在尿樣中分析該標記，在前列腺按摩(PM)后獲得的排出尿液樣本的沉淀物上進行的定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測可能能夠在占主導地位的非惡性細胞環(huán)境中檢測出少量惡性細胞。此外，單個標記不一定能反映出PCa的多因子、多病灶及異質性質，多種生物標記組合將相對于單個標記明確地改進性能(Etzioni R,等Biostatistics2003;4:523-38)。將臨床和人口統(tǒng)計資料數(shù)據與多個標記結合使用會輔助預測處于罹患PCa風險的患者并評估他們的預測。為此，敏感度>95%的單個標記，其特異性將大幅下降。例如，對于敏感度為96%的PCA3，發(fā)現(xiàn)其特異性只有14% (Marks LS等，Rev.Urol.2008;10:175-81)0另外，盡管在這個主題上進行了研究，目前從臨床觀點看只有很少的腫瘤標記可用于PCa診斷。此外，歐洲每年進行數(shù)量非常龐大的不必要的活檢(約260，000)。因此，在本領域中需要能夠解決上述任何提到的缺陷的診斷PCa的方法。有利地，所述方法應當能使用非侵入性程序在早期階段檢測出PCa。因此，需要額外的生物標記以補充或潛在地替代目前使用的診斷技術。發(fā)明簡述已經鑒定出尿轉錄物的新型多樣組，其在PCa檢測方面優(yōu)于單個PCA3轉錄物和單個PSA。為了確定準備進行前列腺活檢的154個患者的推定PCa生物標記PCA3、PSGR和PSMA的過度表達，發(fā)明人已經檢驗了前列腺按摩后的尿液沉淀。該組合標記模型的曲線下面積(AUC)為0.80。通過前列腺活檢的PCa檢出率為37% (57/154)。隨后，發(fā)明人在77個男性(35%罹患PCa )的目標子集中具體地測驗了其臨床有效性，這些男性的血清PSA在4ng/mL至10ng/mL之間并且在之前未接受活檢(特殊目的組)。PSA密度(PSAD)也作為典型的臨床工具包括在這項分析中以提高PSA特異性。通過使用多重模型，在所述特殊目的組內的男性中該曲線下面積(AUC)為0.89，而其在綜合組中為0.80。具有96%的敏感度和62%的特異性(綜合組為40%)。使用所述三基因組合結合PSAD將能夠節(jié)省42% (綜合組為26%)的不必要施行的活檢。因此，發(fā)明人示出了一種敏感的方法以在尿液中檢測PCa，其可以用于提高PSA的特異性，避免了大量不必要的活檢。這種新型方法提高了 PSA的診斷效率，而且在PSA的灰色區(qū)域特別有用。因此，本發(fā)明基于基因組合的鑒定，所述基因的差異性表達與PCa相關。進一步使用這種模型以評估是否應該施行活檢。在各方面，本發(fā)明提供了評估PCa存在或不存在(例如診斷或預測)的方法，以及評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法響應的方法，以及監(jiān)測受試者體內PCa進展的方法，所述方法基于來自受試者的樣本，并確定與PCa相關的3個特異性基因(PCA3、PSMA和PSGR)量的定量測定。因此，第一方面，本發(fā)明涉及在理想敏感度下用于診斷受試者體內前列腺癌的方法，其包含(i)確定從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液構成的組中，以及(ii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應于所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在所述理想敏感度下的最高特異性相關，該ROC曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值的明顯升高表明在所述理想敏感度下該受試者罹患PCa。另一方面，本發(fā)明 涉及用于評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法響應的方法，其包含比較(i)確定在施用所述療法前獲得的從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3.PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)確定在施用所述療法后獲得的從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3.PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(iii)將在施用所述療法前后獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，施用所述療法后，在受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著下降或沒有變化，其表明施用的該療法有效或者其中，施用所述療法后，在受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明施用的該療法無效。還一方面，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測受試者體內PCa進展的方法，其包含(i)確定在第一時間段從所述受試者身上獲得的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)確定在第二時間段相同受試者的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述第二時間段晚于所述第一時間段，而且其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(iii)將在第一和第二時間段獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在所述理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在第二時間段，在受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于在第一時間段的所述表達水平顯著下降或沒有變化，其表明受試者體內的陽性進展或者其中，在第二時間段，在受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于在第一時間段的所述表達水平顯著升高，其表明受試者體內的陰性進展。
另一方面，本發(fā)明涉及用于評估受試者是否必須接受前列腺活檢的方法，其包含(i)確定從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在訴述理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明該受試者是前列腺活檢的候選者。另一方面，本發(fā)明涉及包含第一組分和可選的第二組分的試劑盒，其中該第一組分是一套試劑，其由以下組成(i )能夠確定基因PCA3的表達水平的試劑；(ii)能夠確定基因PSMA的表達水平的試劑；(iii)能夠確定基因PSGR的表達水平的試劑；其中，第二組分由能夠確定一個或多個前列腺持家基因表達水平的一個或多個試劑組成。在另一方面，本發(fā)明涉及根據權利要求16所述的試劑盒在Pca診斷中的用途，其用于評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法的響應或用于監(jiān)測受試者體內的PCa進展。


圖1:基于尿液的PCa生物標記的特征。圖1.1示出了在4ng/mL至10ng/mL的血清PSA中并在之前未接受活檢(特殊臨床目的的患者組)的情況下，患有PCa的男性對比患有良性癥狀的男性的體內PCA3 (A)、PSGR (B)、PSMA (C)和PSAD⑶的相對水平以及患有PCa的男性對比患有良性癥狀的男性的體內PCA3(E)、PSGR(F)、PSMA(G)和PSAD(H)的相對水平。圖2:對在活檢中檢測出患有前列腺癌的男性和在活檢中沒有檢測出癌癥的男性體內的組合生物標記的接受者操作特征(ROC)曲線。PCA3的ROC曲線(X )、PSGR的ROC曲線(.)和PSMA的ROC曲線(▽)，以及PSAD ( X )組合的3基因ROC (令)。組合的3基因+PSAD ROC曲線(口)。圖中示出了完整的ROC曲線和對應于90%至100%敏感度的區(qū)域。圖3:在活檢中檢測出前列腺癌的男性和在活檢中未檢測出癌癥的男性中邏輯回歸模型與mROC模型3M (PSMA對PSGR對PCA3)的比較。圖4:具有4ng/mL至10ng/mL的PSA并在之前未接受活檢的男性中，比較單個標記和組合標記(PCA3、PSGR、PSMA+PSAD)的接受者操作特征(ROC)曲線。PCA3的ROC曲線(X )、PSGR的ROC曲線(.)和PSMA的ROC曲線(▽)，以及PSAD (X)組合的3基因ROC (令)。組合的3基因+PSAD ROC曲線(口)。圖中示出了完整的ROC曲線和對應于90%至100%敏感度的區(qū)域。圖5:將研究中所有的患者與特殊目的的臨床風險組(PSA在4ng/mL至10ng/mL范圍內并在之前未接受活檢)作比較可以節(jié)省的活檢?；顧z節(jié)省(％)=(真陰性+假陰性)/所有患者。敏感度=真陽性/ (真陽性+假陰性)。發(fā)明詳述本發(fā)明的診斷方法本發(fā)明的作者已經鑒定了特定基因的組合，其在診斷出患有PCa的患者腫瘤樣本中相對于無PCa的參考樣本進行差異性表達，所述參考樣本在組合的ROC分析中分析時能夠獲得組合的標記，其能夠以改進的性能進行PCa檢測。比如，如本發(fā)明的圖2所示，該組合的ROC分析能夠通過0.80的AUC檢測PCa，其與單個標記的AUC相比有所改進(PCA3為0.61，PSGR為0.64，PSMA為0.63)。對每個生物標記使用一個檢測閾值(截止)；然后，如果至少一個分數(shù)高于其檢測閾值，則將患者宣布為陽性。在閾值(截止)范圍上計算敏感度和特異性值。因此，第一方面，本發(fā)明涉及在理想敏感度下用于診斷受試者體內前列腺癌的方法，其包含(i)確定從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預 定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在所述理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據在處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在所述生物流體樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明在所述理想敏感度下該受試者罹患PCa。本發(fā)明涉及在理想敏感度下用于診斷受試者體內前列腺癌的方法，其包含(i)提供來自所述受試者的生物流體，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，(ii)確定在所述生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，以及(iii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據在處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在所述生物流體樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明在所述理想敏感度下該受試者罹患PCa。如本文所使用的，術語“用于診斷的方法”涉及實質上地可以由前述步驟組成或可以包括其他步驟的方法。然而，必須理解的是，該方法在優(yōu)選的實施方案中是在體外實施的方法，即其不在人類或動物體內實施。如本文所使用的，診斷涉及評估受試者患病的可能性。本領域技術人員將會理解的是，盡管其是優(yōu)選地，這種評估正常情況下可能不是對100%的受診斷的患者都是正確的。然而，該術語要求可以將受試者的統(tǒng)計顯著的部分鑒定為患病或具有患病傾向。本領域技術人員可以通過使用幾種眾所周知的統(tǒng)計評估工具立刻確定某部分是否是統(tǒng)計上顯著的，例如，確定置信區(qū)間、確定P值、Student t檢驗、Mann-Whitney 檢驗等等。詳細內容參見 Dowdy 和 Wearden, Statistics for Research, Johnffiley&Sons, New Yorkl983。優(yōu)選的置信區(qū)間是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，優(yōu)選地至少99%。P值優(yōu)選的是0.2,0.1,0.05，優(yōu)選地0.01。本發(fā)明用于診斷的方法能夠評估受試者是否患有PCa。術語“前列腺癌”是指任何一種前列腺的癌癥，其中前列腺細胞突變并開始不受控制的繁殖，其與癌癥階段無關。通過分析臨床和組織病理學信息來評估前列腺癌在患者體內的進展程度。癌癥階段根據腫瘤尺寸(O、是否有淋巴結牽連(N)、轉移的存在(M)和腫瘤等級(G)來分類。Tl類腫瘤限于前列腺，因為太小而不能通過直腸指診檢查出來。Tl進一步包括Tla (在組織樣本中癌細胞低于5%)和Tlb (高于5%)子部分。Tlc表明該患者具有升高的前列腺特異性抗原(PSA ;參見下文的定義)。如果腫瘤足夠大而能夠在直腸指診中檢查出來，則將其歸類為T2。T2a是指只有前列腺的一邊(左邊或右邊)有腫瘤；T2b是指兩邊都有腫瘤。通常將T2稱為“局部癌癥”。如果該癌癥是T3，其已經擴散到臨近前列腺的結締組織(T3a)或精囊(T3b)的連接組織。T4表明癌癥擴散到前列腺旁邊的組織，例如膀胱括約肌、直腸或骨盆壁。前列腺癌還可能擴散到骨盆的局部淋巴結內，將其評為前列腺癌的NI階段。將T3、T4和NI這些階 段統(tǒng)稱為“局部晚期”或區(qū)域癌癥。如果這種癌癥已經擴散到遠的地方，如骨骼，則將其稱為“轉移”或處于Ml階段。將已經擴散到遠處淋巴結的前列腺癌歸類為Mla，而將已經擴散到骨骼的前列腺癌歸類為Mlb，并將已經擴散到器官如肝臟和大腦等的前列腺癌評估歸類為Mlc。如果不治療，前列腺癌幾乎全部轉移到骨骼中。如本文所使用的，“受試者”是指任何一種歸類為哺乳動物的動物，其包括但不限于家畜和農畜、靈長類動物和人類，例如人、非人類靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒類動物。優(yōu)選地，該受試者為任何年齡或人種的男人或女人。在優(yōu)選的實施方案中，實施確定的受試者顯示出高于4ng/mL的PSA水平。在還更優(yōu)選的實施方案中，對顯示出低于10ng/mL、且更優(yōu)選地在4ng/mL至10ng/mL之間的PSA水平的受試者實施本發(fā)明的方法。在另一實施方案中，對還未接受前列腺活檢的受試者實施本發(fā)明的方法。在優(yōu)選的實施方案中，受用本發(fā)明的方法的受試者是指患有前列腺惡性腫瘤前病變、如單獨的高等級前列腺上皮內瘤形成的患者。如本文所使用的，術語“高等級前列腺上皮內瘤形成”或“HG-PIN”是指與前列腺癌的高風險相關的癥狀，而且已知是發(fā)育異常、管內發(fā)育異常、大腺泡非典型增生、非典型原發(fā)性增生、伴有惡性變的增生、標記的非典型和管-腺泡發(fā)育不良的癥狀。HG-PIN的特征可能在于高的核/質比、著色過度、粗糙的顆粒狀染色質、缺少核仁、分離的細胞以及細胞的和核多形性。用于診斷PIN的方法在本領域中已知，其包括但不限于穿刺活檢和埃茲蛋白表達的測定，該蛋白為細胞骨架連接蛋白，其對控制癌細胞的增長和轉移能力有積極作用(參見 Pang 等，Urology.2004Mar;63 (3): 609-12)，美國專利號 6，054，320 提供了用于鑒別PIN的試劑盒。HG-PIN包括分離的及多病灶的HG-PIN。因此，診斷出HG-PIN的患者是本發(fā)明的方法的特別合適的候選者，因為他們由于HG-PIN的惡性轉化具有發(fā)生前列腺癌的高風險。
如本文所使用的，術語“敏感度”是指當樣本為陽性時，本發(fā)明的診斷方法得出陽性結果的概率。敏感度通過由真陽性結果數(shù)除以真陽性和假陰性的總數(shù)來計算。敏感度實質上是一種標準，衡量一種鑒別患有疾病的患者的方法的準確度，所述疾病為前列腺癌。在本發(fā)明的方法中，可以選擇截止值以使得在受驗患者群體的至少60%、或受驗患者群體的至少65%、70%、75%或80%中，診斷個體的敏感度為至少大約70%，而且可以是，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或至少100%。在第一步，本發(fā)明的診斷方法包含從將受診斷的受試者中分離的樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平的確定。根據本發(fā)明的方法所使用的，術語“一個或多個基因的表達水平”涉及一個或多個基因表達的程度。典型地，通過測定RNA表達水平可以確定給定基因的表達水平，其中術語“RNA表達水平”是指轉化成轉錄的RNA、初始未拼接的RNA轉錄物或成熟mRNA的DNA基因序列息的確定水平?？梢酝ㄟ^測定該基因的全部RNA或子序列的水平來監(jiān)測RNA表達。實際上，可以在本發(fā)明的框架下采用任何一種用于檢測基因的存在并定量基因水平的方法，以檢測和定量由生物標記基因編碼的mRNA水平。通過非限制性說明，在特殊實施方案中，為了測定樣本中特殊RNA的量，可以使用本領域技術人員已知的方法來提取并定量來自樣本的關于生物標記基因(PSGR)的轉錄RNA。請參見W02008/121132和W098/24935，其關于RNA分析方案的內容通過參考的方式并入本文。簡言之,從樣本中,例如任意組織、體液、細胞(例如循環(huán)腫瘤細胞)等中提取RNA。例如，可以在合適的溶液中溶解細胞并洗脫RNA。在RNA提取之后，可以通過使用逆轉錄酶進行第一鏈合成。然后，可以進行基因擴增，更具體地是定量PCR試驗，相對于內部標記例如18S rRNA校準目的基因，盡管也可以使用其他內源性標記，如28S-25S rRNA和5S rRNA。多次重復測試樣本，例如3次重復。在本發(fā)明的實施方案中，使用擴增、報道試劑和如由Applied Biosystems商業(yè)化供應的儀器施行qPCR。給定祀轉錄物的擴增的限定效率，可檢測的從擴增的靶模板發(fā)出信號的該點(例如循環(huán)數(shù)或ct)與測定樣本中的特異性信息轉錄物直接相關。相似地，當其他可計量的信號如熒光、酶活性、每分鐘分解、吸光度等與 已知靶模板濃度相關(即參考標準曲線)或通過標準化成具有有限變異性標準時，可以將其用于定量未知樣本內的靶模板的數(shù)量。盡管并不限于擴增方法，定量基因表達技術可以使用靶轉錄物的擴增。可選地，或者與該靶轉錄物的擴增結合，還可以使用對內部標記的報道信號的定量，該內部標記由擴增產物的指數(shù)增長產生?？梢酝ㄟ^等溫基因擴增策略或通過使用熱循環(huán)如PCR進行的基因擴增來完成該靶模板的擴增。通過使用信使特異性引物或隨機引物擴增特異性RNA。根據從公共數(shù)據庫中獲得的數(shù)據可以合成該特異性引物(例如，Unigene, National Center forBiotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda,MD), 這些數(shù)據包括來自從人類和其他動物身上獲得的基因組和cDNA文庫的信息。選擇引物以優(yōu)先從特異性RNA中擴增，該特異性RNA從檢驗或指示樣本中獲得(參見，例如 RT PCR, Chapterl5in RNA Methodologies.A Laboratory Guide for Isolationand Characterization.2nd edition, 1998,Robert E.Farrell, Jr., Ed., AcademicPress;或 Chapter22pp.143-151，RNA Isolation and Characterization Protocols.Methods in Molecular Biology, Volume86, 1998, R.Rapley 和 D.L.Manning Eds., HumanPress,或 Chapter14Statistical refinement of primer design parameters;或Chapter5, pp.55-72, PCR Applications: protocols for functional genomics,M.A.1nnis, D.H.Gelfand和 J.J.Sninsky, Eds.，1999, Academic Press)。在等溫條件下進行擴增或使用熱循環(huán)儀擴增(例如，從Applied Biosystems獲得的ABI9600或9700或7900)。通過使用突光標記檢測寡核苷酸探針來檢測擴增的核酸(參見，例如，Taqman PCR ReagentKit, Protocol, part number402823, Revision A, 1996, Applied Biosystems),其根據針對擴增引物描述過的公知的數(shù)據庫中鑒定并合成。例如，但不限于，通過使用合適的檢測系統(tǒng)，例如ABI Prism 7900序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)檢測并定量擴增的cDNA。該檢驗樣本中含有的特異性RNA的量可以與觀察到的突光相對量相關(參見，例如，Advances in QuantitativePCR Technology:5' Nuclease Assays, Y.S.lie and CJ.Petropolus, CurrentOpinion in Biotechnology,1998,9:43-48,或 Rapid Thermal Cycling and PCRKinetics, pp.211-229, chapterl4in PCR applications!protocols for functionalgenomics, M.A.1nnis, D.H.GelfandandXJ.Sninsky, Eds., 1999;Academic Press)。

在特定實施方案中，使用定量PCR(qPCR)檢測并定量PSGR、PCA3和PSMA基因的表達水平。可以從例如，Sambrook 等，2001“Molecular cloning: to Laboratory Manual”, 3rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol.1-3 中找到定量基因表達水平的常見方法。術語“PCA3”是指已知為前列腺癌抗原3 (在NCBI中的登錄號為AF103907或NR_015342)的基因，其對應位于染色體9的非蛋白編碼基因，該基因編碼前列腺特異性非編碼RNA，該RNA在95%以上的原發(fā)性PCa樣本和PCa轉移中高度過度表達。如本文所使用的，術語“PSMA”是指已知為前列腺特異性膜抗原的基因，也稱為F0LH1 (葉酸水解酶前列腺特異性膜抗原1)，其編碼至少2個轉錄變體(在NCBI中鑒定為NM_004476和NM_001014986 )，所述變體編碼整體非剪切2型膜蛋白，其在前列腺上皮細胞上高度并特異性表達，并在PCa以及其他固體腫瘤的新血管系統(tǒng)中大力上調(Elsasser-Beile, U.et al..Curr Drug TargetslO:118-25(2009))。如本文所使用的，術語“PSGR”是指前列腺特異性G蛋白偶聯(lián)受體，也稱為0R51E2(嗅覺受體，51家族，E亞族，成員2，NM_030774)，其為G蛋白偶聯(lián)OR家族的一員，該家族具有高前列腺組織特異性和腫瘤相關過度表達。為確定起見，用于實踐本發(fā)明的多核苷酸包括但不限于突變體、同系物、亞型、等位基因等等。應該理解的是，只要變體基因與自然基因相似，都顯示出在它們的表達水平與PCa的存在之間的相關性，那就不需要本發(fā)明的序列編碼PCA3、PSMA和PSGR基因的功能性變體。如本文所使用的，術語變體是指PSGR多核苷酸缺失、插入或替代一個或多個核苷酸而得到的多核苷酸。該PSGR的變體包括但不限于顯示出與PSGR mRNA至少70%、有利地至少75%、典型地至少80%、優(yōu)選地至少85%，更優(yōu)選地至少90%，還更優(yōu)選地至少95%、97%、98%或99%的同一度的多核苷酸?？梢酝ㄟ^常見方法,例如,通過本領域內已知的標準序列比對算法，比如BLAST確定兩個氨基酸序列之間的同一度(Altschul S.F.等Basic localalignment search tool.J Mol Biol.19900ct5;215(3):403-10)。
在本發(fā)明中，術語“樣本”或“生物樣本”是指從受試者身上分離的生物材料。如本文所使用的，術語“生物流體”是指提供來自前列腺組織或細胞的核酸源的樣本，其包括，例如前列腺細胞、前列腺組織、前列腺液、尿液、射精的精液、精液等。實際上，由于可以在PCa男性患者的尿液中檢測出前列腺細胞，推薦使用流體，如尿液。在特定的實施方案中，根據本發(fā)明用于確定生物標記的樣本優(yōu)選地是前列腺按摩(例如DRE)后或前列腺活檢后(活檢后)或通過自發(fā)排尿液得到的尿液樣。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的方法包含前列腺按摩(例如DRE)后得到的尿樣的使用。該樣本看起來是在男性患者中廣泛接受的微創(chuàng)技術和為了作出正確診斷而獲得足夠細胞的可能性之間最好的折中。在另一實施方案中，根據本發(fā)明用于確定生物標記的樣本是通過表達的前列腺分泌物或前列腺切除術得到的樣本(作為陰性對照使用)。因為排出尿液樣本的第一部分含有最高濃度的前列腺和尿道分泌物(IwakiriJ，等J Uroll49:783-6(1993))，選擇前列腺按摩后收集的排出尿液樣本。此外，這種類型的樣本比精液或表達的前列腺分泌物更容易從男性患者身上收集。第二步，本發(fā)明的方法包含將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算。術語“截止值”，當指代PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平時，是指參考表達水平，其表明如果患者的表達水平高于上面的所述截止或參考水平，具有給定敏感度的受試者可能罹患PCa。典型地，使用接受者操作特征曲線(ROC曲線)來計算截止值。實際上，典型地通過繪制在“正?！?即明顯健康的)和“患病”群體中變量值對相對頻率來計算接受者操作特征曲線(R0C曲線)。對任何特殊標記或標記組(即所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平)，對患病和不患病受試者的標記水平分布可能會重疊。在這種情況下，檢驗無法100%準確地完全把正常受試者與患病受試者區(qū)分開，而且該重疊面積表明該檢驗不能把正常受試者與患病受試者區(qū)分開的位置。選擇閾值或截止值，在其上(或在其下，這取決于標記如何隨疾病改變)則認為該檢驗是不正常的，而在其下則認為該檢驗是正常的。ROC曲線下面積用于度量感知的測量值能夠對癥狀進行正確鑒定的概率。甚至當檢驗結果未必給出精確數(shù)值時，也可以使用ROC曲線。只要一個人能夠排列結果，其就能夠作出ROC曲線。例如，可以根據等級(例如，1=低，2=正常，3=高)排列“疾病”樣本的檢驗結果。該排列可以與“正?！比后w中的結果相關，并作出ROC曲線。這些方法在本領域內眾所周知。參見，例如Hartley等1982.Radiologyl43:29_36。優(yōu)選地,選擇閾值以提供大于約0.5，更優(yōu)選地大于約0.7，還更優(yōu)選地大于約0.8，甚至更優(yōu)選地大于約0.85，最優(yōu)選地大于約0.9的ROC曲線面積。在上下文中，術語“大約”是指給定測量值的+/_5%。ROC曲線的橫軸表示(1-特異性)，其隨著假陽性率而增加。該曲線的縱軸表示敏感度，其隨真陽性率而增加。因此，對所選的特定截止，可以確定(1-特異性)的值，而且可以獲得對應的敏感度。ROC曲線下面積用于度量測定的標記水平能夠正確地鑒定疾病或癥狀的概率。因此，可以使用ROC曲線下面積來確定該檢驗的有效性。 在某些實施方案中，不用依靠用于一組內一個或多個標記的特定閾值來確定從受試者身上獲得的標記水平分布圖是否表明特定的診斷/預后。相反地，本發(fā)明可以應用標記組“分布圖”的評估作為統(tǒng)一的整體。實質上，在這樣的標記組中，特定“指紋”變化模式可以用作特異性診斷或預后指示物。如本文所討論的，可以從單個樣本或從該組內一個或多個成員的暫時變化(或組響應值)中獲得這種變化模式。本文中的組是指一套標記。如本文下文中所述，優(yōu)選地通過繪制在不同截止值下標記的特定組的敏感度(SP真陽性)對組的1-(特異性)(即假陽性)的ROC曲線來確定組響應值。在這些方法中，將來自受試者的標記測量值分布圖一起考慮以提供診斷或預后的總概率(以數(shù)字分數(shù)或百分比風險表達)。在這樣的實施方案中，標記的某些子集的增加能夠充分表明一患者的特定診斷或預后，而標記的不同子集的增加能夠充分表明其它患者的相同或不同診斷/預后。還可以將加權因子應用到組的一個或多個標記中，例如，當標記在鑒定特定的診斷/預后方面有特別高的應用性時，可以將其加權，從而在某個給定水平上，僅其一個就足以表明陽性結果。同樣地，可以提供加權因子，從而未給定水平的特殊標記足以表明陽性結果，但是當另一個標記也應用于該分析時，其只能表明一個結果。對在連續(xù)尺度上測定的標記，ROC曲線是真陽性分數(shù)對假陽性分數(shù)的繪圖，其用于評估所有可能的截止點值。為了得到二進制的結果，即前列腺癌是否存在，該ROC曲線定量了標記的區(qū)分實例與對照的鑒別能力。通過DeLong等的U-統(tǒng)計(Biometrics, 1988， 44:837-845)或引導重采樣方法來計算在該曲線下面積(AUC)的標準方差和AUC之間的差別。優(yōu)選地，首先使用每個生物標記的k_分量檢測閾值，然后如果至少一個分數(shù)高于其檢測閾值，則宣稱該檢驗為陽性，從而確定k標記的ROC曲線。通常在k-分量閾值范圍內計算敏感度和特異性值，該區(qū)域能夠產生點云?？梢酝ㄟ^以下方法獲得新標記的最佳ROC曲線點:對固定的敏感度值，在與敏感度值相匹配的點云的特異性區(qū)域內選擇特異性最大值。在某些實施方案中，選擇標記和/或標記組以顯示至少約70%的敏感度，更優(yōu)選地至少約80%的敏感度，甚至更優(yōu)選地至少約85%的敏感度，還更優(yōu)選地至少約90%的敏感度，最優(yōu)選地至少約95%的敏感度，與至少約70%的特異性，更優(yōu)選地至少約80%的特異性，甚至更優(yōu)選地至少約85%的特異性，還更優(yōu)選地至少約90%的特異性，最優(yōu)選地至少約95%的特異性組合。在特別優(yōu)選的實施方案中，該敏感度和特異性都為至少約75%，更優(yōu)選地至少約80%，甚至更優(yōu)選地至少約85%，還更優(yōu)選地至少約90%，最優(yōu)選地至少約95%。在此上下文中術語“約”是指給定測量值的+/_5%。技術人員會理解的是，將診斷或預后的指示物與診斷或未來臨床結果的預后風險相聯(lián)系是統(tǒng)計性分析。例如，如統(tǒng)計性顯著水平所確定的，與具有小于或等于X的水平的患者相比，大于X的標記水平可以表明患者更有可能遭受不良結果。此外，基線水平的標記濃度變化可以反應患者預后，而且標記水平的變化程度可以與不良情況的嚴重程度相關。通常通過比較兩個或多個群體，并確定置信區(qū)間和/或P值來確定統(tǒng)計顯著性。參見，例如，Dowdy 和 Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, New York, 1983。本發(fā)明優(yōu)選的置信區(qū)間是90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%,99.9%和99.99%，而優(yōu)選的p值是0.1,0.05,0.025,0.02,0.01,0.005,0.001 和 0.0001。如本文所使用的，術語“處于罹患前列腺癌風險的患者群體”是指已經診斷為顯示出罹患前列腺癌風險的患者群體，該診斷基于可用于檢測前列腺癌的一個或多個試驗。例如，該群體可以包含3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多受試者。
處于罹患前列腺癌風險的患者包括但不限于表現(xiàn)出一個或多個以下診斷特征的患者:-DRE 為陽性，即如 Richie JP 等(Urology, 1993，42:365-74)和 Carvalhal GF 等(J.Urol.，1999，161:835-9)所述，檢驗員將戴手套的潤滑的手指插入直腸中檢查前列腺的尺寸、形狀和結構，通過這樣的程序檢測出存在不規(guī)則、堅硬和塊狀的區(qū)域。盡管DRE只能評估前列腺的背面，但是85%的前列腺癌發(fā)生在前列腺的這部分。通過DRE可以觸摸到的前列腺癌通常是發(fā)展到較晚期了。-經直腸超聲，也稱為前列腺超聲、超聲波掃描或超聲描記術，其涉及將身體的一部分暴露于高頻率聲波下以產生身體內部的圖像。因為超聲圖像是實時捕捉的，它們可以顯示身體內部器官的結構和運動，以及流經血管的血液。-血液中升高的PSA水平:盡管對血液中顯示出升高的PSA水平的患者進行活檢的判定水平不存在標準，已經任意選擇了不同的PSA值作為判定水平，特別地，將高于4ng/mL的水平選為在臨床試驗中進行活檢的判定水平，基于此FDA于1994年增加了對50歲年齡男性的前列腺癌檢測；將4ng/mL用作PLCO (前列腺、肺、結腸直腸和卵巢癌)試驗的活檢判定水平，將3ng/mL用作ERSPC (歐洲前列腺癌的隨機篩查)和ProtecT試驗，而且將
2.5ng/mL用于2007NCCN (美國國立綜合癌癥網)指南。PSA水平可以因癌癥之外的原因而改變。高PSA水平的兩個普遍原因是前列腺的膨大(良性前列腺增生(BPH))和前列腺感染(前列腺炎)。-血液中前列腺酸性磷酸酶(PAP)的升高水平。-年齡高于50歲的患者。

在優(yōu)選的實施方案中，處于罹患前列腺癌風險的患者群體中的患者是具有高于4ng/ml PSA水平的患者和/或具有陽性DRE的患者。在還更優(yōu)選的實施方案中，處于罹患前列腺癌風險的患者群體由具有在所謂的灰色區(qū)域內的PSA水平的患者組成，該灰色區(qū)域對應與不理想的大量假陽性和假陰性相關的血清或血液中的PSA水平。典型地，該灰色區(qū)域對應于高于4ng/ml并低于10ng/ml的PSA水平。在更優(yōu)選的實施方案中，實施本發(fā)明的方法的受試者是之前沒有實施活檢的患者。一旦將在給定患者體內PCA3、PSMA和PSGR基因的水平與每個相應基因的表達水平作比較，該單個基因的表達水平通過使用多標記ROC曲線分析在理想敏感度下給出的最大特異性來確定，當至少一個上述基因的表達水平高于所述預定的表達水平時，診斷出在理想敏感度下患者罹患前列腺癌。如本文所使用的，在所研究的受試者樣本內，術語基因的“表達水平的顯著升高”是指該表達水平相對于該截止值升高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多。如本文所使用的，術語“特異性”是指當樣本不是陽性時，本發(fā)明的診斷方法給出陰性結果的概率。特異性通過真陰性結果數(shù)除以真陰性與假陽性之和來計算。實質上，特異性是一種方法排除那些沒有罹患前列腺癌的患者的準確度的度量。在本發(fā)明的方法中，可以選擇對PCA3、PSMA和PSGR基因表達的截止值，以使得當敏感度在至少約70%時，診斷個體的特異性在70%至100%的區(qū)域內，例如，在至少60%的受驗的患者群體中，或在至少65%、70%,75%或80%的受驗的患者群體中，該特異性為至少75%、80%、85%、90%或95%。如本發(fā)明實施例中所描述的，該方法能夠診斷出在敏感度為96%，特異性為40%時，存在PCa，其陽性和陰性預測值分別為49%和95% (圖2)。如本文所使用的，術語“陰性預測值”與“NPV”同義，其是指診斷出未患有前列腺癌的個體確實未患有前列腺癌的概率。陰性預測值可以通過真陰性數(shù)除以真陰性和假陰性之和來計算。如本文所使用的，術語“陽性預測值”與“PPV”同義，其是指診斷出患有纖維化的個體確實具有此癥狀的概率。陽性預測值可以通過真陽性數(shù)除以真陽性和假陽性之和來計
算當至少一個本發(fā)明的方法測定的標記表達高于作為參考的截止值水平時，本發(fā)明的方法能夠在理想敏感度下檢測出PCa，而無需大幅度降低該診斷方法的特異性。這種令人驚奇的效果源自以下事實，即在一個患者中不同基因的變更表達可能與在另一個患者中的不同，其取決于腫瘤起源、腫瘤亞型、進展程度。在這種情況下，單個基因或成對明智的基因組合的確定會導致一些實例無法恰當?shù)卦\斷，從而降低敏感度。根據本發(fā)明的方法能夠通過測定所有三個基因的表達來提高敏感度，而不會影響特異性。本領域技術人員將會理解的是，如果至少PCA3、至少PSMA或至少PSGR的表達水平高于截止值時，該診斷可以為陽性。此外，當3種上述基因中的2種的表達水平高于每個基因的參考值，比如，當PCA3和PSMA水平升高時，當PCA3和PSGR水平升高時或當PCA3和PSGR水平升高時，也可以診斷為陽性。此外，當PCA3、PSMA和PSGR的表達水平同時升高時，可以得到陽性診斷結果。由本發(fā)明提供的PCa診斷方法是非侵入性方法，因為其可以通過使用來自所分析的受試者的含有前列腺細胞的尿樣來進行，而且由于該方法的高敏感度和特異性(在敏感度為96%時得到40%的特異性)，其是安全可靠的；此外，陽性和陰性預測值分別為49%和95%。因此，合起來，可以將這些結果用于開發(fā)PCa的高特異性檢驗，這可以容易地整合到常規(guī)的泌尿科醫(yī)生的工作流程中，而且如在下文中將討論的，由于PSA檢驗特別在特殊臨床目的患者組中的低特異性(患者具有4ng/mL至10ng/mL血清PSA并在之前未接受活檢),其可以明顯地降低大量不必要的活檢。在優(yōu)選的實施方案中，考慮到在樣本中基因升高的表達水平可能不是前列腺細胞惡性增殖的結果，而是例如在BPH中發(fā)生的非惡性前列腺增長的結果，所以通過使用持家基因的表達水平將PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平標準化。此外，可以在含有從組織而不是從表達這些標記的前列腺中取得的細胞的樣本中實施該方法。特別地，如果在尿液沉淀中實施該方法，除了癌細胞之外，還可能發(fā)現(xiàn)來自尿路上皮、腎臟、膀胱或血液的細胞。因此，在優(yōu)選的實施方案中，將形成標記組的不同基因的表達水平標準化成持家基因的量。如本文所使用的，術語“標準化”是指定量數(shù)值轉換成可以與從其他基因表達分析中得到的基因表達量相比較的數(shù)值。典型地，使用穩(wěn)定表達的持家基因的基因表達水平實施標準化，將該基因表達水平用作基因表達量的標準化指數(shù)。如本文中所使用的，術語“持家基因”是指通常在所有組織中普遍表達的基因。這些基因編碼蛋白質，其提供所有細胞生存所需的基礎、實質的功能。持家基因通常在所有細胞和組織中以相同水平表達，但有一些差異，特別是在細胞生長和有機體發(fā)展過程中。普遍使用的持家基因包括但不限于GAPDH (3-磷酸甘油醛脫氫酶)、β-肌動蛋白基因、微管蛋白基因、編碼核糖體的18S或28S rRNA亞基的基因。例如，可以在Trends inGenetics, 19, 362-365(2003)中找到持家基因的典型列表。
在優(yōu)選的實施方案中，該持家基因為“前列腺持家基因”。如本文所使用的，術語“前列腺持家基因”是指不管前列腺細胞是正常的前列腺細胞還是前列腺腺癌細胞，都在該細胞中以穩(wěn)定水平表達的基因。該基因允許在樣本中檢測前列腺派生細胞的數(shù)量。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的第一個方法包含在確定PCA3、PSMA和PSG的相同樣本中，標準化成前列腺持家基因表達水平后的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平的用途。本發(fā)明使用的合適的前列腺持家基因包括但不限于PSA (Sokoll等，1997，Urol.Clin.North Am.24:253-259)、DD3 (Cancer Res.，1999，59:5975-9)、HPG-1、PSM、NKX3、前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)、Trp-p8 (Tsvaler等)、前列腺酸性磷酸酶、肌酸激酶、胸腺素b-15、HPCl基礎前列腺癌基因、hKLK2基因編碼的前列腺特異性腺體激肽釋放酶蛋白hK2、前列腺特異性抗原蛋白、hKLK3基因編碼的hK3 (PSA)、SM2基因(W009135019A)、ERG 基因(W009135019A)、TMPRSS2、PSM 或前列腺特異性膜抗原(Fair等,1997, Prostate32:140-148)、PSCA 或前列腺干細胞抗原(Reiter 等,1998.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:1735-1740)、TMPRSS2 (Lin 等，1999.Cancer Res.59:4180-4184)、PDEF (Oettgen 等，2000，J.Biol.Chem.275:1216-1225)、PSG-1 或前列腺特異性基因-1 (Herness, 2003, Cancer Res.63:329-336)、PCA3 (Bussemakers 等，1999.，CancerRes.59:5975-5979]、W098/045420、W001/0235, W02004/070056, W02005/003387), PCGEMl(Srikantan 等，2000.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:12216-12221)和基因 P704P、P712P 和P775P (Stolk 等，2004.Prostate60:214-226)。在優(yōu)選的實施方案中，前列腺持家基因是PSA基因。如本文所使用的，術語PSA是指位于染色體19上的基因，染色體19編碼具有絲氨酸蛋白酶活性的糖蛋白，該糖蛋白通過前列腺的腺上皮細胞在雄激素控制下表達，并分泌成精清以將其液化。正常情況下，PSA蛋白在前列腺內，但是在如癌癥或BPH的前列腺疾病的情況下，PSA滲入到血液中，在其中其以不同的形式存在，該形態(tài)包括與蛋白絡合物組合的形式和不與蛋白絡合物組合的形式(El-Shirbiny, 1994, Adv.Clin.Chem.31:99)?？侾SA血清濃度的測定是前列腺癌患者的篩選和管理中使用最頻繁并獲FDA認可的生物化學試驗之一。迄今為止的研究表明，PSA篩選組合DRE和經直腸超聲，通常提高了早期前列腺癌的檢出率，但其仍局限于腺體本身(Brawer等，1992，J.Urol.147:841)。血清PSA還用于治療后、特別是前列腺癌切除手術后對患者的監(jiān)測。然而，總PSA的測定還鑒別出具有異常升高水平但后來發(fā)現(xiàn)未患有前列腺癌的大量患者。最近，測定游離/總PSA比例百分比的概念示出在對具有4至10ng/mL PSA的男性進行篩選時增加前列腺癌的特異性(Letran等，1998，J.Urol.160:426)。在優(yōu)選的實施方案中，通過使用PSA mRNA水平實施標準化。本發(fā)明的作者還觀察到，可以通過合并前列腺癌的其他生物標記可進一步提高該標記組的診斷值，該其他生物標記選自包含PSA密度(PSAD)或血清PSA水平的組。因此，如本發(fā)明的實施例中所示，包含PCA3、PSMA和PSGR的表達水平以及PSAD的標記組能夠在AUC為0.89時診斷出前列腺癌，其中使用沒有PSAD的3個表達水平導致AUC為0.82。該組合的標記模型的敏感度為96%，特異性為40%。陽性和陰性預測值分別為49%和95% (參見圖2)。術語“生物標記”在本領域內通用，其是指過程、結果或條件的區(qū)別性的生物的或生物派生的指示物。將其他生物標記合并入該診斷方法要求(i)確定所研究的患者體內的其他生物標記值，(ii)將該生物標記值與所述參數(shù)的截止值作比較，其中所述截止值對應通過使用ROC曲線在理想敏感度下提供最高特異性的截止值，該曲線通過使用組合的4個標記組來計算。其中，其他生物標記為PSAD，本發(fā)明的診斷方法還包含(i)確定在所研究的患者體內的PSAD值，(ii)將PSAD值與所述參數(shù)的截止值作比較，其中所述截止值對應通過使用ROC曲線在理想敏感度下提供最高特異性的截止值，該曲線通過使用組合的4個標記組來計算。其中，其他生物標記為PSA，本發(fā)明的診斷方法還包含(i)確定在所研究的患者體內的PSA值，(ii)將PSA值與所述參數(shù)的截止值作比較，其中所述截止值對應通過使用ROC曲線在理想敏感度下提供最高特異性的截止值，該曲線通過使用組合的4個標記組來計算。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的診斷方法還包含步驟(i)確定患者體內的PSAD,步驟(ii )將患者體內的PSAD水平與PSAD的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關的PSAD值，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA、PSGR基因的表達水平和PSAD來計算，并且最后，判定患者是否顯示出 前列腺癌，其中在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高，或PSAD值相對于所述預定的截止值升高，其表明在所述理想敏感度下受試者罹患PCa。如本文所使用的，術語“PSA密度”或PSAD是指來自體液樣本的PSA值除以前列腺體積所得到的PSA值。例如:PSA密度(PSAD) =PSA值/前列腺體積可以通過測定樣本(例如，血清、血液等等，優(yōu)選血清)中PSA的濃度和前列腺體積(描述生態(tài)學)根據以下公式確定PSAD (PSA/前列腺體積)值。PSA密度=PSA體積/前列腺體積可以通過任何確定樣本中PSA的濃度的方法，包括如上所述本領域技術人員眾所周知的常見方法(例如免疫學方法等等)來確定樣本中PSA的濃度。通過測定前列腺體積的任何方法，包括本領域技術人員眾所周知的常見方法(包括但不限于使用公式HxWxLx0.52的所謂TRUS檢查)，來測定前列腺體積。典型地根據超聲測量值來確定該前列腺體積，其包括但不限于以最大尺寸進行的經直腸超聲測量值(TRUS)0在還一特定實施方案中，通過HxWxLx0.52的橢球體積方法來計算TRUS測量值。可以通過測量整個前列腺腺體來計算體積，或可選地，也可以獲得測量過渡區(qū)(TZ) /尿道周良性前列腺腺體葉(腺瘤)的體積并且該值用于確定PSA密度?！敖浿蹦c超聲”或“TRUS”是5至15分鐘的門診病人程序，其使用聲波創(chuàng)建前列腺腺體的視頻圖像。該程序包括將小型潤滑探針置入直腸內，其釋放聲波并當它們進入前列腺時產生回聲。前列腺腫瘤通常產生與正常前列腺組織不同的回聲。反彈回的回聲被發(fā)送到計算機，其將回聲模式轉換成前列腺圖片。使用TRUS估計該前列腺腺體的重量，幫助醫(yī)生對輔助鑒別BPH和PCa的PSA密度有更好的了解?！坝糜跍y定前列腺體積的橢球體積方法”是一種用于評估前列腺體積的方法，而且其是TRUS程序的重要組成部分。已經使用了幾個公式，但是最普遍的一個是橢球公式，其需要3個前列腺尺寸的測量值。通過在最寬的橫向尺寸的估計點上測定橫向和前后尺寸來首先在軸平面確定尺寸。在中線旁邊的徑向平面上測定縱向尺寸，因為膀胱頸經常遮住腺體的向頭側部分。然后應用該橢球體積公式:體積=高度.次數(shù).寬度.次數(shù).長度.次數(shù).0.52?？蛇x地，可以通過使用PSA、cPSA (PSA至α I抗凝乳蛋白酶)、游離PSA、B_PSA (良性PSA)的組合；PR0-PSA (游離 PSA的前體同種型，其與前列腺癌相關而且其由天然PSA前體以及截短的PSA前體形式組成，[-2]pPSA和[_4]pPSA)和/或人類激肽釋放酶(HK2)測量值來確定該前列腺體積。如本文所使用的，術語“PSA”涉及33kDa的胰凝乳蛋白酶類蛋白的血清濃度，該蛋白是人類激肽釋放酶基因家族的一員，其由前列腺腺體細胞產生。如本文所使用的,術語“總PSA血清水平”涉及PSA血清濃度，其對應于“游離PSA”(未結合或不與其他實體結合的PSA)和“結合PSA”(與其他實體如α I抗凝乳蛋白酶(ACT)、α I抗胰蛋白酶(AT)、蛋白酶C抑制劑(PCl)和a 2macroglobupsilonlin (A2M)結合的PSA)之和。如本文所使用的，術語“游離PSA血清水平”是指未結合或不與其他實體結合的PSA的量。術語“游離對總血清PSA的比例”是指“游離PSA”(未結合或不與其他實體結合的PSA)與“結合PSA”(與其他實體如α I抗凝乳蛋白酶(ACT)、α I抗胰蛋白酶(AT)、蛋白酶C抑制劑(PCl)和a 2macroglobupsilonlin (A2M)結合的PSA)在血清中的濃度比例。如本文所使用的，術語“PSA前體”是指PSA的前體形式。PSA的全長度前體形式包括7個氨基酸的前肽(即前導肽)、在237個氨基酸的成熟PSA蛋白之前的APLILSR。PSA前體的全長度氨基酸序列在本領域中是已知的，而且其由Kumar A.等(CancerRes, 1997，57:3111-3114)充分描述過。為了達到本發(fā)明的目的，將前肽序列的最后的氨基酸“R”算作[-1]氨基酸。例如，[_7]PSA前體是具有在前肽的-7氨基酸上起始的末端的PSA前體，其含有全長度PSA前體。[-5]PSA前體表明該PSA前體的末端在該前肽的_5氨基酸上起始，而且其含有該前肽序列的最后5個氨基酸序列。為了達到本發(fā)明的目的，PSA前體包括其末端在前肽的任何氨基酸上起始的全長度和截短形式的PSA前體，即PSA前體可以是[_1]PSA 前體、[_2]PSA 前體、[_3]PSA 前體、[_4]PSA 前體、[_5]PSA 前體、[-6]PSA前體、[_7]PSA前體及以上組合。將術語“PSA倍增時間”定義為在治療期間血清PSA的倍增數(shù)。本發(fā)明的方法能夠鑒定罹患PCa的患者，其中至少一個上述標記相對于截止值明顯地增加。如本領域技術人員將會理解的，如果至少PCA3、至少PSMA或至少PSGR或至少PSAD/血清PSA的表達水平高于截止值水平，診斷為陽性。另外，當3個標記中的2個的表達水平高于每個基因的參考值時，比如，當PCA3水平和PSGR水平升高，當PCA3水平和PSMA水平升高，當PCA3水平和PSAD/血清PSA水平升高，當PSGR和PSMA水平升高，當PSGR水平和PSAD/血清PSA水平升高或當PSMA水平和PSAD/血清PSA水平升高時，也為陽性診斷。此外，當PCA3、PSMA和PSGR的表達水平同時升高，當PCA3、PSMA和PSAD/PSA血清值的表達水平同時升高，當PCA3和PSGR以及PSAD/PSA血清值的表達水平同時升高，當PSGR和PSMA以及PSAD/PSA血清的表達水平同時升高時，得到了陽性診斷結果。用于評估或監(jiān)測對PCa療法響應的方法可以將本發(fā)明的教導用于監(jiān)測和確定對患有PCa的受試者施用的療法的療效。特別地，本發(fā)明基于的事實是可以將不同標記的表達水平用于監(jiān)測PCa是否對給定治療發(fā)生響應。然而，前列腺的手術移除導致不同標記不再表達，因為負責產生這些標記的器官已經不存在了。因此，本發(fā)明的方法特別地用于那些情況，其中使用不會導致前列腺完全移除的方法治療患者(例如，放療、化療等)。因此， 另一方面，本發(fā)明涉及用于評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法響應的方法，其包含比較:(i)確定在施用所述療法前從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)確定在施用所述療法后從所述受試者中分離的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(iii)將施用所述療法前后獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，施用所述療法后，在受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著下降或沒有變化，其表明施用的該療法有效?？蛇x地，另一方面，本發(fā)明涉及用于評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法響應的方法，其包含比較(i)確定在施用所述療法前獲得的從所述受試者中分離的樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)確定在施用所述療法后獲得的從所述受試者中分離的樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(iii)將施用所述療法前后獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患前列腺癌風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，
其中，施用所述療法后，在受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明施用的療法無效。如本發(fā)明所使用的，表述“評估或監(jiān)測對療法的響應”涉及確定患有PCa的受試者對施用于該受試者的療法的響應的可能性。在PCa療法中，可以采取多種治療以試圖根除或控制癌癥。對PCa的治療可以包括主動監(jiān)視、激素療法、包括近距離放療(前列腺近距離放療)和外粒子束輻射的放療、高強度聚焦超聲(HIFU)、化療或一些組合。哪種選擇最好取決于疾病的階段、Gleason評分和PSA水平。其他重要因素為男性年齡、整體健康狀況、對潛在治療的感覺和它們可能產生的副作用。因為所有的治療可具有明顯的副作用，如勃起功能障礙和尿失禁，治療討論通常集中在如何平衡療法的目標和生活方式變更的風險。簡言之，根據上述因素(例如，受試者年齡，以及尺寸、位置和癌癥階段)，可以使用(i)細胞毒性/細胞抑制治療，如化療，其使用抗癌藥品通過使藥品經過血管在體內循環(huán)以破壞癌細胞；放療，其使用高能量輻射殺死癌細胞，和抗癌劑；和/或(ii)免疫療法，其中施用的化合物刺激、提高或增強免疫系統(tǒng)抗癌的天然功能以識別和根除體內的癌細胞。因此，本發(fā)明的方法能夠確定患有PCa的受試者對任何治療的響應，特別地，針對任何細胞毒性和/或細胞抑制治療，更具體地，針對通過化療、放療、抗癌劑或以上組合的方式的治療。合適的化療試劑包括但不限于烷化劑(例如，順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、BBR3464、苯丁酸氮芥、氮芥、環(huán)磷酰胺、Ifosmade、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥、福替目丁、洛莫司汀、鏈脲菌素、白消安、氮烯咪(唑)胺、二氯甲基二乙胺、甲基芐肼、替莫唑胺、ThioTPA、芥尿嘧啶等);抗代謝藥(例如，嘌呤(硫唑嘌呤、巰基嘌呤)、嘧啶(卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他濱)、葉酸(氨甲喋呤、培美曲塞、雷替曲塞)等)；長春花生物堿(例如，長春新堿、長春花堿、長春瑞濱、長春地辛)；紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他奇、BMS-247550等)；蒽環(huán)類抗生素(柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌、戊柔比星、博萊霉素、羥基脲、絲裂霉素等)；拓撲異構酶抑制劑(例 如，托泊替康、伊立替康依托泊苷、替尼泊甙等)；單克隆抗體(例如，阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、吉姆單抗、帕尼單抗、利妥昔單抗、曲妥單抗)；光敏劑(例如，氨基酮戊酸、甲基氨基酮戊酸鹽、葉吩姆鈉、維替泊芬等)；酪氨酸激酶抑制劑(例如，Gleevec( ));表皮生長因子受體抑制劑(例如，Iressa(TM),埃羅替尼(Tarceva( ))、吉非替尼等)；FPTase 抑制劑(例如，F(xiàn)TIs (R115777、SCH66336、L-778，123)等)；KDR 抑制劑(例如，SU6668、PTK787等)；蛋白體抑制劑(例如，PS341等)；TS/DNA合成抑制劑(例如，ZD9331、雷替曲塞(ZD1694、拓優(yōu)得)、ZD9331、5-FU等);S腺苷蛋氨酸脫羧酶抑制劑(例如，SAM468A等)；DNA甲基化劑(例如，TMZ等);DNA粘合劑(例如，PZA等);粘合并鈍化O6-烷基鳥嘌呤AGT的試劑(例如BG) ；c-ra/-l反義寡脫氧核苷酸例如，ISIS-5132 (CGP-69846A));腫瘤免疫治療；留族的和/或非留族的抗炎藥(例如，皮質類固醇、C0X-2抑制劑);或其他試劑如阿利維A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天門冬酰胺酶、貝沙羅汀、硼替佐米、塞來考昔、達沙替尼、Denileukin Diftitox、雌氮芥、羥基脲、伊馬替尼、噴司他丁、馬丙考、米托擔、天門冬酰胺酶和維甲酸。合適的化療試劑在相關文獻中有更詳細的描述，如The MerckIndex in CD-ROM, 13thedition。根據本發(fā)明的這一方面，將在第一時間段從患有PCa的受試者身上獲得的樣本(第一受試者樣本)中確定的基因PCA3、PSMA和PSGR表達水平與在第二時間段從患有PCa的受試者身上獲得的樣本(第二受試者樣本)中確定的基因PCA3、PSMA和PSGR表達水平作比較，從而能夠評估或監(jiān)測所述患有PCa的受試者對療法響應的效力?？梢栽诘诙r間段，也就是第一時間段后的任何時間，例如第一受試者樣本后的I天、I周、I個月、2個月、3個月、I年、2年或更久的時間，從進行第一次測定的患有PCa的相同受試者身上采集第二受試者樣本。在特殊實施方案中，在受試者接受治療(例如化療或放療)前采集第一受試者樣本；并在治療后采集第二受試者樣本。在另一特殊實施方案中，在受試者已經開始/接受治療(例如化療或放療)后采集第一受試者樣本，并在之后，在治療過程的不同時間段采集第二受試者樣本，將評估和監(jiān)測該治療的療效。這些方法能夠對之前診斷出PCa的所選受試者的特定治療進行評估。因此，如果該療法對治療所述受試者體內的PCa無效，那么應該改變所述療法并應該設計新療法以治療所述受試者體內的PCa。根據此方法可以輕易的跟進新治療過程。如前所述關于本發(fā)明的診斷方法，可以通過本領域中已知的任何合適方法(例如qPCR)來確定生物標記基因(PCA3、PSMA和PSGR)的表達水平。在大量可重復的條件下獲得
該測量值。一旦確定在不同時間段的受試者樣本(第一和第二受試者樣本)中生物標記基因的表達水平，則有必要鑒定，在第二受試者樣本中每一個所述基因的表達與在第一受試者樣本中的所述基因生物標記的表達水平相比是否顯著下降。當?shù)诙茉囌邩颖局械谋磉_水平相對于第一受試者樣本中的該表達水平降低了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100% (即缺失)時，在所研究的第二受試者樣本中基因表達相對于所述第一受試者樣本中所述生物標記基因的表達水平的降低被認為是“顯著下降”。同樣地，當?shù)诙茉囌邩颖局械谋磉_水平相對于第一受試者樣本中的該表達水平升高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多時，所研究的第二個受試者樣本中的基因表達相對于所述第一受試者樣本中所述生物標記基因的表達水平的升高被認為是“顯著升高”。同樣地，當研究第二受試者樣本中的表達水平時，所研究的第二受試者樣本中基因表達相對于所述第一受試者樣本中所述生物標記基因的表達水平沒有變化，這表明該表達水平在兩個測量值之間是實質上恒定的。例如，恒定的表達水平表明第一測量值不高于105%、不高于104%、不高于103%、不高于102%、不高于101%、不低于99%、不低于98%、不低于97%、不低于97%、不低于96%或不低于95%。因此，在第二受試者樣本中至少一個所述生物標記基因(PCA3、PSMA和PSGR)的表達水平相對于在第一受試者樣本中每個所述生物標記基因的表達水平顯著下降，其表明施用于患有PCa的受試者的療法是有效的。反之，如果在第二受試者樣本中所述生物標記基因的表達水平相對于在第一受試者樣本中所述生物標記基因的表達水平沒有顯著下降(沒有變化或顯著升高)，或者甚至，在第二受試者樣本中至少一個所述生物標記基因的表達水平相對于在第一受試者樣本中至少一個所述生物標記基因的表達水平顯著升高，那么施用于所述受試者的該療法對治療所述受試者體內的PCa是無效的；因此，應該改變所述療法并設計新療法以治療所述受試者體內的PCa。根據此方法可以輕易的跟進新治療過程。此外，可以通過將不同基因的表達水平與對PCa的其他生物標記值結合來進一步改進根據本發(fā)明的用于評估或監(jiān)測對PCa療法響應的方法，從而，當至少一個上述基因的表達水平或至少其他生物標記值低于截止值時，該療法被認為是有效的，或者當至少一個上述基因的表達水平或至少其他生物標記值高于截止值時，療法被認為是無效的。如本發(fā)明的診斷方法的上下文所描述的，從由PSA密度(PSAD)、游離血清PSA水平、總血清PSA水平、游離血清PSA水平對總血清PSA水平的比例、PSA前體水平和PSA倍增時間(PSADT)或PSA組成的組中選出其他生物標記。因此，在優(yōu)選的實施方案中，通過施行上述定義的步驟(i)和(ii)來實施根據本發(fā)明的用于監(jiān)測對療法響應的方法，但是其中步驟(i )和(ii )還包含確定來自患者體內的PSAD，其中步驟(iii)還包含將患者體內的PSAD水平與對PSAD的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC (接受者操作特征曲線)中在所述理想敏感度下的最高特異性相關的PSAD值，該曲線根據在處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和PSAD來計算。最后，該方法能夠得出療法是否有效，其如下所述進行判斷，即如果檢測出在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值降低了，或PSAD值相對于所述預定的截止值降低了，療法是有效的，或者如果檢測出在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高了或沒有變化，或PSAD值相對于所述預定的截止值升高了或沒有變化，療法是無效的。因此，在優(yōu)選的實施方案中，通過施行上述定義的步驟(i)和(ii)來實施根據本發(fā)明的用于監(jiān)測對療法響應的方法，但是其中步驟(i)和(ii)還包含確定來自患者體內的PSA，其中步驟(i i i )還包含將患者體內的PSA水平與PSA的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC (接受者操作特征曲線)中在所述理想敏感度下的最高特異性相關的PSA值，該曲線根據在處于罹患前列腺癌風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和PSA來計算。最后，該方法能夠得出療法是否有效，其如下所述進行判斷，即如果檢測出在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值降低了，或PSA值相對于所述預定的截止值降低了，療法是有效的，或者如果檢測出在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高了或沒有變化，或PSA值相對于所述預定的截止值升高了或沒有變化，療法是無效的。監(jiān)測等試者體內PCa的講展還可以將本發(fā)明的教導用于監(jiān)測受試者體內PCa的進展。因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種用于監(jiān)測受試者體內PCa進展的方法，其包含(i)確定在第一時間段從所述受試者身上分離的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)確定在第二時間段分離的相同受試者的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，而且所述第二時間段晚于所述第一時間段； (iii)將在第一和第二時間段獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在第二時間段，受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于在第一時間段的所述表達水平顯著下降或沒有變化，其表明PCa在受試者體內沒有進展。可選地，用于監(jiān)測受試者體內PCa進展的方法包含a)確定在第一時間段獲得的受試者樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及b)確定在第二時間段獲得的相同受試者的樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，而且所述第二時間段晚于所述第一時間段；c)將在第一和第二時間段獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特 征)曲線中在所述理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在第二時間段，受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于在第一時間段的所述表達水平顯著升高，其表明PCa有進展。如本發(fā)明所使用的，表述“監(jiān)測PCa的進展”相當于“確定預后”，其涉及確定一個或幾個表明診斷患有PCa的患者體內疾病進展的參數(shù)。適用于確定診斷患有PCa的受試者發(fā)展的參數(shù)選自由腫瘤響應、復發(fā)風險、無病生存和/或該受試者的總生存率構成的組。如本文所使用的，表述“復發(fā)風險”應理解為受試者在無病階段后再次發(fā)生PCa和/或二次轉移的概率；“無病生存”應理解為在治療后沒有發(fā)現(xiàn)癌癥的時段；而“受試者總生存率”應理解為從診斷或治療的時間起，在確定的時段后受試者存活的百分比。如本文所使用的，疾病惡化是指在優(yōu)選的實施方案中，可以將用于監(jiān)測PCa進展的方法用于檢測器官局限性疾病(O⑶)與非器官局限性疾病(NO⑶)之間的差異。在另一優(yōu)選的實施方案中，可以將用于監(jiān)測PCa進展的方法用于預測侵略性前列腺癌或臨床顯著的/慢性PCa)。根據本發(fā)明的這一方面，將在第一時間段從患有PCa的受試者身上獲得的樣本(第一受試者樣本)中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和在第二時間段從患有PCa的受試者身上獲得的樣本(第二受試者樣本)中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平分別與每個基因的截止值作比較，其中對所述截止值如上所述地進行確定?？梢栽诘诙r間段，即第一時間段后的任何時間，例如第一受試者樣本后的I天、I周、I個月、2個月、3個月、I年、2年或更久的時間，從進行第一次測量的患有PCa的相同受試者身上采集第二受試者樣本。在特定實施方案中，在受試者接受治療(例如化療或放療)前采集第一受試者樣本；并在治療后采集第二受試者樣本。在另一特定實施方案中，在受試者已經開始/接受治療(例如化療或放療)后采集第一受試者樣本，并在之后，在治療過程的不同時間段采集第二受試者樣本。這些方法能夠對之前診斷罹患PCa的所選受試者的Pca進展進行評估。因此，如果該PCa預后不良，那么應該設計其他療法以治療所述受試者體內的PCa。根據本發(fā)明提供的教導可以輕易的跟進施用所述新治療后PCa的進展。
如前所述關于本發(fā)明的診斷方法，可以通過本領域已知的任何合適方法(例如qPCR)來確定生物標記基因(PCA3、PSMA和PSGR)的表達水平。在大量可重復的條件下獲得
該測量值。一旦確定在不同時間段的受試者樣本(第一和第二受試者樣本)中生物標記基因的表達水平，則有必要鑒定，在第二受試者樣本中至少一個所述基因的表達與在第一受試者樣本中的所述基因生物標記的表達水平相比是否顯著升高?？蛇x地，如果需要，可以分析在第二受試者樣本中至少一個所述基因的表達與在第一受試者樣本中所述基因生物標記的表達水平相比是否顯著下降或沒有變化。應用于生物標記基因表達水平的術語“顯著升高”、“顯著下降”和“沒有變化”在之前已經定義。因此，在第二受試者樣本中至少一個所述生物標記基因(PCA3、PSMA和PSGR)的表達水平相對于在第一受試者樣本中每個所述生物標記基因的表達水平顯著升高，其表明所研究的受試者體內PCa在進展(即其具有不良的預后);因此，應該改變施用于所研究的受試者的療法并應該設計新療法以治療所述受試者體內的PCa。根據此方法可以輕易跟進受試者體內PCa的進展。反之，如果在第二受試者樣本中至少一個所述生物標記基因的表達水平相對于在第一受試者樣本中每個所述生物標記基因的表達水平沒有顯著升高，或者甚至，如果在第二受試者樣本中至少一個所述生物標記基因的表達水平相對于在第一受試者樣本中每一個所述生物標記基因的表達水平顯著下降，那么所研究的該受試者體內的PCa沒有進展(即，其不具有不良預后)。此外，可以通過不同基因表達水平與PCa的其他生物標記值的結合來進一步改進根據本發(fā)明的用于監(jiān)測PCa進展的方法，從而當至少一個上述基因的表達水平或至少所述其他生物標記值低于截止 值時，可以認為疾病沒有進展。如上所述，在由PSAD和PSA組成的組中選擇其他生物標記。因此，另一方面，通過施行上述定義的步驟(i)和(ii)來實施根據本發(fā)明的用于監(jiān)測對療法響應的方法，但是其中步驟(i)和(ii)還包含確定患者體內的PSAD，其中步驟
(iii)還包含將患者體內的PSAD水平與PSAD的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC (接受者操作特征曲線)中在所述理想敏感度下的最高特異性相關的PSAD值，該曲線根據處于罹患前列腺癌風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和PSAD來計算。最后，該方法能夠推斷PCa是否有進展，即如果所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高了或沒有變化，或PSAD值相對于所述預定的截止值升高了或沒有變化，則PCa在進展中。另一方面，通過施行上述定義的步驟(i )和(i i )來實施根據本發(fā)明的用于監(jiān)測對療法響應的方法，但是其中步驟(i )和(i i )還包含確定患者的體內的PSA，其中步驟(i i i )還包含將患者體內的PSA水平與PSA的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC (接受者操作特征曲線)中在所述理想敏感度下的最高特異性相關的PSA值，該曲線根據處于罹患前列腺癌危險風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因和PSA的表達水平來計算。該方法能夠推斷PCa是否有進展，如果檢測出在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高了或沒有變化，或PSA值相對于所述預定的截止值升高了或沒有變化，則PCa在進展中。
選擇活檢患者如上所述，可以將本發(fā)明的教導用于選擇活檢患者。事實上，由于PSA檢驗的低特異性進行了很多不必要的活檢。特別是具有在被稱為“灰色區(qū)域”的4.0ng/mL至
10.0ng/mL區(qū)域中的血清PSA水平的患者的情況下，PSAD遠比總PSA更精確(Ohori M,等Urology46:666-71(1995))。
如本發(fā)明的作者所示，本發(fā)明的標記組的應用能夠判定具有升高的敏感度和特異性的患者是否罹患PCa，從而能夠大幅度減少不必要活檢的數(shù)量。比如本發(fā)明的實施例中所示，通過在特殊臨床目的組(血清PSA范圍在4ng/mL至10ng/mL內，并在之前未接受活檢)中使用本發(fā)明提供的3分量生物標記結合PSAD節(jié)省的活檢數(shù)計算為“節(jié)省的活檢=真陰性+假陰性”，其將是:-敏感度為100%時，可以節(jié)省32.5%的活檢，-敏感度為96%時，可以節(jié)省41.6%的活檢，這對應于歐洲地區(qū)每年節(jié)省大約126，750至162，240的活檢。因此，另一方面，本發(fā)明涉及用于評估受試者是否必須接受前列腺活檢的方法，其包含(i)確定從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及(ii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算，其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明該受試者是前列腺活檢的候選者?？梢酝ㄟ^確定其他前列腺生物標記來改進用于評估受試者是否必須接受前列腺活檢的方法。特別的，該其他標記可以是PSA密度(PSAD)、游離血清PSA水平、總血清PSA水平、游離血清PSA水平對總血清PSA水平的比例、PSA前體水平和PSA倍增時間(PSADT)(如上述在本發(fā)明的診斷方法的內容中所解釋的進行定義和計算)。根據本發(fā)明的方法進行分析的患者優(yōu)選是之前未接受前列腺活檢的患者。在另一優(yōu)選的實施方案中，根據本發(fā)明進行分析的該患者是之前至少接受過一次活檢、之前至少接受過兩次活檢、之前至少接受過三次或更多次活檢的患者。因此，在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明選擇活檢的患者的方法，其中步驟(i)還包含在確定患者體內的PSAD，其中步驟(ii)還包含將患者體內的PSAD水平與PSAD的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC (接受者操作特征曲線)中在所述理想敏感度下的最高特異性相關的PSAD值，該曲線根據處于罹患前列腺癌風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和PSAD來計算，而且其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高，或PSAD值相對于所述預定的截止值升高，其表明該受試者為前列腺活檢的候選者。在另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明選擇活檢的患者的方法，其中步驟(i)還包含確定患者體內PSA， 其中步驟(ii )還包含將患者體內的PSA水平與PSA的預定的截止值作比較，其中所述預定的截止值對應與ROC (接受者操作特征曲線)中在所述理想敏感度下的最高特異性相關的PSA值，該曲線根據處于罹患前列腺癌風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和PSA來計算，而且其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高，或PSA值相對于所述預定的截止值升高，其表明該受試者為前列腺活檢的候選者。在優(yōu)選的實 施方案中，用于評估受試者是否必須接受前列腺活檢的方法由PSA水平高于4ng/mL的患者、具有陽性DRE的患者或50歲以上的患者組成。在更優(yōu)選的實施方案中，處于摧患PCa風險的患者群體由PSA水平低于10ng/mL的患者組成。本發(fā)明的試劑盒另一方面，本發(fā)明涉及包含第一組分和可選的第二組分的試劑盒，其中該第一組分是一套試劑，其由以下試劑組成( i )能夠確定基因PCA3表達水平的試劑；(ii)能夠確定基因PSMA表達水平的試劑；(iii)能夠確定基因PSGR表達水平的試劑；其中，第二組分由能夠確定一個或多個前列腺持家基因表達水平的一個或多個試劑組成。可以將本發(fā)明的試劑盒用于診斷PCa，即用于評估患者是否罹患PCa，或用于評估或監(jiān)測PCa患者對療法的響應，即用于評估治療對診斷出PCa的受試者的療效，或用于監(jiān)測受試者體內PCa的進展或分化，即用于確定診斷出PCa的受試者的預后。在本發(fā)明的上下文中，“試劑盒”應理解為含有實施本發(fā)明的方法所必須的不同試劑的產品，將其包裝以便運輸和儲存。適于包裝試劑盒成分的材料包括水晶、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等等)、瓶、管瓶、紙、信封等等。此外，本發(fā)明的試劑盒可以包含試劑盒內不同成分的同時、連續(xù)或獨立使用的說明書。所述說明書可以是打印的材料的形式，或能夠被受試者讀取的可以儲存說明書的電子支持的形式，如電子存儲介質(磁盤、磁帶等等)、光學介質(CD-ROM、DVD)等等。此外或者可選地，該介質可以含有提供所述說明書的互聯(lián)網adDRMsses?！澳軌虼_定基因表達水平的試劑”是指能夠確定基因表達水平，例如，RNA材料的提取等等，例如，確定對應mRNA的水平等等的一種化合物或一套化合物，例如通過RT的方式用于對應的cDNA合成的引物，用于DNA擴增的引物，能夠與由所述基因編碼的mRNA (或相應的cDNA)特異性雜交的探針，Taqman探針等等。在特定實施方案中，設計本發(fā)明的試劑盒以用于qPCR試驗。此外，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒的第一組分由PCA3、PSMA和PSGR每一個基因的特異性Taqman探針組成。用于qPCR分析的基因表達試驗可以由本領域技術人員設計或購買自例如AppliedBiosystems，編碼 Hs01371938-ml (PCA3)、Hs00379515-ml (PSMA)和 Hs00951952-ml (PSGR)(實施例1)。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的試劑盒的用途，其用于PCa的診斷、評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法的響應、監(jiān)測受試者體內PCa的進展或判定患者是否必須接受前列腺活檢。在優(yōu)選的實施方案中，對具有4ng/mL至10ng/mL血清PSA水平的受試者實施本發(fā)明的試劑盒。通過以下實施例的方式對本發(fā)明進行詳述，其僅為說明，而絕不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1尿液中PCa早期檢測的Ξ基因組的鑒定1.材料和方法1.1患者和尿液收集此研究獲Vall d’ Hebron醫(yī)院的機構審查委員會認可。從Vall d’ Hebron醫(yī)院(巴塞羅那-西班牙)的泌尿部門獲得并在前列腺按摩(PM)后立刻從接受前列腺活檢的198個男性身上采集所有尿樣，活檢指示為異常的直腸指檢(DRE)和/或高于4.0ng/ml的血清PSA。獲得所有患者的書面通知許可。將具有其他已知腫瘤和/或之前接受過PCa療法的患者從此研究中排除。表I示出了這154個患者的臨床和病理學信息數(shù)據。PM操作方法:通過對前列腺從底到頂，每個葉從側邊到中線系統(tǒng)地應用數(shù)字重壓施行PM?；顧z操作方法 和PCa檢出率:使用端射式超聲波換能器(Falcon2101，B-KMedical Inc)和自動18號針頭(Bard，Inc.)進行活檢。根據維也納列線圖，每個過程中除去的最低核心數(shù)量為10，而且將1-8個的多余核心除去(Remzi等，J.Urol.2005; 174:1256-60;discussionl260_l;author replyl261)。在所研究的總受試者組中，198個樣本中有154個獲得了足夠用于分析的RNA，其對應78%的信息樣本率(91%的PCa患者和28%的良性患者)。通過前列腺活檢的PCa檢出率為37% (57/154)。在77個特殊臨床目的患者的子組中，為了判定是否應該施行活檢，而且其具有4ng/mL至10ng/mL的PSA范圍并在之前未接受活檢，該PCa檢出率為36%( 28/77)(表 I)。表1:信息患者的臨床和病理學信息
權利要求
1.一種在理想敏感度下用于診斷受試者體內前列腺癌(PCa)的方法，其包括 (i)確定從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及 (ii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算， 其中，在所述生物流體樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明在所述理想敏感度下該受試者罹患PCa。
2.根據權利要求1所述的方法， 其中步驟(i)還包含確定患者體內用于PCa的其他生物標記，其中所述生物標記選自由PSA密度(PSAD)、游離血清PSA水平、總血清PSA水平、游離PSA水平對總血清PSA水平的比例、PSA前體水平和PSA倍增時間(PSADT)構成的組，以及 其中步驟(ii)還包含比較患者體內所述其他生物標記的水平與所述生物標記的預定的截止值，其中所述預定的截止值對應生物標記值，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在所述理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和其他生物標記的水平來計算，以及 其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高，或其他生物標記的水平相對于所述預定的截止值升高，其表明在所述理想敏感度下該受試者摧患PCa。
3.一種用于評估或監(jiān)測患有PCa的受試者對療法響應的方法，其包含比較 (i)確定在施用所述療法之前獲得的從所述受試者分離的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及 (ii)確定在施用所述療法過程之中或之后從所述受試者中分離的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及 (iii)將施用所述療法之前和之中或之后獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算， 其中，施用所述療法后，生物流體樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著下降或沒有變化，其表明施用的療法有效， 或者 其中，施用所述療法后，生物流體樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明施用的療法無效。
4.根據權利要求3所述的方法，其中步驟(i)和步驟(ii)還包含確定患者體內對PCa的其他生物標記，其中所述其他生物標記選自由PSA密度(PSAD)、游離血清PSA水平、總血清PSA水平、游離PSA水平對總血清PSA水平的比例、PSA前體水平和PSA倍增時間(PSADT)構成的組，以及 步驟(iii)還包含比較所述其他生物標記的水平與所述生物標記的預定的截止值，其中所述預定的截止值對應生物標記值，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和所述其他生物標記來計算， 其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著下降或沒有變化，或所述生物標記的水平相對于所述預定的截止值降低了，其表明施用的療法有效， 或者 其中，使用所述療法后，在該受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，或所述生物標記的水平相對于所述預定的截止值顯著升高，其表明施用的療法無效。
5.一種用于監(jiān)測受試者體內前列腺癌(PCa)進展的方法，其包含 (i)確定在第一時間段從所述受試者身上分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組， (ii)確定在第二時間段從相同受試者身上獲得的生物流體樣本中的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中 所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，而且其中所述第二時間段晚于所述第一時間段，以及 (iii)將在第一和第二時間段獲得的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算， 其中，在第二時間段，在該樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于在第一時間段的所述表達水平顯著下降或沒有變化，其表明前列腺癌在該受試者體內沒有進展， 或者 其中，在第二時間段，在該受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于在第一時間段的所述表達水平顯著升高，其表明前列腺癌的進展。
6.根據權利要求5所述的方法， 其中步驟(i)和步驟(ii)還包含確定患者體內對PCa的其他生物標記的水平，其中所述其他生物標記選自由PSA密度(PSAD)、游離血清PSA水平、總血清PSA水平、游離PSA水平對總血清PSA水平的比例、PSA前體水平和PSA倍增時間(PSADT)構成的組，以及 步驟(iii)還包含比較患者體內所述生物標記的水平與所述生物標記的預定的截止值，其中所述預定的截止值對應生物標記水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在所述理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和所述生物標記來計算， 其中，在第二時間段，在該受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平或該生物標記的水平相對于在第一時間的段所述表達水平顯著下降或沒有變化，其表明受試者的陽性進展， 或者 其中，在第二時間段，在該受試者樣本中至少一個所述基因的表達水平或該生物標記的水平值相對于在第一時間段的所述表達水平顯著升高，其表明受試者的陰性進展。
7.一種用于評估受試者是否必須接受前列腺活檢的方法，其包含 (i)確定從所述受試者中分離的生物流體樣本中的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平，其中所述生物流體選自由尿液、前列腺分泌物、精液和前列腺按摩后的尿液組成的組，以及 (ii)將所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平與每個所述基因的預定的截止值作比較，其中每個基因的所述預定的截止值對應所述基因的表達水平，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平來計算， 其中，在所述生物流體樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值顯著升高，其表明該受試者是前列腺活檢的候選者。
8.根據權利要求7所述的方法， 其中步驟(i)還包含確定患者體內對PCa的其他生物標記，其中所述其他生物標記選自由PSA密度(PSAD)、游離血清PSA水平、總血清PSA水平、游離PSA水平對總血清PSA水平的比例、PSA前體水平和PSA倍增時間(PSADT )，而且 步驟(ii)還包含比較患者體內所述其他生物標記的水平與所述生物標記的所述預定的截止值，其中所述預定的截止值對應生物標記水平值，其與ROC (接受者操作特征)曲線中在理想敏感度下的最高特異性相關，該曲線根據處于罹患PCa風險的患者群體中確定的所述PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平和所述生物標記來計算， 其中，在所述樣本中至少一個所述基因的表達水平相對于所述基因的所述預定的截止值升高，或所述生物標記的水平相對于所述預定的截止值升高了，其表明該受試者是前列腺活檢的候選者。
9.如權利要求7或8中任一項所定義的方法，其中處于罹患PCa風險的患者群體由PSA水平高于4ng/mL和/或具有陽性DRE的患者組成。
10.根據權利要求9所述的方法，其中處于罹患PCa風險的患者群體由PSA水平低于10ng/mL的患者組成。
11.在權利要求1至10中任一項所定義的方法，其中所述生物流體樣本是在前列腺按摩后獲得的排出尿液樣本的沉淀。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述理想敏感度為100%。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的方法，其中在確定PCA3、PSMA和PSGR的相同的樣本中，將PCA3、PSMA和PSGR基因的表達水平標準化成前列腺特異性持家基因的表達水平。
14.根據權利要求13所述的方法，其中前列腺持家基因是PSA，而且通過測定該PSAmRNA水平確定PSA的表達水平。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其中通過定量PCR確定所述PCA3、PSMA和PSGR基因和/或所述持家基因的表達水平。
16.根據權利要求15所述的方法，其中定量PCR是多重PCR。
17.根據權利要求1至16任一項所述的方法，其中該患者罹患單獨的或多病灶高等級前列腺上皮內瘤。
18.—種包含第一組分和可選的第二組分的試劑盒，其中第一組分是一套試劑，其由以下組成 (i)能夠確定基因PCA3表達水平的試劑； (ii)能夠確定基因PSMA表達水平的試劑； (iii)能夠確定基因PSGR表達水平的試劑； 其中，第二組分由能夠確定一個或多個前列腺持家基因表達水平的一個或多個試劑組成。
19.根據權利要求18所述的試劑盒的用途，其用于診斷前列腺癌、評估或監(jiān)測罹患前列腺癌的受試者對療法的響應或監(jiān)測受試者體內前列腺癌的進展。
20.根據權利要求19所述的用途，其中作為前列腺活檢的候選者而待評估的受試者具有4ng/mL至10ng/mL的血清PSA水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷受試者體內前列腺癌(PCa)的方法和試劑盒，其根據檢測選自PCA3、PSMA和PSGR的組的至少一個基因表達水平的變化來評估或監(jiān)測罹患PCa的受試者對療法的響應或監(jiān)測前列腺癌PCa的進展。本發(fā)明還涉及用于評估受試者是否必須接受前列腺活檢的方法，所述受試者具有4ng/mL至10ng/mL的血清PSA濃度。
文檔編號C12Q1/68GK103221553SQ201180044323
公開日2013年7月24日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權日2010年7月14日
發(fā)明者安德列亞斯·多利, 瑪麗娜·里加圖雷西納, 胡安·莫羅特羅布萊斯, 米格爾·阿巴爾波薩達, 豪梅·雷文托斯普伊赫哈內爾 申請人:瓦爾德希伯倫大學醫(yī)院發(fā)展研究院非公募基金會