專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學等領(lǐng)域，具體涉及ー種低溫殼聚糖酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶主要應(yīng)用于制備具有獨特生理活性和功能的殼寡糖，用于環(huán)保、醫(yī)藥、食品、化妝品、生態(tài)農(nóng)業(yè)病蟲害防治、以及其他殼聚糖酶應(yīng)用行業(yè)?？梢蕴岣咴系睦寐?、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，減少エ藝流程，増加經(jīng)濟效益，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。
背景技術(shù)：
殼聚糖酶(Chitosanase, EC 3.2. I. 132)是ー類催化殼聚糖分子中β_1，4_糖苷鍵斷裂，專ー性降解殼聚糖的糖苷水解酶(逄玉娟等，中國海洋大學學報，2005)。水解殼聚糖制備功能性低分子量殼寡糖，在功能食品、保健藥品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用，還具有抗細菌、真菌、調(diào)節(jié)機體免疫及抗癌等功能(屠潔，江蘇農(nóng)業(yè)科學，2009)。目前國內(nèi)外對微生物發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶研究與應(yīng)用主要集中于中溫殼聚糖酶和高溫殼聚糖酶；有關(guān)微生物發(fā)酵 生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶的研究處于起步階段，主要是菌株選育、發(fā)酵條件、酶學性質(zhì)及酶分子特性等研究(陽麗等，化學工程與裝備，2010 ;陳小娥等，食品與發(fā)酵エ業(yè)，2004 ;季更生等，食品科學，2010);微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用還未見報道(黃永春等，化工進展，2002)。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶與高溫、中溫殼聚糖酶相比具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢，因為低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節(jié)能方面有相當大的優(yōu)勢；經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)(黃益等，生物技木，2008)，這將有助于微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶的推廣和使用。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶的應(yīng)用將對傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工、能源和環(huán)保等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠的影響(王宏欽等.エ業(yè)微生物，2000 ;方文建等，中國醫(yī)藥エ業(yè)雜志，2006)。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶用于殼寡糖生產(chǎn)相比于化學方法合成殼寡糖以及中溫、高溫酶轉(zhuǎn)化方法，具有反應(yīng)條件溫和、寡糖得率高、對環(huán)境污染小、產(chǎn)物安全性高等優(yōu)勢，降低生產(chǎn)成本，減少生產(chǎn)エ藝流程，提高生產(chǎn)效率(戴大章，功能高分子學報，2005)。可以從根本上擺脫中溫酶、高溫酶以及化學合成等方法生產(chǎn)殼寡糖的加熱、冷卻設(shè)備和エ藝。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫殼聚糖酶具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供ー種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶的方法，該方法主要是微生物經(jīng)過低溫馴化后，在10 16°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶的方法，發(fā)酵液酶活力最高達到170U/ml，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。添加該酶制劑在低于30°C催化就可明顯提高原料的轉(zhuǎn)化率。該酶制劑應(yīng)用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和エ藝。本發(fā)明所述的ー種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶的方法具體包括以下步驟
(I)將產(chǎn)生殼聚糖酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的殼聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子；
(3)將液體一級種子或ニ級種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)72 144h吋，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。殼聚糖酶產(chǎn)生菌(例如，CGMCC菌種編號4. 477等)，菌株先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶，低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖2. 0g, NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，瓊脂20. 0g, pH值7. 2，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨7. O 13. Og,酵母提取物3. O 7. Og,葡萄糖
I.5 2. 5g, NaCl 3. O 7. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖I. 5 2，5g,蛋白胨8. O 12. Og,酵母提取物3. O
7.0g, K2HPO4 O. 5 O. 9g, KH2PO4 O. I O. 5g, NaCl 3. O 7. 0g, MgSO4 · 7Η200· 4 O. 6g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基殼聚糖5. O 15. Og,葡萄糖I. O 4. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母提取物 3. O 8. 0g，K2HPO4 0. 5 0. 9g, KH2PO4 0. I 0. 6g，NaCl 3. O 7. Og,MgSO4 · 7H20 0.2 0.6g，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產(chǎn)生殼聚糖的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的殼聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)48 72h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發(fā)酵液體積3 5%的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10 12°C培養(yǎng)120 144h吋，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；
(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫殼聚糖酶制劑。實施例ニ (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖2. 0g, NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，瓊脂20. 0g, pH值7. 2，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨7. O 13. Og,酵母提取物3. O 7. Og,葡萄糖I. 5 2. 5g, NaCl 3. O 7. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖I. 5 2，5g，蛋白胨8. O 12. 0g，酵母提取物3. O
7.0g, K2HPO4 O. 5 O. 9g, KH2PO4 O. I O. 5g, NaCl 3. O 7. 0g, MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基殼聚糖5. O 15. Og,葡萄糖I. O 4. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母提取物 3. O 8. 0g，K2HPO4 0. 5 0. 9g, KH2PO4 0. I 0. 6g，NaCl 3. O 7. Og,MgSO4 · 7H20 0.2 0.6g，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產(chǎn)生殼聚糖的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的殼聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)48 72h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發(fā)酵液體積5 7%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在12 14°C培養(yǎng)96 120h吋，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫殼聚糖酶制劑。實施例三(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖2. 0g, NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，瓊脂20. 0g, pH值7. 2，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨7. O 13. Og,酵母提取物3. O 7. Og,葡萄糖I. 5 2. 5g, NaCl 3. O 7. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖I. 5 2，5g，蛋白胨8. O 12. 0g，酵母提取物3. O
7.0g, K2HPO4 0. 5 0. 9g, KH2PO4 0. I 0. 5g, NaCl 3. O 7. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 4 0. 6g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基殼聚糖5. O 15. Og,葡萄糖I. O 4. Og,蛋白胨5. O 、15. 0g，酵母提取物 3. O 8. 0g，K2HPO4 0. 5 0. 9g, KH2PO4 0. I 0. 6g，NaCl 3. O 7. Og,MgSO4 · 7H20 0.2 0.6g，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產(chǎn)生殼聚糖的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的殼聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)48 72h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)， 制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發(fā)酵液體積7 9%的接種量接入100L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在14 16°C培養(yǎng)72 96h吋，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫殼聚糖酶制劑。
權(quán)利要求
1.ー種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產(chǎn)生殼聚糖酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好； (2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的殼聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子； (3)將液體一級種子或ニ級種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)72 144h吋，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備 成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，在步驟(5)之后進ー步包括將步驟(5)得到的粗酶液進ー步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為(1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基蛋白胨7.O 13. Og,酵母提取物3. O 7. Og,葡萄糖I. 5 ·2.5g, NaCl 3. O 7. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖1.5 2，5g，蛋白胨8.O 12. 0g，酵母提取物3. O ·7.0g, K2HPO4 O. 5 O. 9g, KH2PO4 O. I O. 5g, NaCl 3. O 7. 0g, MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基殼聚糖5.O 15. Og,葡萄糖I. O 4. 0g，蛋白胨5. O 15. Og,酵母提取物 3. O 8. 0g，K2HPO4 O. 5 O. 9g，KH2PO4 O. I O. 6g，NaCl 3. O 7. 0g，MgSO4 · 7H20·O.2 O. 6g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶的方法是將產(chǎn)生溶菌酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長良好；將低溫馴化后的殼聚糖酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級擴大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫殼聚糖酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/42GK102653749SQ20121010873
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者于爽, 崔愛萍, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉 申請人:大連大學