專利名稱：檢測綿羊無漿體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測動物血液病原菌的試劑盒。確切講本發(fā)明涉及一種用于檢測綿羊無漿體的試劑盒。
背景技術(shù)：
綿羊無衆(zhòng)體(A naplasma ovis)是立克次體目(Rickettsiales)、無衆(zhòng)體科(Anaplasmataceac)中的無衆(zhòng)體屬(Anaplasma)的一個重要成員，Schellase等人于1912年首先報道在東非發(fā)現(xiàn)了綿羊無漿體，綿羊無漿體有廣泛的宿主，已經(jīng)證明它能寄生于綿羊、山羊、馬鹿、白尾鹿、羚羊和大角羊等反芻動物的體內(nèi)，綿羊無漿體經(jīng)節(jié)肢動物-蜱傳播后寄生于宿主動物的紅細胞內(nèi)，引起以發(fā)熱、貧血、黃疸、衰弱和漸進性消瘦為特征的一類血液細菌疾病，即羊無漿體病，急性發(fā)病時也可造成動物死亡。該病在世界各地廣泛流行，在我國許多地區(qū)也時有發(fā)生，尤其是在某些牧區(qū)，嚴(yán)重阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確又操作方便的檢測方法十分必要。目前常用的診斷方法為血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作熟練程度將直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。還有很多血清學(xué)方法，但都存在一定的假陽性或假陰性以及交叉反應(yīng)。分子生物學(xué)診斷方法有套式PCR檢測方法，參見李樹清，王貴強，陳志飛等，利用套式PCR檢測牛羊乏質(zhì)體，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011. 42 (12) : 1768-1775，但套式PCR檢測過程中容易造成環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測綿羊無漿體的試劑盒，應(yīng)用這種檢測試劑盒進行檢測可克服現(xiàn)有技術(shù)不足。本發(fā)明的檢測綿羊無漿體的試劑盒內(nèi)至少有如下的三條引物探針序列正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ No 2和探針SEQ Na 3，其中的探針序列的5端結(jié)合有熒光發(fā)光基團FAM，3端結(jié)合有熒光猝滅基團BHQl。為方便使用，在本發(fā)明的檢測綿羊無漿體的試劑盒中還包括有如下成分熒光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板pGEM-Teasy-gltA、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。其中的熒光定量PCR反應(yīng)液可以是由Premix Ex Taq (2X) 12. 5 μ L，10 μ M的正向引物SEQ Ns I和
10μ M 的反向引物 SEQ Ns 2 各 0.5 μ L，熒光探針溶液(5 μ Μ) 1.0 μ L，ROX Reference Dye
11(50X)0.5yL，滅菌蒸餾水8.0yL組成。另外，本發(fā)明檢測綿羊無漿體的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板pGEM-Teasy-gltA為由正向引物SEQ Ns 4和反向引物SEQ Na 5擴增的DNA片段構(gòu)建的PGEM-Teasy重組質(zhì)粒；而陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品可以是滅菌蒸餾水。本發(fā)明實際上是一種利用gltA基因檢測綿羊無漿體的實時熒光定量PCR方法。實時突光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative polymerasechain reaction,real-time FQ-PCR)技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR技術(shù)相比它所具有的特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動化程度高、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，使其很快成為科研、臨床診斷的熱點技術(shù)。目前，國內(nèi)外均 未有檢測綿羊無漿體實時熒光定量PCR方法的報道，本發(fā)明利用綿羊無漿體gltA基因作為實時熒光定量PCR檢測靶基因，設(shè)計針對綿羊無漿體gltA基因的特異性引物和探針，從而提供了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確又操作方便的檢測綿羊無漿體的方法，填補了技術(shù)空白。本發(fā)明中，通過對實時熒光定量PCR反應(yīng)條條件的優(yōu)化，使本發(fā)明具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性，其敏感性比常規(guī)PCR高100倍，可以用于綿羊無漿體的快速定量檢測。


圖I實時熒光定量PCR擴增動力學(xué)曲線。圖2實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3實時熒光定量PCR靈敏度試驗。圖4普通PCR檢測方法電泳圖。其中M 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 ;1、2、3、4、5、6、7、8 分別為 I. O X IO7-L O X IO0 拷貝/μ L的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；9為陽性對照；10為正常羊全血基因組；11為空白對照。圖5實時熒光定量PCR特異性試驗。圖6實時熒光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性試驗。圖7實時熒光定量PCR批間重復(fù)性試驗。
具體實施例方式本發(fā)明以下結(jié)合附圖和實施例作詳細說明。本發(fā)明的試劑盒中最主要的是如下的三條引物探針序列，即gltA-rtFl (正向引物)5，-AGGTACCGGGTATCGTTGCA-3，SEQ Na IgltA-rtRl (反向引物)5，-AGGTTTGGATCTGCCTCTGTGA-3，SEQ Na 2gltA-rtPb (熒光探針)5’ (FAM) -ACATTTACAGGCACACCTCTGGCATGC- (BHQl) 3，SEQNa 3其中的的熒光探針SEQ Ns 3的5端結(jié)合有熒光發(fā)光基團FAM，3端結(jié)合有熒光猝滅基團BHQ1。目的片段大小為73bp，這些引物和探針由生工生物工程(上海)有限公司合成。在具體應(yīng)用時還需要有突光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板pGEM-Teasy-gltA、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。在本實施例中熒光定量PCR反應(yīng)液由Premix ExTaqTM(2X)12·5μL，10μM的正向引物SEQN2 I 和 10 μ M 的反向引物 SEQ Ns 2 各 O. 5 μ L，熒光探針 SEQ Na 3 溶液(5 μ Μ) I. O μ L，熒光校正液 ROXReference Dye II (50 X) O. 5 μ L，滅菌蒸餾水8. 0μ L。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用實例I.構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。(I)根據(jù)綿羊無衆(zhòng)體gltA基因序列，使用Primer premier 6.0和Oligo 7設(shè)計引物，目的片段大小為481bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物對序列為AOgltA-FlK 正向引物)5，-ATAGATGGCGATGAGGGTG-3，SEQ Na 4AOgltA-Rl2 (反向引物)5，-ATTCTGCTCGTGGTCTGC-3，SEQ Na 5
(2)以實驗室保存的綿羊無漿體菌株DNA為模板進行擴增，采用50 μ L的PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，然后94°C 30s,53°C 30s,72°C 30s，35個循環(huán)，72°C延伸5min。取5yL擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒(TaKaRa,大連)進行純化回收,將回收產(chǎn)物連接到pGEM_Teasy載體(Promega,America)后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞JM-109 (TaKaRa，大連)中，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆(白班)進行PCR和測序鑒定。(3)對鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒，使用NanoDrop 2000/2000C(ThermoScientific, America)超微量分光光度計測定質(zhì)粒濃度,并將其換算成拷貝/ μ L,以此作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。將構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，系列稀釋為終 濃度為I. OXlO8-L 0X10°拷貝/yL，再進行定量PCR擴增，定量PCR反應(yīng)體系為25 μ L :Premix Ex Taq (2X) 12. 5 μ L，正向引物 SEQ Ns I 和反向引物 SEQNs 2(10μΜ)各 O. 5 μ L，熒光探針 SEQ Ns 3 (5 μ Μ) I. O μ L，ROXReference Dye II (50 X) 0. 5 μ L，DNA 模板 2 μ L，滅菌蒸餾水 8. 0 μ L。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30s，然后95°C 5s,58°C 15s、72°C 20s，40個循環(huán)。在每一循環(huán)的延伸溫度結(jié)束時設(shè)定熒光信號采集點進行實時檢測，每個模板濃度做3個重復(fù)，取平均值計算變異系數(shù)，實驗均設(shè)陰性對照。所建立的實時熒光定量PCR動力學(xué)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖I和圖2，模板量與對應(yīng)的Ct值呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為O. 999，擴增效率為98. 7%，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3. 351X+41. 83。實時熒光定量PCR方法特性分析。(I)敏感性分析取濃度I. OX IO7-L OX 10°拷貝/ μ L的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行靈敏度試驗，結(jié)果顯示實時熒光定量PCR方法最低檢出限為IO1拷貝/ μ L (圖3)，而普通PCR的最低檢出限為IO3拷貝/ μ L (圖4)，比普通PCR檢測方法靈敏度高100倍。(2)特異性分析利用本文所建立實時熒光定量PCR方法，分別檢測了綿羊無漿體、邊緣無漿體、牛無漿體、嗜吞噬細胞無漿體、支原體、衣原體、螺旋體、羊巴貝斯蟲、羊泰勒蟲，結(jié)果顯示只有綿羊無漿體呈陽性反應(yīng)，其他病原體均呈陰性(圖5)。(3)穩(wěn)定性分析取濃度為1.0Χ IO6-L O X IO1拷貝/ μ L的5個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進行穩(wěn)定性分析。先進行批內(nèi)重復(fù)性試驗(圖6)，對同一批次稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度重復(fù)檢測四次，經(jīng)分析Ct值變異系數(shù)在O. 26% -O. 97%，小于5%。然后進行批間重復(fù)性試驗(圖7)，對3個不同批次的稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，經(jīng)分析Ct值變異系數(shù)在O. 42%-I. 5%,小于10%。由此說明本發(fā)明具有較好的穩(wěn)定性。表一批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.檢測綿羊無漿體的試劑盒，其特征在于試劑盒至少有如下的三條引物探針序列正向引物SEQ Ns 1，反向引物SEQ Ns 2和探針SEQ Na 3，其中的探針序列的5’端結(jié)合有熒光發(fā)光基團FAM，3’端結(jié)合有熒光猝滅基團BHQl。
2.權(quán)利要求I所述的檢測綿羊無漿體的試劑盒，其特征在于試劑盒中還包括有如下成分熒光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板pGEM-Teasy-gltA、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。
3.權(quán)利要求2所述的檢測綿羊無漿體的試劑盒，其特征在于熒光定量PCR反應(yīng)液由Premix Ex Taq (2 X) 12. 5 μ L，10 μ M 的正向引物 SEQ Ns I 和 10 μ M 的反向引物 SEQ Ns 2 各O. 5 μ L，5 μ M 的熒光探針 SEQ Na 3 溶液 l.OyL，ROX Reference Dye II (50 X) O. 5 μ L，滅菌蒸餾水8. OyL組成。
4.權(quán)利要求3所述的檢測綿羊無漿體的試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板pGEM-Teasy-gltA為由正向引物SEQ Ns 4和反向引物SEQ Ns 5擴增的DNA片段構(gòu)建的pGEM-Teasy重組質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求4所述的檢測綿羊無漿體的試劑盒，其特征在于陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為滅菌蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于檢測綿羊無漿體的試劑盒。本發(fā)明的檢測綿羊無漿體的試劑盒內(nèi)至少有如下的三條引得物探針序列正向引物SEQ№1，反向引物SEQ№2和探針SEQ№3，其中的探針序列的5端結(jié)合有熒光發(fā)光基團FAM，3端結(jié)合有熒光猝滅基團BHQ1。本發(fā)明應(yīng)用是一種利用gltA基因檢測綿羊無漿體的實時熒光定量PCR方法。
文檔編號C12Q1/06GK102634597SQ20121013723
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者劉志杰, 李有全, 楊吉飛, 殷宏, 羅建勛, 遲慶安, 馬米玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所