專利名稱：一種木聚糖酶的固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬酶工程研究開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及木聚糖酶固定化方法的研究，適合科學(xué)研究或エ業(yè)化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
木聚糖是半纖維素的主要成分，屬于植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉性多糖，
約占細(xì)胞干重的15% 30%，為自然界第二大可再生性資源。木聚糖酶(endo-1，4-β -D-xylanxylanohydrolase EC3. 2. I. 8)以內(nèi)切方式作用于木聚糖分子中β-1,4-木糖苷鍵，其主要水解產(chǎn)物為木ニ糖與木ニ糖以上的低聚木糖，還有少量木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶降解過程具有得率高、污染小和產(chǎn)物的安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是降解半纖維素最有潛力的方法。木聚糖酶是半纖維素酶的ー種，是ー種能降解木聚糖的復(fù)合酶。被廣泛用于釀造中的澄清以及食品、飼料、造紙和紡織エ業(yè)中。目前國內(nèi)大多數(shù)廠家使用的都是進(jìn)ロ酶。但該酶穩(wěn)定性差，保質(zhì)期短，重復(fù)利用率低，往往使應(yīng)用成本增高而限制了其應(yīng)用。所以在酶的應(yīng)用研究中，固定化酶的研究是生物技術(shù)領(lǐng)域中新興的ー門技術(shù)。酶的固定化是指用載體材料將酶限制于一定空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)，固定化酶可回收及反復(fù)連續(xù)利用的ー類技木。固定化酶保留了游離酶高效專一、溫和的催化性質(zhì)，同時(shí)又克服了游離酶的缺點(diǎn)，具有高穩(wěn)定性、易分離純化、回收使用、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。然而，廣泛投入エ業(yè)化應(yīng)用的固定化酶卻不多。因此，進(jìn)一歩開發(fā)更經(jīng)濟(jì)適用的固定化方法，使更多的酶取得エ業(yè)上的廣泛應(yīng)用，仍是科技工作者追求的目標(biāo)。酶的固定化方法常用的是吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合和法包理法。在此基礎(chǔ)上還出現(xiàn)了上述方法的結(jié)合法等酶固定化研究中，良好的載體是固定化酶成功的關(guān)鍵。所以在酶固定化領(lǐng)域，作為固定化載體的篩選和制備就成為了主要研究方向。選擇合適的載體，從實(shí)用性方面來考慮，探索研制高效、廉價(jià)且制備簡(jiǎn)單的載體乃是酶工程應(yīng)用基礎(chǔ)研究急需解決的ー個(gè)重要課題。在近幾年來，我們?cè)诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，苯酚類物質(zhì)和福爾馬林作用可產(chǎn)生ー種凝膠狀物質(zhì)，此類物質(zhì)疏松多孔，具有極強(qiáng)的親水性.不溶于水和有機(jī)溶劑，有很好的機(jī)械強(qiáng)度.可快速、有效地對(duì)各種酶和蛋白質(zhì)加以固定，對(duì)蛋白質(zhì)有很高的結(jié)合量。此類固定化劑在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。盡管木聚糖酶的固定化載體目前很多，但該方法所制備的凝膠成本低廉，且操作簡(jiǎn)單、無毒性，是ー種可以推廣使用的優(yōu)良酶載體.所以利用廉價(jià)的該載體固定木聚糖糖酶具有較大的理論和實(shí)踐意義。而本方法研究的目的是開發(fā)新型的酶的固定化載體，并可以增強(qiáng)木聚糖酶在エ業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
I.本發(fā)明涉及木聚糖酶固定化載體的制備和木聚糖酶的固定化方法，其特征在木聚糖酶載體的制備和木聚糖酶的固定化方法，包括以下過程步驟(一)取對(duì)苯ニ酚30-40g、福爾馬林水溶液80-90mL、鹽酸20_30mL，攪拌混勻；步驟(ニ)將步驟(一)的混合液攪拌加熱至形成凝膠； 步驟(三)將步驟(ニ)的凝膠用去離子水洗滌至中性，干燥，研磨，過篩，取直徑大約O. 05 O. 2mm的顆粒，經(jīng)水溶漲即得固定化載體；步驟(四)取步驟(三)的凝膠載體I克(含水量85%)，加入3 4%的戊ニ醛溶液5-8mL，室溫下攪拌O. 5小時(shí)，室溫交聯(lián)5_6小時(shí)，離心去上清，水洗除去殘余戊ニ醛，留沉淀；步驟(五)步驟(四)中的沉淀載體加入10_15mL稀釋的木聚糖酶，攪拌均勻，4°C固定5 6小時(shí)，離心，留沉淀；步驟(六)步驟(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc緩沖液洗漆，除去多余酶液；步驟(七)將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。2.根據(jù)本發(fā)明所述，制備固定化木聚糖酶的載體是對(duì)苯ニ酚、福爾馬林水溶液和鹽酸的混合物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的涉及凝膠載體的制備和木聚糖酶的固定化方法包括以下實(shí)施例，下面的實(shí)施例可進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例I :步驟(一)取對(duì)苯ニ酚30g、福爾馬林水溶液80mL、鹽酸20mL，攪拌混勻；步驟(ニ)將步驟(一)的混合液攪拌加熱至形成凝膠；步驟(三)將步驟(ニ)的凝膠用去離子水洗滌至中性，干燥，研磨，過篩，取直徑大約O. 05 O. 2mm的顆粒，經(jīng)水溶漲即得固定化載體；步驟(四)取步驟(三)的凝膠載體I克，加入3%的戊ニ醛溶液5mL，室溫下攪拌O. 5小時(shí)，室溫交聯(lián)5小時(shí)，離心去上清，水洗除去殘余戊ニ醛，留沉淀；步驟(五)步驟(四)中的沉淀載體加入IOmL稀釋的木聚糖酶，攪拌均勻，4°C固定5小時(shí)，離心，留沉淀；步驟(六)步驟(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc緩沖液洗漆，除去多余酶液；步驟(七)將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。實(shí)施例2 步驟(一)取對(duì)苯ニ酚40g、福爾馬林水溶液90mL、鹽酸30mL，攪拌混勻；步驟(ニ)將步驟(一)的混合液攪拌加熱至形成凝膠；步驟(三)將步驟(ニ)的凝膠用去離子水洗滌至中性，干燥，研磨，過篩，取直徑大約O. 05 O. 2mm的顆粒，經(jīng)水溶漲即得固定化載體；
步驟(四)取步驟(三)的凝膠載體I克，加入4%的戊ニ醛溶液8mL，室溫下攪拌O. 5小時(shí)，室溫交聯(lián)6小時(shí)，離心去上清，水洗除去殘余戊ニ醛，留沉淀；步驟(五)步驟(四)中的沉淀載體加入15mL稀釋的木聚糖酶，攪拌均勻，4°C固定6小時(shí)，離心，留沉淀；步驟(六)步驟(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc緩沖液洗漆，除去多余酶液；步驟(七)將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。附實(shí)驗(yàn)例證I.凝膠與蛋白質(zhì)的結(jié)合量凝膠與蛋白質(zhì)的結(jié)合量受其成分、反應(yīng)時(shí)間和pH的影響·凝膠成分對(duì)載體的影響改變凝膠成分的比例可影響載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合量(表I)
表I凝膠成分對(duì)載體的影響
對(duì)苯ニ釀(g) 福爾馬林(ml)鹽酸(ml) 蛋白質(zhì)結(jié)合量(mg/g干膠)
T-5-K)35U5^
210156380
315209406
4202512480
5254515501從表I可見，處理I和5與蛋白結(jié)合量較大些，其次是處理4和3，最差的是2，所以在制備載體時(shí)采用的是福爾馬林為對(duì)苯ニ酚的二倍量，而鹽酸約為福爾馬林的1/3倍量(1:2: 1/3)。2.作為載體固定木聚糖酶2. I溫度對(duì)固定化反應(yīng)的影響當(dāng)在pH4. 6,0. lmol/L HAc-NaAc緩沖液中，以不同的溫度進(jìn)行固定化反尖，可得不同溫度下固定化酶的活力回收，得知其活力回收隨溫度升高而下降，所以在對(duì)酶進(jìn)行固定化時(shí)，盡量在低溫下(冰箱)進(jìn)行(表2)。表2.溫度對(duì)固定化反應(yīng)的影響
溫度CC )さカ回收(％)
-5-5 Γ5
1095.8
15 94.3 20 81.3 _ 25 _70. I_2. 2ρΗ值對(duì)固定化反應(yīng)的影響
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及木聚糖酶固定化載體的制備和木聚糖酶的固定化方法，其特征在木聚糖酶載體的制備和木聚糖酶的固定化方法，包括以下過程 步驟(一)取對(duì)苯二酚30-40g、福爾馬林水溶液80-90mL、鹽酸20-30mL，攪拌混勻； 步驟(二)將步驟(一)的混合液攪拌加熱至形成凝膠； 步驟(三)將步驟(二)的凝膠用去離子水洗滌至中性，干燥，研磨，過篩，取直徑大約O. 05 O. 2mm的顆粒，經(jīng)水溶漲即得固定化載體； 步驟(四)取步驟(三)的凝膠載體I克，加入3 4%的戊二醛溶液5-8mL，室溫下攪拌O. 5小時(shí)，室溫交聯(lián)5-6小時(shí)，離心去上清，水洗除去殘余戊二醛，留沉淀； 步驟(五)步驟(四)中的沉淀載體加入10-15mL稀釋的木聚糖酶，攪拌均勻，4°C固定5 6小時(shí)，離心，留沉淀； 步驟(六)步驟(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc緩沖液洗漆,除去多余酶液； 步驟(七)將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。
2.根據(jù)本發(fā)明所述，制備固定化木聚糖酶的載體是對(duì)苯二酚、福爾馬林水溶液和鹽酸的混合物，其三者比例約為1 2 1/3。
全文摘要
本發(fā)明所屬酶工程研究開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及木聚糖酶載體的制備和木聚糖酶的固定化方法研究。取對(duì)苯二酚30-40g、福爾馬林水溶液80-90mL、鹽酸20-30mL，攪拌混勻；混合液攪拌加熱至形成凝膠；凝膠用去離子水洗滌至中性，干燥，研磨，過篩，取直徑大約0.05～0.2mm的顆粒，經(jīng)水溶漲即得固定化載體；取凝膠載體1g，加入3～4％的戊二醛溶液5-8mL，室溫下攪拌0.5h，室溫交聯(lián)5-6h，離心去上清，水洗除去殘余戊二醛，留沉淀；沉淀載體加入10-15mL稀釋的木聚糖酶，攪拌均勻，4℃固定5～6h，離心，留沉淀；沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc緩沖液洗滌，除去多余酶液；抽真空得到固定化木聚糖酶。本發(fā)明載體和固定化酶的制備方法，載體原料廉價(jià)易得，工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)酶活性損失小，酶活回收率可達(dá)到80.5％。
文檔編號(hào)C12N11/04GK102660532SQ20121014396
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月29日
發(fā)明者朱啟忠 申請(qǐng)人:山東大學(xué)威海分校