專(zhuān)利名稱(chēng)：一種病毒誘導(dǎo)蛋白Mig1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種病毒誘導(dǎo)蛋白Migl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)集約式和工廠化快速發(fā)展，病害問(wèn)題日益嚴(yán)重。病毒是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)病害的主要病原，其中虹彩病毒等 能感染多種魚(yú)類(lèi)，造成危害嚴(yán)重的傳染性疫病。研究表明，病毒感染魚(yú)類(lèi)后可誘發(fā)一系列機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括產(chǎn)生各種天然免疫和獲得性免疫因子，如干擾素、Mx, viperin、各種干擾素刺激基因產(chǎn)物等，這些因子在不同程度上可協(xié)助機(jī)體抑制病毒的復(fù)制、粘附、釋放等過(guò)程，從而抵抗病毒感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種病毒誘導(dǎo)蛋白Migl及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種病毒誘導(dǎo)蛋白Migl，病毒誘導(dǎo)蛋白Migl為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。病毒誘導(dǎo)蛋白Migl的制備方法，I)質(zhì)粒pMigl的構(gòu)建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與EcoRV酶切的質(zhì)粒PID2用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pMigl ;所述 Fl 為 5’-GATATCGCCACCATGCAGAITTCAGGAAGA-3’，Rl 為 5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。病毒誘導(dǎo)蛋白Migl的應(yīng)用，所述病毒誘導(dǎo)蛋白Migl用于制備抗病毒藥物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的病毒誘導(dǎo)蛋白Migl轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠明顯提高細(xì)胞的抗病毒能力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: ALaboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母轉(zhuǎn)化按Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS — PAGE)按照Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press2001o
3.所有限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。實(shí)施例I本發(fā)明的病毒誘導(dǎo)蛋白Migl為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。序列表SEQID No. I 為:MQISGRVQSCCVALVFALTTASAVKQLKSIHDLKKINFGQTVPKHSLVLLHWFANVVNIDNNNIVRLTFNPNS⑶YGSHHYGNYEGLLDPPPPGQQYYTLGNLNQGSSELPDHVVHSQGEYAGRNLDRIILRVRNHNTGRQRLQRVYQVYITQHYAASENHGTMYDLHNTYCITTDLLRQIQEFSVGTDQQPLSALRDDFQSNADDFQLRHIKLSWGELACLALFLFIVIEDKYCPKRASKGPQRSVRNNIETDYAIDNKYHPKRASTEPQRSVRNNIQSHYVVEIPEHLLYSDDGIHLQVTTGTNGKARIIWNGVPQHRLENGAMVVLFRNNKDNEASSTYKYISNKESGSFDTSVPLNDGLQARLHKVRIKYCFWKVVGEEICRGPEFKNPQTATNIGNYGAKLQLFVKDGKACARLFVQKSFTEWRSEFVNSWVGFYTSSDKATNEYSffffQ
WQWAIKFKPNTDVKDFFYDVYDFHSELAIAPGVQARFMLSNKDVRATTISSWR(a)序列特征 長(zhǎng)度507 類(lèi)型氨基酸序列籲鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(b)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(C)假設(shè)否(d)反義否( e )最初來(lái)源半滑舌鰨結(jié)構(gòu)特點(diǎn)該蛋白預(yù)期含有一個(gè)信號(hào)肽(氨基酸I 一 23)。實(shí)施例2病毒誘導(dǎo)蛋白Migl的細(xì)胞轉(zhuǎn)染I)質(zhì)粒pMigl的構(gòu)建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94° C 60s預(yù)變性模板DNA,然后 94° C 40s, 50° C 60s, 72° C 60s, 5 個(gè)循環(huán)后改為 94° C 40s, 65° C60s, 72° C 60s，30個(gè)循環(huán)后再在72° C延伸反應(yīng)7 — lOmin。PCR產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá)載體PID2 (pID2構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)Hu YH, Sun LA bivalent Vibrioharveyi DNA vaccine induces strong protection in Japanese flounder(Paralichthysolivaceus) · Vaccine 2011; 29:4328 — 33)用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRV酶切后回收6kb片段，將其與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，在氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pMigl，由序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’ ;R1 為 5’ -GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。2)pMigl轉(zhuǎn)染頭腎白細(xì)胞制備半滑舌鰨頭腎白細(xì)胞(具體方法參見(jiàn)Sun J, Li Y, Sun L. Cynoglossussemilaevis thioredoxin: a reductase and an antioxidant with immunostimulatoryproperty. Cell Stress Chaperon.2012;17:445-55。將 I — 2 μ g 上述步驟 I)制備的 pMigl 或 pID2 (對(duì)照)用Lipofect (購(gòu)于“天根生化科技(北京)有限公司”)轉(zhuǎn)染頭腎白細(xì)胞(具體方法參見(jiàn)HuY, Deng T,Sun L. The Rabl GTPase of Sciaenops ocellatus modulates intracellularbac terial infection. Fish Shellfish Immunol. 2011; 31:1005-12.)，獲得含有 pMigl的轉(zhuǎn)染子和含有PID2的對(duì)照轉(zhuǎn)染子。實(shí)施例3病毒誘導(dǎo)蛋白Migl的抗毒病作用將上述實(shí)施例2步驟2)的pMigl轉(zhuǎn)染子和對(duì)照轉(zhuǎn)染子置于含有L 一 15培養(yǎng)基(購(gòu)于Thermo Scientific HyClone,北京)的96 —孔平板(每孔IO5個(gè)細(xì)胞),每孔加入IO6個(gè)虹彩病毒，25°C保溫4h。細(xì)胞用PBS洗3次。用絕對(duì)定量PCR方法(該方法具體參見(jiàn)=ZhangM, Xiao ZH, Hu YH, Sun L. Characterization of a megalocytivirus from cultured ·rockbream, Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege), in China. Aquae Res. 2012;43:556 -64)計(jì)算胞內(nèi)感染的病毒數(shù)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，pMigl轉(zhuǎn)染子中的病毒平均數(shù)比對(duì)照轉(zhuǎn)染子中的病毒平均數(shù)低4. 5倍(顯著差異P〈0. 01)，說(shuō)明病毒誘導(dǎo)蛋白Migl能夠顯著保護(hù)細(xì)胞抵抗病毒的侵染。所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)0. 8 % NaCl, O. 02 % KCl, O. 358 %Na2HPO4. 12H20, O. 024% NaH2PO4,余量為水。
權(quán)利要求
1.一種病毒誘導(dǎo)蛋白Migl，其特征在于病毒誘導(dǎo)蛋白Migl為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求I所述病毒誘導(dǎo)蛋白Migl的制備方法，其特征在于 I)質(zhì)粒pMigl的構(gòu)建 以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與EcoRV酶切的質(zhì)粒PID2用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)SpMigl ;所述 Fl 為 5’-GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’，Rl 為 5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。
3.—種權(quán)利要求I所述病毒誘導(dǎo)蛋白Migl的應(yīng)用，其特征在于所述病毒誘導(dǎo)蛋白Migl用于制備抗病毒藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種半滑舌鰨病毒誘導(dǎo)蛋白Mig1及其應(yīng)用。病毒誘導(dǎo)蛋白Mig1為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。應(yīng)用方法以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增Mig1基因，PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體后得質(zhì)粒pMig1，將其轉(zhuǎn)染頭腎白細(xì)胞，得含有pMig1的轉(zhuǎn)染子。所述pMig1轉(zhuǎn)染子具有顯著增強(qiáng)的抗病毒能力。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102875660SQ20121033540
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者孫黎, 汪瑋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所