專(zhuān)利名稱(chēng)：一種小單孢菌菌株、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
一種小單孢菌菌株、制備方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小單孢菌菌株，該小單孢菌菌株的制備方法，及該小單孢菌菌株的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小單孢菌屬(Micromonospora)屬于放線(xiàn)菌目小單孢菌科(Micromonosporaceae),因菌絲上著生單個(gè)孢子而得名，該屬菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，不抗酸，好氧或微好氣，化能異養(yǎng)菌，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，分枝有隔。在基內(nèi)菌絲上長(zhǎng)單個(gè)孢子，有梗或無(wú)梗，孢子不游動(dòng)。小單孢菌是抗生素的重要來(lái)源。臨床上應(yīng)用的許多氨基糖抗生素如慶大霉素等都是小單孢菌產(chǎn)生的。目前從該屬發(fā)現(xiàn)的抗生素種 類(lèi)僅次于鏈霉菌，達(dá)450種以上。1987年從Caliche 土壤樣品中分離的棘孢小單孢菌Micromonospora echinospora subsp. calichensis產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的烯二塊類(lèi)抗腫瘤抗生素CalicheamicinYltj該化合物細(xì)胞毒性高，至少是多柔比星的1000倍。該藥物的第一個(gè)抗體靶向化療藥物CMA-676 (Mylotarg) 以在臨床應(yīng)用，它可治療嚴(yán)重、快速發(fā)展的致命性疾病急性骨髓性白血病(acute myeloid leukaemia)。從斐濟(jì)海鞘(Polysyncratonlithostrotum)中分離到小單抱菌Micromonospora Iomaiviticins,它產(chǎn)生抗腫瘤和細(xì)胞毒的抗生素Lomaiviticins即Lomaiviticins A和B (重氮苯并荷葡萄糖苷對(duì)稱(chēng)二聚體)。Lomaiviticins 是很強(qiáng)的破壞 DNA 的藥物,BIA〈0. lng/spot。Lomaiviticins A 對(duì)許多腫瘤細(xì)胞株作用強(qiáng)，IC50為0. 01-98ng/ml，細(xì)胞毒作用方式與已知DNA損害劑多柔比星、絲裂霉素不同。它還具有很強(qiáng)的抗金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的作用，MIC為6-25ng/spot,已進(jìn)入I期臨床實(shí)驗(yàn)。綜上所述，在小單孢菌中已發(fā)現(xiàn)了一些具有重要商業(yè)價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它們是新生素和其他生物活性物質(zhì)的重要微生物來(lái)源。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于提供一種小單孢菌菌株。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之一的一種小單孢菌菌株，所述菌株為小單孢菌菌株 FM07-0019 (Mciromonospora sp. FM07-0019)，于 2012 年 8 月 23 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6474。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于提供一種所述的小單孢菌菌株的分離方法，充分利用中國(guó)的海洋藥物資源，簡(jiǎn)單易行。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之二的一種所述的小單孢菌菌株的分離方法，包括以下步驟步驟100 :將2克采集于智利南部43° 32 ^ (V S，72° 52f Of W，水深20米的海底海泥用無(wú)菌陳海水稀釋成KT1和10_2倍；步驟200 :分別取原液及稀釋過(guò)的樣品懸液0. ImL涂布于燕麥瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離，并于30°C下培養(yǎng)2周，得到小單孢菌菌FM07-0019。
進(jìn)一步地，所述燕麥瓊脂培養(yǎng)基組分為燕麥粉2%、瓊脂2%、重鉻酸鉀50mg/L、微量元素溶液0. lml/100ml,其余成分為水,且所述水包括質(zhì)量比為I : I的蒸懼水和海水；所述微量元素溶液包括如下組分=FeSO4 7H200. lg, MnCl2 4H20 0. lg, ZnSO4 7H20 0. lg,蒸鍛水IOOOmlo本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三在于提供一種所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物的方法，通過(guò)提取分離該新菌株的發(fā)酵液獲得了一種能夠抑制腫瘤的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之三的一種所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物的方法，包括以下步驟(I)制備小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液將一鉬環(huán)小單孢菌菌株FM07-0019的燕麥瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，于溫度35°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下培養(yǎng)48h ;然后按10%的移種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，并于溫度28°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下振蕩培養(yǎng)96 120h ； (2)提取將⑴中獲得的小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液于4500rpm離心15min以獲得上清液和菌絲體；所述菌絲體用2倍于菌絲體體積的甲醇浸泡，經(jīng)減壓濃縮后再用水稀釋?zhuān)粚⑾♂屢号c上清液合并后一起流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂Hp-20，再用甲醇洗出并濃縮，最后濃縮物用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物；(3)分離將⑵中獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，用體積比100 0，98 2，95 5，90 10，80 20，70 30，50 50，0 100 的氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，并收集Rf值為0.6的餾份；再經(jīng)S印hadex LH-20凝膠柱層析，用體積比I: I的甲醇-氯仿洗脫，薄層層析檢測(cè)，并收集Rf值為0. 6的餾份；再經(jīng)C18反相柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，流速為lml/min，且所述甲醇-水梯度為甲醇含量在30min內(nèi)從0到100% ;薄層層析檢測(cè)，并收集Rf值為0. 6的餾份；再將餾份經(jīng)制備型高壓液相色譜進(jìn)行分離，以60%乙腈溶液洗脫，流速為I. 5ml/min，得到大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物。進(jìn)一步地，所述薄層層析的展層劑為體積比9:1氯仿-甲醇溶劑。進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉I. 5%，葡萄糖0. 5%，蛋白胨0. 5%酵母粉 0. 5%MgS04 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4) 2S040 . 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%，蒸餾水配制，pH為7. 5 ;且所述種子培養(yǎng)基中各組分的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4%葡萄糖0. 5%，蛋白胨0. 5%花生餅粉 2. 0%MgS04 7H20 0. 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%，蒸餾水配制，pH 為 7. 5，且所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之四在于提供一種所述的小單孢菌菌株制備的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物，其具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之四的一種所述的小單孢菌菌株制備的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種小單孢菌菌株，其特征在于所述菌株為小單孢菌菌株FIM07-0019 (Mciromonospora sp. FM07-0019)，于 2012 年 8 月 23 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6474。
2.一種如權(quán)利要求I所述的小單孢菌菌株的分離方法，其特征在于包括以下步驟 步驟100 :將2克采集于智利南部43° 32' 0' S，72° 52' 0' W，水深20米的海底海泥用無(wú)菌陳海水稀釋成KT1和10_2倍； 步驟200 :分別取原液及稀釋過(guò)的樣品懸液0. ImL涂布于燕麥瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離，并于30°C下培養(yǎng)2周，得到小單孢菌菌株FM07-0019。
3.如權(quán)利要求2所述的小單孢菌菌株的分離方法，其特征在于所述燕麥瓊脂培養(yǎng)基組分為燕麥粉2%、瓊脂2%、重鉻酸鉀50mg/L、微量元素溶液0. lml/100ml，其余成分為水，且所述水包括質(zhì)量比為I : I的蒸餾水和海水；所述微量元素溶液包括如下組分FeSO4 7H20 0. lg, MnCl2 4H20 0. lg, ZnSO4 7H20 0. lg，蒸餾水 1000ml。
4.一種利用權(quán)利要求I所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)制備小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液將一鉬環(huán)小單孢菌菌株FM07-0019的燕麥瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，于溫度35°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下培養(yǎng)48h ;然后按10%的移種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，并于溫度28°C，轉(zhuǎn)速220rpm/min下振蕩培養(yǎng)96 120h ； (2)提取將(I)中獲得的小單孢菌菌株FM07-0019發(fā)酵液于4500rpm離心15min以獲得上清液和菌絲體；所述菌絲體用2倍于菌絲體體積的甲醇浸泡，經(jīng)減壓濃縮后再用水稀釋?zhuān)粚⑾♂屢号c上清液合并后一起流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂Hp-20，再用甲醇洗出并濃縮，最后濃縮物用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物； (3)分離將(2)中獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，用體積比100 0,98 2，95 5，90 10，80 20,70 30,50 50，0 100的氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)，并收集Rf值為0.6的餾份；再經(jīng)S印hadex LH-20凝膠柱層析，用體積比I : I的甲醇_氯仿洗脫，薄層層析檢測(cè)，并收集Rf值為0. 6的餾份；再經(jīng)C18反相柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，流速為lml/min，且所述甲醇-水梯度為甲醇含量在30min內(nèi)從0到100%;薄層層析檢測(cè)，并收集Rf值為0. 6的餾份；再將餾份經(jīng)制備型高壓液相色譜進(jìn)行分離，以60%乙腈溶液洗脫，流速為I. 5ml/min，得到大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物。
5.如權(quán)利要求4所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物的方法，其特征在于所述薄層層析的展層劑為體積比9I氯仿-甲醇溶劑。
6.如權(quán)利要求4所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，酵母粉0. 5 %，MgSO4 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4)2SO4O. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，蒸餾水配制，pH為7. 5 ;且所述種子培養(yǎng)基中各組分的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
7.如權(quán)利要求4所述的小單孢菌菌株制備大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4 %，葡萄糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，花生餅粉2. 0 %，MgSO4 7H20 0. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，蒸餾水配制，pH 為 7. 5，且所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
8.一種利用權(quán)利要求I所述的小單孢菌菌株制備的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)化合物，其特征在于結(jié)構(gòu)式如下
全文摘要
本發(fā)明提供了一種小單孢菌菌株、制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明從海洋沉積物中分離并篩選到一株抗腫瘤活性很好的放線(xiàn)菌，該放線(xiàn)菌為小單孢菌菌株FIM07-0019(Mciromonospora sp.FIM07-0019)，并利用該小單孢菌菌株FIM07-0019制備出發(fā)酵液，再將所述發(fā)酵液經(jīng)提取、正相硅膠柱層析、C18反相柱層析等處理，提取分離得到對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，該大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物為研究開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了天然藥物化學(xué)研究基礎(chǔ)和先導(dǎo)化合物，對(duì)開(kāi)發(fā)利用中國(guó)的海洋藥物資源具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102965300SQ20121034785
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者彭飛, 連云陽(yáng), 王傳喜, 謝陽(yáng), 林如, 江宏磊, 江紅 申請(qǐng)人:福建省微生物研究所