專利名稱：miRNA 320a在前列腺癌血清學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微小RNA (micro RA,miRNA,miR) 320a在前列腺癌血清學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
前列腺癌(prostate carcinoma, PCa)為歐美國家男性常見惡性腫瘤和主要死亡原因之隨著我國人均壽命延長和生活方式的西化，PCa發(fā)病率呈逐年增加趨勢，它被列為中國21世紀(jì)增長最快的腫瘤之一。本項(xiàng)目在前期工作中篩選出的19個在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNAs序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測其在臨床血清樣本中的含量，尋找人前列腺癌轉(zhuǎn)移患者的血清學(xué)生物標(biāo)志物。
目前前列腺癌診斷指標(biāo)的研究工作主要集中在以下幾個方面(I)PSA亞型和其它的激肽釋放酶(如血清KLK2) ; (II)DNA生物標(biāo)志物，包括一些表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物(如GSTPi甲基化)，基因融合(如TMPRSS2:ERG融合)和雜合性缺失等；(III)RA生物標(biāo)志物，如非編碼的前列腺特異的RA PCA3 (曾被稱為DD3)和a-甲基?；o酶A消旋酶(Alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR)mRA在前列腺癌中的表達(dá)；(IV)蛋白分子標(biāo)志物，如PSA,前列腺特異膜抗原(prostate-specifc membrane antigen, PSMA),前列腺干細(xì)胞抗原(prostatestem cell antigen, PSCA)等。盡管許多候選的生物學(xué)標(biāo)志物在不斷地被發(fā)現(xiàn)，尚無新的指標(biāo)和方法應(yīng)用于臨床檢測。miRAs是一種新的不編碼蛋白的內(nèi)源性小RAs，它們通過抑制蛋白質(zhì)翻譯過程在細(xì)胞增殖、凋亡以及分化等生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過miRAs微列陣、Northern blot和實(shí)時PCR等手段,在多種類型人腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些miRAs表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的現(xiàn)象。有研究報道了 miRA在乳腺癌和肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，人血漿和血清中存在其它組織來源的miRNAs，它們可以以一種可抵抗內(nèi)源性RA酶活性的形式存在。測定血漿或血清中腫瘤來源miRNAs的含量可以作為腫瘤檢測的手段之一。近年有研究者報道從血清和其它一些體液中miRA的水平可以診斷一些處于早期的疾病。2008年Mitchell報道，miR-141在前列腺癌組患者血清中比對照組高46倍，而且其靈敏度為60%，特異性為100%。對于血清中miRAs的深入研究可為尋找疾病生物標(biāo)志物提供新的獨(dú)特視角。有研究報道，miR-320a在肝癌、胰腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤等大部分人腫瘤中頻繁高表達(dá)。它通過靶向作用于抑癌基因如p27、p57，PTEN，前凋亡因子Bim、Bmf 等，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長和遷移，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。目前的研究結(jié)果提示miRA-320a可能是一種致癌miRNA，在人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展階段扮演著至關(guān)重要的角色
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測血液中miR_320a的試劑在制備用于前列腺癌血清學(xué)診斷的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明利用我們發(fā)明的異種移植模型和新一代測序技術(shù)，對轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移前列腺癌異種移植組織系中miRNAs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了深入的研究，初步發(fā)現(xiàn)miR — 320a與前列腺癌的惡性程度相關(guān)(ffatahiki et al. , PLOS One 2011)。我們優(yōu)化了從血清中提取miRNA的方法以及用實(shí)時定量PCR檢測miRNA的方法；整理和收集了百余份前列腺癌患者的病理資料和血清樣本；對用異種移植模型篩選出的在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中上調(diào)的19個miRNA序列進(jìn)行了臨床血清樣本的檢測，揭示了 miR —320a在前列腺癌患者血清中和組織中含量明顯升高。該發(fā)明對開發(fā)中國人群前列腺癌的血清學(xué)臨床診斷方案中具有重要的應(yīng)用前景。本發(fā)明首先提供了一種檢測血液樣品中微小RNAmiR-320a及其前體的試劑在制備用于對對象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑是對微小 RNAmiR-320a及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR_320a及其前體有檢測特異性的PCR引物和雜交探針以及利用該探針制備的基因芯片。所述miR-320a的序列如SEQ ID NO 1所示；在一個優(yōu)選例中，所述特異性引物選自SEQ ID NO: 2所示序列；在一個優(yōu)選例中，所述特異性探針選自SEQ ID N0:5所示序列。本發(fā)明通過檢測血液中miR_320a的含量來診斷對象是否患有前列腺癌。在一個優(yōu)選例中，通過實(shí)時定量PCR方法對miR_320a進(jìn)行測定，包括(I)提取對象血液樣品中的RNA，并添加人工合成的線蟲miR-39寡聚核苷酸作為參照物；(2)利用反轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA ；(3)采用實(shí)時定量PCR方法檢測樣品中miR-320a的含量；(4)用線蟲miR-39的含量作為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如果對象血清中miR — 320a含量與正常對照組相比明顯升高，則診斷該對象罹患前列腺癌。當(dāng)檢測結(jié)果顯示對象血液中微小RNAmiR_320a或其前體的水平高于對照血清中的水平，則提示所述對象罹患前列腺癌。其次，本發(fā)明同時提供了一種前列腺癌診斷試劑盒，該試劑盒檢測的目標(biāo)核酸為具有SEQ ID NO 1所示多核苷酸序列的miR-320a，具體包括(I)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；包括熱啟動Taq DAN聚合酶(2. 5U/ul)及其反應(yīng)緩沖液，dNTP (IOmM)；(2)miR-320a特異性引物；在一個優(yōu)選例中，所述miR_320a特異性引物選自SEQIDNO: 2所示序列；(3)線蟲 miR-39 參照寡核苷酸序列5’ -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQIDN0:3)；(4)線蟲 miR-39 特異性引物5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’ (SEQ ID N0:4)；(5)熒光染料 SYBR-GREEN I ;(6)使用說明書。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果利用本試劑盒中提供的試劑，結(jié)合本領(lǐng)域研究人員熟知的RNA提取試劑和通用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑，本發(fā)明可以特異性地檢測血清中miR-320a的含量，有效用于臨床前列腺癌的輔助診斷。


圖I為內(nèi)參miRNA和目的miRNA的實(shí)時PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線，可見溶解曲線均為單峰，無非特異性峰出現(xiàn)；圖2為qRT-PCR檢測miR_320a在正常人和前列腺癌患者血清中的表達(dá)量柱高=x-+SE ；圖3為miR_320a在前列腺癌患者血清中相對表達(dá)量ROC曲線分析。圖4 為前列腺組織的 miR_320a FISH 照片(200 X ) A =Normal prostate B PCa-1(gleasonscore :6 分)C :PCa_2 (gleason score :9 分)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I本發(fā)明首先提供了一種檢測血液樣品中微小RNA miR_320a及其前體的試劑在制備用于對對象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑是對微小RNAmiR-320a (如SEQ ID NO :1所示)及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR_320a及其前體有檢測特異性的PCR引物和探針及使用該探針制備的基因芯片。所述的特異性引物選自SEQ ID NO:2所示序列；所述的特異性探針選自SEQ ID N0:5所示序列。實(shí)施例2、前列腺癌診斷試劑盒本發(fā)明所述試劑盒檢測的目標(biāo)核酸為具有SEQ ID NO :1所示多核苷酸序列的miR-320a,具體包括(I)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；包括熱啟動Taq DAN聚合酶(2. 5U/ul)及其反應(yīng)緩沖液，dNTP (IOmM)；(2)miR_320a特異性引物；在一個優(yōu)選例中，所述miR_320a特異性引物選自SEQIDNO: 2所示序列；(3)線蟲 miR-39 參照寡核苷酸序列5’ -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQIDN0:3)；(4)線蟲 miR-39 特異性引物5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’ (SEQ ID N0:4)；(5)熒光染料 SYBR-GREEN I ;(6)使用說明書。實(shí)施例3、診斷效果實(shí)驗(yàn)I、利用我們發(fā)明的異種移植模型(即將前列腺癌組織移植到免疫缺欠小鼠的腎包月吳中，所得到的組織系與臨床腫瘤的病理特征高度相關(guān))和新一代測序技術(shù)，對轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性前列腺癌異種移植組織系(來自于同一個前列腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本)中miRNAs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了深入的研究。通過比較我們鑒定出104個表達(dá)差異的miRNAs，除了一些已知的miRNAs和它們的異型體(isomiRs),還有一部分是尚未被發(fā)現(xiàn)的新的miRNAs。其中21個miRNAs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，5個miRNAs已經(jīng)被報道在前列腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，這也從側(cè)面證明了我們采用的研究手段的有效性。除了那些已經(jīng)被證明和前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs外，我們還發(fā)現(xiàn)了 36個迄今為止尚未被報道的miRNAs (Watahiki et al. , PLOS One 2011)，這其中可能存
在著潛在 的可作為中國人群前列腺癌患者血清學(xué)生物標(biāo)志物的miRNAs。2、血清中微量miRNA的提取由于miRNA在血清中的含量很少，在實(shí)驗(yàn)前期，我們參閱了大量的文獻(xiàn)，嘗試了純化柱試劑盒提取法和液相Trizol提取法提取miRNA。發(fā)現(xiàn)Trizol法提取的miRNA的量和純度更好一些(miRNA的蛋白含量及鹽分含量更少)。在用Trizol法中我們進(jìn)行了兩方面的優(yōu)化(I)血清中含蛋白量較多，可以加大Trizol的含量，以使所含的蛋白質(zhì)得到充分的變性；并用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行多次抽提，以將所含的蛋白質(zhì)進(jìn)行充分的去除；(2)因?yàn)閙iRNA分子量很小，在加入異丙醇沉淀這步中，不容易沉淀下來，可以適量的延長沉淀時間，以使miRNA充分的沉淀下來增加miRNA的得率。3、血清中微量miRNA的檢測方法米用All-in-OneT miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。根據(jù)miRNA的特點(diǎn)和PCR擴(kuò)增原則，采用所發(fā)明的試劑盒在MJ Opticon II定量PCR儀上檢測miR_320a和線蟲miR-39的含量。miRNA的相對表達(dá)量使用2_ A A Ct法計算。4、檢測在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNAs在前列腺癌患者血清中的含量(I)我們對天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿研究所提供的百余份臨床資料和病人病歷信息等進(jìn)行了整理工作，篩選出了 35例正常人，49例高分級(7_9分)前列腺癌患者病歷，13例低分級前列腺患者病歷，并取得其血液樣本。(2)對這些臨床樣本進(jìn)行miRNA提取，QRT-PCR檢測得到如下結(jié)果從所收集的血清樣品中提取RNA，利用特異于miR — 320a的PCR引物，采用反轉(zhuǎn)錄一實(shí)時定量PCR的方法檢測該miRNA的表達(dá)水平。所使用的PCR弓I物能夠特異、有效地擴(kuò)增待檢測序列(圖I)。所得到的數(shù)據(jù)用SPSS軟件對其進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，miR-320a在前列腺癌患者血清中表達(dá)升高(圖2)。表I miR — 320a在正常組和前列腺癌組血清中的相對表達(dá)倍數(shù)
權(quán)利要求
1.檢測血液樣品中微小RNAmiR-320a及其前體的試劑在制備用于對對象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑是對微小RNA miR-320a及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR-320a及其前體有檢測特異性的PCR引物和探針以及利用該探針制備的基因芯片。
2.如權(quán)利要求I中所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-320a的序列如SEQID N0:1所/Jn ο
3.ー種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒檢測的目標(biāo)核酸為具有SEQ IDNO I所示多核苷酸序列的miR-320a,具體包括 (1)聚合酶鏈反應(yīng)試劑； (2)miR-320a特異性引物，如SEQID N0:2所示; (3)線蟲miR-39參照寡核苷酸序列，如SEQID NO: 3所示； (4)線蟲miR-39特異性引物，如SEQID N0:4所示; (5)熒光染料SYBR-GREEN I ； (6)使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微小RNA(miR-320a，如SEQIDNO1所示)在前列腺癌血清學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用，具體涉及檢測血液樣品中miR-320a的試劑在制備用于對象前列腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑是對微小RNAmiR-320a及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR-320a及其前體有檢測特異性的探針和PCR引物。本發(fā)明還涉及一種前列腺癌診斷試劑盒，包括聚合酶鏈反應(yīng)試劑；miR-320a特異性引物；線蟲miR-39參照寡核苷酸序列；線蟲miR-39特異性引物；熒光染料SYBR-GREEN1；使用說明書。當(dāng)檢測結(jié)果顯示對象血液中miR-320a或其前體的水平高于對照血清中的水平，則提示所述對象罹患前列腺癌，該試劑盒可有效用于臨床前列腺癌的輔助診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102827943SQ20121035168
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者石建黨, 張琚, 王玉琢, 成颯, 楊闊, 杜小玲, 原輝, 徐勇, 羅飛 申請人:南開大學(xué)