專利名稱：一種多酶體系的仿生固定化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于固定化酶領域，特別是ー種固定化多酶體系的エ藝方法。
背景技術：
多酶體系是指由不同的酶聯(lián)合組成的一個結構和功能的整體，能夠進行連續(xù)的反應催化，自然界中生物體的物質代謝就是由各種各樣的多酶體系維系的，多酶體系是高效而精確的系統(tǒng)，常由兩個或兩個以上的酶組成ー個復合體。復合體中第一個酶催化的產物作為底物直接被第二個酶催化，第二個酶催化的產物又為復合體下一個酶的底物，如此進行連續(xù)的催化反應，使催化效率顯著提高并有機協(xié)調著一系列酶反應之間的平衡。多酶體系在催化過程中表現(xiàn)出的高效率和高度協(xié)調性，為后續(xù)人工構建多酶反應體系、優(yōu)化改造生物催化過程提供了借鑒。
多酶體系共固定和共反應已成為ー個活躍的研究領域，近年來已引起了國內外眾多酶工程專家的極大興趣。固定化多酶和普通固定化酶相比，具有以下優(yōu)點不同酶的催化特性被有機結合起來，使得單ー酶的應用范圍擴大；催化反應中，前一種酶的產物作為底物被后一種酶催化，反應過程中由于非攪拌層的存在，使得中間產物到本體溶液的擴散受阻，造成非攪拌層內底物有效濃度較高，反應速度加快，提高了固定化酶的催化效率；反應中，由于產物抑制的減少，逆反應速率大大降低，使反應更徹底。隨著對多酶體系認識和不斷深入的研究，多酶體系固定化成為了研究固定化技術的熱點。多酶體系的固定化技術大致可分為兩種，一種是以單酶固定化為基礎的混合固定化酶技木，即將不同的酶分別固定在不同載體上；第二種是多酶體系共固定技術，指多酶體系中所有的酶固定在同一種載體上?；旌瞎潭ɑ夹g中酶在反應時要克服不同載體的傳質屏障，所以反應受到很大的限制。多酶共固定化技術能將不同酶的特點充分發(fā)揮并相互結合起來，有效地解決了混合固定化技術中多酶間載體的傳質問題，其固定方法有、交聯(lián)法、包理法等。包理法是指酶分子被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。優(yōu)點是制備エ藝簡單，操作條件溫和；包埋在聚合物中的酶不易漏出；對外界環(huán)境的緩沖作用大，可有效防止酶體的機械損傷；穩(wěn)定性強，產物容易分離。關于多酶體系的固定化技術的文獻報道包括文獻I :Langmuir，2000，16(24)9595-9603利用靜電作用，在帶負電的模板上層層組裝帶正電的聚電解質和帶負電的酶分子，將多酶體系中不同的酶分別固定于各層之間。文獻2 :Radiation Physics andChemistry, 2005, 73 :91-99用聚こ烯亞胺的氨基覆蓋多孔こ醛酸瓊脂表面的醛基做成惰性載體，并以此為載體共價共固定化環(huán)己酮單加氧酶和葡萄糖-6_磷酸脫氫酶。文獻3 :Advanced. Materials, 2007,19(20) :3142-3145 采用共沉淀的方法將ー種酶固定在 CaCO3內，再利用靜電作用層層組裝帶負電的PSS和帶正電的PAH，得到微球，將其與CaCl2混合用共沉淀法再固定另ー種酶，再層層組裝形成聚電質外殼，最后去除模板可得到的固定化酶不同酶分別固定于各層中。文獻4 :Chemistry-AEuropean Journal, 2009,15 (5)1104-1107以PS-PIAT嵌段共聚物為載體，將葡萄糖氧化物酶包埋于微囊內，脂肪酶固定子雙親分子形成的微囊壁中，最后通用疊氮反應將辣根過氧化物酶接于微囊表面。文獻5 :Chemistry-A European Journal, 2009,15 (46) : 12600-12603 辣根過氧化物酶經過 PS (聚苯こ烯)或PMMA (聚甲基丙稀酸甲酷)修飾，合成酶親水頭，PS或PMMA為疏水尾的雙親性高分子，以此兩親高分子做載體固定化葡萄糖氧化酶，實現(xiàn)雙酶共固定。文獻6 Carbon,2009,47 :957-966以經過甲苯胺藍修飾的多層碳納米管為載體，實現(xiàn)了對葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的共固定，并驗證了固定化酶和電極之間的電子轉移，制得了測量低濃度葡萄糖的生物傳感器。文獻 7 Bioorganic&Medicinal Chemistry, 2011,19, 5071-5078 先通過對漆酶和辣根過氧化物酶的交聯(lián)聚合再經過高分子電解質層層包覆實現(xiàn)了對這兩種酶的共沉淀，并在木質素的氧化級聯(lián)反應中得到應用。以上相關文獻考察了多酶體系通過不同方法制備的固定化酶，所用固定化方法涉及到吸附、交聯(lián)和共價結合，這些方法的局限在干吸附法游離酶用量大，且酶與載體結合 率較低，所得的固定化酶穩(wěn)定性較弱；共價結合與交聯(lián)法由于固定化過程中載體與酶的結合依靠化學反應實現(xiàn)，對酶的活性影響較大，因此探求ー種固定化效率高、對酶活性影響小的方法很重要。目前為止，文獻中還未見采用仿生硅化包埋方法進行的多酶體系共固定的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供ー種操作簡單、成本低廉的固定化多酶體系的方法，它是以TMOS為前軀體溶液，在PDADMA (聚ニ甲基ニ烯丙基銨)的誘導下實現(xiàn)多酶體系共固定的方法，該方法所用載體價廉易得，成本較低而且固定化效率較高。本發(fā)明解決該技術問題所采用的技術方案是一種通過仿生硅化方法固定化多酶體系的方法，包括以下步驟是I)前驅體溶液的制備在室溫下將TMOS (正硅酸甲酷)加入到lmmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清后再加入pH=5-9磷酸緩沖液，混勻；其物料配比為體積比TM0S HCl溶液磷酸緩沖液=0. 6 :4. 4 :5。2)固定化酶的制備將多酶(葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶)溶液與PDADMA (6mg/mL)溶液均勻混合，其配比為體積比多酶(葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶)溶液PDADMA溶液=1: 1，得到含酶溶液A ;在30°C恒溫條件下，取上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，其配比為前驅體溶液酶溶液A體積比=1:10，立即振蕩，室溫靜置10-30min，離心分離5min后，用pH=7的磷酸緩沖液清洗，剩余固體真空冷凍干燥24h即得仿生硅化的多酶；所述的多酶溶液，是指每lmL、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中溶有0. 2-0. 4mg葡萄糖氧化酶和4mg a-淀粉酶的溶液。本發(fā)明的有益效果是I.本發(fā)明制備固定化酶的方法，受生物體內生物硅化現(xiàn)象的啟發(fā)，采用了仿生硅化技術進行了多酶固定化，制備エ藝簡單，條件溫和，對酶活性損失小，酶活回收率可達85. 12% ；2.載體為TM0S，廉價易得。
具體實施方式
本發(fā)明所用的TMOS購自于天津市化學試劑研究所。本發(fā)明所用的葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶均購于sigma公司。本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖溶液為Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液。實例I :實驗所用不同pH值的緩沖液配 制方法如下母液I :稱取NaH2P04_2H20固體0. lmol，溶于IOOOmL蒸餾水中得到0. lmol/L的NaH2PCM溶液；母液2 :稱取Na2HP04_12H20固體0. lmol，溶于IOOOmL蒸餾水中得到0. lmol/L的Na2HPO4溶液，不同pH的緩沖溶液由母液I與母液2按ー定比例混合并用pH計校正后得到。在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清后再加入5mL磷酸緩沖液(pH=5)，混勻，得到預處理過的前驅體溶液。將ImL比例為0. 2:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中溶有質量分別為葡萄糖氧化酶0. 2mg和a -淀粉酶4mg)與ImLPDADMA (6mg/mL)均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恒溫條件下，取200 u L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置lOmin，離心(5000rpm，5min)，用pH=7的磷酸緩沖液徹底清洗3次，剰余固體真空冷凍干燥24h即得仿生硅化的多酶。實驗中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為75. 58%。實例2 在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清后再加入5mL磷酸緩沖液(pH=7)，混勻。將ImL比例為0. 3:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中溶有葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶的質量分別為0. 3mg和4mg)與ImLPDADMA (6mg/mL)溶液均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恒溫條件下，取200y L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置20min，離心(5000rpm，5min),用pH=7的磷酸緩沖液徹底清洗3次，剩余固體真空冷凍干燥24h即得仿生硅化的多酶。實驗中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為80. 27%。實例3 在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清后再加入5mL磷酸緩沖液(pH=7)，混勻。將ImL比例為0. 4:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中溶有葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶的質量分別為0. 4mg和4mg)溶液與ImLPDADMA (6mg/mL)均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恒溫條件下，取200y L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置30min，離心(5000rpm，5min),用pH=7的磷酸緩沖液徹底清洗3次，剩余固體真空冷凍干燥24h即得仿生硅化的多酶。實驗中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為85. 12%。實例4
在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清后再加入5mL磷酸緩沖液(pH=9)，混勻。將ImL比例為0. 35:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中溶有葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶的質量分別為0. 35mg和4mg)溶液與ImLPDADMA (6mg/mL)均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恒溫條件下，取200 y L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置30min,離心(5000rpm,5min),用pH=7的磷酸緩沖液徹底清洗3次，剩余固體真空冷凍干燥24h即得仿生硅化的多酶。實驗中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為84. 57%?！?br> 權利要求
1.一種多酶體系的仿生固定化方法，其特征為包括以下步驟 1)前驅體溶液的制備在室溫下將TMOS(正硅酸甲酯)加入到I mmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清后再加入pH=5-9磷酸緩沖液，混勻；其物料配比為體積比TMOS HCl溶液磷酸緩沖液=0. 6 :4. 4 5 ； 2)固定化酶的制備將多酶(葡萄糖氧化酶和α-淀粉酶)溶液與PDADMA (6 mg/mL)溶液均勻混合，其配比為體積比多酶(葡萄糖氧化酶和α -淀粉酶)溶液=PDADMA溶液=1:1，得到含酶溶液A ;在30 °C恒溫條件下，取上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，其配比為前驅體溶液酶溶液A體積比=1:10，立即振蕩，室溫靜置10-30 min，離心分離5 min后，用PH=7的磷酸緩沖液清洗，剩余固體真空冷凍干燥24 h即得仿生硅化的多酶。
2.如權利要求I所述的多酶體系的仿生固定化方法，其特征為所述的多酶溶液是指每I mL、pH值為7的磷酸鹽緩沖液中溶有O. 2-0. 4 mg葡萄糖氧化酶和4 mg α -淀粉酶的溶液。
全文摘要
本發(fā)明是一種固定化多酶體系的工藝方法。該方法包括以下步驟是1)前驅體溶液的制備在室溫下將TMOS(正硅酸甲酯)加入到1mmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清后再加入pH=5-9磷酸緩沖液，混勻；2)固定化酶的制備將多酶溶液與PDADMA溶液均勻混合，得到含酶溶液A；在30℃恒溫條件下，取上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩，室溫靜置、離心分離后，用磷酸緩沖液清洗，剩余固體真空冷凍干燥24h即得仿生硅化的多酶。本發(fā)明制備固定化酶的方法，制備工藝簡單，條件溫和，對酶活性損失小，酶活回收率可達85.12%；載體為TMOS，廉價易得。
文檔編號C12N11/08GK102851273SQ20121039038
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權日2012年10月16日
發(fā)明者高靜, 王洪武, 姜艷軍 申請人:河北工業(yè)大學