專利名稱：五重熒光pcr快速超敏檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及能同時對沙眼衣原體、淋病奈瑟菌、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體等五種致病病原體進行檢測的多重實時PCR方法，其快速、超敏且一步完成。另外，本發(fā)明還涉及上述PCR方法中所涉及的試劑，如互不相干繞的引物、探針等，以及用于上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的制備應用等。
背景技術：
淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、生殖支原體(MG)是引起泌尿生殖系統(tǒng)感染的5種主要病原體，可引起尿道炎、前列腺炎、宮頸炎、輸卵管炎甚至不孕不育等。其中，淋病奈瑟菌(Niesseria gonorrhoeae, NG)是引起淋病的病原體，而淋病一直是性傳播疾病中最常見的疾病，可引起嚴重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常導致盆腔炎癥性疾病和繼發(fā)不孕；沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, CT)也是重要的性傳播疾病的病原體之一，可以導致陰道、尿道和上行的生殖道感染，也能導致盆腔炎、輸卵管損傷；解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, UU)是引起泌尿生殖道炎癥(NGU)及男女不育不孕的主要病原體，也是性傳播的常見病原體，是常見的泌尿生殖寄生物；人型支原體(Mycoplasma hominis, MH)是成人泌尿生殖道的一種常見的微生物，和某些婦科、男性疾病有關，也和新生兒呼吸道感染、中樞神經系統(tǒng)感染有關；生殖支原體(Mycoplasma genitalium, MG)可引起非淋菌性尿道炎(NGU)、前列腺炎、宮頸炎、子宮內膜炎、附件炎及不孕，同時可能在HIV感染中起著重要的作用，被稱為“AIDS相關支原體”。美國自1995年開展生殖道衣原體感染病例報告工作以來，其發(fā)病率很高，在180/萬以上；非洲性病發(fā)病率更高，如津巴布韋衛(wèi)生系統(tǒng)較為完善，全國1000多萬人口，I年報告的性病病例就達80萬，占總人口近10%。而隨著我國改革開放的不斷深入，社會經濟不斷發(fā)展，人口流動不斷加強，性病的感染的有逐年上升的趨勢，目前我國淋病和梅毒發(fā)病率高于發(fā)達國家，低于非洲國家，而且我國性病的發(fā)病率仍保持快速增長，1991 - 2000年全國性病平增長19. 30%，尤其是梅毒、生殖器皰疹和N⑶增長幅度在40%以上，而且性病和艾滋病的流行密切相關，性病的流行將促進艾滋病的傳播?，F(xiàn)在對淋病奈瑟菌、解脲支原體、人型支原體、生殖支原體的檢測主要以培養(yǎng)法為主；沙眼衣原體主要針對其抗原進行免疫學檢測。培養(yǎng)法檢測耗時長，一般需經48-72小時才能得到結果；靈敏度低，受采集、運送、保存等影響較大，容易出現(xiàn)假陰性結果；操作煩瑣，導致各種操作的結果判別標準難以統(tǒng)一，需要的技術和設備要求高。免疫學方法相比培養(yǎng)法有了長足的進步，但是因為生殖道微生物之間存在的交叉反應使得該方法的特異性受到影響，容易出現(xiàn)假陽性反應，給治療帶來誤判的可能。近年也有報道利用聚合酶鏈反應(PCR)來實施對病原體的檢測。PCR是當今核酸檢測中最常用的技術之一，其中實時(Real Time)PCR技術采用了諸如熒光標記等可實時檢測的標記，在核酸檢測、臨床診斷及分子生物學研究等方面，可以快速地獲得結果。常規(guī)的實時 PCR 檢測，如中國專利 CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A 等，僅用于檢測單一靶核酸；中國專利CN101624629A公開了(在單個PCR反應容器中)多重檢測樣品中靶核酸的實時PCR方法，執(zhí)行速度更快、更整合，但是其僅僅用于檢測HBV、HCV和HIV等三種靶核酸，沒有更多重檢測的實踐，例如沒有關于如何設計互不干擾的引物對和探針的提示，更沒有提示對探針濃度的進行調整。然而，對于更多重的實時PCR檢測，尤其是對于淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、生殖支原體(MG)這五種病原體(其中三種支原體的同源性較高)來說，通過目前已知的引物對和探針序列設計方法(包括現(xiàn)有的生物信息學軟件)，無法設計出這五重互不干擾的引物對和探針，設計出的將導致互相干擾而使得熒光檢測曲線失真。為此，本發(fā)明人經過艱苦的努力并且憑借了一些運氣，針對這五種病原體，設計出了互相干擾程度在實時PCR檢測中可接受的引物對和探針，更令人意外的是，在探針濃度上進行了調整，增強了它們的檢測曲線都能的清晰度和分辨度(曲線相互分離)，使得檢測靈敏度達到了超敏級，而且可以不使用內對照。另外，本發(fā)明對于上述微生物的核酸提取方法進行了優(yōu)化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的要解決的問題在于提供新的五重實時PCR方法，用于五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，通過互相干擾程度在實時PCR檢測中可接受的引物對和探針，并任選優(yōu)化探針濃度和核酸提取的過程，可以同時高特異性、高靈敏度和高重復性地分辨出樣品中是否存在來自上述微生物的靶核酸。另外，本發(fā)明還涉及提供上述方法的檢測試劑盒和應用等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，所述靶核酸來自淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，其包括，(I)在所述單個PCR反應容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中，靶核酸引物對包括 NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC,NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC,CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT,CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA,UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA,和MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG，靶核酸探針包括NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，
CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT ；(2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；和，(3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中?？梢詫怂崽崛∫哼M行直接檢測，但是優(yōu)選對樣品進行處理后獲得核酸提取液后再進行檢測。所以，優(yōu)選核酸提取液是提取樣品中的核酸而獲得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特異性的磁珠提取法采用表面涂有非特異性核酸吸附類物質的順磁性顆粒，在低PH(如，pH值5 7)和高鹽濃度的情況下核酸可以吸附到順磁性顆粒表面，在進行磁 分離和充分洗滌后，在高pH(如，pH值8、)、低鹽濃度的條件下可將核酸洗脫下來，由此富集了核酸(如靶核酸)的樣品可用于PCR試驗；另外還可以采用特異性吸附(如雜交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。這些處理過程對于本領域技術人員來說是熟知的，也可參見鄭秀芬等，模板DNA磁珠提取法·中國法醫(yī)學雜志，18(3):107-108 ;中國專利200610030229.5、200710118802. 2 和 201110105181. O 等。優(yōu)選采用本發(fā)明人進一步優(yōu)化的磁珠提取法，其對于同時提取淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體中的核酸，更為可靠，步驟也方便。優(yōu)選的提取受試品中的核酸的過程是向樣品加入核酸萃取液(優(yōu)選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液(如，Tris-HCl ))，保溫后加入磁珠，混合均勻后，施加磁場后，棄去其中液體，然后洗滌(優(yōu)選洗滌兩次，更優(yōu)選其中第一次洗滌所用的洗滌液包含高氯酸鈉和乙醇，也更優(yōu)選其中第二次洗滌所用的洗滌液包含乙醇)，并洗脫(優(yōu)選洗脫所用的洗脫液包含PH緩沖液(如，Tris-HCl ))。因此，本發(fā)明優(yōu)選提供了五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的方法，其包括，(A)提取樣品中的核酸，獲得核酸提取液；和，(B)對核酸提取液實施本發(fā)明的第一方面的在單個PCR反應容器中五重檢測樣品中靶核酸的實時PCR方法。在本文中，所檢測的“樣品”是潛在可能含有靶核酸或微生物的離體樣品，如食品、血液、血液制品、尿液、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。本發(fā)明的方法優(yōu)選不是診斷方法，如可用于公共衛(wèi)生領域的血液樣品檢測(如，輸血前血液樣品檢測，其直接目的是判斷是否可以使用該血液樣品，而非對患者進行診斷)，以及檢驗檢疫領域的產品安全檢測(如，衣物是否污染有上述微生物，其直接目的是檢測產品質量)。本發(fā)明的方法優(yōu)選僅限于對離體樣品的檢測，檢測的直接結果是靶核酸或微生物的存在性與否。即使對于利用本發(fā)明的檢測方法檢測人或動物的血液樣品中病原體(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在與否，還需要有經驗的醫(yī)生或取樣人員判斷檢測出的靶核酸是來自于血液中的病原體還是取樣時不慎污染的病原體，而不能直接得到疾病的診斷結果或健康狀況；即使靶核酸來自于血液中的病原體，也只能說明相應人或動物是相應病原體的攜帶者，還需要有經驗的醫(yī)生根據相應人或動物的體質、病史、臨床癥狀等綜合情況才能判斷出是否會造成疾病或對健康狀況有影響。
在本文中，“單個PCR反應容器”指所述實時PCR方法在技術上是在同一個容器中進行的，沒有必要更換容器。最優(yōu)選其中所述容器是PCR反應管，其它可以進行PCR反應并可進行實時熒光檢測的容器也在本發(fā)明的保護范圍內。在本發(fā)明第一方面的實時PCR方法中，在同一個容器中就可以完成PCR擴增和實時檢測的步驟，整個過程不必更換容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入樣品與各種試劑即可，就可以通過市售的普通實時熒光PCR儀來自動完成，整個過程操作者只需添加樣品和試劑即可，非常方便。尤其是，整個過程只需添加樣品和試劑的步驟干預，便于實現(xiàn)全自動操作，如使用中國專利申請2007100030261公開的自動微量加液系統(tǒng)(即，吸取和分配實驗液體的移液裝置及帶有該裝置的PCR儀)，即可完成本發(fā)明檢測方法的全過程自動化，從而節(jié)約了人力成本并最大程度降低了人為失誤的可能性，因此本發(fā)明的檢測方法便于自動化所帶來的成本和可靠性優(yōu)勢是可以預期的。在本文中，“五重”檢測指的是同時檢測的核酸(或其所代表的微生物)有五種，即淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體。 在實時熒光PCR反應中，Ct值表示每個PCR反應管內熒光信號到達實時熒光PCR儀所默認設定的閾值時所經歷的循環(huán)數，其具有良好的再現(xiàn)性，因此可以用于作為判讀結果的優(yōu)良指標。在本發(fā)明的第一方面的方法中，對于步驟(3)，其中一種靶核酸的熒光檢測結果計算出的Ct值< 45，則這種靶核酸存在于樣品中；一種靶核酸的熒光檢測結果計算出的Ct值>45，則這種靶核酸不存在于樣品中。這是我們經過長期大量試驗摸索出來的經驗，可靠性和重復性俱佳。因此也優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，優(yōu)選不采用內對照核酸。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果提高探針的濃度，可以進一步提高本發(fā)明的第一方面的方法的檢測靈敏度。所以，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，每種靶核酸探針在在所述單個PCR反應容器中的濃度大于5pmol/ml,優(yōu)選為6 12pmol/ml,更優(yōu)選為7 10pmol/ml,最優(yōu)選為8pmol/ml。另外，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，在步驟(I)中所述單個PCR反應容器中還進一步混合有PCR反應所需的其他試劑，如鹽。還優(yōu)選了甘油濃度，用以延長PCR條件下酶活耐久力。在本發(fā)明的具體實施方式
中，鹽優(yōu)選是Mg鹽。本領域技術人員還可以容易地選擇出其他pH緩沖劑(如磷酸緩沖液等)來調節(jié)到合適的pH，也可以容易地選擇出其他可溶性鹽(如KCl等)來調節(jié)離子強度。另外，還可以進一步混合有抗氧化劑(還原劑)、蛋白(酶)保護劑(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。這些成分的選擇對于本領域技術人員來說都是熟知的。在本文中，核酸按照本領域所常用的表示方法表示，其序列如未特別指出，均為5’端到3’端方向。其中，探針上標記有熒光標記物。熒光標記物可以位于探針的5’端、內部和/或3’端，優(yōu)選位于5’端和/或3’端。在本發(fā)明的第一方面的方法中，不同種探針(之間所標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，這樣能夠同時或快速地順序掃描不同的檢測波長，分別記錄下各種熒光基團的熒光變化，從而能夠進行同時檢測。在本文中，探針具有本領域技術人員所熟知的含義，其由為能與擴增出的靶核酸單鏈結合的單鏈DNA。通常，在每種探針的核苷酸序列的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。優(yōu)選其中各種探針標記有不同的熒光基團。優(yōu)選熒光基團及其淬滅基團是市售的，如可以采用FAM /SYBR Green I、yic:' /JOE/HEX、NED /TAMRA / Cy3^、R0X /Texas Re￡f 和Cy5 等常規(guī)產品，它們的檢測波長互不相同，也可以委托公司合成標記有熒光標記的探針。在本發(fā)明的具體實施方式
中，其中采用的標記有不同檢測波長的熒光標記的探針都是委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成的，純度達到HPLC純，不含雜帶。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，各種探針標記有不同的熒光基團。在本發(fā)明的具體實施方式
中，優(yōu)選的熒光基團是FAM、VIC、NED、Texas Red和 CY5。本領域技術人員能夠根據引物及相應需要PCR擴增的核酸來設計PCR反應條件。對于本發(fā)明的五重檢測，為了平衡不同種核酸的擴增條件，本發(fā)明人經過長期摸索，優(yōu)化出的條件為PCR反應的每個循環(huán)的條件為94°C 10秒、55°C 15秒以及65°C 45秒。在本發(fā)明的具體實施方式
中，PCR反應優(yōu)選先25°C保溫5分鐘并94°C變性10分鐘，然后進行上述條件的45個循環(huán)。在第二方面，本發(fā)明提供了用于在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法的檢測試劑盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中，靶核酸引物對包括 NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC，NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC，CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT，CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA，UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA，UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA，和
MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG,靶核酸探針包括NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。在試劑盒中，不同的試劑可以分裝在不同容器中，也可以選擇幾種長期保存而不發(fā)生化學反應的試劑合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容納上述試劑的容器，例如常規(guī)用于裝PCR、酶或核酸試劑的容器。檢測試劑盒中還可以有標簽或說明書，用以指示按照本發(fā)明第一方面所述方法進行操作。標簽可以貼在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供獨立的說明書。根據需要，如方便運輸、存放的需要，試劑盒還可以進一步包裝進更大的包裝中，這樣的產品也在本發(fā)明的范圍內。對于本發(fā)明第二方面的檢測試劑盒，其中優(yōu)選的各成分如本發(fā)明第一方面所述的那樣優(yōu)選。優(yōu)選諸如，其中各種探針標記有不同的熒光基團，更優(yōu)選熒光基團是FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5 ;其中每種靶核酸探針在在所述單個PCR反應容器中的濃度大于5pmol/ml,優(yōu)選為6 12pmol/ml,更優(yōu)選為7 10pmol/ml,最優(yōu)選為8pmol/ml。也優(yōu)選其中不含有內對照核酸。在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面所述的試劑盒在制備用于在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法的檢測試劑產品中的應用，優(yōu)選提供了本發(fā)明第二方面所述的檢測試劑盒在制備用于本發(fā)明第一方面所述方法的檢測試齊U產品中的應用。在本文中，檢測試劑產品可以是檢測試劑盒本身，也可以是合并裝有多個檢測試劑盒的更大包裝產品。根據前文所述，本領域技術人員很容易理解其中檢測試劑盒的成分以及其中方法的流程。試劑盒中還可以包含提取樣品中的核酸獲得核酸提取液所用的試劑。因此，在第四方面，本發(fā)明提供用于五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的檢測試劑盒，其包括本發(fā)明的第二方面的試劑盒和磁珠提取法所需試劑。優(yōu)選其中磁珠提取法所需試劑包括，核酸萃取液，優(yōu)選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液(如，Tris-HCl)；第一次洗滌所用的洗滌液，優(yōu)選其包含高氯酸鈉和乙醇；第二次洗滌所用的洗滌液，優(yōu)選其包含乙醇；和，洗脫所用的洗脫液，優(yōu)選其包含pH緩沖液(如，Tris-HCl)。相應地，在第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第四方面所述的試劑盒在制備用于五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的檢測試劑中的應用。在第六方面，本發(fā)明提供了互不干擾實時PCR的核酸混合物，其是引物或探針的混合物，所述引物或探針選自NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC,NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC,CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT，CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA,UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA,MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG,NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA， UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA,MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。該混合物可以用于本發(fā)明的第一方面的方法中，也可以用于制備本發(fā)明第二和/或第四方面的試劑盒。本發(fā)明的有益效果在于能夠五重檢測樣品中是否存在淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，五重引物/探針無交叉污染及干擾，保證了的準確性、可靠性、特異性、靈敏度和重復性，而且使用目前常規(guī)的市售實時熒光PCR設備，無需改造，操作方便并節(jié)省成本，并且可以不使用內對照監(jiān)控，進一步節(jié)約了成本。為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。


圖I顯示了示例性的本發(fā)明實施例中對淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、解脲 支原體(UU)、人型支原體(MH)、生殖支原體(MG)進行五重實時PCR的檢測圖譜，其結果曲線能夠清晰區(qū)分。
具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施。其中，所用的探針、引物可以委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實施例I核酸的提取淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)和生殖支原體(MG)在許可條件下可購自國家衛(wèi)生部臨檢中心，均為標準品，供核酸提取。核酸的提取按照常規(guī)磁珠提取法進行提取，為了同時適應上述五種微生物的核酸提取，改進如下向IuL標準品加入90uL核酸萃取液(配方及終濃度為異硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸鈉(pH8. 0)10mM、吐溫-20 2% (W/W)、高氯酸鈉 1M、乙醇 40% (V/V)、Tris_HCl(pH8. 0)10mM)，于 42°C保溫 lOmin，然后加入 IOuL MagDNA D-Beads DNA 磁珠懸浮液(50mg/mL，可購自北京艾比根生物技術有限公司)，振蕩混合均勻后，套在磁架上施加磁場，棄去其中液體，然后加入200uL洗滌液A (配方及終濃度為高氯酸鈉1M、乙醇30% (V/V))，洗滌后棄去洗滌液A，再加入200uL洗滌液B (配方及終濃度為乙醇70%(V/V))，洗滌后棄去洗滌液B，最后加入洗脫液(配方及終濃度為Tris-HCl ( 即.0)10禮)，于421保溫IOminJl出并保留液體，即為核酸提取液。合并各微生物標準品的核酸提取液，并稀釋供以下步驟測試。實施例2五重實時PCR測試I，引物及探針序列委托合成如下引物對和探針
檢測淋病奈瑟菌的引物對NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTCNG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC檢測淋病奈瑟菌的探針NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT檢測沙眼衣原體的引物對CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGATCT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA 檢測沙眼衣原體的探針CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA檢測解脲支原體的引物對UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACAUU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC檢測解脲支原體的探針UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA檢測人型支原體的引物對MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACATMH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA檢測人型支原體的探針MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA檢測生殖支原體的引物對MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACAMG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG檢測生殖支原體的探針MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT2，熒光標記在上述探針CT-P、NG-P、UU_P、MH-P和MG-P的5’端分別委托合成標記熒光標記FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5，并在3’端標記相應的淬滅基團。3，PCR反應條件PCR反應體系總體積為20μ 1，其中各組分的終濃度分別為核酸提取液(100倍稀釋)luL，上述5對引物對中的每一種引物含量為15pmol/ml，上述5種探針中的每一種含量增加至 8pmol/ml, Mg2+ (MgCl2)濃度為 3. 75mmoI /ml , dNTP 濃度各為 O. 2mmo1 /ml , UNG 酶含量為 O. 05U，2XPCR buffer (可購自 TaKaRa 公司，ρΗ8· 3，無 Mg2+)為 IOul，Taq DNA 聚合酶為2U，甘油15% (V/V)，余量為去離子水。反應熱循環(huán)條件如下250C 5 分鐘 94°C 10 分鐘(940C 10 秒 55°C 15 秒 65°C 45 秒)X45 個循環(huán)使用ABI 7500實時熒光PCR儀，熒光采集FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5檢測波長。
4，結果判斷基線和閾值設定為ABI 7500熒光儀默認自動設定。如果各熒光(FAM、VIC、NED、TexasRed或CY5)層Ct值大于45，則判定為相應微生物的核酸檢測陰性，如果小于等于45，則判定相應微生物的核酸檢測陽性。具體檢測圖譜見圖15，表明本發(fā)明的方法能夠檢測極底濃度的上述微生物的靶核酸，而且檢測互相不干擾，達到了超敏的檢測靈敏度。以上測試重復120次(包括樣品中只添加一、二、三或四種微生物標準品的核酸提取液，或者未添加任何提取液的情況，但是其他檢測條件不變)，結果均正確，表明本發(fā)明準確性和可靠性好，無需內對照。序列表<110>蘇州華益美生物科技有限公司〈120〉五重熒光PCR快速超敏檢測試劑盒及其應用 〈130〉中國申請<160>15<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Iaccgtaacgt ctctaagtc19<210>2<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>2gcaagatttc cgatttggc19<210>3<211>21<212>DNA〈213〉人工序列<400>3tgtccatatc tttgatacga t21<210>4<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>4ctctgatatt tgaagactct aca23<210>5
<211>19<212>DNA
〈2 13〉人工序列<400>5ctgctcgtga agtattaca19<210>6<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>6gtaccatctg ggaaagtac19<210>7<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>7tgtggtttaa tttgaagata cat23<210>8
<211>21<212>DNA〈213〉人工序列<400>8agtcctcaac ttaatgttag a21<210>9<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>9aggcagtaat gtcaatcaca20<210>10<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>10ggctttatca ttggcaaacg20<210>11<211>22<212>DNA〈213〉人工序列
〈400〉11cagacatcac gcaccgaagc at22<210>12〈211>27<212>DNA〈213〉人工序列<400>12ccaagccgag tctacagtta taggtca27·<210>13<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<400>13accaaccatt gtatctacac cttccata28<210>14<211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉14ccactcttga catccttcgc ata23<210>15<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>15ccattcgcat ccaacttcac ctct2權利要求
1.在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，所述靶核酸來自淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，其包括， (1)在所述單個PCR反應容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中， 靶核酸引物對包括 ACCGTAACGTCTCTAAGTC,GCAAGATTTCCGATTTGGC,TGTCCATATCTTTGATACGAT,CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,CTGCTCGTGAAGTATTACA,GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT,AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，AGGCAGTAATGTCAATCACA,和GGCTTTATCATTGGCAAACG, 靶核酸探針包括CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA,ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA,CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT ； (2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；和， (3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中。
2.五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的方法，其包括， (A)提取樣品中的核酸，獲得核酸提取液；和， (B)對核酸提取液實施權利要求I所述的在單個PCR反應容器中五重檢測樣品中靶核酸的實時PCR方法。
3.權利要求I或2所述的方法，其是非診斷方法。
4.權利要求I所述的方法，其中各種探針標記有不同的熒光基團，優(yōu)選熒光基團是FAM、VIC、NED、Texas Red 和 CY5。
5.權利要求I所述的方法，其中PCR反應的每個循環(huán)的條件為94°C10秒、55°C 15秒以及65°C 45秒。
6.權利要求I所述的方法，其中每種靶核酸探針在在所述單個PCR反應容器中的濃度大于5pmol/ml,優(yōu)選為6 12pmol/ml,更優(yōu)選為7 10pmol/ml,最優(yōu)選為8pmol/ml。
7.權利要求2所述的方法，其中提取樣品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。
8.權利要求7所述的方法，其中提樣試品中的核酸的過程是向樣品加入核酸萃取液(優(yōu)選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液(如，Tris-HCl))，保溫后加入磁珠，混合均勻后，施加磁場后，棄去其中液體，然后洗滌(優(yōu)選洗滌兩次，更優(yōu)選其中第一次洗滌所用的洗滌液包含高氯酸鈉和乙醇，也更優(yōu)選其中第二次洗滌所用的洗滌液包含乙醇)，并洗脫(優(yōu)選洗脫所用的洗脫液包含PH緩沖液(如，TriS-HCl))ο
9.用于在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法的檢測試劑盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中， 靶核酸引物對包括 ACCGTAACGTCTCTAAGTC,GCAAGATTTCCGATTTGGC,TGTCCATATCTTTGATACGAT,CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,CTGCTCGTGAAGTATTACA,GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT,AGTCCTCAACTTAATGTTAGA， AGGCAGTAATGTCAATCACA,和 GGCTTTATCATTGGCAAACG, 靶核酸探針包括CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA,ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA, CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和 CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。
10.權利要求9所述的試劑盒，其中各種探針標記有不同的熒光基團，優(yōu)選熒光基團是FAM、VIC, NED、Texas Red 和 CY5。
11.權利要求9所述的試劑盒，其中每種靶核酸探針在在所述單個PCR反應容器中的濃度大于5pmol/ml,優(yōu)選為6 12pmol/ml,更優(yōu)選為7 10pmol/ml,最優(yōu)選為8pmol/ml。
12.用于五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的檢測試劑盒，其包括權利要求擴11之任一所述的試劑盒和磁珠提取法所需試劑。
13.權利要求12所述的試劑盒，其中磁珠提取法所需試劑包括， 核酸萃取液，優(yōu)選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和PH緩沖液(如，Tris-HCl)； 第一次洗滌所用的洗滌液，優(yōu)選其包含高氯酸鈉和乙醇； 第二次洗滌所用的洗滌液，優(yōu)選其包含乙醇；和， 洗脫所用的洗脫液，優(yōu)選其包含PH緩沖液(如，Tris-HCl)。
14.權利要求擴11之任一所述的試劑盒在制備用于在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法的檢測試劑產品(優(yōu)選是用于權利要求1-8之任一所述的方法的檢測試劑產品)中的應用。
15.權利要求12或13所述的試劑盒在制備用于五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體的檢測試劑(優(yōu)選是用于權利要求2、7或8所述的方法的檢測試劑產品)中的應用。
16.互不干擾實時PCR的核酸混合物，其是引物或探針的混合物，所述引物或探針選自 ACCGTAACGTCTCTAAGTC,GCAAGATTTCCGATTTGGC,TGTCCATATCTTTGATACGAT,CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,CTGCTCGTGAAGTATTACA,GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT,AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，AGGCAGTAATGTCAATCACA，GGCTTTATCATTGGCAAACG,CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA,ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA, CCACTCTTGACATCCTTCGCATA,和 CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT。
全文摘要
本發(fā)明涉及在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，用于檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體。
文檔編號C12Q1/04GK102888464SQ20121041093
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權日2012年10月25日
發(fā)明者陳悅科, 張文艷, 劉明霞, 葉成果, 王奕江, 沈靖 申請人:蘇州華益美生物科技有限公司