專利名稱：一種制備蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子及gfp標記菌株的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及一種蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子及其制備方法，同時還提供一種蘋果樹腐爛病菌GFP標記菌株及其制備方法。
背景技術：
黑腐皮殼菌(Valsa ceratosperma)引起的蘋果樹腐爛病,是對蘋果產(chǎn)業(yè)威脅最大的一種毀滅性病害，該病在我國蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，可造成果樹主干及整樹死亡，甚至毀園(陳策，1987 ;2009)。自1916年蘋果樹腐爛病在遼寧省南部地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，該病已在我國有過幾次大流行，造成了嚴重的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失(陳策等，1980 ;2009)。隨著我國蘋果種植結(jié)構(gòu)和栽培制度的調(diào)整，腐爛病已成為限制我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因子。2008年，國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術體系調(diào)查顯示，全國范圍內(nèi)蘋果樹腐爛病的總體發(fā)生率為52. 7%，部分地區(qū)發(fā)病率高達85%以上(曹克強等，2009)。2011年，山東煙臺蘋果產(chǎn)區(qū)腐爛病再次嚴重發(fā)生，本課題 組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，旺盛結(jié)果期的蘋果樹具有新病疤的病株率為68. 20%，死株率為2. 76% (王彩霞等，2012)。針對蘋果樹腐爛病造成的嚴重危害及防治困難等問題，引起了國內(nèi)外相關科研工作者及多國政府部門的高度重視，該病現(xiàn)在仍被列為歐洲的主要檢疫對象(http//WWW.eppo. orR)。我國自上世紀50年代以來,對蘋果樹腐爛病的發(fā)生和流行規(guī)律、防治技術及病原學等進行了系統(tǒng)研究，取得了許多有意義的成果。目前生產(chǎn)上對于腐爛病的防控，采取的措施主要包括加強栽培管理、噴藥保護、及時刮治病斑等，但這些措施都未能有效控制病害的發(fā)生和流行。其中一個重要原因是對于腐爛病菌的侵染、致病過程與致病機理尚不清楚，制約了對病害發(fā)生、流行規(guī)律的深入了解，導致病害防治工作低效、盲目和被動，造成腐爛病的危害近年來仍在逐年加重。植物病原菌侵染致病過程的研究，對于病害防控具有重要的實踐價值，可以為施藥提供一定的科學依據(jù)，如施藥時期、施藥部位、施藥次數(shù)等，還可根據(jù)抗感病品種不同的侵染過程而篩選抗病品種。對于真菌侵染過程的研究，多采用切片染色結(jié)合電子顯微鏡觀察的方法進行，但對于木本植物的枝干類病害如蘋果樹腐爛病、枝干輪紋病等，由于材料木質(zhì)化程度高，采用傳統(tǒng)的技術方法很難取得理想的觀察效果，這也是該類病害侵染致病過程研究無法取得突破性進展的主要原因之一。隨著生物技術和分子生物學的不斷發(fā)展，利用分子標記如綠色熒光蛋白(GFP)研究病原菌的侵染過程與致病機理已成為可能(Spellig et al.，1996)。因此，在目前缺乏有效抗腐爛病品種及殺菌劑的前提下，利用GPF標記菌株揭示腐爛病菌的侵染致病過程及其潛伏位點，明確其致病機理及其與寄主的互作機制，將為蘋果樹腐爛病的有效、安全控制提供新的指導思路，為生產(chǎn)上科學、高效地防控腐爛病提供堅實的理論基礎。綠色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作為一種重要的報告基因，在病原菌的侵染致病過程、病原菌在寄主組織中的發(fā)育和形態(tài)觀察、致病機理及其病原物-寄主互作研究等諸多方面均顯示了良好的應用前景(Chen et al. , 2003;Dueketal. , 2004;Sarrocco et al. , 2007;Rajasekaran et al. , 2008;Mansouri et al.,2009;Pliego et al.，2009)。在植物病原真菌中，GFP標記技術也已得到廣泛應用，并取得了前所未有的成果，受到植物病理學家的高度關注。對于蘋果樹腐爛病菌而言，由于其功能基因尚未被克隆，因此，要得到其GFP標記菌株，首先必須建立高效、穩(wěn)定的腐爛病菌遺傳轉(zhuǎn)化技術體系。
目前廣泛采用的真菌轉(zhuǎn)化方法有聚乙二醇(PEG)介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電激法、醋酸鋰法、限制性內(nèi)切酶介導法(REMI)和基因槍轉(zhuǎn)化法等，這些方法大都需以原生質(zhì)體為受體。高靜等(2011)報道了 PEG介導的蘋果樹腐爛病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化效率為44個/μ g DNA，作者僅得到218個轉(zhuǎn)化子。有大量報道稱原生質(zhì)體制備繁瑣，或不同批次的酶活性不一致，導致原生質(zhì)體制備試驗不能很好的重復(Weld et al. , 2006; Levyet et al. , 2008;Bashi Zafer Dallal et al.，2010),是使用原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體的主要問題。因此原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體，仍有問題需要解決。針對這一問題，許多學者提出了一些改進技術和新方法，其中最有效的是根癌農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉(zhuǎn)化法(Agrobacteriumt umefaciens-mediated transformation, ATMT),在多種絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中得到成功應用，高靜(2011，碩士論文)初步建立了蘋果樹腐爛病菌的ATMT轉(zhuǎn)化體系，但是轉(zhuǎn)化效率極低，每IO6個分生孢子僅得到6個轉(zhuǎn)化子。
總之，目前缺乏高效、穩(wěn)定的蘋果樹腐爛病菌遺傳轉(zhuǎn)化技術體系，更沒有關于腐爛病菌GFP標記方法的報道，成為腐爛病菌侵染致病過程與機理研究的瓶頸。因此，建立新的高效的蘋果樹腐爛病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的標記菌株，對于推動腐爛病菌侵染致病過程的組織學研究及其分子生物學研究具有重大意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子的方法及制 備GFP標記腐爛病菌的方法。本發(fā)明一個方面提供一種制備蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子的方法，包括以下步驟
A.制備平果樹腐爛病囷分生抱子
( U將蘋果樹腐爛病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)3天；
(2)將活化培養(yǎng)的腐爛病菌打取菌餅接種于含有大麥粒的PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)20-30天，至橘黃色分生孢子角溢出；
B.培養(yǎng)農(nóng)桿菌
(I)將質(zhì)粒pBIG3C (由中國農(nóng)業(yè)大學彭友良教授饋贈)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；
(2)取步驟B(I)中的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有卡那霉素、利福平和鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)I天；
(3)取步驟B (2)中的農(nóng)桿菌菌液于含卡那霉素的基本培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)2 天，測量菌液的OD6c 值；
(4)用含有乙酰丁香酮和2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的頂培養(yǎng)基稀釋步驟B (3) 中的農(nóng)桿菌懸浮液至0D_值為O. 15，繼續(xù)在28°C條件下振蕩培養(yǎng)6h備用；
C.根癌農(nóng)桿菌與蘋果樹腐爛病菌分生孢子共培養(yǎng)
(I)取步驟A (2)中的蘋果樹腐爛病菌分生孢子角至步驟B (4)中的農(nóng)桿菌懸浮液中，用農(nóng)桿菌溶液稀釋混合均勻，調(diào)節(jié)濃度至IO6個分生孢子/mL ；(2)將步驟C (I)中的農(nóng)桿菌-腐爛病菌分生孢子混合液，按200 μ L/皿的量均勻涂布于鋪有玻璃紙的含有乙酰丁香酮和2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的Co-M培養(yǎng)基上，置于25°C共培養(yǎng)3 5天；D.轉(zhuǎn)化子的篩選及保存(I)將步驟C (2)中的玻璃紙放于一空的無菌培養(yǎng)皿中，使有菌絲的一面朝上，玻璃紙上面覆蓋含有潮霉素和頭孢霉素PDA培養(yǎng)基，置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)3飛天；(2)將長出的腐爛病菌菌落轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的PDA平板中繼續(xù)培養(yǎng)，將能繼續(xù)生長的菌落再次接種至含有潮霉素的PDA平板上，連續(xù)培養(yǎng)三代得到蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子;·
(3)將得到的轉(zhuǎn)化子保存在含有50 μ g/mL潮霉素的PDA斜面培養(yǎng)基上，置于4°C冰箱中保存。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟A中培養(yǎng)的溫度均為25V。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟A中PDA培養(yǎng)基制作方法如下200g去皮馬鈴薯，加適量水蒸煮30min后用四層紗布過濾，然后在濾液中加入葡萄糖20g、15g瓊脂煮沸溶解，補充蒸餾水至IOOOmL,置于121°C滅菌30min。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中采用電擊的方法將質(zhì)粒pBIG3C轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中LB液體培養(yǎng)基為2mL含有50 μ g/mL卡那霉素、50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL鏈霉素的的LB液體培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中LB液體培養(yǎng)基配方如下蛋白胨10g，酵母粉5g, NaCl 5g,補充去離子水至IOOOmL, pH7. O,分裝后置于121 °C高壓滅菌30min。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中農(nóng)桿菌菌液與基本培養(yǎng)基的體積為O. 25:50。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中為含50 μ g/mL的卡那霉素的50mL基本培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中基本培養(yǎng)基(MM)配方如下磷酸氫鉀緩沖液(K-buffer)，含K2HP04200g/L，KH2P04145g/L,用 H3PO4 調(diào) ρΗ7· O,使用量為IOmL ；硫酸鎂-氯化鈉溶液(M-Nbuffer)，含 MgSO4 · 7H20 30g/L 和 NaC115g/L，使用量為 20mL ；20%葡萄糖(w/v),20g葡萄糖溶解于70g去離子水中，定容至IOOmL,過濾除菌,使用量為IOmL ；其他成分包括l%CaCl2 · 2H20 (w/v) ImL, 20%NH4N03 (w/v) 2. 5mL，使用之前加入0. 01%FeS04 (w/v) IOmL,補充去離子水至 lOOOmL，以 H3PO4 或 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7. O。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中為含有200 μ M的乙酰丁香酮和1. 0mg/mL的
2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉的頂培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟B中誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)基(IM)配方如下磷酸氫鉀緩沖液pH4. 9 (1. 25Μ K-buffer, ρΗ4· 9)，含 K2HP04184g/L，KH2P04145g/L,用H3p04調(diào)節(jié)pH，使用量為0. 8mL ；其他成分為M-N溶液 20mL, l%CaCl2 · 2H20 (w/v) ImL, 20% 葡萄糖(w/v) IOmL,20%NH4N03 (w/v) 2. 5mL, 50% 甘油(v/v) IOmL,使用前加入 0. 01%FeS04 (w/v) IOmL,補充去離子水至 1000mL。
乙酰丁香酮(AS)配制取AS O. 1962g，用二甲基亞砜(DMSO)直接溶解后定容到 10mL，即為O.1M的AS，分裝于無菌1. 5ml離心管中，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉(MES)的配制在無菌1. 5mL離心管中稱取O.1 O. 15g MES，用1. (Tl. 5mL無菌去離子水完全溶解，配制成100mg/mL MES置于_20°C下保存?zhèn)溆谩?br> 根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟C中為含有200 μ M的乙酰丁香酮和1.0mg/mL的 2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的Co-M培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟C中共培養(yǎng)培養(yǎng)基(Co-1M)的配方如下
磷酸氫鉀緩沖液(K-buffer)，含K2HP04200g/L，KH2P04145g/L,用 H3PO4 調(diào) ρΗ7· O,使用量為IOmL ；
硫酸鎂-氯化鈉溶液(M-Nbuffer)，含 MgSO4 · 7H20 30g/L 和 NaC115g/L，使用量為 20mL ；
20%葡萄糖(w/v)，20g葡萄糖溶解于70g去離子水中，定容至IOOmL,過濾除菌，使用量為5mL ；
其他成分包括l%CaCl2 · 2H20 (w/v) ImL, 20%NH4N03 (w/v) 2. 5mL,使用之前加入0.01%FeS04 (w/v) IOmL,補充去離子水至 IOOOmL,以 H3PO4 或 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7. O。
根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟D (I)中為20mL含有50 μ g/mL潮霉素和300 μ g/mL 頭孢霉素的PDA培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟D (2)和(3)中均為含有50 μ g/mL的潮霉素的PDA 平板。
根據(jù)本發(fā)明的具體示例，步驟D中制得的轉(zhuǎn)化子保存在含有PDA斜面培養(yǎng)基的 1.5mL的離心管中，置于4°C冰箱中保存。
本發(fā)明的一個方面，提供一種蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子，采用如上述方法制備。
本發(fā)明的另一個方面，提供一種蘋果樹腐爛病菌GFP標記菌株的制備方法，包括如下步驟
(I)以權利要求1中步驟B (I)的載體PBIG3C為框架，通過限制性內(nèi)切酶Apa I和Sac I進行酶切；將經(jīng)相同酶切處理的PtrpC-GFP-TtrpC表達盒連接到載體中，獲得以潮霉素抗性標記基因為篩選標記，組成性表達egfp的表達載體命名為pHG-C。進一步的，利用特異性引物分別以質(zhì)粒pEGFP-Cl和pAN52-l為模板擴增到egfp基因和來自于構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans的色氨酸合成酶基因啟動子PtrpC及終止子TtrpC,獲得 PtrpC-GFP-TtrpC表達盒，再經(jīng)相同內(nèi)切酶Apa I和Sac I酶切處理后連接到pBIG3C載體中，獲得以潮霉素抗性標記基因為篩選標記，組成性表達egfp的表達載體命名為pHG-C ；
(2)將上述步驟(I)中構(gòu)建的載體pHG-C轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，然后按權利要求1所述步驟B-D進行后續(xù)操作，在含潮霉素PDA平板上篩選獲得轉(zhuǎn)化子；
(3)利用熒光顯微鏡觀察各轉(zhuǎn)化子的菌絲體在488nm藍色激發(fā)光源的激發(fā)下能否產(chǎn)生綠色熒光，將表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化子接種至含有50 μ g/mL潮霉素的PDA平板上， 連續(xù)培養(yǎng)三代得到穩(wěn)定表達egfp的蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子。
根據(jù)本發(fā)明的具體示例，按照上述方法保存蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明的另一個方面，提供一種蘋果樹腐爛病菌GFP標記菌株，采用如上述方法制備。本發(fā)明提供了一種簡便的農(nóng)桿菌介導的蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子制備方法，同時還提供了一種高效的腐爛病菌GFP分子標記方法。具有的優(yōu)點如下1.蘋果樹腐爛病菌誘導分生孢子的方法與已報道的腐爛病菌誘導產(chǎn)孢方法更為簡單，可以直接在培養(yǎng)皿內(nèi)產(chǎn)生分生孢子，無需其它藥品及處理，更為經(jīng)濟，同時已經(jīng)證實此方法適宜于不同致病力腐爛病菌菌株分生孢子的誘導。2.以腐爛病菌分生孢子為受體，無需制備原生質(zhì)體，操作簡便。3.以根癌農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化介體，具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定且單拷貝頻率高等優(yōu)點。4.本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法效率高，約IO3個分生孢子可以獲得I個轉(zhuǎn)化子，而已報道的 腐爛病菌分生孢子為受體進行的轉(zhuǎn)化為每1. 67X IO5個分生孢子獲得一個轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率提高了約167倍。5.建立的ATMT轉(zhuǎn)化方法應用廣泛,適合于多種果樹病原真菌。已在梨樹腐爛病菌(Valsa mali)、蘋果炭疽病菌(Glomerella cingulata)和樓桃干腐病菌(Phomopsisperniciosa)中得到驗證。其它難以制備原生質(zhì)體的絲狀真菌，也可參考此說明方法。6.構(gòu)建的組成性表達egfp載體pHG_C，利用本方法轉(zhuǎn)化蘋果樹腐爛病菌后，96. 7%的轉(zhuǎn)化子可表達強的綠色熒光蛋白，且遺傳穩(wěn)定性良好。利用本方法成功轉(zhuǎn)化了多個不同致病力的蘋果樹腐爛病菌菌株，而且經(jīng)多次重復實驗具有相同轉(zhuǎn)化效率，為構(gòu)建腐爛病菌菌株T-DNA隨機插入突變體庫提供了高效的轉(zhuǎn)化技術。這是國內(nèi)外首次報道利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化蘋果樹腐爛病菌，獲得大量穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的腐爛病菌轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


圖1、實施例1中蘋果樹腐爛病菌LXS080901在大麥粒培養(yǎng)基上產(chǎn)生的分生孢子。圖2、實施例1中所用質(zhì)粒PBIG3C的圖譜。圖3、實施例1中腐爛病菌LXS080901部分轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)(PDA，25°C，5d)。圖中W為未轉(zhuǎn)化的LXS080901野生型菌株，其余均為LXS080901的轉(zhuǎn)化子。圖4、實施例1中隨機挑選腐爛病菌轉(zhuǎn)化子潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)的PCR擴增電泳圖譜。圖中泳道M DL2000DNA Maker ;泳道 CK :質(zhì)粒 pBIG3C ;泳道 W LXS080901未轉(zhuǎn)化的野生型菌株；泳道f 14 :腐爛病菌LXS080901菌株的轉(zhuǎn)化子；泳道15 :無菌水對照圖5、實施例1中隨機挑選的轉(zhuǎn)化子以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)片段為探針進行的Southern雜交圖譜。圖中泳道M λ -Hind III digest DNA Marker ;泳道 CK Apa I 酶切的 pBIG3C 質(zhì)粒；泳道W =Hind III酶切的腐爛病菌LXS080901野生型菌株基因組DNA ;泳道I 8 Hind III酶切的腐爛病菌LXS080901轉(zhuǎn)化子基因組DNA。
圖6、實施例2中隨機挑取部分轉(zhuǎn)化子的GFP熒光顯微觀察(3個連續(xù)繼代5次的 GFP標記轉(zhuǎn)化子)
圖7、實施例2中部分轉(zhuǎn)化子的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)和綠色熒光蛋白 (efpg)基因穩(wěn)定性檢測的PCR和RT-PCR擴增電泳圖譜。圖中
泳道M DL2000DNA Marker ;泳道 I, 11 :質(zhì)粒 pBIG3C ;泳道 2，12 LXS080901 未轉(zhuǎn)化的野生型菌株；泳道3-10:轉(zhuǎn)化子hph基因的PCR擴增產(chǎn)物；13:不表達egfp基因的轉(zhuǎn)化子；14-17:轉(zhuǎn)化子的egfp基因的RT-PCR產(chǎn)物。
圖8、實施例2中部分轉(zhuǎn)化子的菌絲生長速率。
圖9、實施例2中GFP標記蘋果樹腐爛病菌菌株對富士離體枝條侵染過程的顯微觀察。
圖10、實施例3中梨樹腐爛病菌LXS240101部分轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)(PDA，25°C，4d)。 圖中W為未轉(zhuǎn)化的LXS240101野生型菌株，其余均為LXS240101的轉(zhuǎn)化子。
圖11、實施例3中部分梨樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)片段為探針進行的Southern雜交圖譜。圖中
泳道M λ -Hind III digest DNA Marker ;泳道 CK Apa I 酶切的 pBIG3C 質(zhì)粒；
泳道W =Hind III酶切的梨樹腐爛病菌LXS240101野生型菌株基因組DNA ;泳道 Γ3 =Hind III酶切的梨樹腐爛病菌LXS240101轉(zhuǎn)化子基因組DNA。
圖12、實施例3中部分櫻桃干腐病菌轉(zhuǎn)化子潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)的PCR 擴增電泳圖譜。圖中
泳道M DL2000DNA Marker ;泳道W LXS230101未轉(zhuǎn)化的野生型菌株；泳道CK :質(zhì)粒pBIG3C ;泳道1-9 LXS230101轉(zhuǎn)化子hph基因的PCR擴增產(chǎn)物。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。
實例1:蘋果樹腐爛病菌菌株LXS080901的T-DNA隨機插入突變體庫的構(gòu)建
1.轉(zhuǎn)化受體蘋果樹腐爛病菌LXS080901分生孢子的制備
將保存的腐爛病菌菌株LXS080901接種在PDA培養(yǎng)基中，于25 °C恒溫暗培養(yǎng)3天。 將活化后的蘋果樹腐爛病菌，打取菌餅(直徑6mm)接種于下列6種培養(yǎng)基制備的平板上，繼續(xù)置于25°C恒溫箱暗培養(yǎng)。下述第6種培養(yǎng)基誘導產(chǎn)孢時,待腐爛病菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上長滿整個平皿后，放入滅菌的蘋果枝條，并置黑光燈下(365nm)誘導。6種培養(yǎng)基的配方如下
(I)PDA培養(yǎng)基稱取200g去皮馬鈴薯，加適量蒸餾水煮30min后用四層紗布過濾， 向濾液中加入葡萄糖20g，瓊脂15g煮沸，補充蒸餾水至IOOOmL,分裝后121°C滅菌30min。
(2)大麥粒PDA培養(yǎng)基將帶殼大麥粒沖洗干凈后，蒸餾水中浸泡lh，取70g浸泡過的大麥粒于250mL三角瓶中，加入l%(w/v)的蛋白胨20mL，6%(v/v)的蜂蜜20mL，混勻后置于121°C滅菌lh。PDA培養(yǎng)基制備方法同前，此大麥粒培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基分開單獨滅菌。 之后先倒I3DA平板，后將大麥粒均勻撒在上面，即為含大麥粒的PDA培養(yǎng)基。
(3)蘋果樹皮漿培養(yǎng)基取2 3年生富士蘋果幼樹枝干的樹皮300g，組織勻漿后，加Λ IOg瓊脂,用蒸懼水定容至IOOOmL,分裝后滅菌。(4)燕麥片培養(yǎng)基稱取燕麥片30g，煮沸后，加入瓊脂15g，蒸餾水定容至IOOOmL,分裝后滅菌。(5)蘋果汁培養(yǎng)基成熟富士果實去皮，稱取果肉組織300g，勻漿后四層紗布過濾，濾液中補加蒸餾水300mL，加入瓊脂15g，分裝后滅菌。(6)蘋果枝條培養(yǎng)基取I年生富士蘋果枝條剪成5cm小段，高壓滅菌后放置于長滿腐爛病菌菌絲的PDA平板上，每個平皿2 4個枝條。蘋果樹腐爛病菌LXS080901僅在大麥粒PDA培養(yǎng)基和滅菌蘋果枝條上產(chǎn)生的子實體可溢出孢子角，在蘋果枝條上誘導65天后僅5%的子實體能溢出孢子角，而在大麥粒PDA培養(yǎng)基上，20天左右即可見大量的橘黃色分生孢子角溢出，每個大麥粒平均可產(chǎn)生6個子實體，其中1. 8個子實體可溢出孢子角，每個孢子角含有約IO8個分生孢子，為利用腐爛病菌分生孢子進行遺傳轉(zhuǎn)化提供了足夠的試材(見表I和圖1)。表I蘋果樹腐爛病菌在6種培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢數(shù)量
權利要求
1.一種制備蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子的方法，其特征在于，包括以下步驟A.制備蘋果樹腐爛病菌分生孢子(1)將蘋果樹腐爛病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)3天；(2)將活化培養(yǎng)的腐爛病菌打取菌餅接種于含有大麥粒的PDA培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)20-30天，至橘黃色分生孢子角溢出；B.培養(yǎng)農(nóng)桿菌(1)將質(zhì)粒PBIG3C轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；(2)取步驟B(I)中的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有卡那霉素、利福平和鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)I天；(3)取步驟B(2)中的農(nóng)桿菌菌液于含卡那霉素的基本培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)2天， 測量菌液的OD6tltl值；(4)用含有乙酰丁香酮和2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉的IM培養(yǎng)基稀釋步驟B (3)中的農(nóng)桿菌懸浮液至0D_值為O. 15，繼續(xù)在28°C條件下振蕩培養(yǎng)6h備用；C.根癌農(nóng)桿菌與蘋果樹腐爛病菌分生孢子共培養(yǎng)(1)取步驟A(2)中的蘋果樹腐爛病菌分生孢子角至步驟B (4)中的農(nóng)桿菌懸浮液中， 用農(nóng)桿菌溶液稀釋混合均勻，調(diào)節(jié)濃度至IO6個分生孢子/mL ；(2)將步驟C(I)中的農(nóng)桿菌-腐爛病菌分生孢子混合液，按200 μ L/皿的量均勻涂布于鋪有玻璃紙的含有乙酰丁香酮和2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的Co-M培養(yǎng)基上，置于25°C 共培養(yǎng)3 5天；D.轉(zhuǎn)化子的篩選及保存(1)將步驟C(2)中的玻璃紙放于一空的無菌培養(yǎng)皿中，使有菌絲的一面朝上，玻璃紙上面覆蓋含有潮霉素和頭孢霉素的PDA培養(yǎng)基，置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)3飛天；(2)將長出的腐爛病菌菌落轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的PDA平板中繼續(xù)培養(yǎng)，將生長的菌落再次接種至含有潮霉素的PDA平板上，連續(xù)培養(yǎng)三代得到蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子；(3)將得到的轉(zhuǎn)化子保存在含有50μ g/mL潮霉素的PDA斜面培養(yǎng)基上，置于4°C低溫保存。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中LB液體培養(yǎng)基為2mL含有50μ g/ mL卡那霉素、50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中農(nóng)桿菌菌液與基本培養(yǎng)基的體積為0.25:50。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中為含50μ g/mL的卡那霉素的50mL 基本培養(yǎng)基。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中為含有200μ M的乙酰丁香酮和1.Omg/mL的2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的頂培養(yǎng)基。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中為含有200μ M的乙酰丁香酮和1.Omg/mL的2- (N-嗎啉基)乙磺酸鈉的Co-頂培養(yǎng)基。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟D(I)中為含有50 μ g/mL潮霉素和 300 μ g/mL頭孢霉素的PDA培養(yǎng)基。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟D(2)和(3)中為含有50 μ g/mL的潮霉素的PDA平板。
9.一種蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子，其特征在于采用如權利要求1所述方法制備。
10.一種蘋果樹腐爛病菌GFP標記菌株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)以權利要求1中步驟B(I)的載體PBIG3C為框架，通過限制性內(nèi)切酶Apa I和Sac I進行酶切，將經(jīng)相同酶切處理的PtrpC-GFP-TtrpC表達盒連接到載體中，獲得以潮霉素抗性標記基因為篩選標記，組成性表達egfp的表達載體命名為pHG-C ；(2)將上述步驟(I)中構(gòu)建的載體pHG-C轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，然后按權利要求1中步驟B-D 進行后續(xù)操作，在含潮霉素TOA平板上篩選獲得轉(zhuǎn)化子；(3)利用熒光顯微鏡觀察各轉(zhuǎn)化子的菌絲體在488nm藍色激發(fā)光源的激發(fā)下能否產(chǎn)生綠色熒光，將表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化子接種至含有50 μ g/mL潮霉素的PDA平板上，連續(xù)培養(yǎng)三代得到穩(wěn)定表達egfp的蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子。
11.一種蘋果樹腐爛病菌GFP標記菌株，其特征在于采用如權利要求10所述方法制備。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種蘋果樹腐爛病菌轉(zhuǎn)化子及其制備方法。該方法將含有二元載體的根癌農(nóng)桿菌與腐爛病菌的分生孢子懸浮液混合后共培養(yǎng)，用抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)化子。該方法以蘋果樹腐爛病菌的分生孢子為受體，以根癌農(nóng)桿菌為介體，克服了蘋果樹腐爛病菌原生質(zhì)體制備困難，且聚乙二醇(PEG)介導的轉(zhuǎn)化效率低等原因?qū)е碌母癄€病菌遺傳轉(zhuǎn)化困難的問題。該方法的轉(zhuǎn)化效率可達1/103個分生孢子。本發(fā)明同時提供了一種蘋果樹腐爛病菌綠色熒光蛋白(GFP)標記菌株及其制備方法，該方法獲得的轉(zhuǎn)化子，表達強的綠色熒光蛋白的效率可達96.7%。
文檔編號C12N1/15GK102994401SQ201210431660
公開日2013年3月27日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權日2013年1月5日
發(fā)明者王彩霞, 李保華, 王海艷, 李桂舫, 董向麗, 張清明 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學