專利名稱：一種快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物農(nóng)藥的檢測方法，具體涉及一種用于測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法。
背景技術(shù)：
微生物農(nóng)藥通常包括細菌、真菌和病毒微生物農(nóng)藥。是直接利用細菌、真菌和病毒等產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)或生物活體本身開發(fā)的，對植物病蟲草割進行防治的農(nóng)藥。這類農(nóng)藥具有選擇性強，對人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全，不任務(wù)天敵、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點。微生物農(nóng)藥中的含菌量(尤其是活菌量)是決定產(chǎn)品質(zhì)量好壞和田間防治效果的重要因子，因此活菌量是微生物農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量檢測的一項重要技術(shù)指標?！び捎谖⑸镛r(nóng)藥的有效成分為活體，不能用化學(xué)農(nóng)藥的分析儀器進行含量檢測。對于真菌微生物農(nóng)藥，通常采用血球計數(shù)板結(jié)合孢子萌發(fā)的方法進行檢測，即先用血球計數(shù)板測定總的孢子含量(樣品稱量、稀釋、血球計數(shù)板計數(shù)、結(jié)果計算)，然后測定孢子萌發(fā)率(樣品稱量、稀釋、孢子培養(yǎng)、顯微觀察孢子萌發(fā)情況、結(jié)果計算)，最后計算活的孢子含量(總的含孢量X孢子萌發(fā)率)。上述方法存在以下主要缺點操作繁瑣，在顯微鏡下不易區(qū)分真菌孢子和助劑顆粒，而且由于培養(yǎng)時間短，有的孢子尚未萌發(fā)，影響測定結(jié)果。近年來，一些真菌微生物農(nóng)藥如球孢白僵菌、綠僵菌、木霉、淡紫擬青霉等在國內(nèi)陸續(xù)獲得登記，生產(chǎn)上和市場上急需建立這類農(nóng)藥的快速、簡便、準確的產(chǎn)品質(zhì)量檢測方法。一種考慮是采用平板菌落計數(shù)的方法來直接獲得活孢子的含量，但是，按照普通用于細菌計數(shù)的平板菌落計數(shù)法對真菌進行操作的話，不同孢子的菌落會長在一起連成片，形成大的菌落，影響測定結(jié)果；而菌落太小時計數(shù)則看不清，且不能區(qū)分目標菌落和雜菌的菌落。因此，需要尋找改進的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，以簡化操作，獲得更為準確的檢測結(jié)果。為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，包括下列步驟(I)在真菌培養(yǎng)基中加入以重量計O. 25%。 5%。的脫氧膽酸鈉，并制備成平板；(2)將真菌微生物農(nóng)藥樣品在含重量百分比O. 05% O. 1%吐溫20或O. 05% O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的滅菌水中浸泡20 40min，再振蕩20 40min ；(3)將步驟⑵處理后的樣品進行倍數(shù)梯度稀釋，分別將不同稀釋度的樣品均勻涂布在步驟(I)獲得的平板上，室溫下培養(yǎng)48 120h，其中，同一稀釋度制作至少2個重復(fù)樣品；
(4)統(tǒng)計各平板上的菌落數(shù)，其中菌落數(shù)在30個 300個的平板為有效計數(shù)平板；(5)真菌微生物農(nóng)藥中，活孢子的含量為C = TXNXlO,式中C是真菌農(nóng)藥活孢 子含量，單位為CFU/g ；T是統(tǒng)計平板對應(yīng)的稀釋倍數(shù)；Ν是同一稀釋倍數(shù)的多個有效計數(shù)平板上的平均菌落數(shù)。脫氧膽酸納(Sodiumdeoxycholate,CAS號:302-95-4),中文別名為 3 α , 12 α-二羥-5 β -膽烷酸鈉以及去氧膽酸鈉，系膽酸鹽，類似膽汁氣味，有強烈苦味，易吸濕，易溶于水，微溶于無水醇，不溶于醚，低毒，半數(shù)致死量(大鼠，經(jīng)口)1370mg/kg，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
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HO1' 個V vOH H脫氧膽酸鈉為離子型去垢劑，是一種應(yīng)用較廣泛的生化試劑，其作用主要有裂解細胞、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些難溶于水的蛋白，如膜蛋白等。此外，膽酸鹽是重要的生物活性分子，能參與許多生理過程；被廣泛應(yīng)用于粘膜和皮膚給藥的促吸收劑。本發(fā)明將脫氧膽酸鈉添加到培養(yǎng)基中，能夠抑制真菌的菌落擴展，同時在低濃度下也不會讓真菌孢子致死，實現(xiàn)了采用平板菌落計數(shù)法一步直接獲得活孢子的含量，而且可以通過肉眼或菌落計數(shù)儀統(tǒng)計菌落數(shù)。上述技術(shù)方案中，步驟(I)中，所述真菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，待冷卻到55 62°C時，向培養(yǎng)基中加入脫氧膽酸鈉，制備成平板。步驟⑵中，所述振蕩在室溫、150rpm的條件下進行。優(yōu)選地，步驟(2)中，浸泡時間為30min，振蕩時間為30min。步驟(3)中，采用10倍數(shù)梯度稀釋，同一稀釋度制作3個重復(fù)樣品。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點I.本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入一定濃度的脫氧膽酸鈉，不抑制真菌孢子萌發(fā)，但能抑制孢子萌發(fā)后所形成菌落的擴展，然后將真菌農(nóng)藥孢子液涂布在該培養(yǎng)基平板上，從而通過計數(shù)菌落的數(shù)量換算得到活孢子的含量，可以簡便快速測定真菌微生物農(nóng)藥的活孢子含量。2.由于脫氧膽酸鈉的應(yīng)用，本發(fā)明能夠抑制真菌的菌落擴展，同時在低濃度下也不會讓真菌孢子致死，從而可以通過肉眼或菌落計數(shù)儀統(tǒng)計菌落數(shù)。3.本發(fā)明操作過程簡便，檢測準確度高。


圖I是本發(fā)明實施例中測定方法流程圖。圖2是對比例中培養(yǎng)平板的照片。圖3是實施例中培養(yǎng)平板的照片。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例采用圖I所示的方法，分別對木霉可濕性粉劑、淡紫擬青霉可濕性粉劑、淡紫擬青霉液劑、球孢白僵菌母藥的活孢子含量進行測定。作為實施例I至實施例4。測定步驟如下(I)將馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉(PDA)38g加入IOOOmL蒸餾水中，加熱煮沸，分裝入500mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌后，待冷卻至60°C左右后分別制備O. 25%。、O. 5%。、I %、2%、5%。含量的脫氧膽酸鈉PDA平板；(2)在無菌操作條件下，將樣品攪拌均勻，準確稱取3. Og樣品，溶入27. OmL的含O. 05% Tween20的無菌水中浸泡30min后，振蕩30min，得到稀釋10倍的樣品溶液，標記為 O號，然后依次進行梯度稀釋，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)樣品；(3)將上述各梯度稀釋液分別吸取100 μ L用L形玻棒均勻涂布在步驟(I)所得平板上，于25°C下培養(yǎng)48 120h后，選擇適宜的稀釋度，菌落數(shù)在30個 300個的平板為有效計數(shù)平板；(4)計算加入不同濃度脫氧膽酸鈉后的孢子含量測定結(jié)果活孢子含量為C = TXNXlO式中C――真菌農(nóng)藥活孢子含量，單位為CFU/g ；T-----稀釋倍數(shù)；N3個有效計數(shù)平板上的平均菌落數(shù)。測量結(jié)果參見表I和表2所示,平板照片如圖3所示。對比例稱取樣品I. 00g，共稱取3個試樣，分別進行以下操作(I)將樣品分別置于搗碎機的盛液杯中，加入O. 05%吐溫20溶液IOOmL,緩慢攪拌，盡量使孢子充分潤濕。(2)用移液管從溶液中部移取孢子懸浮液2mL到試管中，加蒸餾水8mL，于旋渦混合器上振蕩約30sec。(3)重復(fù)步驟(2)，制備梯度濃度孢子懸浮液，以5中格孢子數(shù)為100 300的稀釋度為有效稀釋濃度。(4)將孢子液靜置約30sec，用細頭吸管從溶液中部吸取孢子懸浮液，在蓋玻片邊緣滴I滴，使液體沿邊緣滲入蓋玻片下，剛好充滿蓋玻片與計數(shù)板計數(shù)區(qū)域之間，以孢子液不入槽為度，應(yīng)無氣泡且計數(shù)區(qū)域四周凹槽無液體，如有多余液體，用小條吸水紙吸去。(5)用顯微鏡觀察，選取待浮動孢子靜止后進行計數(shù)。在規(guī)劃格區(qū)內(nèi)，計四周及中央的5個中格即雙線范圍內(nèi)80小格。然后根據(jù)稀釋倍數(shù)計算孢子總含量。(6)將馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉(PDA)38g加入IOOOmL蒸餾水中，加熱煮沸，分裝入500mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌后，待冷卻至60°C左右后分別制備PDA平板。(7)將D步驟的孢子懸浮液100 μ L用L形玻璃棒涂布PDA平板上，在25°C下培養(yǎng)12h后于顯微鏡下統(tǒng)計萌發(fā)和未萌發(fā)孢子數(shù)，以顯微鏡(物鏡X目鏡倍數(shù)400倍)下20個孢子的稀釋度為有效計數(shù)濃度。最后計算孢子萌發(fā)率。結(jié)果比較對實施例和對比例的測試結(jié)果進行比較，如表I所示。從表I可以看出，4個實施例采用本發(fā)明的方法的測定結(jié)果均略高于常規(guī)的血球計數(shù)板結(jié)合孢子萌發(fā)的方法，說明本發(fā)明更加準確，且操作更加簡便。表I血球板計數(shù)法與本實施例方法(加入250mg/L脫氧膽酸鈉)的活孢子含量測定結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，包括下列步驟 (1)在真菌培養(yǎng)基中加入以重量計O.25%。 5%。的脫氧膽酸鈉，并制備成平板； (2)將真菌微生物農(nóng)藥樣品在含重量百分比O.05% O. I %吐溫20或O. 05% O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚的滅菌水中浸泡20 40min，再振蕩20 40min ； (3)將步驟(2)處理后的樣品進行倍數(shù)梯度稀釋，分別將不同稀釋度的樣品均勻涂布在步驟(I)獲得的平板上，室溫下培養(yǎng)48 120h，其中，同一稀釋度制作至少2個重復(fù)樣品; (4)統(tǒng)計各平板上的菌落數(shù)，其中菌落數(shù)在30個 300個的平板為有效計數(shù)平板； (5)真菌微生物農(nóng)藥中，活孢子的含量為 C = TXNX10, 式中C是真菌農(nóng)藥活孢子含量，單位為CFU/g ；T是統(tǒng)計平板對應(yīng)的稀釋倍數(shù)；Ν是同一稀釋倍數(shù)的多個有效計數(shù)平板上的平均菌落數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，其特征在于步驟(I)中，所述真菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，待冷卻到55 62°C時，向培養(yǎng)基中加入脫氧膽酸鈉，制備成平板。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，其特征在于步驟(2)中，所述振蕩在室溫、150rpm的條件下進行。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，其特征在于步驟(2)中，浸泡時間為30min，振蕩時間為30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，其特征在于步驟(3)中，采用10倍數(shù)梯度稀釋，同一稀釋度制作3個重復(fù)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速測定真菌微生物農(nóng)藥中活孢子含量的方法，包括(1)在真菌培養(yǎng)基中加入以重量計0.25‰～5‰的脫氧膽酸鈉并制備成平板；(2)將真菌微生物農(nóng)藥樣品在含吐溫20或聚乙二醇辛基苯基醚的滅菌水中浸泡、振蕩；(3)進行倍數(shù)梯度稀釋，分別將不同稀釋度的樣品均勻涂布在平板上，室溫下培養(yǎng)48～120h；(4)統(tǒng)計菌落數(shù)，菌落數(shù)在30個～300個的平板為有效計數(shù)平板；(5)活孢子的含量為C＝T×N×10，式中C是真菌農(nóng)藥活孢子含量，單位為CFU/g；T是統(tǒng)計平板對應(yīng)的稀釋倍數(shù)；N是同一稀釋倍數(shù)的多個有效計數(shù)平板上的平均菌落數(shù)。本發(fā)明可以簡便快速測定真菌微生物農(nóng)藥的活孢子含量，檢測準確度高。
文檔編號C12Q1/06GK102899386SQ20121043484
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者袁善奎, 姜輝, 崔曉嵐, 王一喆, 林榮華, 瞿唯鋼, 胡承勇, 曲甍甍, 周艷明 申請人:農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所