專利名稱：水稻不定根控制基因arlr1及其應(yīng)用的制作方法
水稻不定根控制基因ARLR1及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種反向遺傳學(xué)途徑克隆的水稻ARLRl (Adventitious rootlessl recoveryl)基因，以及轉(zhuǎn)基因回復(fù)及RNAi技術(shù)實驗鑒定該基因；還涉及利用該基因物調(diào)控水稻不定根發(fā)生能力從而調(diào)節(jié)水稻的根系結(jié)構(gòu)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
根系是植物錨定和從土壤中吸收水分和養(yǎng)分的重要器官。植物根系主要可分為直根系和須根系。須根系植物根系由種子根、不定根以及側(cè)根組成，不定根是須根系植物根系最重要的組成部分。水稻是全球主要的糧食作物之一，也是須根系植物的模式植物。
不定根為胚后發(fā)育的器官，在水稻的莖節(jié)位產(chǎn)生。正常情況下，水稻的各個節(jié)位都有不定根原基發(fā)生，但一般只在基部節(jié)位的不定根原基才能發(fā)育并突破表皮形成不定根。
水稻不定根原基起始于根莖結(jié)合部鄰近維管束的中柱鞘最內(nèi)層的分生細胞。根據(jù) Itoh等(2005)的報道，水稻不定根的發(fā)生發(fā)育過程可以分為以下7個階段不定根原基起始細胞形成；不定根原基起始細胞變大形成表皮-內(nèi)皮層起始細胞、中央維管束起始細胞及根冠起始細胞；表皮-內(nèi)皮層起始細胞分化生成表皮和內(nèi)皮層；內(nèi)皮層細胞分化產(chǎn)生皮層細胞；產(chǎn)生根冠柱，不定根的基本結(jié)構(gòu)建成；中柱基部細胞開始伸長，皮層細胞開始空泡化；不定根原基最后突破莖表皮成為成熟的不定根。
分子水平的研究遠不及組織形態(tài)學(xué)的研究，到目前為止，雖然有幾個基因報道影響不定根的發(fā)生發(fā)育，但相關(guān)信息還比較比較零碎。CRL1/ARL1和CRL4/GN0M1的突變都在不定根原基起始階段產(chǎn)生缺陷，這兩個突變體分別與生長素的信號和轉(zhuǎn)運相關(guān)(Inukai et al. , 2005; Liu et al. , 2005; Kitomi et al. , 2008; Liu et al. , 2009)。另外內(nèi)源生長素IAA3增強表達及IAA23的功能獲得性突變體也影響不定根發(fā)生(Nakamura et al.， 2006; Ni et al. , 2011)。WOXll和CRL5的突變導(dǎo)致不定根原基大量減少，這兩個突變體參與生長素和細胞分裂素信號，并且在不定根發(fā)育過程中分別調(diào)控RR2和RRl基因的表達 (Zhao et al. , 2009)。
所涉及的參考文獻具體如下
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本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻不定根控制基因ARLRl及其應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻不定根控制基因ARLRl編碼的蛋白質(zhì)，為SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列。
本發(fā)明還同時提供了編碼上述蛋白質(zhì)的基因，該基因的核苷酸序列與SEQ ID NO I所示的序列一致。
本發(fā)明還同時提供了上述基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的等位基因和衍生物在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物中的用途。
本發(fā)明還同時提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細胞，包含上述基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的等位基因和衍生物。
本發(fā)明還同時提供了一種對水稻植株進行不定根發(fā)生能力改造(調(diào)節(jié)不定根的數(shù)目)的方法包括用上述基因轉(zhuǎn)化水稻細胞，將轉(zhuǎn)化的水稻細胞培育成植株。
本發(fā)明的目的是提供 一種從水稻中克隆的新基因ARLR1,如SEQ ID NO 1所示的 DNA序列，也包括與SEQ ID NO 1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID N02所示的蛋白質(zhì)屬于AGC激酶基因家族，其中進行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID NO 1中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用ARLRl基因進行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID N01所示序列的基因或基因部分片段的載體，該載體可以表達有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。
本發(fā)明還提供了一種利用植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞影響水稻不定根發(fā)生能力的方法。
發(fā)明人通過候選差異表達基因篩選到ARLl的下游候選基因ARLR1。ARLRl屬于 AGC激酶基因家族，在動物中AGC激酶家族基因參與生長、代謝、細胞分裂、增殖以及凋亡 (Pearce et al.，2010)。在植物中AGC家族成員參與子葉發(fā)育、向光性、向地性及抗病性等(Briggs and Christie, 2002; Bogre et al. , 2003; Rentel et al. , 2004; Matsui et al. , 2010; Hirt et al.，2011)。擬南中與ARLRl最同源的基因功能尚不明確，但同源性比較高的基因有PH0T1，2參與向光性反應(yīng)及氣孔開放(Briggs and Christie, 2002)。
本發(fā)明是首次發(fā)現(xiàn)AGC家族基因ARLRl具有控制水稻不定根發(fā)育的功能，且ARLRl 是ARLl的下游基因。由于不定根的正常發(fā)生發(fā)育對維持須根系植物生長發(fā)育以及高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是必不可少的，因此在分子育種中存在較大的應(yīng)用潛力。


下面結(jié)合附圖對理解本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并非對發(fā)明作限定。
圖1是RT-PCR鑒定ARLRl的表達模式圖。
A，ARLRl在野生型(WT)，aril突變體及ARLl增強表達材料(ARLlOV)中的表達。 B，ARLRl在根、莖基部及葉片中的表達模式。
圖2是在aril突變體中表達ARLRl部分恢復(fù)不定根生長圖。
A、20天水培苗根莖結(jié)合部圖，Bar=Icm; B,野生型、aril突變體及ARLRl轉(zhuǎn)基因苗莖基部橫切圖；C，dCAPS標記確證轉(zhuǎn)基因苗是aril背景的。D，利用RT-PCR技術(shù)檢測 ARLRl的表達水平，ACTINl作為內(nèi)參。E、利用定量RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因苗ARLRl的表達。F，不同水培時間野生型、aril突變體、ARLRl轉(zhuǎn)基因苗的(aril背景)不定根數(shù)統(tǒng)計。
圖3是降低ARLRl的表達量(RNAi )減少不定根數(shù)目圖。
A, 25天野生型及RNAi轉(zhuǎn)基因株系苗(Ri)根莖結(jié)合部；B，RNAi苗中ARLRl的表達；C，水培20、30天苗不定根數(shù)統(tǒng)計結(jié)果，**表明在野生型和RNAi株系間存在極顯著差異 P〈0.01 (T-test, N=15)。
圖4是超表達及RNAi轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA1300改的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下
一、ARLRl的克隆、鑒定
通過RT-PCR篩選在野生型`、aril突變體、ARLl增強表達材料間有表達差異的候選基因，我們獲得了一個在ARLl增強表達材料里表達上調(diào)而在突變體中表達下調(diào)的基因(圖 1A)。定量RT - PCR分析表明該基因在莖基部表達量最高，而在葉中表達較弱(圖1B)。
二、增強表達ARLRl基因能部分回復(fù)aril突變體不定根缺失的表型
我們構(gòu)建了增強表達載體，通過轉(zhuǎn)基因在aril突變體中增強表達ARLRl基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因苗能部分回復(fù)不定根缺失的表型(圖2A，2F)，切片分析表明轉(zhuǎn)了 ARLRl的轉(zhuǎn)基因苗不定根原基發(fā)生得到恢復(fù)(圖2B)。dCAPS分析證明了轉(zhuǎn)基因苗是aril突變體背景的，而定量RT - PCR及半定量RT - PCR分析表明轉(zhuǎn)基因株系中ARLRl得到增強表達(圖2D，2E)。 表明ARLRl參與不定根的發(fā)生。
三、抑制ARLRl基因在水稻中的表達減少不定根數(shù)目。
我們構(gòu)建了 RNAi載體，通過轉(zhuǎn)化野生型水稻獲得一系列RNAi轉(zhuǎn)基因苗，定量 RT - PCR結(jié)果表明RNAi轉(zhuǎn)基因苗中ARLRl基因的表達得到一定程度的抑制。而對這些 RNAi的不定根數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果表明不定根數(shù)目減少了約30% (圖3)，表明我們獲得了不定根數(shù)目減少的轉(zhuǎn)基因水稻，不定根數(shù)目與ARLRl基因的表達量相關(guān)，證明降低ARLRl基因表達能夠調(diào)節(jié)不定根的數(shù)目(圖3)。
上述結(jié)果表明，我們克隆的水稻ARLRl基因具有一定的應(yīng)用價值，可以通過利用該基因?qū)ψ魑锔到Y(jié)構(gòu)進行轉(zhuǎn)基因改造。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1、ARLRl基因克隆、鑒定
利用基因芯片分析了野生型(WT，石獰白茅可購自中國水稻研究所的種子庫)、 aril突變體(由本實驗室篩選)及ARLl增強表達材料(ARLlOV)(由本實驗室創(chuàng)制)的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)其中ARLRl這個基因在ARLl增強表達材料中表達上調(diào)而在突變體中下調(diào)(圖1)，利用定量RT-PCR(qRT-PCR)也驗證了這一結(jié)果(圖1)。qRT_PCR實驗應(yīng)用Roche 公司的 Real Time PCR 專用試劑 LightCycler 480 SYBR Green I Master, PCR 反應(yīng)在 LightCycIer 480 (Roche, USA)定量PCR儀上進行。我 們通過PCR方法克隆了該基因，測序分析表明該基因編碼區(qū)序列如SEQ ID N0:1所示為1368bp(包含終止密碼子)，編碼一個包含455個氨基酸的蛋白如SEQ ID NO :2。
備注說明野生型(WT)為石狩白茅,突變體aril (adventitious rootless I)為石獰白茅背景下篩選出來的ARLl基因突變的突變體；ARL1增強表達材料(ARLlOV)為ARLl 基因增強表達的轉(zhuǎn)基因材料，ARLlOV的載體見(Liu et.，2005)。
實施例2、水稻轉(zhuǎn)基因
農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人(1994)報道的方法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。具體過程如下
水稻成熟胚愈傷組織的準備
水稻(石獰白茅，SSBM)成熟種子脫殼后，挑選飽滿光潔無菌斑的種子放入燒杯中， 用70% (體積比濃度)酒精消毒2min ；
倒去酒精，加入25% (v/v) NaClO溶液消毒30min ；
倒去NaClO溶液，用無菌水清洗5遍，最后I遍在無菌水中浸泡30min ；
倒去無菌水，將種子放在無菌濾紙上吸干，種子平放于秈稻成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中， 28°C暗培養(yǎng)10天；
在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子將芽和胚乳去掉，留下胚性愈傷組織(淡黃色，致密不規(guī)則)，移入秈稻繼代培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)5-10天。
農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保農(nóng)桿菌菌液ΙΟΟμΙ于5ml YEP (含50mg/L Kan和 50mg/L Str)培養(yǎng)液中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)12-36h至菌液0D600飽和；
從上述飽和的菌液中吸取500μ1于30ml YEP (含50mg/L Kan和50mg/L Str)培養(yǎng)液中，28°C，250rpm 振蕩培養(yǎng) 12_16h 至菌液 0D600=0. 8-1. 5。
共培養(yǎng)及抗性愈傷的篩選
取培養(yǎng)好的菌液15ml于50ml離心管中，4°C, 4000rmp,離心IOmin,去上清；
用含200Mmol/L As的30ml AAM感菌液制成懸浮液，使菌液0D600的終濃度為O.4-0. 7 ；
將長到一定大小(約l_2mm)的水稻愈傷組織挑出，切割成粒狀，放入農(nóng)桿菌懸浮液，振蕩培養(yǎng)30min ；
將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干30min ；
然后將愈傷組織置于放有一層濾紙的共培養(yǎng)基上；
25°C暗培養(yǎng)2. 5天后，將愈傷組織取出，用無菌水清洗5-6次，其間需不停的振蕩；
再用含250mg/L羧芐青霉素鈉的無菌水清洗1-2遍；
最后置于無菌濾紙上浙干2小時；
將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含250mg/L羧芐青霉素鈉和50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進行第一輪選擇，280C，暗培養(yǎng)14天；
將長大的初始愈傷轉(zhuǎn)到含250mg/L羧芐青霉素鈉和50mg/L潮霉素選擇培養(yǎng)基上進行第二輪選擇，280C，暗培養(yǎng)14天，此時抗性愈傷組織長出。
抗性愈傷的分化及成苗
挑取從同一愈傷來的抗性愈傷2-3顆置于分化培養(yǎng)基上，25°C光照培養(yǎng)(16h/8h 光周期，光強為20001x)；
分化培養(yǎng)30天左右愈傷組織會分化出小苗，當小苗長至3_5cm左右，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，25°C光照培養(yǎng)(16h/8h光周期，光強為20001x)。
轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽
生根14天后，將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出，打開封口膜，加入適量蒸餾水或無菌水，在培養(yǎng)室煉苗2-3天；
洗去瓊脂，轉(zhuǎn)入水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)2周，所得苗為Ttl代轉(zhuǎn)基因苗，將獲得的轉(zhuǎn)基因陽性苗移入大田或盆栽，收種。
轉(zhuǎn)基因陽性苗的鑒定
T0代陽性轉(zhuǎn)基因苗的篩選
T0代轉(zhuǎn)基因苗在正常條件下(溫度白天30°C，晚上22°C ;濕度>60% ;光照度3萬 LUX,白天晚上時間分別為12小時)溶液培養(yǎng)一周之后，取Icm長的葉片提取基因組DNAjlJ 用抗性篩選標記基因?qū)D(zhuǎn)基因苗進行鑒定，篩選成功的轉(zhuǎn)化株系。
基因組DNA的提取(TPS法)
1.取2 cm葉片置于2 ml離心管中，加入200 μ TPS抽提液(100 mM Tris-HCl (pH 8. 0),10 mM EDTA (pH 8· O)，I M KCl )，加入一枚鋼珠，蓋緊離心管蓋，在組織搗碎儀 TissueLyser II (QIAGEN, U. S. Α)震蕩1. 5 min。
2.將搗碎的組織勻漿轉(zhuǎn)移至新的1. 5 ml離心管中，70 °C溫浴30 min。
3. 12000 rpm離心10 min,取上清于另一新的1. 5 ml離心管中。
4.加等體積異丙醇,上下顛倒混勻之后，12000 rpm離心10 min,棄上清。
5.加 900 μ 70% 乙醇洗漆沉淀，12000 rpm 離心 5 min。
6.棄去乙醇，晾干DNA，之后用30 μ ddH20溶解。
潮霉素抗性基因檢測
潮霉素抗性基因引物序列為
上游引物5，TTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGCT3，
下游引物5’ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC 3’ ；
PCR體系為=DNA 100 ng、上游引物O. 2MM、下游引物O. 2μΜ、IOX PCR buffer μ 、 dNTP O. 2mM、TAQ DNA 聚合酶 IU (寶生公司)、加 ddH20 到 10μ1。
PCR條件是94 V變性5 min，然后進入循環(huán)反應(yīng)94 V 30s, 60 V 30s, 72 V lmin，循環(huán)數(shù)為28，最后延伸5min結(jié)束。取2 μ I PCR產(chǎn)物在O. 8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測， 然后用Gel Doc XR+ (BIO-RAD, USA)成像系統(tǒng)記錄實驗結(jié)果。
當檢測結(jié)果為有擴增產(chǎn)物時，認定·該Ttl代轉(zhuǎn)基因苗為潮霉素陽性轉(zhuǎn)基因苗，相反則為潮霉素陰性苗。
實施例3、在aril突變體增強表達ARLRl基因
增強表達載體P35S: :ARLR的構(gòu)建
通過PCR擴增方法克隆了 ARLR全長cDNA序列(SEQ ID NO :1所示)，引物序列如下，上下游引物末端分別加上KpnI和XbaI的識別位點(下劃線標記)。
上游引物5,AAAAGGTACCATGCAGCAGCAGCAGCAG 3'
下游引物5'ACGATCTAGATCAGAACTCCGGCAAGAACTCCGT 3'
PCR反應(yīng)中所用模板為7天苗齡SSBM野生型的cDNA，所用聚合酶為PrimeSTAR HS DNA Polymerase (寶生公司)。
PCR體系為=DNA 100 ng、上游引物O. 2MM、下游引物O. 2μΜ、IOX PCR buffer 2μ1、 dNTP O. 2mM、TAQ DNA 聚合酶 IU (寶生公司)、加 ddH20 到 20μ1。
PCR 反應(yīng)程序為98 O 變性 30 sec ；98 °C 10 sec,60 °C 7sec,72 °C 90sec, 30cycles ;72°C延伸10 min結(jié)束。通過1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，割膠回收目的條帶，連接pEASY-Blunt Simple Cloning Vector (寶生公司)測序載體。提取質(zhì)粒酶切鑒定之后，對陽性質(zhì)粒上的ARLR基因區(qū)域進行測序，將無突變的質(zhì)粒命名為ARLRCDS-T。 用KpnI/Xbal雙酶切ARLRCDS-T質(zhì)粒，電泳分離并割膠回收目的片段，連入經(jīng)實驗室改造的 PCAMBIA1300改載體中(圖4)(Jia et al. 2011)。通過酶切鑒定，獲得陽性載體P35s: :ARLR。 通過實施例2所說的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ARLR增強表達載體P35S: :ARLR轉(zhuǎn)化aril突變體。獲得一系列轉(zhuǎn)基因苗，通過潮霉素抗性基因檢測、RT-PCR表明轉(zhuǎn)基因苗ARLRl得到增強表達 (圖 2D，2E)。
備注說明pCAMBIA1300改載體的改造方法如下為在pCAMBIA1300載體的EcoRI 及XmaI兩個酶切位點間接入一個35S啟動子，在PstI及HindIII兩個酶切位點間接入一個 NOS 終止子，見(Jia et al. 2011)。
陽性轉(zhuǎn)基因苗的RT-PCR鑒定如下
選取10個潮霉素陽性株系和一個潮霉素陰性對照株系提取RNA，做反轉(zhuǎn)錄，用 RT-PCR方法檢測ARLR的相對表達量。具體過程如下
RNA提取采用天根公司的植物RNA提取試劑盒提取總RNA，實驗分7步1.將研缽研杵于180°C烘烤2小時以除去RNase備用；2.取50_100mg植物樣品速凍于液氮之中； 3.在冷凍狀態(tài)下將樣品充分研磨粉碎；4.加入提取液使細胞充分裂解；5.過濾除去組織碎片；6.純化層析柱中的RNA (去蛋白、去DNA、脫鹽)；7.RNaSe-free H20洗脫獲取RNA。具體操作過程參照試劑盒附帶說明書。
cDNA的合成采用Invitrogen公司的superscript II RT試劑盒完成，反轉(zhuǎn)錄體系中總RNA的用量為3 μ g，具體過程參照試劑盒附帶說明書。
用定量和半定量RT-PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化株系做鑒定，定量RT-PCR分析與實例I 中qRT-PCR所述方法完全一致。半定量RT-PCR鑒定時，首先通過內(nèi)參基因OsActinl (水稻肌動蛋白)將各樣品的cDNA濃度調(diào)到基本一致，再以調(diào)好濃度的樣品為模板做PCR，擴增 ARLR基因的一段大小為234bp的序列。PCR產(chǎn)物在1. 2%(m/v)的瓊脂糖凝膠上電泳分離， 然后用Gel Doc XR+ (BIO-RAD，USA)成像系統(tǒng)記錄實驗結(jié)果。半定量RT-PCR鑒定所用引物如下表1:其中0sActin385F及0sActin385R用于內(nèi)參基因OsAcinl擴增，而ARLR-RT-F2 及ARLR-RT-R2則用于ARLRl的擴增。結(jié)果ARLRl相比arlI突變體表達量高2部以上的株系為增強表達轉(zhuǎn)基因株系。
表I
權(quán)利要求
1.水稻不定根控制基因ARLRl編碼的蛋白質(zhì)，其特征是為SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列與SEQID NO 1所示的序列一致。
3.權(quán)利要求2所述的基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的等位基因和衍生物在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物中的用途。
4.一種轉(zhuǎn)基因植物細胞，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的等位基因和衍生物。
5.一種對水稻植株進行不定根發(fā)生能力改造的方法，其特征是包括用權(quán)利要求2所述的基因轉(zhuǎn)化水稻細胞，將轉(zhuǎn)化的水稻細胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻不定根控制基因ARLR1編碼的蛋白質(zhì)，為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時公開了編碼上述蛋白質(zhì)的基因，該基因的核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的序列一致。本發(fā)明還同時公開了一種對水稻植株進行不定根發(fā)生能力改造的方法，包括用上述基因轉(zhuǎn)化水稻細胞，將轉(zhuǎn)化的水稻細胞培育成植株。本發(fā)明是首次發(fā)現(xiàn)AGC家族基因ARLR1具有控制水稻不定根發(fā)育的功能，且ARLR1是ARL1的下游基因。由于不定根的正常發(fā)生發(fā)育對維持須根系植物生長發(fā)育以及高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是必不可少的，因此在分子育種中存在較大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N9/12GK103045555SQ201210527558
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者毛傳澡, 吳平, 劉紹軍, 任美燕, 馬孝霞, 吳運榮 申請人:浙江大學(xué)