專利名稱：一種麥芽糖底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及制備方法，特別是一種麥芽糖底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
L-抗壞血酸(L-AA，維生素C)是水溶性維生素，參與很多體內(nèi)的生理活動，在保持和促進人體健康中起到重要的作用，是人體無法自身合成的必需的營養(yǎng)元素。但L-AA極不穩(wěn)定，在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸，破壞分子中的共軛體系，發(fā)生不可逆裂解反應， 特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下，反應更迅速，使L-AA的生理活性減弱甚至消失，這使得它在應用上受到很大的限制。因此，如何增強L-AA的穩(wěn)定性是目前國內(nèi)外學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界所關(guān)注的焦點問題。2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是將一個糖基以α -I, 4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易發(fā)生氧化反應，所以在水溶液中特別穩(wěn)定，并且AA-2G沒有直接還原性，有效地保護了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定性和性能最佳的L-AA替代品。目前，AA-2G主要通過糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化生成，其中環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _環(huán)糊精或β _環(huán)糊精為糖基供體，將葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到受體L-AA上。然而，若以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；若以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于它的溶解度較低，酶促反應效率受到較大限制。因此，選擇一種既便宜又易溶的糖基供體(如麥芽糖)將會大大減少AA-2G的生產(chǎn)成本，提高其利潤。但是，由于目前環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)對麥芽糖的底物特異性(轉(zhuǎn)化率)較低，因此，通過分子改造CGTase技術(shù)提高其對麥芽糖的底物特異性，將推動與L-AA糖基衍生物相關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種麥芽糖底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，以GenbankAF047363. I所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為出發(fā)序列，第47位的賴氨酸突變成苯丙氨酸K47F、酪氨酸K47Y或脯氨酸K47P。其中優(yōu)選突變?yōu)楦彼?。所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)。所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的獲得方法為以Genbank AF047363. I公布的基因為出發(fā)基因，將第47位的賴氨酸突變成苯丙氨酸K47F、酪氨酸K47Y或脯氨酸K47P。產(chǎn)所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細胞系也為本發(fā)明要求保護的范圍。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下
I)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；2)將步驟I)獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體；3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)得到基因工程菌。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種應用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至0D_=0. 6，加入O. OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。 軟化類芽孢桿菌(Peanibacillusmacerans) JFB05-01 (CCTCC NO :M208063)，已在中國專利CN101294149公開，
公開日2008年10月29日。來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGTase)的三種突變體酶K47F，K47Y及K47P，它們相比于野生型CGTase利用麥芽糖為糖基供體生產(chǎn)AA-2G時，產(chǎn)量分別提高17. 1%, 22. 1%和32. 9%。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明構(gòu)建了 3個有意義的突變體，均實現(xiàn)了環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶對麥芽糖的底物特異性的提高，以此為糖基供體所產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I不同反應時間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G的產(chǎn)量?！?野生型 CGTase ；· K47F ；▲ K47Y ; :Κ47Ρ。
具體實施例方式實施例I :底物特異性提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶是在GenBank AF047363. I公布的基因序列基礎(chǔ)上，將其47位點的賴氨酸突變成苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸，分別為K47F、K47Y和K47P?？梢酝ㄟ^化學全合成或定點突變的方式將其成熟區(qū)的47位點進行氨基酸的取代。實施例2 :底物特異性提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法本例以PCR方法為例進行說明，但被發(fā)明的保護并不限于僅通過PCR方法獲得突變的方法。突變體酶K47F、K47Y和K47P的制備方法如下I)定點突變單突變體酶K47F、K47Y和K47P的定點突變，利用快速突變試劑盒MutanBEST kit,以表達載體cgt/pET-20b (+)1為模板，引入K47F密碼子的頂點突變引物為正向引物5’-CCAATTTGTTCCTCTATTTCGGGGG-3’，下劃線為突變堿基；反向引物5’-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3’；引入K47Y密碼子的頂點突變引物為
正向引物5’ -CCAATTTGTACCTCTATTTCGGGGG-3’，下劃線為突變堿基；反向引物5’ -ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3’ ；引入K47P密碼子的頂點突變引物為正向引物5’-CCAATTTGCCGCTCTATTTCGGGGG-3’，下劃線為突變堿基；反向引物5’-ATCGGTCGCCGCTGAACGCA-3’。PCR 反應體系均為5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ L, 2. 5mMdNTPs4 μ L, 10 μ M 正向弓丨物 I μ L，10 μ M 反向弓丨物 I μ L，模板 DNAl μ L, 2. 5U/ μ LPrimeSTARTaq HSO. 5 μ L，加入雙蒸水至50 μ L ;PCR產(chǎn)物擴增條件均為98 V預變性3min ;隨后進行98 V IOs, 62 V 15s， 72°C 6min30個循環(huán)；最后72°C保溫IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)MutanBEST kit處理，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞在含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受:態(tài)細胞，所有質(zhì)粒均測序正確；2)突變體表達與純化挑取轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長8 10h，按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至0D_=0. 6，加入O. OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集上清液。上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4°C、IOOOOrpm離心20min,取沉淀物用適量含20mM磷酸鈉、O. 5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7. 4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過O. 22 μ m膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫，流速lmL/min，檢測波長為280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脫液；活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液(pH=6)中透析過夜后，分別得到純化突變體酶K47F、K47Y和K47P。實施例3 :本實施例說明酶活分析及AA-2G的合成及檢測。I)酶活測定方法甲基橙法測定α-環(huán)化活力的方法取適當稀釋的酶液O. lmL，加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH6. 5)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40°C下反應IOmin后，加入I. OmLl. OM的鹽酸停止反應，再加入I. OmL用50mM磷酸緩沖液配制的O. ImM甲基橙，在16°C下保溫20min，在505nm下測定吸光度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成I μ mol α -環(huán)糊精所需酶量。淀粉水解活力測定方法將適量的酶液加入到含1%可溶性淀粉的50mM磷酸緩沖液中(pH6. 5)，50°C反應lOmin，然后用DNS法測定還原糖濃度。一個酶活單位定義在該條件下每分鐘生成I μ mol還原糖所需酶量。歧化反應活力測定方法將含有6mM供體底物4-硝基苯基-a-D-麥芽庚糖-4-6-0-亞乙基(EPS)和IOmM受體底物麥芽糖的IOmM檸檬酸緩沖液(pH6. O)在50°C保溫IOmin中，然后加入適當稀釋的酶液O. ImL反應,每O. 5min取100 μ L反應樣品加入20 μ LI. 2MHC1 (4°C )，然后在 60°C保溫 IOmin 使 CGTase 失活。隨后，加入 20 μ LI. 2Μ NaOH中和，將樣品加到磷酸緩沖液(ΡΗ7. 0)，并加入60 μ L (IU) α -糖苷酶于37°C反應60min。加入ImLlM碳酸鈉使樣品pH升至8以上，在401nm波長下側(cè)吸光值(ε 401=18. ^iT1)。I單位酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化I μ mol的酶的量。AA-2G的合成及檢測方法將適量酶液加入含有麥芽糖和L-AA (終濃度為5%)的醋酸-醋酸鈉緩沖液中(PH5. 5)，于避光避氧條件下37°C反應24h，然后加入10U/mL糖化酶在65°C，pH5. 5條件下反應24h，通過HPLC方法檢測AA-2G產(chǎn)量。HPLC檢測AA-2G產(chǎn)量方法酶反應樣品通過O. 22 μ m濾膜過濾，使用AmethystC18-H 柱(4. 6 X 250mm, Sepax, America)檢測。檢測波長238nm ;流動相0. 05M KH2P04/H3PO4(pH2. O);流速0. 6mL/min。在此條件下,在大約IOmin時會出現(xiàn)AA-2G的流出峰。AA-2G濃度通過峰面積計算而得。 2)酶活比較實驗結(jié)果見下表，將上述突變體表達獲得的突變體純酶制品與野生菌純酶制品相比，可以發(fā)現(xiàn)與野生型CGTase相比突變體酶K47F、K47Y和K47P α -環(huán)化活力分別降低44. 9%, 52. 5%和2. 6% ；突變體酶K47F略微提高6. 5%，Κ47Υ和Κ47Ρ淀粉水解活力分別降低了 62. 2%和68. 7% ；突變體酶K47F、Κ47Υ和Κ47Ρ歧化活力分別提高了 12. 5%, 18. 1%和30. 2% ；突變體酶K47F、Κ47Υ和Κ47Ρ以麥芽糖為糖基供體生成AA-2G產(chǎn)量分別提高了 17. 1%，21· 1% 和 32. 8%ο
相對_fg (%)*AA-2G 產(chǎn)量(g/L)
α-環(huán)化活力淀粉水解活歧化話力 +老芽糖為糖S供休
力
.................................CG7kse...............................................................................................................100.................................................................................................................................................100.....................................................................................................................100..............................................................................................................................0J6±0'^03......................................................
K47F55.1 土I. 2士0力 112.5士1.40.89±0.05
K47Y47.5土 L O3 .8±0.8 118.1=0.90.92±0.04
K47P97.4+1.531.3±1.1 130.2 土 1.51.01 ±0.033)不同反應時間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G產(chǎn)量的比較結(jié)果列于圖1，可以發(fā)現(xiàn)，突變型K47F酶在反應16h時AA-2G達到最高產(chǎn)量；野生型，突變型K47Y和K47P在反應20h時AA-2G達到最高產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一種麥芽糖底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，以GenbankAF047363. I所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為出發(fā)序列，其特征在于第47位的賴氨酸突變?yōu)楸奖彼?、酪氨酸或脯氨酸?br> 2.權(quán)利要求I所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于第47位的賴氨酸突變脯氨酸。
3.權(quán)利要求I所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來源于軟化類芽抱桿菌(Peanibacillus macerans)。
4.一種獲得權(quán)利要求I或2所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于以GenbankAF047363. I公布的基因為出發(fā)基因，將第47位的賴氨酸突變成苯丙氨酸、酪氨酸或脯氨酸。
5.產(chǎn)權(quán)利要求I所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細胞系。
6.權(quán)利要求4所述產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 1)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權(quán)利要求I所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因； 2)將步驟I)獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體； 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
7.權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述表達載體為pET-20b(+)。
8.應用權(quán)利要求5所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 u g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至OD600=O. 6，加入0. OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種麥芽糖底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過對P.macerans strain JFB05-01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的47位的賴氨酸(Lys)分別替換為苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)，使AA-2G產(chǎn)量分別提高了17.1%，22.1%和32.9%。這些突變株比野生型CGTase更利于利用麥芽糖為糖基供體生產(chǎn)AA-2G，具有重要的工業(yè)應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102965353SQ201210527870
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 韓瑞枝 申請人:江南大學