專利名稱：一種原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在生物制品領(lǐng)域中原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，具體說(shuō)是一種將原代細(xì)胞通過(guò)一定的技術(shù)手段培養(yǎng)并篩選出保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的，高活力的繼代細(xì)胞(指自組織分離后體外培養(yǎng)不超過(guò)5代細(xì)胞)，并利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠方式實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于利用生物反應(yīng)器，微載體及細(xì)胞工廠培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的報(bào)道。細(xì)胞微載體培養(yǎng)方法是由Van Wezel于1967年構(gòu)思發(fā)明的，經(jīng)過(guò)40年來(lái)人類大量的摸索，該技術(shù)已經(jīng)日趨成熟和完善，并廣泛應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域以及一些具有重要價(jià)值的細(xì)胞產(chǎn)品。微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有許多傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì)，例如在生 物反應(yīng)器中，微載體增加了單位容積中的表面積；為細(xì)胞提供了均相的生長(zhǎng)環(huán)境；環(huán)境條件容易測(cè)量與監(jiān)控；細(xì)胞培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動(dòng)化，降低了污染發(fā)生的機(jī)會(huì)。但該技術(shù)主要用于傳代細(xì)胞系的培養(yǎng)，但用于原代細(xì)胞培養(yǎng)，因無(wú)法批量獲得保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的細(xì)胞，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。原代細(xì)胞可用于生產(chǎn)狂犬疫苗、乙腦疫苗、流感疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗和流行性出血熱病毒疫苗等，這些疫苗的生產(chǎn)需要使用大量動(dòng)物，而傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不能完全排除外源因子污染的可能，質(zhì)量難以控制，制約了疫苗制品的規(guī)模化生產(chǎn)?；谏鲜鲈?，也限制了原代細(xì)胞或其繼代細(xì)胞在生物制品生產(chǎn)中無(wú)傳代細(xì)胞系潛在致腫瘤性風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是一種原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法。本發(fā)明是一種原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，在本發(fā)明中用來(lái)培養(yǎng)的原代細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的那些原代細(xì)胞，例如猴腎細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞、家兔腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞、沙鼠細(xì)胞、牛腎細(xì)胞等。該方法包括下列步驟a)批量獲取保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的繼代細(xì)胞(指自組織分離后體外培養(yǎng)不超過(guò)5代細(xì)胞)；b)適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠細(xì)胞的篩選；c)利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)篩選出的細(xì)胞。在本發(fā)明中，批量獲取保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的繼代細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下來(lái)源于動(dòng)物機(jī)體組織的細(xì)胞在利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方法初代培養(yǎng)成功后，要保持其在反復(fù)傳代中不發(fā)生轉(zhuǎn)化或不停止生長(zhǎng)其措施是嚴(yán)格控制pH值(7. 2 . 4之間)；最好在5%C02 (指CO2濃度)環(huán)境中培養(yǎng)；并最好根據(jù)原代細(xì)胞的種類及分化程度，在轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)表面包被膠原、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白等；嚴(yán)格控制換液時(shí)間，不宜太長(zhǎng)(最長(zhǎng)8天或連續(xù)灌注)，換液時(shí)，不要全部更新，盡量保留一部分舊培養(yǎng)液，以棄掉1/2 2/3為宜；細(xì)胞生長(zhǎng)至75、5%匯合階段即按一分為二的原則進(jìn)行傳代；培養(yǎng)液與液面以上空間的體積比例保持在1:8 1:12之間；加入培養(yǎng)液的高度要控制在8mm以下。利用上述方式獲得的細(xì)胞含有細(xì)菌、真菌、支原體、外源病毒的潛在可能性較大，其生物學(xué)性狀改變或活力不夠的可能性也較大。因此，利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠立即進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，失敗的風(fēng)險(xiǎn)性很高，導(dǎo)致其不能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，必須進(jìn)行細(xì)胞的鑒別與篩選，其措施如下a)原代細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等外源污染檢測(cè)，可采取《中國(guó)藥典》收載的常規(guī)檢測(cè) 方法，更適宜采用檢測(cè)時(shí)間短的酶標(biāo)等替代方法，b)用乳糖脫氫酶法測(cè)定乳糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖濃度，通過(guò)葡萄糖消耗來(lái)判定原代動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；c)細(xì)胞損傷檢測(cè)，通過(guò)細(xì)胞損傷檢測(cè)來(lái)調(diào)整批量獲取高活力的繼代細(xì)胞的操作工藝參數(shù)，是不同種類及分化程度原代細(xì)胞利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)成功的重要條件之一，該項(xiàng)檢測(cè)在確定某一具體細(xì)胞培養(yǎng)工藝時(shí)，十分必要。根據(jù)用正常不能滲透的大分子示蹤劑標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)的原理鑒別受傷細(xì)胞。細(xì)胞膜破裂，示蹤劑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后破裂處封閉，示蹤劑位于細(xì)胞內(nèi)。死細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂后不能封閉，只要洗去全部外源性示蹤劑則不被標(biāo)記。有幾種示蹤劑供選擇。熒光素標(biāo)記的右旋糖酐比較適宜。如果使用醛固定的標(biāo)本，須用結(jié)合有賴氨酸的右旋糖酐。外加性示蹤劑的優(yōu)點(diǎn)是已知加入和除去示蹤劑的時(shí)間，如熒光素標(biāo)記的右旋糖酐。因此可用于脈沖追蹤標(biāo)記方案，以便確定細(xì)胞損傷時(shí)間的選擇。定義與鑒定細(xì)胞損傷的標(biāo)準(zhǔn)(A)機(jī)械性應(yīng)力引起細(xì)胞膜破裂；(B)正常情況下不能滲透的分子可通過(guò)破裂處進(jìn)出細(xì)胞；(C)損傷處迅速封閉(< 5s，受鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞膜移動(dòng)和融合的調(diào)節(jié))，細(xì)胞存活；(D)在存在損傷示蹤分子(正常情況下不能滲透)條件下發(fā)生細(xì)胞破裂時(shí)；(E)示蹤分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；(F)細(xì)胞膜封閉時(shí)，示蹤分子滯留于細(xì)胞。如果在顯微鏡測(cè)定或熒光方面可觀察到損傷示蹤劑，能鑒定受傷細(xì)胞。經(jīng)過(guò)上述兩個(gè)步驟進(jìn)行培養(yǎng)篩選的細(xì)胞可立即利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，也可凍存為種子細(xì)胞，用于生產(chǎn)時(shí)，解凍一支或數(shù)支，這樣可以實(shí)現(xiàn)一批凍存細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期生產(chǎn)使用，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目的。篩選出的細(xì)胞利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)的措施是選取細(xì)胞工廠或剪切力小的固定床籃式培養(yǎng)系統(tǒng)的生物反應(yīng)器進(jìn)行原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)，選取連續(xù)灌注方式，以獲得保留一部分舊培養(yǎng)液培養(yǎng)效果，其它培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定也應(yīng)選取較連續(xù)傳代細(xì)胞系更溫和的培養(yǎng)條件。本發(fā)明的效果是利用a)批量獲取保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的繼代細(xì)胞(指自組織分離后體外培養(yǎng)不超過(guò)5代細(xì)胞)；b)適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠細(xì)胞的篩選；c)利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)篩選出的細(xì)胞三個(gè)步驟中全部或大部分操作工藝達(dá)到原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的目的。本發(fā)明與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)原代細(xì)胞方式比較，生物反應(yīng)器綜合可比因素分析對(duì)比，用本發(fā)明的產(chǎn)量比現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)瓶方法提高了 100倍以上，可以達(dá)到傳代細(xì)胞系利用生物反應(yīng)器達(dá)到的產(chǎn)量；細(xì)胞工廠綜合可比因素分析對(duì)比，用本發(fā)明的產(chǎn)量比現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)瓶方法提高了 10倍以上，不僅提高了培養(yǎng)原代細(xì)胞單位體積的細(xì)胞培養(yǎng)率，還提高了原代細(xì)胞的質(zhì)量，將此技術(shù)應(yīng)用于疫苗制品的生產(chǎn)，也會(huì)提高疫苗制品的產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)規(guī)模及生產(chǎn)效率。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一地鼠腎細(xì)胞篩選及利用生物反應(yīng)器及以聚酯切片為載體培養(yǎng)
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為原代地鼠腎細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)瓶繼代培養(yǎng)一代后；采用總體積為5升的生物反應(yīng)器(Cellige n Plus 生物反應(yīng)器,購(gòu)自New Brunswick ScientificCo.，Inc.公司)和聚酯切片載體(Fibra-Cel Disks);所用的培養(yǎng)基是M199培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。所用其它試劑包括牛血清、胰酶等。I、將地鼠解剖取腎細(xì)胞，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制得原代細(xì)胞；嚴(yán)格控制pH值為7.2 ;將蓋有透氣塞的三L轉(zhuǎn)瓶置于37°C，5%co2環(huán)境中培養(yǎng)，三L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)表面經(jīng)O. Γ mg/ml的多聚賴氨酸包被后,用無(wú)Ca2+, Mg2+的BSS浸洗平衡；換液時(shí)間為4天，換液時(shí),保留1/3舊培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至95%匯合階段即按一分為二的原則進(jìn)行傳代，培養(yǎng)液與液面以上空間的體積比例保持在1:10，加入培養(yǎng)液的高度要控制在4mm。2、采取《中國(guó)藥典》收載的常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等外源污染檢測(cè)；用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖濃度，通過(guò)葡萄糖消耗來(lái)判定原代動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；細(xì)胞損傷檢測(cè)將待檢細(xì)胞放于無(wú)菌的蓋玻片上，用適量細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至單層，用無(wú)菌Dulbecco磷酸鹽水浸先一次；將蓋玻片細(xì)胞面朝上放于培養(yǎng)皿中，將5mg/mlFDxLys溶液(100 μ I)注于蓋玻片上面，然后吸去，如此反復(fù)幾次；模擬工藝操作參數(shù)建立可引起細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)條件，不要干擾陰性對(duì)照；作為陽(yáng)性對(duì)照，用單刃剃須刀刮蓋玻片約10次后用位相差顯微鏡觀察，以確保用此方法從底物上刮除細(xì)胞；受傷細(xì)胞后示蹤劑處理時(shí)間應(yīng)盡量短，再用無(wú)菌Dulbecco磷酸鹽水浸先一次，然后加入培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱，使細(xì)胞在理想時(shí)間內(nèi)盡快恢復(fù)正常狀態(tài)；用無(wú)菌Dulbecco磷酸鹽水將蓋玻片清洗3次,然后用3. 7%甲醛浸泡10 — 30min ;用注射用水將蓋玻片洗2次,然后用抗漂白封固液封片，在突光顯微鏡下觀察。3、通過(guò)上述1、2項(xiàng)操作，剔除不合格細(xì)胞，然后以IX l(TlX IO7個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于裝有聚酯切片載體的生物反應(yīng)器內(nèi)；接種后，使攪拌速度調(diào)節(jié)為90rpm，在37°C下培養(yǎng)5-8天，培養(yǎng)期間補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中葡萄糖含量保持在5克/升。調(diào)節(jié)02，N2，C02氣體的流速，培養(yǎng)期進(jìn)行檢測(cè)。乳糖濃度，用乳糖脫氫酶法測(cè)定；葡萄糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，通過(guò)葡萄糖消耗來(lái)判定地鼠腎細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)施例二 雞胚細(xì)胞篩選及利用細(xì)胞工廠方式培養(yǎng)
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為原代雞胚細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶繼代培養(yǎng)一代后；采用ThermoScientific Nunc細(xì)胞工廠(10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000ml)對(duì)雞胚細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；所用的培養(yǎng)基是M199培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。所用其它試劑包括牛血清、胰酶等。I、將9日齡雞胚去頭、腳后解剖，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制得原代細(xì)胞；嚴(yán)格控制PH值為7. 2 ;將蓋有透氣塞的三L轉(zhuǎn)瓶置于37°C，5%co2環(huán)境中培養(yǎng)，三L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)表面經(jīng)O. Γ1 mg/ml的多聚賴氨酸包被后,用無(wú)Ca2+, Mg2+的BSS浸洗平衡；換液時(shí)間5天，換液時(shí)，保留一部分舊培養(yǎng)液，以棄掉1/2，細(xì)胞生長(zhǎng)至95%匯合階段即按一分為二的原則進(jìn)行傳代，培養(yǎng)液與液面以上空間的體積比例保持在1:10，加入培養(yǎng)液的高度要控制在4mm。
2、細(xì)胞質(zhì)量篩選措施同實(shí)施例一。3、通過(guò)上述實(shí)施例二 1、2項(xiàng)操作，剔除不合格細(xì)胞，然后以1Χ1(Τ6Χ104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于Nunc細(xì)胞工廠內(nèi)；在37°C下培養(yǎng)5 8天，培養(yǎng)期間補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中葡萄糖含量保持在2-2. 5克/升。乳糖濃度，用乳糖脫氫酶法測(cè)定；葡萄糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，通過(guò)葡萄糖消耗來(lái)判定雞胚細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。本發(fā)明的特點(diǎn)是
培養(yǎng)用的細(xì)胞可以為猴腎細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞、家兔腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞、沙鼠細(xì)胞、牛腎細(xì)胞等原代動(dòng)物細(xì)胞，取材廣泛；
克服了傳統(tǒng)原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)外源污染的風(fēng)險(xiǎn)高，質(zhì)量難以控制，制約了生物制品的規(guī)?；a(chǎn)的缺點(diǎn)。批量獲取與篩選保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的繼代細(xì)胞，使細(xì)胞的生長(zhǎng)空間增大，提高了培養(yǎng)效率， 充分利用了培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分；同時(shí)，又使細(xì)胞在均一的環(huán)境下生長(zhǎng)，保證了細(xì)胞的質(zhì)量，原代細(xì)胞經(jīng)自組織分離后體外培養(yǎng)不超過(guò)5代的繼代擴(kuò)增，大大降低了活體動(dòng)物的使用量，將此技術(shù)應(yīng)用于生物制品的生產(chǎn)，將會(huì)提高生物制品的產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)規(guī)模及生產(chǎn)效率，既可以造福于人類，又具有巨大的商業(yè)價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，其步驟是 (1)批量獲取保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的繼代細(xì)胞； (2)對(duì)步驟(I)獲取的繼代細(xì)胞，進(jìn)行篩選； (3)利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)步驟(2)篩選出的繼代細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述原代細(xì)胞是猴腎細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞、家兔腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞、沙鼠細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、狗腎細(xì)胞中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟(I)中，來(lái)源于動(dòng)物機(jī)體組織的細(xì)胞在利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方法初代培養(yǎng)成功后，保持其在反復(fù)傳代中不發(fā)生轉(zhuǎn)化或不停止生長(zhǎng)其措施是 (I. I)控制pH值為7. 2 7. 4; (I. 2)在5%C02環(huán)境中培養(yǎng)； (I. 3)根據(jù)原代細(xì)胞的種類及分化程度在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)表面包被膠原、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白； (I. 4)換液間隔時(shí)間最長(zhǎng)為8天，或連續(xù)灌注，換液時(shí)，棄掉1/2 2/3舊培養(yǎng)液； (I. 5)細(xì)胞生長(zhǎng)至75、5%匯合階段即按一分為二的原則進(jìn)行傳代； (I. 6)培養(yǎng)液與液面以上空間的體積比例保持在1:8 1:12之間，加入培養(yǎng)液的高度控制在8mm以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟(2)所說(shuō)的篩選的措施是 (2. I)原代細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)菌、真菌、支原體、病毒外源污染檢測(cè)； (2. 2)用乳糖脫氫酶法測(cè)定乳糖濃度，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖濃度，通過(guò)葡萄糖消耗來(lái)判定原代動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)； (2. 3)細(xì)胞損傷檢測(cè)，通過(guò)細(xì)胞損傷檢測(cè)來(lái)調(diào)整批量獲取高活力細(xì)胞操作工藝參數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟(3)所說(shuō)的大規(guī)模培養(yǎng)的措施是選取細(xì)胞工廠或剪切力小的固定床籃式培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應(yīng)器進(jìn)行原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種原代細(xì)胞大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，該方法包括下列步驟a)批量獲取保持其細(xì)胞二倍體生物學(xué)性狀的、高活力的、適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的繼代細(xì)胞；b)適于利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠細(xì)胞的篩選；c)利用生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)篩選出的細(xì)胞。該方法解決了原代細(xì)胞用于生產(chǎn)需要使用大量動(dòng)物，外源污染風(fēng)險(xiǎn)高，質(zhì)量難以控制，規(guī)?；a(chǎn)困難問(wèn)題，同時(shí)也發(fā)揮了原代細(xì)胞或其繼代細(xì)胞在生物制品生產(chǎn)中無(wú)傳代細(xì)胞系潛在致腫瘤性風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102965333SQ201210537870
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者李偉, 蘇文全 申請(qǐng)人:李偉, 蘇文全