專利名稱：鴨性別快速鑒別試劑盒盒體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供一種快速進(jìn)行鴨的性別鑒定的試劑盒，該試劑盒用于PCR-瓊脂糖電泳技術(shù)。
技術(shù)背景
家禽的性別由W染色體和Z染色體決定，家禽雌性基因型為ZW型，雄性基因型為ZZ型，Z或W傳遞給子代的概率是一樣的，均為二分之一，其遺傳方式遵循孟德爾的獨(dú)立分配定律和自由組合定律。到目前為止，發(fā)現(xiàn)有少數(shù)分布在禽類Z和W染色體上的基因，它們不出現(xiàn)在假常染色體區(qū)，但都是以W和Z單拷貝出現(xiàn)，且以性染色體兩種類型的非重組部分的形式存在。最具有典型特征的是CHDlZ—CHDlff (chromodomain helicase DNA bindingprotein I)基因，研究認(rèn)為它們?cè)谒续B類中(平胸鳥除外)分別與W或Z連鎖。由于一些內(nèi)含子在基因CHDIZ與CHDlW中的序列大小不同，使用保守性引物，就能通過PCR-瓊脂糖電泳技術(shù)，根據(jù)PCR產(chǎn)物的片段大小和數(shù)量，判斷雄性基因型(ZZ型，一條大的PCR產(chǎn)物片段)和雌性基因型(ZW型，一大一小的兩條PCR產(chǎn)物片段)。這兩種基因獨(dú)立進(jìn)化，使用直接PCR技術(shù)分析，為研究鳥類(除平胸鳥之外)分子性別決定提供了途徑。隨著鴨的胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科研究的深入，鴨胚胎早期性別的鑒定成為一個(gè)科學(xué)問題。經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利的檢索，至今未見有家鴨CHD基因完整序列及分子性別鑒定的研究報(bào)道。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是為了給鴨性別分子鑒定提供一種結(jié)構(gòu)合理、價(jià)格低廉的基因分型試劑盒。本實(shí)用新型的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種鴨性別快速鑒別試劑盒盒體，所述試劑盒由盒體，盒體內(nèi)的襯墊，襯墊的各孔腔內(nèi)分別置入的特異性引物混合物ZWp、擴(kuò)增緩沖液、DNA marker和瓊脂糖組成。其中ZWp詳細(xì)信息如下引物混合物ZWp表示用于CHD基因PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物，引物信息如下上游引物5’- AGTGCATTGCAGAAGCAATATT - 3’，下游引物5’- GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT - 3’。本試劑盒使用方法I、PCR擴(kuò)增目的片段I) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系準(zhǔn)備在200 u I的PCR薄壁管中，加入2W模板DNA(約50 ng )、12. 5W擴(kuò)增緩沖液、2W引物ZffP (5uM)、和8. 5W水，PCR的反應(yīng)體系為25W，充分混勻后短暫離心。2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置[0015]在^pendorf PCR儀上設(shè)置PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4 min,后94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸308，35個(gè)循環(huán)，最后721延伸6 min，4°C保存?zhèn)溆?。程序設(shè)置完畢后，將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。2、鑒定基因型反應(yīng)結(jié)束后，取4-lOiU反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖膠，IXTBE電泳液中電泳。室溫下，按照電泳槽寬度X6-8V，電泳20分鐘。根據(jù)電泳圖譜，鑒定基因型。本實(shí)用新型由CHD基因PCR擴(kuò)增的上下游弓丨物混合物ZWp、擴(kuò)增緩沖液、DNAmarker和瓊脂糖組成，利用PCR-瓊脂糖電泳技術(shù)檢測(cè)基因的基因型，具有準(zhǔn)確性高、快速、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。

圖I為本實(shí)用新型鴨性別快速鑒別試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 CHD基因PCR產(chǎn)物分型圖；圖中1盒體、2襯墊、3特異性引物混合物ZWp、4擴(kuò)增緩沖液、5DNA marker、6瓊脂糖。
具體實(shí)施方式
結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說明本實(shí)用新型。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。一種鴨性別快速鑒別試劑盒，由盒體1，盒體內(nèi)的襯墊2，襯墊的各孔腔內(nèi)分別置入的特異性引物混合物ZWp3，擴(kuò)增緩沖液4，DNA marker5和瓊脂糖6組成。 運(yùn)用本試劑盒對(duì)已知性別的30只13胚齡鴨胚和40只高郵鴨進(jìn)行分子性別分型鑒定。I、樣品采集30只13胚齡鴨胚的尿囊膜和40只高郵鴨的血液，應(yīng)用傳統(tǒng)的苯酚/氯仿法提取DNA，并將DNA濃度稀釋到50ng/ U I。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)及結(jié)果I) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系準(zhǔn)備在200 U I的PCR薄壁管中，加入2m模板DNA(約50 ng ),12. 5^1擴(kuò)增緩沖液、2W引物ZffP (5uM)、和8. 5W水，PCR的反應(yīng)體系為25W，充分混勻后短暫離心。2 ) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置在^pendorf PCR儀上設(shè)置PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4 min,后94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸308，35個(gè)循環(huán)，最后721延伸6 min，4°C保存?zhèn)溆?。程序設(shè)置完畢后，將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳鑒定反應(yīng)結(jié)束后，取4-lOiU反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖膠，IXTBE電泳液中電泳。室溫下，按照電泳槽寬度X6-8V，電泳20分鐘。根據(jù)電泳圖譜，鑒定基因型。在對(duì)應(yīng)DNA marker 500bp下方出現(xiàn)的PCR產(chǎn)物為Z帶495 bp，在對(duì)應(yīng)DNA marker 250_500bp之間出現(xiàn)的PCR產(chǎn)物為W帶351 bp。其中，在對(duì)應(yīng)DNA marker 500bp下方出現(xiàn)一條PCR產(chǎn)物的的雄性ZZ型，在對(duì)應(yīng)DNA marker 250_500bp 之間出現(xiàn)兩條PCR產(chǎn)物的雌性ZW型，樣品個(gè)體分子性別鑒定結(jié)果與其已知性別核對(duì)無誤。
權(quán)利要求1 .鴨性別快速鑒別試劑盒盒體，其特征是，所述試劑盒由盒體(I),盒體內(nèi)的襯墊(2)，襯墊的各孔腔內(nèi)分別置入的特異性引物混合物ZWp (3)，擴(kuò)增緩沖液(4)，DNA marker (5)和瓊脂糖(6)組成。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種鴨性別快速鑒別試劑盒盒體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。鴨性別快速鑒別試劑盒盒體，由盒體，盒體內(nèi)的襯墊，襯墊的各孔腔內(nèi)分別置入的特異性引物混合物ZWp、擴(kuò)增緩沖液、DNAmarker和瓊脂糖組成，利用PCR-瓊脂糖電泳技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片段大小，根據(jù)PCR產(chǎn)物的片段大小和數(shù)量鑒定個(gè)體的性別，具有準(zhǔn)確性高、快速、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202808812SQ2012202861
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者胡艷, 李慧芳, 顧華兵, 徐文娟, 章明, 宋遲, 陶志云, 單艷菊, 章雙杰, 陳文峰 申請(qǐng)人:江蘇騰達(dá)源農(nóng)牧有限公司, 江蘇省家禽科學(xué)研究所