變異狂犬病毒及疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種安全性高、有效且廉價的狂犬病疫苗。本發(fā)明提供了一種變異狂犬病毒及含有此變異狂犬病毒的狂犬病疫苗制劑，所述變異狂犬病毒在其狂犬病毒結構蛋白中，至少N蛋白的273位為苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位為酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位為精氨酸和賴氨酸以外的其他氨基酸(例如，圖2中的ERA-N273/394-G333株)。除了能夠通過G蛋白333位氨基酸的變異導入來使狂犬病毒的毒性降低以外，還能夠通過對N蛋白273位和394位氨基酸進行變異導入來使免疫原性和安全性提高。此外，通過對N蛋白273位和394位氨基酸進行變異導入，即使G蛋白194位變異為賴氨酸的情況下也能夠防止病毒毒性加強，能夠降低因突變引起病原性恢復的可能性，可以使安全性進一步提高。
【專利說明】變異狂犬病毒及疫苗
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種變異狂犬病毒、含有此病毒的狂犬病疫苗制劑、狂犬病的預防和治療方法、狂犬病疫苗制造方法以及用于狂犬病疫苗制劑制造的使用等，所述變異狂犬病毒在狂犬病毒結構蛋白中至少是N蛋白的273位為苯丙氨酸(phenylalanine)以外的其他氨基酸(amino acid), N蛋白的394位為酪氨酸(tyrosine)以外的其他氨基酸，G蛋白的333位為精氨酸(arginine)或賴氨酸(lysine)以外的其他氨基酸。
【背景技術】
[0002]狂犬病是一種來自咬傷等所致的感染狂犬病毒而引起的一種人畜共患感染性疾病。治療方法尚未明確，發(fā)病時伴有重度神經癥狀，幾乎100%死亡。
[0003]狂犬病毒具有非常廣的宿主范圍，可以使包括人在內的所有哺乳類動物感染。在發(fā)展中國家，主要感染源是犬，在發(fā)達國家，主要感染源是狐貍、浣熊、臭鼬、蝙蝠等野生動物。據推測，即使現在，每年也有50000人以上死于狂犬病。
[0004]狂犬病可以通過接種疫苗來預防，目前滅活狂犬病疫苗已廣泛使用。但是，使用滅活疫苗時，為了得到理想效果，需要大量的抗原，疫苗成本增加。另一方面，雖然弱毒活疫苗與滅活疫苗相比能夠更加廉價地制作，但存在安全性隱患。因此，特別是在發(fā)展中國家，疫苗尚未充分普及。
[0005]狂犬病毒屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬。病毒粒子具有寬60]11]1至110111]1、長130111]1至250nm的彈丸狀的形態(tài)，由 5個結構蛋白即G蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白組成。病毒基因組全長約12000個堿基,負鏈為單鏈RNA,含有自上游(3’末端側)開始依次為編碼N、P、M、G、L的五個結構蛋白的基因序列。
[0006]近年來，隨著狂犬病毒的病原性決定因子的研究等的進展，已知能夠通過將G蛋白的333位的氨基酸置換為精氨酸和賴氨酸以外的其他氨基酸來使病毒的毒性減弱(參考非專利文獻I等)。另外，將G蛋白的333位氨基酸置換成弱毒型后所得的病毒作為野生動物的口服免疫用的弱毒活疫苗的情況，在歐洲已得到實際應用(參考專利文獻I等)。
[0007]據報道，這種弱毒變異型病毒即使G蛋白333位變異成弱毒型，也可通過突變將G蛋白194位突變?yōu)橘嚢彼岫蛊涠拘栽鰪?參考非專利文獻2)。因此,存在因G蛋白194位的突變而導致病原性恢復的擔憂，僅G蛋白333位弱毒變異型病毒的安全性未必可靠。
[0008]本發(fā)明人公開了以下情況:就狂犬病弱毒株N1-CE株而言，狂犬病N蛋白273位和394位氨基酸對于通過維甲酸誘導基因-1 (Retinoic acid-1nducible gene I,RIG_I)介導的抗病毒應答及病原性是重要的(參考非專利文獻3)。
[0009]其他，非專利文獻4及非專利文獻5是關于后述的基于反向遺傳法的人工合成狂犬病毒變異株的文獻。
[0010]專利文獻1:US2011/0064764A1
[0011]非專利文獻1:Dietzschold B et al, “Characterization of an antigenicdeterminant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabiesvirus.” Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.80:70-74，1983
[0012]非專利文獻2:Milosz Faber et al, “A single amino acid changein rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances viruspathogenicity.”Journal of Virology, vol.79, N0.22pl4141-14148.2005
[0013]非專利文獻3 ；Tatsunori Masatani et al, “Amino acids atposition273and394in rabies virus nucleoprotein are important for bothevasion of host RIG-1-mediated antiviral response and pathogenicity.，，VirusResearchl55(2011)168-174.[0014]非專利文獻4:Naoto Ito et al, “Rescue of rabies virus from clonedcDNA and identification of the pathogenicity-related gene: Glycoproteingene is associated with virulence for adult mice.”Journal of VirologyVol.75，N0.19p9121-91282001.[0015]非專利文獻 5:Naoto Ito et al, “Improved recovery of rabies virus fromcloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.，’MicrobiolImmunol.2003;47(8):613-7.【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是表示實施例3中，以ERA-N273/394-G333株對小鼠進行免疫時的小鼠血清的中和抗體效價的圖表。
[0017]圖2是表示實施例4中的ERA-N273/394-G333株的ED5tl(半數有效量)的圖表。
[0018]圖3A是表示實施例5中的腦內接種ERA-G194/333株的存活率的圖表。
[0019]圖3B是表示實施例5中的腦內接種ERA-N273/394-G194/333株的存活率的圖表。

【發(fā)明內容】

[0020]〈發(fā)明要解決的課題>
[0021]如上所述，雖然狂犬病的弱毒活疫苗較滅活疫苗可以更低廉地制作，但是具有病原性恢復等安全隱患。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種安全性高、有效且廉價的狂犬病疫苗。
[0022]<用于解決課題的手段>
[0023]本發(fā)明人對于將狂犬病毒的結構蛋白中的G蛋白的333位氨基酸置換后所得的弱毒性狂犬病毒，除了 G蛋白的333位，還對N蛋白的273位及394位進行了變異導入，由此能夠使免疫原性及安全性提高，且即使在G蛋白的194位變異為賴氨酸的情況下，病毒毒性也不會增強。
[0024]因此，在本發(fā)明中提供了一種變異狂犬病毒及含有此變異狂犬病毒的狂犬病疫苗制劑，其特征在于，在所述變異狂犬病毒的結構蛋白中至少N蛋白的273位為苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位為酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位為精氨酸和賴氨酸以外的其 他氨基酸。
[0025]能夠在通過對G蛋白的333位的氨基酸進行變異導入使毒性減弱的同時，通過對N蛋白273位及394位氨基酸進行變異導入來提高免疫原性。另外，除了 G蛋白的333位，還對N蛋白273位以及394位進行變異導入，由此，與只對G蛋白的333位施加變異的情況相比，由于以少量的接種量實現了充分的免疫效果，因此能夠使接種量減少，能夠進一步提高安全性。
[0026]另外，通過對N蛋白273位及394位氨基酸進行變異導入，即使在G蛋白194位變異為賴氨酸后也能夠防止毒性增強，因此能夠降低因突變導致病原性恢復的可能性，能夠進一步提聞安全性。
[0027]因此，本發(fā)明的含有變異狂犬病毒的疫苗制劑是有效的，通過使用本疫苗制劑，能夠有效地預防和治療狂犬病。
[0028]另外，由于這種重組病毒能夠采用培養(yǎng)細胞進行人工合成，因此具有以下方面的優(yōu)勢:例如在作為弱毒活疫苗使用時，可以比較廉價地制造狂犬病疫苗制劑。
[0029]〈發(fā)明的效果〉
[0030]本發(fā)明提供了一種免疫原性高、突變導致恢復病原性等安全性問題少、有效且廉價的狂犬病疫苗。
【具體實施方式】
[0031 ] <關于本發(fā)明的變異狂犬病毒>
[0032]本發(fā)明包括所有這樣的狂犬病毒:在狂犬病毒結構蛋白中，至少N蛋白的273位為苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位為酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位為精氨酸和賴氨酸以外的其他氨基酸的變異狂犬病毒。即，本發(fā)明對病毒的制備方法等不作狹義限制，可進行廣泛選擇，包括例如采用雞胚以及/或培養(yǎng)細胞等進行傳代所得的變異病毒、采用克隆cDNA等來進行人工合成所得的變異病毒等。
[0033]本發(fā)明能夠通過在狂犬病`毒結構蛋白中至少分別將N蛋白273位的苯丙氨酸置換成其他氨基酸、將N蛋白394位的酪氨酸置換成其他氨基酸、將G蛋白333位的精氨酸和賴氨酸置換成其他氨基酸，由此使狂犬病毒毒性減弱，且能夠提高免疫原性和安全性，并能夠降低因突變而引起的病原性恢復等的危險性。
[0034]除N蛋白273位、N蛋白394位、G蛋白333位之外的其他氨基酸序列，只要與已知狂犬病毒株的序列實質性一致即可，并不作特別限定。以氨基酸序列作為公知的狂犬病毒株,可舉出例如 CVS 株、ERA 株、西原株、HEP-Flury 株、LEP-Flury 株、SAD Bern 株、SAD B19株等。另外，所謂“實質性一致”是指在該領域的氨基酸序列具有80%至100%的同源性、較優(yōu)選具有90%至100%的同源性。
[0035]N蛋白273位的氨基酸只要是苯丙氨酸(phenylalanine)之外的其他氨基酸即可，不作特別限定。優(yōu)選例如甘氨酸(glycine)、丙氨酸(alanine)、繳氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、異亮氨酸(isoleucine)、絲氨酸(serine)、蘇氨酸(threonine)、半胱胺酸(cystein)、蛋氨酸(methionine)、天冬酰胺(Asparagine)、谷酰胺(glutamine)、脯氨酸(proline)、酪氨酸(tyrosine)、色氨酸(tryptophane)、天冬氨酸(asparagic acid)、谷氨酸(glutamic acid)、精氨酸(arginine)、賴氨酸(lysine)、組氨酸(histidine)中的任一種，更優(yōu)選的是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸中的任一種，最優(yōu)選亮氨酸。
[0036]N蛋白394位的氨基酸只要是酪氨酸(tyrosine)之外的其他氨基酸即可，不作特別限定。優(yōu)選例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸中的任一種，更優(yōu)選的是精氨酸、賴氨酸、組氨酸中的任一種，最優(yōu)選組氨酸。
[0037]G蛋白333位的氨基酸只要是精氨酸和賴氨酸之外的其他氨基酸即可，不作特別限定。優(yōu)選例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸中的任一種，更優(yōu)選甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸，最優(yōu)選谷氨酸。
[0038]作為N蛋白273位為亮氨酸、N蛋白394位為組氨酸、G蛋白333位為谷氨酸的變異狂犬病毒，可舉出例如以含有序列編號I所示的氨基酸序列的N蛋白以及含有序列編號2所示的氨基酸序列的G蛋白作為結構蛋白的變異狂犬病毒。
[0039]<關于本發(fā)明的狂犬病疫苗制劑>
[0040]本發(fā)明包括全部至少含有上述變異狂犬病毒的狂犬病疫苗制劑。
[0041]本發(fā)明的變異狂犬病毒也可以適用于弱毒活疫苗和滅活疫苗中的任一種，然而如上所述，從可以較廉價地制造狂犬病疫苗制劑且作為疫苗的效果也好這些方面出發(fā)，優(yōu)選弱毒活疫苗。
[0042]也可以根據目的和用途，在疫苗中適當地添加緩沖劑、等張調節(jié)劑、止痛劑、防腐劑、抗氧化劑等。
[0043]作為緩沖劑的優(yōu)選例，可以使用例如磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖液。
[0044]作為等 張調節(jié)劑的優(yōu)選例,可以使用例如氯化鈉、甘油(glycerine)、D-甘露醇(D-manitol)等。
[0045]作為止痛劑的優(yōu)選例,可以使用例如苯甲醇(benzil alcohol)等。
[0046]作為以防腐為目的的藥劑的優(yōu)選例，可以使用例如硫汞撒(timerosal)、對羥基苯甲酸酯(para-Hydroxy )類、苯氧乙醇、氯丁醇(ChlorobutanoI )、苯甲醇、苯乙醇、脫氫乙酸、山梨酸及其他各種防腐劑、抗生素、合成抗菌劑等。
[0047]作為抗氧化劑的優(yōu)選例，可以使用例如亞硫酸鹽、抗壞血酸等。
[0048]另外，在本制劑中還可含有輔助成分，例如作為保存、功效的輔助劑的光吸收色素(核黃素、腺嘌呤、腺苷等)、發(fā)揮穩(wěn)定作用的螯合劑、還原劑(維生素C、檸檬酸等)、碳水化合物(山梨糖醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖等)、酪蛋白水解物、各種維生素
坐寸o
[0049]關于疫苗制劑的劑型等，可以采用公知的劑型，并無特別限定。例如可以作為液體制劑來使用，也可以在口服使用中經冷凍干燥等處理后混入食餌等之中。
[0050]另外，在作為滅活疫苗制劑使用的情況下，可以通過公知的方法來進行，例如對培養(yǎng)液進行物理處理(紫外線照射、X射線照射、熱處理、超聲波處理等)、化學處理(基于福爾馬林、氯仿等有機溶劑的處理，基于醋酸等弱酸的處理，基于乙醇、氯、水銀等的處理)
坐寸O
[0051]例如，向培養(yǎng)液中以體積濃度為0.001%至2.0%、優(yōu)選0.01%至1.0%添加福爾馬
林，能夠通過將培養(yǎng)液置于4°C至30°C下進行I至3天的日光反應來進行基于福爾馬林的滅活化?？梢杂镁彌_液將滅活處理病毒洗凈，去除福爾馬林等滅活劑，且向滅活處理病毒中添加中和劑來進行中和。另外，可以通過膜過濾分離、離心分離等方法回收滅活處理病毒。
[0052]滅活疫苗中包含的滅活病毒的含量雖無特別限定，但優(yōu)選的是，滅活前的病毒含量為IO3FFU至IO11FFU的范圍，更優(yōu)選的是為IO4FFU至IO11FFU的范圍。
[0053]作為滅活疫苗制劑使用時，可加入公知的佐劑。作為公知的佐劑，可列舉出:例如含有動物油(鯊烯等)及其硬化油、植物油(棕櫚油、蓖麻油等)及其硬化油、失水甘露醇油酸酯、液狀石蠟、聚丁烯、辛酸、油酸、高級脂肪酸酯等的油性佐劑；含有PCPP、皂苷、葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、甘油磷酸錳、可溶性醋酸鋁、水楊酸鋁、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、無水馬來酸酐共聚物、烯烴衍生聚合物、水包油型乳液、季銨鹽陽離子脂質體等的水溶性佐劑；含有氫氧化鋁(明礬)、氫氧化鈉等的沉降性佐劑；霍亂毒素、致熱型大腸菌毒素等微生物毒素等的來自微生物的毒素成分；膨潤土、羅莫肽、白介素等其他佐劑。另外，也可將上述佐劑混合使用。
[0054]此外，本發(fā)明的疫苗制劑也可以是與針對其他疾病的一種或多種疫苗的混合疫苗制劑。
[0055]<關于本發(fā)明的狂犬病疫苗制劑的制備方法>
[0056]本發(fā)明的狂犬病疫苗制劑的制備方法，包括全部采用培養(yǎng)細胞來進行人工合成變異狂犬病毒的工序的狂犬病疫苗制劑制造方法。
[0057]所述變異狂犬病毒能夠通過反向遺傳法，采用培養(yǎng)細胞來進行人工合成，因此，能夠比較廉價且批次差異小地制造疫苗制劑。
[0058]首先制備重組狂犬病毒的基因組-質粒。
[0059]在狂犬病毒的親株中能夠使用例如上述狂犬病毒的基因組-質粒。在狂犬病毒親本株的基因組全鏈cDNA中，對編碼為N蛋白273位和394位、以及G蛋白333位的這三個氨基酸的堿基序列進行變異導入。變異導入可以采用重疊延伸PCR法等公知的點突變方法來進行。
[0060]將變異導入后的cDNA片段經限制性酶切和酶連接等處理，插入到質粒載體的多克隆位點。在這種情況下，例如通過將17啟動子序列配置于cDNA片段的上游區(qū)域(3’末端側)、將用于對D型肝炎病毒核酶編碼的堿基序列配置于下游(5’末端)，能夠使由I7RNA聚合酶所轉錄的人工正鏈基因組RNA的3’末端具有與原來的病毒相同的序列。
[0061 ] 質粒載體可以采用公知的載體，并未特別限定。
[0062]接下來，將上述重組狂犬病毒的基因組-質粒轉染至培養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)上清中表達重組病毒。轉染可以采用公知的方法，并無特別限定。另外，培養(yǎng)細胞也可以廣泛地使用BHK細胞等公知的培養(yǎng)細胞，但在通過I7RNA聚合酶表達病毒的情況下，可以使用由I7RNA聚合酶穩(wěn)定表達的細胞。
[0063]在轉染重組狂犬病 毒的基因組-質粒時，作為輔助質粒，通過同時地轉染表達狂犬病毒N蛋白的質粒、同樣地表達P蛋白的質粒、同樣地表達L蛋白的質粒，可以高效地合成變異狂犬病毒。
[0064]接下來，將培養(yǎng)上清中表達的重組狂犬病毒加入至培養(yǎng)細胞中，大量地表達重組病毒。對于此時所使用的培養(yǎng)細胞，可以使用例如來自小鼠神經母細胞瘤的NA細胞、Vero細胞等。
[0065]病毒的回收可以采用離心分離、膜過濾分離等公知的方法來進行。另外，將回收的病毒進一步添加到培養(yǎng)細胞中，由此能夠實現重組病毒的擴增，進行大量生產。
[0066]在將重組病毒作為弱毒活疫苗使用時，在回收后的病毒中適當地添加緩沖劑、等張調節(jié)劑、止痛劑、防腐劑以及抗氧化劑等來進行制品化。在將重組病毒作為滅活疫苗使用時，也可以在采用公知的方法將病毒滅活之后，適當地添加緩沖劑、等張調節(jié)劑、止痛劑、防腐劑以及抗氧化劑等來進行制品化。
[0067]<關于用于制造本發(fā)明的狂犬病疫苗制劑的病毒的使用>
[0068]本發(fā)明包括全部將上述變異狂犬病毒的用于制造狂犬病疫苗制劑的使用。
[0069]為了制造狂犬病疫苗制劑，能夠通過使用上述變異狂犬病毒，減少病原性恢復等安全隱患，能夠比較廉價且大量地制造疫苗效果好的狂犬病疫苗。
[0070]<關于本發(fā)明的狂犬病預防和治療方法>
[0071]本發(fā)明包括全部這樣的狂犬病的預防和治療方法:至少包含使用至少含有上述變異狂犬病毒的狂犬病疫苗制劑的狂犬病預防和治療方法。
[0072]本發(fā)明可以適用于能感染狂犬病的動物，例如人、以及犬、貓、狐貍、浣熊、臭鼬、蝙蝠、鼠等非人的動物。
[0073]通過例如對于健康個體使用上述的狂犬病疫苗制劑來免疫，可以預防罹患狂犬病，或者在因咬傷帶來的狂犬病毒顯現后立即集中地使用所述狂犬病疫苗制劑，也可以引發(fā)免疫反應來治療狂犬病。
[0074]該狂犬病疫苗制劑可以通過皮下注射、皮內注射、肌肉注射等方式來應用液體制劑，在為野生動物的情況下，也可以將其混入食餌中口服使用。在使用弱毒活疫苗制劑的情況下，通過皮下注射、皮內注射、肌肉注射等方式，例如每次給藥IO3FFU至IO11FFU ;在口服給藥的情況下，例如每次給藥IO4FFU至10nFFU。在使用滅活疫苗制劑的情況下，在進行皮下注射、皮內注射、肌肉注射等時，每次以病毒數為IO3至IO11個來給藥；在口服給藥時，每次以病毒數為IO4至IO11個來給藥。給`藥次數無特別限定，優(yōu)選I次或以I周至3個月的間隔進行數次。另外，優(yōu)選I年使用I次以上。
[0075]實施例1
[0076]在實施例1中，通過反向遺傳法來進行重組狂犬病毒的人工合成。
[0077]將在作為狂犬病毒的強毒固定株之一的ERA株基因組全鏈cDNA的上游區(qū)域(3’末端一側)配置了 17啟動子序列、以及在下游(5’末端)配置了用于編碼D型肝炎病毒核酶的堿基序列的重組cDNA片段通過PCR法進行擴增。另外，插入D型肝炎病毒核酶的編碼序列是為了將由I7RNA聚合酶轉錄的人工正鏈基因組RNA的3’末端具有與原病毒相同的序列。
[0078]通過限制性酶切和酶連接，將前述cDNA片段插入至質粒載體PUC19的多克隆位點。按上述步驟，制得了保有ERA株基因組全鏈cDNA的基因組-質粒(以下稱為“ERA株基因組-質?！?。
[0079]接下來，以將ERA株基因組全鏈中的N蛋白273位和394位，以及G蛋白333位這三處的氨基酸分別置換為亮氨酸、組氨酸、谷氨酸的方式，將堿基序列變異后的cDNA片段以ERA株基因組-質粒作為模板，通過重疊延伸PCR法進行擴增(參考非專利文獻4)。
[0080]通過限制性酶切和酶連接，將ERA株基因組-質粒上的基因組全鏈cDNA編碼區(qū)域置換為變異后的基因組全鏈cDNA片段。按上述步驟，制作了保有將ERA株基因組全鏈中的三處氨基酸序列變異后得到的變異株(ERA-N273/394-G333株)的基因組全鏈cDNA的基因組-質粒(以下稱為“ERA-N273/394-G333株基因組-質?！?(關于ERA-N273/394-G333株基因組的喊基序列，參考序列編號3)。
[0081]除此之外，也可以采用同樣步驟，制作保有將ERA株的基因組全鏈中的G蛋白333位氨基酸置換為谷氨酸后得到的變異株(ERA-G333株)的基因組全鏈cDNA的基因組-質粒(以下稱為“ERA-G333株基因組-質?！?。
[0082]序列解析結果表明，目標變異存在于各基因組-質粒上。
[0083]接下來，利用上述基因組-質粒來嘗試各種重組病毒的人工合成。
[0084]首先，作為輔助質粒，準備了表達狂犬病毒的N蛋白的質粒、同樣地表達P蛋白的質粒和表達L蛋白的質粒(參考非專利文獻5)。
[0085]前一日，將T7RNA聚合酶穩(wěn)定表達BHK細胞(以下稱為“BHK/T7-9細胞”)播種于24孔組織培養(yǎng)板。當日，將基因組-質粒(2 μ g/孔)及3種輔助質粒(分別為0.4 μ g/孔、
0.1yg/孔、OJyg/孔)共轉染于BHK/T7-9細胞，培養(yǎng)4至5日，將培養(yǎng)上清回收，以-80°C進行保存。
[0086]另外，在將轉染后的BHK/T7-9細胞固定以后，以抗狂犬病毒N蛋白單克隆抗體來進行熒光染色。并且，以熒光信號的增大作為指標來確認病毒變異株的存在。
[0087]接著，試制作重組病毒庫。
[0088]添加回收的培養(yǎng)上清來培養(yǎng)來自小鼠神經母細胞瘤的NA細胞，在利用細胞變異效果達到約50%的細胞脫落的 時間點，進行培養(yǎng)上清的回收。將此培養(yǎng)上清進行離心分離，以此上清作為病毒變異株庫，以_80°C進行保存。
[0089]對于按上述步驟進行人工合成后的重組病毒，測量病毒效價。
[0090]將稀釋了 10倍的各病毒液以100 μ L/孔向24孔組織培養(yǎng)板上的NA細胞中接種。在37°C下靜置I小時，待病毒感染細胞后，洗凈細胞。將含0.5%甲基纖維素的培養(yǎng)液添加入細胞，以37°C培養(yǎng)2日。在固定了感染細胞后，以抗狂犬病毒N蛋白單克隆抗體進行熒光染色，計算每個孔的熒光點數。作為病毒效價，基于在相同稀釋倍數的3個孔中出現的平均突光點數，計算突光點形成單位(FFU ；Focus forming unit)/mL。
[0091]實施例2
[0092]在實施例2中，對于重組病毒(ERA-N273/394-G333株)的增殖性進行討論。
[0093]T-25培養(yǎng)瓶中包埋Vero細胞，在復合感染度=0.01條件下，接種ERA株和/或ERA-N273/394-G333株。以37°C靜置I小時，待病毒吸附于細胞后，將細胞洗凈。以每瓶7mL的培養(yǎng)液加入細胞，以37°C進行培養(yǎng)。分別于感染第3、5、7、9、11日采集100 μ L培養(yǎng)液，以與實施例1相同的步驟來測量病毒效價。
[0094]其結果，感染Vero細胞的ERA-N273/394-G333株病毒效價在感染第7日達到
IX 106FFU/mL以上，感染第11日達到lX108FFU/mL以上，與ERA株病毒效價基本相同。由該結果顯示，雖然狂犬病毒的結構蛋白中的N蛋白273位和394位，以及G蛋白333位三處的氨基酸同時發(fā)生變異，但是病毒增殖能力并未受到影響。
[0095]實施例3
[0096]在實施例3中，對于重組病毒(ERA-N273/394-G333株)的免疫原性進行討論。
[0097]對于每組5只ddY小鼠(鼠齡6周，雌性)分別肌肉內接種IO4FFU的ERA-G333株和ERA-N273/394-G333株，由此進行免疫。
[0098]接種后第2周對免疫小鼠采血，將血清稀釋2倍后，以56 °C滅活30分鐘，再將稀釋2倍的血清(25 μ L)與相當于50%組織培養(yǎng)感染量200倍的CVS株病毒液(25 μ L)混和。將此混合液于4°C反應一晚，由此使稀釋血清中的中和抗體與病毒反應。
[0099]在96孔組織培養(yǎng)板上播種NA細胞懸浮液(3X IO5個/mL、0.1mL/孔)，接種血清-病毒混合液。將細胞在37°C下培養(yǎng)3日。在將感染細胞固定后，以抗狂犬病毒N蛋白單克隆抗體進行突光染色，以Reed and Munch法計算病毒中和抗體效價。同時,關于來自世界動物衛(wèi)生組織(OIE)的標準血清(0.5國際單位[IU/mL])，也按同樣方法進行測量，將中和抗體效價換算為國際單位[IU/mL]。
[0100]結果如圖1所示。圖1是表示以ERA-N273/394-G333株對小鼠進行免疫的情況下小鼠血清的中和抗體效價圖。圖1中，橫軸的“ERA-G333”為以ERA-G333株對小鼠進行免疫時的結果，“ERA-N273/394-G333”為以ERA-N273/394-G333株對小鼠進行免疫時的結果；縱軸為小鼠血清的中和抗體效價(單位:IU/mL)。
[0101]如圖1所示那樣，以IO4FFU的重組狂犬病毒進行肌肉內接種來免疫時，就ERA-N273/394-G333株而言，對于全部的個體來講，小鼠血清的中和抗體效價均在0.5IU/mL以上，與ERA-G333株的情況相比，為較高的數值。由結果所示，ERA-N273/394-G333株與ERA-G333株的情況相比，具有較高的免疫原性。
[0102]實施例4
[0103]在實施例4中，對于重組病毒(ERA-N273/394-G333株)的ED5tl (半數有效量)進行討論。
[0104]通過對每組5只ddY小鼠(鼠齡6周，雌性)分別肌肉內接種IO2FFU至IO5FFU的ERA-G333株和ERA-N273/394-G333株來進行免疫。接種后第6周，將50%致死量的25倍的疫苗檢查用標準攻擊株(CVS株)接種于免疫小鼠腦內。觀察各小鼠14日，從小鼠存活率計算各株的ED5tl (半數 有效量)。
[0105]結果如圖2所示。圖2為表示ERA-N273/394-G333株的ED5tl(半數有效量)的圖。圖2中，橫軸的“ERA-G333”表示ERA-G333株的結果，“ERA-N273/394-G333”表示ERA-N273/394-G333株的結果；縱軸表示ED5tl (半數有效量，單位FFU)。
[0106]如圖2所示，ERA-N273/394-G333株的ED5tl(半數有效量)為5，000FFU以下，與ERA-G333株相比，若產生與ERA-G333株等同的效果，只需ERA-G333株約1/3的量。
[0107]上述結果表明，就對于G蛋白333位與N蛋白273位和394位施加了變異的株而言，與僅對G蛋白333位施加變異的情況相比，免疫原性提高。另外，通過免疫原性提高使接種量變少，也能夠實現相同的免疫效果，因此，通過使接種量變少，其結果是能夠進一步提高安全性。
[0108]如上述實施例3和實施例4結果所示，ERA-N273/394-G333株具有高的免疫原性和安全性，即作為弱毒活疫苗對狂犬病是有效的。
[0109]實施例5
[0110]如上所述，已知:即使在對G蛋白333位氨基酸施加變異而使狂犬病毒毒性減弱的情況下，當以突變的方式對G蛋白194位氨基酸進行置換時，也會使病毒的毒性增強，病原性恢復。因此，在實施例5中，對于在ERA-N273/394-G333株的G蛋白194位變化為賴氨酸的情況下是否導致病毒的毒性增強進行討論。
[0111]以與實施例1相同的方法，以將G蛋白194位的氨基酸置換為賴氨酸的方式，對于ERA-N273/394-G333株基因組-質粒及ERA-G333株基因組-質粒進行變異導入。以與實施例I相同的方法，使用上述基因組-質粒，人工合成使ERA株基因組中的三處氨基酸序列和G蛋白194位變異所得的變異病毒(ERA-N273/394-G194/333株)、以及使G蛋白333位以及194位的氨基酸變異所得的變異病毒(ERA-G194/333株)。
[0112]對每組5只ddY小鼠(鼠齡6周，雌性)分別腦內接種IO2FFU至IO4FFU的ERA-N273/394-G194/333株和ERA-G194/333株。觀察各小鼠18日，考察小鼠的存活率的規(guī)律。
[0113]結果如圖3A和圖3B所示。圖3A是表示腦內接種ERA-G194/333株的存活率的圖表；圖3B是表示腦內接種ERA-N273/394-G194/333株的存活率的圖表。在兩圖中，橫軸表示小鼠接種后天數，縱軸表示存活率(%)，各圖表分別表示小鼠未接種(非感染)及接種了IO2FFU至IO4FFU時的結果。
[0114]在腦內接種了 ERA-G194/333株的情況下，如圖3A所示，在接種了 IO2FFU情況下
17日后的存活率為20%，在接種了 IO3FFU情況下17日后的存活率為40%，病毒出現強毒性，相對于此，在腦內接種了 ERA-N273/394-G194/333株的情況下，如圖3B所示，任意濃度時存活率均為100%，未觀察到病毒的強毒性。
[0115]如該結果所示，就ERA-N273/394-G333株而言，即使G蛋白194位氨基酸以突變的方式被置換為賴氨酸，病毒也未毒性增強，通過變異導入G蛋白333位、N蛋白273位以及394位的氨基酸，即使將G蛋白194位置換為賴氨酸也不再出現強毒性，也即由突變引起的病原性恢復的危險性降低。`
【權利要求】
1.一種變異狂犬病毒，其特征在于，在所述變異狂犬病毒的結構蛋白中，至少N蛋白的273位為苯丙氨酸以外的其他氨基酸，N蛋白的394位為酪氨酸以外的其他氨基酸，G蛋白的333位為精氨酸和賴氨酸以外的其他氨基酸。
2.根據權利要求1所述的變異狂犬病毒，其特征在于，所述變異狂犬病毒是采用培養(yǎng)細胞進行人工合成所制成。
3.根據權利要求1所述的變異狂犬病毒，其特征在于，所述N蛋白的273位為亮氨酸、所述N蛋白的394位為組氨酸、所述的G蛋白的333位為谷氨酸。
4.根據權利要求1所述的變異狂犬病毒，其特征在于，在所述變異狂犬病毒的結構蛋白中含有序列編號I所不的氣基酸序列的N蛋白及序列編號2所不的氣基酸序列的G蛋白。
5.一種狂犬病疫苗制劑，其特征在于，含有權利要求1所述的變異狂犬病毒。
6.一種狂犬病預防和治療的方法，其特征在于，使用權利要求5所述的狂犬病疫苗制劑。
7.—種狂犬病疫苗制劑的制造方法，其特征在于，包括人工合成工序:采用培養(yǎng)細胞來合成至少N蛋白的273位為苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位為酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位為精氨酸和賴氨酸以外的其他氨基酸的變異狂犬病毒。
8.一種用于變異狂犬病毒的狂犬病疫苗制劑制造的使用，其特征在于，所述變異狂犬病毒是至少N蛋白273位為苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白394位為酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白333位為精氨酸和賴氨酸以外的其他氨基酸的變異狂犬病毒。
【文檔編號】C12N15/09GK103781902SQ201280035160
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年7月13日 優(yōu)先權日:2011年7月15日
【發(fā)明者】伊藤直人, 杉山誠 申請人:共立制藥股份有限公司, 國立大學法人岐阜大學