專利名稱：一種花生中逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆及功能表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種花生逆境脅迫6基因的克隆及功能表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
花生為豆科落花生屬作物，富含油脂和蛋白，是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。花生的產(chǎn)量和品質(zhì)受干旱、鹽堿等脅迫影響非常嚴(yán)重，全國每年因干旱引起的花生減產(chǎn)率達(dá)20%以上。但由于花生品種資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐鹽的基因源，利用常規(guī)育種方法難以培育出高抗品種。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，近年來利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物脅迫耐受能力的研究取得了顯著成果，對(duì)脅迫相關(guān)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也有了更深入的了解。MYB蛋白是近年來從植物中發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的重復(fù)數(shù)，MYB家族蛋白分為四個(gè)亞家族1R_MYB，2R-MYB, 3R-MYB和4R-MYB。該類轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，病原抗性及非生物脅迫抗性中均有重要功能。該家族基因的表達(dá)受干旱、冷害、鹽脅迫等誘導(dǎo)?，F(xiàn)已在水稻、小麥、擬南芥、煙草、大豆和番茄等植物中發(fā)現(xiàn)了該類基因。已有研究表明，幾個(gè)R2R3-MYB基因參與了植物對(duì)干旱、高鹽及低溫逆境的響應(yīng)(Chen et al. 2006; Agarwal et al. 2006)。Ma 等(2009)在水稻中超表達(dá)似U，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)低溫脅迫的抗性提高。Pasquali等(2008)在蘋果中超表達(dá)水稻的0sMYB4能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫和干旱的抗性。Zhang等(2012)將小麥的TaMYB56_B在擬南芥中超表達(dá)能夠提高擬南芥對(duì)冷凍和鹽脅迫的抗性。大量研究表明在各種非生物脅迫過程中，MYB家族蛋白的積累對(duì)植物在脅迫條件下起潛在的保護(hù)作用，但目前尚未見該類基困在花生中克隆和功能研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高花生生長的抗逆境能力，增強(qiáng)其耐鹽、抗旱、耐低溫能力，發(fā)明了一種花生逆境脅迫基因JMT現(xiàn)6的克隆及功能表達(dá)方法。技術(shù)方案
一種花生逆境脅迫基因的克隆及功能表達(dá)方法，主要包括以下步驟
(I)材料的準(zhǔn)備與處理材料為花生花育19 (Arachis hypogaea L. cultivarHuayul9)。花生種子在營養(yǎng)土和蛭石以2 1混合的土中萌發(fā),萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗(28°C /22°C)。生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理。低溫處理，將三葉期花生幼苗至于4°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，分別于處理的0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生葉片和根作為材料；對(duì)于耐鹽用NaCl處理；對(duì)于抗旱，用PEG6000處理。將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM NaCl或重量濃度20%PEG6000溶液中，在處理時(shí)間為0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的根作為材料。所有材料均保存于_80°C超低溫冰箱中備用。(2) RNA的提取和cDNA的合成
本實(shí)驗(yàn)用天根的RNeasy Mini Kit (Qiagen)分離提取花生幼苗RNA。RQl RNase-freeDNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)進(jìn)行 cDNA 的合成，25-y L 反應(yīng)體系中包含 2 y g RNA。在42° C條件下經(jīng)過60 min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5 min,之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)基因克隆
通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LA Taq DNA polymerase (TaKaRa)，在 25-1i L 體系中加入以下成分2. 5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2) ;2. 5 u L 10 mMdNTPs ；1 u L cDNA 模板；0. 5 u L LA polymerase 和 17. 5 u L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為(a) 94°C,5 min ； (b) 94°C,45 s ；55°C,45 s ；72°C,90 s ;共 35 cycles ； (c) 72°C, 10min。擴(kuò)增基因全長所用引物為 AhMYB6-S: 5’ -GAAGCAAAGATGGTGA GA-3’ 和 AhMYB6_A:5’ -AGCCCTAATCAAAGACGA-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接 pMD18_T Easy vector (Takara)并測(cè)序(Sangon,Shanghai)。本發(fā)明的JMT現(xiàn)6基因開放閱讀框?yàn)?58bp，共編碼286個(gè)氨基酸。本發(fā)明的JMT現(xiàn)6基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與大豆的MYB家族蛋白GmMYB4，GmMYB29, GmMYB29A2同源性均達(dá)到了 60%以上。 本發(fā)明的AhMYBL6基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE I。本發(fā)明的AhMYBL6基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE 2。用熒光定量Real-time RT-PCR對(duì)AMYBL6基因進(jìn)行功能表達(dá)
熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8 ng U L—1，用的聚合酶是SYBR Premix ExTaq polymerase (Takara),用的儀器是 LightCycler 2. 0 instrument system (Roche,Germany)，每反應(yīng)體系加2 y L稀釋的cDNA。PCR反應(yīng)程序如下(I) 95 °C, 10 s ； (2)95°C，5 s,40 cycles ； (3) 60°C，30 s ； (4) 72°C，10 s。PCR 反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0. 5°C。13 -actin為熒光定量PCR內(nèi)參基因。AhMYB6 熒光定量 RT-PCR 用的引物序列為QAhMYBL6_S :5’ - ACCACCACTACAACAACA-3’ 和 QAhMYBL6_A :5’ -ATCATCAATTCCTGCCTCT-3’。內(nèi)參基因后-actin所用引物序列為Qactin_S :5’ -TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’ 和 Qactin-A :5’ -AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。本發(fā)明的顯著效果
通過熒光定量PCR驗(yàn)證了 6在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在三種非生物逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高(圖2)。從圖2可以看出現(xiàn)沒在各種脅迫處理Ih后表達(dá)量均有明顯提高，并且此后一直維持在較高的水平，在低溫處理的葉片中AhMYBL6的表達(dá)量最高提高了 20多倍(圖2，B)。以上結(jié)果表明AhMYBL6可能在花生對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入花生中，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性。說明6基因能顯著提高花生的抗逆性。


圖1花生AhMYBL蛋白與大豆中MYB家族蛋白氨基酸序列比較
NCBI 上蛋白編號(hào)GmMYB4， XP_003518022 ；GmMYB29, NP_001241360 ；GmMYB29A2,BAA81732。圖2 AhMYBL6在低溫，NaCl，PEG6000處理下表達(dá)模式分析
A ^#7現(xiàn)6在低溫處理的花生根中表達(dá)變化；B ^#7現(xiàn)6在低溫處理的花生葉片中表達(dá)變化；C MMYBL6在200mM NaCl處理的花生根中表達(dá)變化；D MMYBL6在20% PEG6000處理的花生根中表達(dá)變化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定。

本發(fā)明的具體實(shí)施過程為
I實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)材料為花生花育IgClracAi1SL. cultivar Huayul9)?；ㄉN子在營養(yǎng)
土和蛭石以2 :1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗(28°C/22°C)。生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理實(shí)驗(yàn)。對(duì)于低溫處理，將三葉期花生幼苗至于4°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，分別于處理的0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生葉片和根作為實(shí)驗(yàn)材料；對(duì)于耐鹽用NaCL處理；對(duì)于抗旱，用PEG6000處理。將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM NaCl或20%PEG6000溶液中，在處理的Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的根作為實(shí)驗(yàn)材料。所有材料均保存于_80°C超低溫冰箱中備用。的提取和cDNA的合成
本實(shí)驗(yàn)用天根的RNeasy Mini Kit (Qiagen)分離提取花生幼苗RNA。RQl RNase-freeDNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)進(jìn)行 cDNA 的合成，25-y L 反應(yīng)體系中包含 2 y g RNA。在42° C條件下經(jīng)過60 min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5 min,之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆??；蚩寺?br> 通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LA Taq DNA polymerase (TaKaRa)，在 25-1i L 體系中加入以下成分2. 5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2) ;2. 5 u L 10 mMdNTPs ；1 u L cDNA 模板；0. 5 u L LA polymerase 和 17. 5 u L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為
(I)94°C,5 min; (2) 94°C,45 s ；55°C,45 s ；72°C,90 s ;共 35 cycles ； (3) 72°C, 10min。擴(kuò)增基因全長所用引物為 AhMYB6-S: 5’ -GAAGCAAAGATGGTGA GA-3’ 和 AhMYB6_A:5’ -AGCCCTAATCAAAGACGA-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接 pMD18_T Easy vector (Takara)并測(cè)序(Sangon,Shanghai)。熒光定量Real-time RT-PCR
熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8 ng U L—1，用的聚合酶是SYBR Premix ExTaq polymerase (Takara),用的儀器是 LightCycler 2. 0 instrument system (Roche,Germany)，每反應(yīng)體系加2 y L稀釋的cDNA。PCR反應(yīng)程序如下(I) 95 °C, 10 s ； (2)95°C，5 s,40 cycles ； (3) 60°C，30 s ； (4) 72°C，10 s。PCR 反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0. 5°C。-actin為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。AhMYB6熒光定量驗(yàn)證用的引物序列為QAhMYBL6_S :5’ - ACCACCACTACAACAACA-3’ 和 QAhMYBL6_A :5’ -ATCATCAATTCCTGCCTCT-3’。內(nèi)參基因后-actin所用引物序列為Qactin_S :5’ -TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’ 和 Qactin-A :5’ -AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 JMT現(xiàn)6核苷酸全長及其編碼的氨基酸序列
通過PCR擴(kuò)增及測(cè)序，得到了目的基因，該基因開放閱讀框?yàn)?58bp，共編碼286個(gè)氨基酸。將該基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與大豆的MYB家族蛋白GmMYB4，GmMYB29, GmMYB29A2同源性均達(dá)到了 60%以上(圖1)，故將該基因命名為必(Arachis hypogaea MYB Like 6J。AnMYBL6在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析 通過熒光定量PCR驗(yàn)證了 6在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在三種非生物逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高(圖2)。從圖2可以看出現(xiàn)沒在各種脅迫處理Ih后表達(dá)量均有明顯提高，并且此后一直維持在較高的水平，在低溫處理的葉片中AhMYBL6的表達(dá)量最高提高了 20多倍(圖2，B)。以上結(jié)果表明AhMYBL6可能在花生對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入花生中，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性。說明這個(gè)基因能顯著提高花生的抗逆性。
權(quán)利要求
1.一種花生逆境脅迫基因的克隆方法，主要包括以下步驟 (1)材料的準(zhǔn)備與處理材料選擇花生花育19，花生種子在營養(yǎng)土和蛭石以2:1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22°C -28°C，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理； 材料的低溫處理，將三葉期花生幼苗放入4°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，取處理時(shí)間分別為Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生葉片和根作為材料；對(duì)于耐鹽用NaCl處理；對(duì)于抗旱，用PEG6000處理；將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM NaCl或重量濃度為20%PEG6000溶液中，在處理Oh，lh, 3h,h, 12h，24h，48h和72h分別取花生的根作為材料，所有材料均保存于_80°C超低溫冰箱中備用； (2)RNA的提取和cDNA的合成 按照試劑盒操作手冊(cè)的方法用天根的RNeasy Mini Kit分離提取花生幼苗cDNA,用RQlRNase-free DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成；用M-MLV ReverseTranscriptase進(jìn)行cDNA的合成,25-1i L反應(yīng)體系中包含2 u g RNA,在42° C條件下經(jīng)過60 min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5 min，之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫? (3)必#7現(xiàn)6基因克隆 通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LA Taq DNA polymerase，在25-1i L體系中加入以下成分含]\%(12的2. 5 u L IOX PCR buffer ；2. 5 u L 10 mM dNTPs ；1 u LcDNA 模板；0. 5 u L LA polymerase和 17. 5 u L ddH20 ;PCR反應(yīng)條件為(a) 94°C，5 min ；(b) 94°C,45 s ；55°C,45 s ；72°C,90 s ;共 35 cycles ； (c) 72°C, 10 min ； 擴(kuò)增基因全長所用引物為 AhMYB6-S: 5 ’ -GAAGCAAAGATGGTGA GA-3 ’ 和 AhMYB6_A:5， -AGCCCTAATCAAAGACGA-3，； PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用Axygen膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接 pMD18_T Easy vector 并測(cè)序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生逆境脅迫6基因的克隆方法，其特征在于所述飽AhMYBL6基因開放閱讀框?yàn)?58bp，共編碼286個(gè)氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生逆境脅迫6基因的克隆方法，其特征在于所述飽AhMYBL6基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與大豆的MYB家族蛋白GmMYB4, GmMYB29, GmMYB29A2同源性均達(dá)到了 60%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生逆境脅迫6基因的克隆方法，其特征在于所述的AhMYBL6基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生逆境脅迫6基因的克隆方法，其特征在于所述的基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一種花生逆境脅迫JMT現(xiàn)6基因功能表達(dá)方法，使用熒光定量Real-time RT-PCR對(duì)AhMYBL6基因逆境下的表達(dá)進(jìn)行分析，其方法如下 熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8 ng U L—1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taqpolymerase,用的儀器是 LightCycler 2. 0 instrument system,每反應(yīng)體系加 2 u L 稀釋的 cDNA ；PCR 反應(yīng)程序如下(a) 95。。，10 s ； (b) 95。。，5 s，40 cycles ； (c) 60。。，30 s ； (d)72°C, 10 s ；PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0. 5°C, P-actin為RT-PCR的內(nèi)參基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6花生逆境脅迫必#7現(xiàn)6基因功能表達(dá)方法，其特征在于:AhMYB6熒光定量 RT-PCR 用的引物序列為QAhMYBL6-S :5，- ACCACCACTA CAACAACA-3，和QAhMYBL6-A :5’ -ATCATCAATTCCTGCCTCT-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求6花生逆境脅迫JMT現(xiàn)6基因功能表達(dá)方法，其特征在于所述的內(nèi)參基因 P-actin 所用引物序列為Qactin-S : 5 ’ -TTGGAATGGGTCAGAAGG ATGC-3 ’ 和Qactin-A :5’ -AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種花生中逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆及功能表達(dá)方法，通過材料的準(zhǔn)備與處理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR進(jìn)行克隆合成出了逆境脅迫AhMYBL6基因，該基因開放閱讀框?yàn)?58bp，共編碼286個(gè)氨基酸；基因氨基酸序列與大豆的MYB家族蛋白GmMYB4,GmMYB29,GmMYB29A2同源性均達(dá)到了60%以上。通過熒光定量PCR驗(yàn)證了AhMYBL6在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，AhMYBL6在各種脅迫處理1h后表達(dá)量均有明顯提高，并且此后一直維持在較高的水平，在低溫處理的葉片中AhMYBL6的表達(dá)量最高提高了20多倍，將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入花生中，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性，AhMYBL6基因能顯著提高花生的抗逆性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060340SQ201310035449
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者陳娜, 陳明娜, 遲曉元, 王通, 王冕, 潘麗娟, 禹山林, 楊珍 申請(qǐng)人:山東省花生研究所