利用融合酶檢測同型半胱氨酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同型半胱氨酸濃度的測定方法：其特征在于被測底物同型半胱氨酸經(jīng)基因工程融合酶催化生成產(chǎn)物腺苷，該腺苷產(chǎn)生的速率與樣本中同型半胱氨酸的含量成正比，通過測定腺苷的方法，可以得出樣本中同型半胱氨酸的含量。所采用的基因融合酶是同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)與腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合酶，和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)與蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(EC2.5.1.6)的融合酶。本發(fā)明建立了一種高效的融合酶蛋白用于檢測同型半胱氨酸，利用融合酶高效的催化活性，大大地提高了普通酶學(xué)反應(yīng)的靈敏度和檢測試劑的穩(wěn)定性。也為酶循環(huán)檢測方法提出了新的方法學(xué)改進(jìn)領(lǐng)域。
【專利說明】利用融合酶檢測同型半胱氨酸
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種同型半胱氨酸測定試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]同型半胱氨酸(Homocysteine)是含硫氨基酸，在細(xì)胞內(nèi)由蛋氨酸脫甲基生成。近期的研究表明，同型半胱氨酸通過產(chǎn)生超氧化物及過氧化物損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變凝血因子功能，增加血栓形成傾向，促進(jìn)動脈粥樣硬化及血栓形成，使心血管疾病發(fā)病率及死亡率增加，因此測定血中同型半胱氨酸的濃度在臨床上意義十分重要。當(dāng)同型半胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)積聚，并進(jìn)入血液循環(huán)后，大部分以氧化型存在，并與蛋白結(jié)合，還原形同型半胱氨酸在血中僅占I %。測定血中總同型半胱氨酸的含量，一般需采用還原劑將氧化型同型半胱氨酸還原為還原型同型半胱氨酸，常用的還原劑為三_(羧乙基)磷化氫鹽酸鹽(TCEP)。
[0003]近幾年隨著同型半胱氨酸酶循環(huán)檢測方法的不斷發(fā)展，一種由同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)及其底物組成的酶循環(huán)反應(yīng)方法，由于其不受體內(nèi)胱硫醚物質(zhì)的干擾，在臨床診斷領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是，該方法由于使用的工具酶較多，連續(xù)催化反應(yīng)步驟復(fù)雜，試劑質(zhì)量和反應(yīng)線性都需不斷校正，對使用維護(hù)要求較高。
[0004]在上述酶循環(huán)方法中，一般需要同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、腺苷同型半胱氨酸酶、蛋氨酸S-腺苷轉(zhuǎn)移酶、腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶、輔酶I和其它生物活性物質(zhì)。由于各個蛋白酶的穩(wěn)定性和活性要求不同，故測定試劑制造中較難找到一個理想的穩(wěn)定條件；同時在反應(yīng)體系中，由于各個酶均單獨(dú)溶解在反應(yīng)緩沖液中，底物和中間產(chǎn)物不斷向主題相擴(kuò)散，增加了連續(xù)催化反應(yīng)的空間位阻，降低了連續(xù)催化反應(yīng)的效率，由于該方法中連續(xù)的酶催化反應(yīng)步驟較多，因此，實際上很難達(dá)到理想的線性反應(yīng)模式。
[0005]本發(fā)明采用了基因工程融合酶技術(shù)，利用融合酶高效的催化活性和穩(wěn)定性，大大提高了催化反應(yīng)的效率，從而提高了檢測試劑的反應(yīng)性能和穩(wěn)定性。
[0006] 融合酶是指通過基因工程蛋白重組手段，將目標(biāo)酶和另外一個或幾個酶通過連接肽連接起來，從而獲得的具有多種功能的融合酶。構(gòu)建融合酶的最直接的優(yōu)勢之一是可以將多個蛋白功能集成于一體，實現(xiàn)酶的多功能化。融合酶的優(yōu)勢在于能夠?qū)⒍喾N酶催化活性整合在一個雜合蛋白上。在類似同型半胱氨酸酶循環(huán)法這樣的連續(xù)酶催化過程中，前一個酶的產(chǎn)物(中間產(chǎn)物)是下一步酶催化反應(yīng)的底物，而這些酶往往處于游離狀態(tài)，特別是在液體試劑中，酶分子之間的距離是游離和疏散的，難以進(jìn)行任何控制，制約了其催化效率。通過融合蛋白技術(shù)將多個參與連續(xù)或循環(huán)序列催化反應(yīng)的酶連接起來，通過調(diào)控其空間靠近效應(yīng)，控制反應(yīng)效率。通過融合酶實現(xiàn)多酶的空間靠近效應(yīng)，能夠:1)強(qiáng)化中間產(chǎn)物在兩個或多酶之間的傳遞過程，即所謂的“鄰近效應(yīng)”;2)避免了中間產(chǎn)物向主體相的擴(kuò)散，此時中間產(chǎn)物類似融合酶蛋白的輔酶；3)減少了中間產(chǎn)物被其他副反應(yīng)的競爭；4)減少了中間體不穩(wěn)定性導(dǎo)致的降解；5)增加了中間產(chǎn)物在催化活性中心附近的局部濃度，從而大大加速了整個順序催化過程；6)更重要的是融合酶蛋白具有更好的穩(wěn)定性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題一方面是為了建立一種利用融合酶的酶學(xué)測定方法；另一方面是為了進(jìn)一步提高現(xiàn)有全自動分析試劑的靈敏度，從而改善測定質(zhì)量，而提供的一種改良的同型半胱氨酸測定試劑方法；并同時還提供了這種同型半胱氨酸融合測定試劑。
[0008]本發(fā)明中的融合酶是指通過基因工程蛋白重組手段，將目標(biāo)酶和另外一個或兩個酶通過連接肽連接起來，從而獲得的具有多種功能的融合酶。融合酶最簡單的構(gòu)建方式是直接把兩個酶的編碼基因首尾相連(除去第一個酶的終止密碼子)，構(gòu)成融合酶基因；也可通過連接肽融合；繼而在宿主中進(jìn)行蛋白表達(dá)得到融合酶。由于簡單的首尾相連容易影響各個結(jié)構(gòu)域的折疊和天然構(gòu)象，故本發(fā)明中采用了連接肽融合的方法。
[0009]常用的連接肽包括柔性連接肽，如聚甘氨酸連接肽((GGGGS) η (—般η≤6))，α螺旋連接肽，如(ΕΑΑΑΚ)η，和抗蛋白酶水解的脯氨酸-蘇氨酸(PT) η重復(fù)序列連接肽。不同類型的連接肽具有不同性質(zhì)，(GGGGS)n連接肽不形成二級結(jié)構(gòu)，能增加蛋白的可溶性，并能提供融合酶蛋白催化活性所需的柔性；(EAAAK)n能形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，故能提供兩個被融合蛋白之間穩(wěn)定可控的隔離效果，有利于融合蛋白的有效表達(dá)和正確折疊。
[0010]在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)這些新構(gòu)建的融合酶蛋白，蛋白的正確折疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力增加50%以上，而且熱穩(wěn)定性顯著提高。
[0011]在本發(fā)明中 ，用于測定同型半胱氨酸的融合酶的單體酶序列基因來自S-腺苷-L-蛋氨酸:L-同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)、S-腺苷-L-同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)和三磷酸腺苷:L-蛋氨酸S-腺苷轉(zhuǎn)移酶(EC2.5.1.6)三種酶。融合后用于檢測的雜合酶蛋白包括:同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)與腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合酶；腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)與蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(EC2.5.1.6)的融合酶。
[0012]所述融合酶在檢測試劑中的用量為催化有效量以上，一般可為0.1~100kU/L(U為國際單位)。
[0013]融合酶作為一種雜合雙功能或多功能酶蛋白，可直接反復(fù)將樣品中的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為腺苷。腺苷的測定方法很多，包括氧化酶方法:(I)腺苷在腺苷脫氨酶的作用下生成氨和肌苷，后者經(jīng)嘌呤核苷磷酸化酶作用，與磷酸反應(yīng)生成次黃嘌呤，在黃嘌呤氧化酶的作用下，次黃嘌呤被最終氧化為尿酸，并產(chǎn)生過氧化物氫，經(jīng)與生色化合物反應(yīng)，測定生成的色素；或者脫氫酶方法，如(2)谷氨酸脫氫酶方法，氨與α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的作用下，產(chǎn)生L-谷氨酸，同時輔酶NADH或NADPH被氧化為NAD+或NADP+，反應(yīng)系統(tǒng)在340nm處的吸光度值下降。由于樣本中的同型半胱氨酸被融合酶反復(fù)催化反應(yīng)，不斷產(chǎn)生腺苷，故大大提聞了測定的靈敏度。
[0014]本發(fā)明的方法中，所述的待測樣本可為各種形式的需檢測其所含同型半胱氨酸含量的樣本，如體液樣品或組織樣本，更具體的如血清樣本或血漿樣本。所述的待測樣本與融合酶反應(yīng)系統(tǒng)的用量比沒有特殊要求，但同一測定批次內(nèi)應(yīng)一致。
[0015]本發(fā)明的融合酶反應(yīng)系統(tǒng)為可保證樣本在其中能有效進(jìn)行，需要能保證融合酶活性的緩沖液體系，該緩沖體系較佳的為PH6~9的緩沖液體系。所述的緩沖液可為本領(lǐng)域常用的各種緩沖液，如磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)(HEPES)緩沖液等。緩沖液的濃度(緩沖對的總濃度)無特殊要求，一般為20~300mmol/L0
[0016]根據(jù)需要，本發(fā)明的融合酶反應(yīng)系統(tǒng)還可包括能穩(wěn)定和/或促進(jìn)酶活性的酶穩(wěn)定劑。所述的酶穩(wěn)定劑較佳的為甘露糖醇、甘油、聚乙二醇(優(yōu)選聚乙二醇2000~8000)、金屬離子(如鉀離子或鈉離子)、牛血清白蛋白、表面活性劑和防腐劑中的一種或多種。所述的酶穩(wěn)定劑的用量按常規(guī)用量選擇，一般為0.1~500mmol/L。
[0017]本發(fā)明的方法中，所述的反應(yīng)和測定的溫度以所用融合酶可發(fā)揮活性的溫度下進(jìn)行即可，一般為25~39°C，較佳的為37°C。較佳的，在進(jìn)行所述的反應(yīng)前，將所述的酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)在上述溫度下進(jìn)行哺育，以使酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)溫度均一平衡。所述的哺育的時間較佳的為2~5分鐘，更佳的為5分鐘。
[0018]本發(fā)明的方法中，具體操作只要使待測樣本能在所述的融合酶反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，測定氨的生成速率即可。
[0019]本發(fā)明的方法中，所述的測定一般在所述的反應(yīng)開始后I~15分鐘內(nèi)完成為宜，最宜在5~10分鐘內(nèi) 完成。
[0020]本發(fā)明中，具體測定的讀點(diǎn)方法可采用速率法或兩點(diǎn)法(也稱固定時間法)，通過參照標(biāo)準(zhǔn)品或繪制標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線等，計算出同型半胱氨酸含量，在此不再贅述。
[0021]上述谷氨酸脫氫酶的反應(yīng)檢測法中，所述的谷氨酸脫氫酶的用量為催化有效量以上，一般可為0.1~50kU/L(U為國際單位)。所述的α -酮戊二酸或其鹽的用量以過量為宜，一般可為I~50mmol/L,較佳的為I~20mmol/L。所述的還原型輔酶的用量以過量為宜，一般可為0.1~lmmol/L,較佳的為0.2~0.3mmol/L。所述的還原型輔酶可為酶學(xué)領(lǐng)域各種具有指示吸光度的還原型輔酶，如NADH、NADPH、硫代NADH或硫代NADPH等。相應(yīng)的，檢測在所選用的還原型輔酶的吸收波長下進(jìn)行。例如，采用NADH或NADPH時，可在340nm下進(jìn)行檢測。采用硫代NADH或硫代NADPH時，特定吸收波長為398nm處，但實際應(yīng)用時，可采用分析儀器上固定設(shè)置的波長，如自動生化分析儀上固定設(shè)置的405nm或410nm下進(jìn)行檢測。
[0022]本發(fā)明的方法可采用常規(guī)儀器進(jìn)行，如紫外/可見光分光光度計分析儀、半自動或全自動生化分析儀。
[0023]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明利用融合酶蛋白穩(wěn)定高效的特點(diǎn)，用于改善同型半胱氨酸的檢測水平，顯著提高了檢測試劑的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。為提高酶學(xué)測定方法開拓了新的領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0024]下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法和條件進(jìn)行。
[0025]實施例1融合酶蛋白的表達(dá)純化
[0026]融合酶蛋白采用柔性連接肽(GGGGS)2，分別應(yīng)用于同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)與腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合，和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)與蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的融合(EC2.5.1.6)，融合基因的構(gòu)建方法均一致:
[0027]設(shè)計第一酶基因帶有EcoR I酶切位點(diǎn)的上游引物，和帶有GGGGS及第二酶基因5’端部分序列的下游引物；設(shè)計帶有GGGGS及第一酶基因3’端部分序列的上游引物，和第二酶基因片段帶有Xhol I酶切位點(diǎn)的下游引物。使用美國ABI梯度PCR儀(Veriti?96)，二者的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件相同(總體積lOOul，其中10*PCR緩沖液10ul，lOOumo/L模板10ul，50umol/L引物各8ul，2.5mM dNTP8ul, 5U/ul TaqDNA聚合酶0.5ul，超純水56ul ；94°C 5min,94°C 30s55°C 30s72°C 60s, 30個循環(huán)，72°C 15分鐘)。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到兩個大片段；以上述兩個大片段互為模板進(jìn)行重疊延伸PCR，通過1.0%瓊脂糖電泳檢測，并用膠回收得到目的片段；將上述目的片段與表達(dá)載體經(jīng)過酶切后連接，構(gòu)建pET-30a表達(dá)載體。按構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21表達(dá)宿主菌中。
[0028]融合酶蛋白采用剛性連接肽(EAAAK)2，分別應(yīng)用于同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)與腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合，和腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)與蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的融合(EC2.5.1.6)，融合基因的構(gòu)建方法一致:
[0029]設(shè)計第一酶基因帶有EcoR I酶切位點(diǎn)的上游引物，和帶有(EAAAK)2及部分第二酶基因5’端部分序列的下游引物；設(shè)計帶有(EAAAK)2及部分第一酶基因3’端部分序列的上游引物，和第二酶基因片段帶有Xhol I酶切位點(diǎn)的下游引物。使用美國ABI梯度PCR儀(Veriti?96)，二者的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件相同(總體積lOOul，其中10*PCR緩沖液10ul，100umo/L 模板 10ul，50umol/L 引物各 8ul，2.5mM dNTP8ul, 5U/ul TaqDNA 聚合酶 0.5ul，超純水 56ul ;94°C 5min，94°C 30s55°C 30s72°C 608，30個循環(huán)，721: 15 分鐘)。經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增得到兩個大片段；以上述兩個大片段互為模板進(jìn)行重疊延伸PCR，通過1.0%瓊脂糖電泳檢測，并用膠回收得到目的片段；將上述目的片段與表達(dá)載體經(jīng)過酶切后連接，構(gòu)建pET-30a表達(dá)載體。按構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21表達(dá)宿主菌中。
[0030]在上述表達(dá)宿主菌種，分別篩選出陽性含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA作菌落PCR驗證，挑取驗證正確陽性重組子，接種到有抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌液按照1: 100的比例接種到有抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。37°C，200rpm, 4h。使培養(yǎng)液的0D600達(dá)0.4~0.6，當(dāng)細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期后加IPTG至終濃度為lmmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)3~5小時。取上述培養(yǎng)液lmL，3500rpm離心I分鐘，沉淀，加20 μ L聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液(含lOOmmol/L Tris緩沖液，pH6.8，20% β-ΜΕ,4% SDS,
0.2%溴酚藍(lán)和20%甘油)后，作SDS-PAGE檢測。選取有目的蛋白表達(dá)的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，表達(dá)目的蛋白。
[0031]融合酶蛋白的提取純化
[0032]將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液4°C，5000rpm離心15分鐘，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液。棄上清，每克濕菌約加PBS緩沖液(含137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，IOmM磷酸氫二鈉和2mM磷酸二氫鉀)清洗三次后，用PBS懸浮菌體。菌液經(jīng)超聲破碎至菌液由渾濁至澄清后，12000rpm離心15分鐘,收集上清。置于_20°C保存或進(jìn)行分離純化。
[0033]將上述樣 品經(jīng)過0.45 μ m濾膜過濾后上樣進(jìn)行親和層析純化。取一只潔凈的25mL體積的純化柱，超聲清洗后用蒸餾水對其輕柔的洗滌數(shù)次，防止濾膜受損，取IOmL的NiSepharose6FF介質(zhì)填入柱子中，用30_50ml的蒸懼水對純化系統(tǒng)進(jìn)行洗漆。用30~50mL結(jié)合緩沖液平衡介質(zhì)，然后把處理好的上柱樣品溶液緩慢的以固定流速泵入到純化柱中，在4°C條件下，使溶液以lmL/min的速度流下，當(dāng)樣品上樣結(jié)束后，用結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗滌，使非特異性結(jié)合蛋白洗脫下來。再用30~50mL的20%洗脫緩沖液沖洗非目的蛋白，然后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，用1.5mL離心管收集洗脫液。
[0034]采用上述方法，分別獲得以下四種融合酶:
[0035]1、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-(GGGGS) 2_腺苷同型半胱氨酸酶，簡稱H-G-Aase ；
[0036]2、腺苷同型半胱氨酸酶-(GGGGS)2-蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶,簡稱A-G-Mase ；
[0037]3、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-(EAAAK)2-腺苷同型半胱氨酸酶,簡稱H-E-Aase ；
[0038]4、腺苷同型半胱氨酸酶-(EAAAK)2-蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶，簡稱A-E-Mase。
[0039]實施例2利用融合酶制備的試劑與普通酶循環(huán)試劑檢測準(zhǔn)確度的比較
[0040]利用融合酶制備的試劑含有如下組分:
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種同型半胱氨酸濃度的測定方法及其檢測試劑，其特征在于其被測底物同型半胱氨酸經(jīng)基因融合酶催化生成產(chǎn)物腺苷，該腺苷產(chǎn)生的速率與樣本中同型半胱氨酸的含量成正比，通過測定腺苷的方法，可以得出樣本中同型半胱氨酸的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的基因融合酶是指:同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)與腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)的融合酶；腺苷同型半胱氨酸酶(EC3.3.1.1)與蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(EC2.5.1.6)的融合酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的測定腺苷的方法是指氨測定方法，其試劑除包含權(quán)利要求2所指的融合酶蛋白外，還應(yīng)包含:腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶、α -酮戊二酸和還原型輔酶I或還原型輔酶II或其類似物等物質(zhì)。
4.如權(quán)利 求1所述的方法，其特征在于:所述的檢測試劑為ΡΗ6~9的緩沖液體系；所述的緩沖液較佳的為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或Ν-(2-羥乙基)哌嗪-Ν’-(2-乙基磺酸)緩沖液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的檢測試劑中還包括酶穩(wěn)定劑； 所述的酶穩(wěn)定劑較佳的為甘露糖醇、甘油、鉀離子、鈉離子、牛血清白蛋白、表面活性劑和防腐劑中的一種或多種。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的檢測試劑是單一液體試劑。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的檢測試劑是分為第一和第二部分的兩部分液體試劑。
【文檔編號】C12Q1/48GK103981251SQ201310051366
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月7日
【發(fā)明者】王學(xué)忠 申請人:王學(xué)忠, 黃秋連