專利名稱：一種碳-Fe₃O₄納米細胞固定材料及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細胞固定材料,特別涉及一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料及其制備方法及其在細胞固定中的應用。
為一種用于細胞固定的新型材料及其大規(guī)模制備方法。利用該方法可以大規(guī)模地制備納米細胞固定材料。所得到的納米細胞固定材料為具有磁性的納米材料，對于巧克力微桿菌等具有很強的吸附性，且細菌在其上可保持功能不變。利用磁場，可方便、高效地回收此材料，因而大大地簡化了發(fā)酵生產(chǎn)中的產(chǎn)品分離過程，在生物醫(yī)藥的發(fā)酵生產(chǎn)領域中具有廣闊的應用前景。
背景技術：
生物醫(yī)藥在癌癥、愛滋病、冠心病、貧血、骨質疏松、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纖維變性和罕見遺傳疾病等惡性病癥的醫(yī)治中顯示出巨大的市場潛力和良好的發(fā)展前景，引起了世人的廣泛關注。
目前，發(fā)酵工程已成為了生物醫(yī)藥的重要分支。它利用微生物自身代謝來產(chǎn)生相關藥物，具有簡便，易控，易擴大生產(chǎn)等優(yōu)點，在降低生產(chǎn)成本、新藥開發(fā)、昂貴藥品的大規(guī)模生產(chǎn)等方面得到了廣泛應用，有可能成為生物醫(yī)藥的主要生產(chǎn)方法。但是，發(fā)酵生產(chǎn)中的分離過程目前還比較繁瑣，需要進一步改進。為此，人們進行了大量的研究，并取得了一些成果。尤其是利用納米技術，通過將工程菌固定在磁性納米材料上，可以使分離過程大大簡化。
目前，文獻報道的磁性納米細胞固定材料主要是Fe3O4納米粒子細胞固定材料，其應用時，即利用化學試劑如戊二醛等直接將細胞固定在Fe3O4納米粒子細胞固定材料上，由于化學試劑有一定的毒性作用，因而導致所固定的細胞的活性并不理想。此外，制備Fe3O4 納米粒子細胞固定材料的方法大都存在著:產(chǎn)量較低、反應條件苛刻、反應時間長、成本較高等缺點，很難進行大規(guī)模生產(chǎn)。這限制了其在實際中的應用。
因此，開發(fā)一種新型納米細胞固定材料，并建立一條操作簡單、成本低廉、反應條件溫和、可大規(guī)模制備的納米細胞固定材料制備路線對于其應用具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了解決現(xiàn)有技術中的Fe3O4納米粒子細胞固定材料固定的細胞的活性并不理想等技術問題而提供一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料,該碳-Fe3O4納米細胞固定材料對細胞無毒害，固定的細胞的活性高。
本發(fā)明的目的之二是為了提供上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法。該制備方法具有產(chǎn)率高、反應條件溫和、操作簡便、生產(chǎn)成本低等特點。
本發(fā)明的目的之三在于提供上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料在細胞固定方面的應用。
本發(fā)明的技術 方案一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C復合而成的納米材料，其中Fe3O4和C 的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe:C為1:0.18-0.25。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將對苯二甲酸、鐵鹽、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即鐵鹽中的鐵:對苯二甲酸: 二甲基甲酰胺為2-4:1:4的比例混合后攪拌均勻，制得前驅體溶液；所述的鐵鹽為硫酸亞鐵、硝酸亞鐵、氯化亞鐵或醋酸亞鐵；(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液在攪拌下油浴反應，反應過程控制溫度為 90-120°C，時間為 12-30h ；(3)、將步驟(2)反應后所得到的沉淀依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次后，放入二氯甲烷中老化10-15h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)所得的老化后的前驅體控制溫度為40-70°C，時間為10-24h進行真空干燥；(5)、將步驟(4)真空干燥后的固體研磨成粉末，置于管式爐內(nèi)，N2保護下煅燒，煅燒過程控制溫度400-600°C，時間為2-5h，最終得到粒徑為50-120nm的碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料可用于發(fā)酵過程中植物、動物或微生物細胞的固定，其固定率可達100%，在發(fā)酵結束后使用磁鐵即可方便的使固定有植物、動物或微生物細胞的碳-Fe3O4納米細胞固定材料與發(fā)酵液進行分離，從而使發(fā)酵后期的植物、 動物或微生物細胞菌體與發(fā)酵液的分離過程大大簡化。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，由于利用碳作為細胞固定位點材料,避免了其它化學試劑的引入，即對細胞無毒害，因此最終用本發(fā)明所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料所固定的細胞的活性高，且固定過程簡單。
進一步，本發(fā)明的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，由于利用Fe3O4作為磁性材料， 因此最終用本發(fā)明所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料固定細胞后，在分離微生物細胞菌體時，利用磁鐵可將最終用本發(fā)明所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料所固定的細胞和發(fā)酵液直接進行分離，避免了攪拌等操作對細胞和載體材料的破壞，簡化了分離過程，從而降低了對固定化細胞強度的要求。
另外，本發(fā)明的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具有產(chǎn)率高、反應條件溫和、操作簡便、成本低等特點，并且有可能在生物醫(yī)藥的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中得到應用。


圖1、實施例1所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的TEM圖；圖2、實施例1所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的XPS譜；圖3、實施例1所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的XRD圖。
具體實施方式
下面通過具體實施例并 結合附圖對本發(fā)明進一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
酶活單位⑶定義為:在測定條件下，每分鐘催化生成Iμ mol單甲酯所需要的脂酶量。L0019」 實施例1一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C復合而成的納米材料，其中Fe3O4和C 的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為1:0.2。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將8.348FeSO4.7H20、1.66g對苯二甲酸加入到300mL 二甲基甲酰胺中，攪拌，制得前驅體溶液；其中的對苯二甲酸、FeSO4.7H20、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即FeSO4.7H20中的鐵: 對苯二甲酸:二甲基甲酰胺為3:1:4 ;(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液油浴加熱到105°C，保持該溫度，攪拌下反應24h；(3)、將步驟(2)油浴反應反應結束后，所得沉淀分離后，依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次，然后放入二氯甲烷中老化12h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)老化后的所得的老化后的前驅體置于真空干燥箱中控制溫度60°C干燥 24h ；(5)、將步驟(4)真空干燥后所得的固體研磨成粒度為60-80目的粉末后，置于管式爐中，在N2保護下，控制溫度為550°C煅燒3h，即得碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的形貌由日本電子公司生產(chǎn)的JEM-1400 型透射電子顯微鏡進行掃描，所得的TEM圖如圖1所示，從圖1可以看出所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料為粒徑為50-100nm的納米粒子。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的組成由日本PHI 5000 Versaprobe型 X-射線光電子能譜儀進行測量，所得的XPS譜如圖2所示，從圖2中可以看出該產(chǎn)品為Fe3O4 和C的復合材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的晶相由荷蘭帕納科公司生產(chǎn)的 PANalytical Xpert Pro MRD型X-射線衍射儀進行測量，所得的XRD圖如圖3所示，從圖3 中可以看出該材料中含有Fe3O4納米粒子。
實施例2一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C復合而成的納米材料，其中Fe3O4和C 的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為1:0.2。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將3.54g Fe (NO3) 2、I.6 6g對苯二甲酸加入到300mL 二甲基甲酰胺中，攪拌，制得前驅體溶液；其中的對苯二甲酸、Fe(NO3)2、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即Fe (NO3)2中的鐵:對苯二甲酸:二甲基甲酰胺為3:1:4;(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液油浴加熱到105°C，保持該溫度，攪拌下反應24h；(3)、將步驟(2)油浴反應反應結束后，所得沉淀分離后，依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次，然后放入二氯甲烷中老化12h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)老化后的所得的老化后的前驅體置于真空干燥箱中控制溫度60°C干燥 24h ；(5)、將步驟(4)真空干燥后所得的固體研磨成粒度為60-80目的粉末后，置于管式爐中，在N2保護下，控制溫度為550°C煅燒3h，即得碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的形貌由日本電子公司生產(chǎn)的JEM-1400 型透射電子顯微鏡進行掃描，可以看出所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料為粒徑為60-110nm 的納米粒子。
實施例3一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C的復合而成的納米材料，其中Fe3O4和 C的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為1:0.2。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將3.81g 6(:12、1.668對苯二甲酸加入到3001^二甲基甲酰胺中，攪拌，制得前驅體溶液；其中的對苯二甲酸、FeCl2、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即FeCl2中的鐵:對苯二甲酸: 二甲基甲酰胺為3:1:4;(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液油浴加熱到105°C，保持該溫度，攪拌下反應24h；(3)、將步驟(2)油浴反應反應結束后，所得沉淀分離后，依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次，然后放入二氯甲烷中老化12h ；(4)、將步驟(3)老化后的所得的老化后的前驅體置于真空干燥箱中控制溫度60°C干燥 24h ；(5)、將步驟(4)真空干燥后所得的固體研磨成粒度為60-80目的粉末后，置于管式爐中，在N2保護下，控制溫度為550°C煅燒3h，即得碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的形貌由日本電子公司生產(chǎn)的JEM-1400 型透射電子顯微鏡進行掃描，可以看出所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料為粒徑為80-120nm 的納米粒子。
實施例4一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C復合而成的納米材料，其中Fe3O4和C 的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為1:0.2。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將6.06g醋酸亞鐵、1.66g對苯二甲酸加入到300mL二甲基甲酰胺中，攪拌，制得前驅體溶液；其中的對苯二甲酸、醋酸亞鐵、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即醋酸亞鐵中的鐵:對苯二甲酸:二甲基甲酰胺為3:1:4；(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液油浴加熱到105°C，保持該溫度，攪拌下反應24h；(3)、將步驟(2)油浴反應反應結束后，所得沉淀分`離后，依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次，然后放入二氯甲烷中老化12h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)老化后的所得的老化后的前驅體置于真空干燥箱中控制溫度60°C干燥 24h ；(5)、將步驟(4)真空干燥后所得的固體研磨成粒度為60-80目的粉末后，置于管式爐中，在N2保護下，控制溫度為550°C煅燒3h，即得碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的形貌由日本電子公司生產(chǎn)的JEM-1400型透射電子顯微鏡進行掃描，可以看出所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料為粒徑為50-110nm 的納米粒子。
實施例5一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C復合而成的納米材料，其中Fe3O4和C 的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe:C為1:0.18。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將5.568FeSO4.7H20、1.66g對苯二甲酸加入到300mL 二甲基甲酰胺中，攪拌，制得前驅體溶液；其中的對苯二甲酸、FeSO4.7H20、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即FeSO4.7H20中的鐵: 對苯二甲酸:二甲基甲酰胺為2:1:4 ;(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液油浴加熱到120°C，保持該溫度，攪拌下反應12h；(3)、將步驟(2)油浴反應反應結束后，所得沉淀分離后，依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次，然后放入二氯甲烷中老化10h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)老化后的所得的老化后的前驅體置于真空干燥箱中控制溫度40°C干燥 18h ；(5)、將步驟(4)真空干燥后所得的固體研磨成粒度為60-80目的粉末后，置于管式爐中，在N2保護下，控制溫度為400°C煅燒5h，即得碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的形貌由日本電子公司生產(chǎn)的JEM-1400 型透射電子顯微鏡進行掃描，可以看出所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料為粒徑為60-110nm 的納米粒子。
實施例6 一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和C復合而成的納米材料，其中Fe3O4和C 的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為I:0.25。
上述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法，具體包括如下步驟:(1)、將11.12g FeS04*7H20、1.66g對苯二甲酸加入到300mL 二甲基甲酰胺中，攪拌，制得前驅體溶液；其中的對苯二甲酸、FeSO4.7H20、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即FeSO4.7H20中的鐵: 對苯二甲酸:二甲基甲酰胺為4:1:1;(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液油浴加熱到90°C，保持該溫度，攪拌下反應30h；(3)、將步驟(2)油浴反應反應結束后，所得沉淀分離后，依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次，然后放入二氯甲烷中老化15h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)老化后的所得的老化后的前驅體置于真空干燥箱中控制溫度70°C干燥 IOh ；(5)、將步驟(4)真空干燥后所得的固體研磨成粒度為60-80目的粉末后，置于管式爐中，在N2保護下，控制溫度為600°C煅燒2h，即得碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
上述所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的形貌由日本電子公司生產(chǎn)的JEM-1400 型透射電子顯微鏡進行掃描，可以看出所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料為粒徑為70-120nm 的納米粒子。
上述實施例2-6中所得碳-Fe3O4納米細胞固定材料均經(jīng)XPS、XRD檢測，所得結果與實施例1中的結果基本一致。
應用實施例1利用實施例1所得的碳-Fe3O4納米細胞固定材料對巧克力微桿菌(SIT101CGMCC N0.4436)細胞進行固定化，步驟如下:(1)、產(chǎn)酯酶細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基為葡萄糖2%、蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，水97%，pH7.0，在250mL三角瓶中裝液 50mL, 121°C滅菌30min，滅菌后冷卻接種巧克力微桿菌(SIT101CGMCC N0.4436)斜面種子， 30°C 培養(yǎng) 48h ；(2)、細胞固定化取一定量巧克力微桿菌(SIT101CGMCC N0.4436)細胞溶于IOml 0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸鹽緩沖液中，即得含有一定巧克力微桿菌細胞的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下測定OD為Atl ;將200mg碳-Fe3O4納米細胞固定材料置于錐形瓶，用0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸鹽緩沖充分溶脹12h，先用0.1Μ，ρΗ7.0的緩沖液，再用去離子水洗滌干凈，然后將上述的含有一定巧克力微桿菌細胞的磷酸鹽緩沖溶液IOml加入其中，震蕩吸附4h，即得含有吸附巧克力微桿菌細胞的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的磷酸鹽緩沖溶液，用磁鐵吸附除去固定有巧克力微桿菌細胞的碳-Fe3O4納米細胞固定材料，剩余液室溫下測定OD為A1 ;碳-Fe3O4納米細胞固定材料的吸附率AD= (Atl -A1VAcixIOi^AD值越大，說明吸附后的剩余液中含巧克力微桿菌細胞越少，吸附效果越好，將吸附有巧克力微桿菌細胞的碳-Fe3O4 納米細胞固定材料置于4°C冰箱內(nèi)，備用；(3)、酶活測定取固定有干重IOmg巧克力微桿菌細胞的碳-Fe3O4納米細 胞固定材料，以950 μ L磷酸鹽緩沖液(0.2Μ, ρΗ8.0)重新懸浮，加入50 μ L 二酸二酯/ 二甲基亞砜(DMSO)溶液，使反應體系中二酸二酯/DMSO溶液最終濃度為10 mM,渦旋振蕩，反應條件為180 rpm, 30°C，30 min,加入2mL甲醇終止反應,潤旋震蕩30s,取ImL混合液離心(常溫，120000rpm, IOmin), 使用高效液相色譜測定二酸二酯轉變?yōu)閱熙サ霓D化速度，進一步計算比酶活為1.26U/g ； 上述的高效液相色譜條件，流動相為甲醇:水為65:35，流速:1.0ml/min, C18柱。
最終測定的結果如下表:
權利要求
1.一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料,其特征在于所述的碳-Fe3O4納米細胞固定材料即由Fe3O4和C復合而成納米材料，其中Fe3O4和C的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為 I:0.18-0.25。
2.如權利要求1所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，其特征在于Fe3O4和C的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe:C為1:0.18。
3.如權利要求1所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，其特征在于Fe3O4和C的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為1:0.2。
4.如權利要求1所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，其特征在于Fe3O4和C的量按摩爾比計算，即Fe3O4中的Fe: C為I:0.25。
5.如權利要求1、2、3或4所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料,其特征在于所述的碳-Fe3O4納米細胞固定材料的粒徑為50-120nm。
6.如權利要求1、2、3或4所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法,其特征在于具體包括如下步驟:(1)、將對苯二甲酸、鐵鹽、二甲基甲酰胺按摩爾比計算，即鐵鹽中的鐵:對苯二甲酸: 二甲基甲酰胺為2-4:1:4的比例混合后攪拌均勻，制得前驅體溶液；所述的鐵鹽為硫酸亞鐵、硝酸亞鐵、氯化亞鐵或醋酸亞鐵；(2)、將步驟(I)所得的前驅體溶液在攪拌下油浴反應，反應過程控制溫度為 90-120°C，時間為 12-30h ；(3)、將步驟(2)反應后所得到的沉淀依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次后，放入二氯甲烷中老化10-15h，即得老化后的前驅體；(4)、將步驟(3)所得的老化后的前驅體控制溫度為40-70°C，時間為10-24h進行真空干燥；(5)、將步驟(4)真空干燥后的固體研磨成粉末，置于管式爐內(nèi)，N2保護下進行煅燒 2-5h，最終得到一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料。
7.如權利要求6所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料的制備方法,其特征在于步驟(5)中所述的煅燒控制溫度為400-600°C。
8.如權利 要求1、2、3或4所述的一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料在發(fā)酵過程中植物、 動物或微生物細胞固定中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料，即由Fe3O4和Ｃ的復合而成的粒徑為50-120nm的納米材料，按摩爾比計算即Fe3O4中的FeＣ為10.18-0.25。其制備方法即將對苯二甲酸、鐵鹽和二甲基甲酰胺混合后攪拌均勻進行油浴反應，反應后所得到的沉淀依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗滌3次后，放入二氯甲烷中老化，老化后的前驅體真空干燥、研磨、N2保護下煅燒，最終得到一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料。本發(fā)明的碳-Fe3O4納米細胞固定材料在生物醫(yī)藥的發(fā)酵生產(chǎn)領域中將具有廣闊的應用前景，所固定的細胞的活性高。細胞固定工藝,簡化了分離過程，從而降低了對固定化細胞強度的要求。
文檔編號C12N11/14GK103205413SQ201310097549
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月26日 優(yōu)先權日2013年3月26日
發(fā)明者康詩釗, 薄林園, 李向清, 穆勁, 徐毅, 周音卉, 許林菊 申請人:上海應用技術學院