專利名稱：用于深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.生產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及用于深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)生產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
嗜熱海洋微生物是來源于地?zé)岷偷刭|(zhì)層、深?；鹕侥?、深海熱液口等特殊環(huán)境的一類嗜熱微生物資源。嗜熱微生物因其對高溫獨(dú)特的適應(yīng)性而備受人們關(guān)注，一般是指最適生長溫度大于45°C的一類微生物。作為嗜熱微生物，其主要應(yīng)用之一是嗜熱酶的開發(fā)應(yīng)用。嗜熱酶因其熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)而備受矚目，其中最有名的就是Tag酶的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，使得PCR反應(yīng)這一革命性的技術(shù)發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域最為重要的技術(shù)之一。目前已知的從嗜熱菌中分離出來的酶具高熱穩(wěn)定性、傳質(zhì)速率高、耐化學(xué)變性劑、易于純化等特點(diǎn)。深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.4j，是由是由中國海洋第三研究所首次分離得到的、來源于深海、最適生長溫度在60°C的一種中度嗜熱微生物。由于其來源于深海這一極端環(huán)境，對溶氧、高鹽、高溫、高壓等環(huán)境條件可能會有特殊的生理相應(yīng)。在應(yīng)用方面，Geobacillus sp.4j目前發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生降解淀粉的淀粉酶。該種淀粉酶的活性和熱穩(wěn)定性等有待進(jìn)一步探索，而能否用于工業(yè)化生產(chǎn)一種新型淀粉酶也值得研究。然而,嗜熱菌Geobacillus sp.4j在原始培養(yǎng)基中生長淀粉酶的產(chǎn)量很低,成為各項研究的瓶頸，特別在其規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酶的領(lǐng)域。如果不能提高淀粉酶的產(chǎn)量，就很難進(jìn)行相應(yīng)的酶學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)的探索。因此，通過優(yōu)化其培養(yǎng)環(huán)境、改善其發(fā)酵工藝成為當(dāng)務(wù)之急。培養(yǎng)基是微生物生長的基質(zhì)，開發(fā)一種用于深?！ずＱ笫葻峒?xì)菌Geobacillus sp.4j生產(chǎn)淀粉酶的新型培養(yǎng)基是目前工作的重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.生產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)基，其制備方法及應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括以下組分:可溶性淀粉4-20 g/L;
酵粉2-12 g/L；
硝酸鈉2-12 g/L;
漢化鈉5-25 g/L;
i:水硫酸鎂0」-4g/L;
氯化鏷0.1-12 g/L；
鉍化街10.01-2 g/L；
M+化鈣0.01-2 g/L;
磷酸氫二鉀0.02-2 g/L
硫酸亞鐵銨0.001 -0.1 g/L；和
Ilftflii0.000 卜 0.001 g/L O在一個優(yōu)選例中，所述的深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.是Geobacillussp.4 j。在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分:
溶性淀粉4-15 g/L；
酵叫:粉3-10 g/L；
硝酸鈉3-10 g/L；
+ 化鈉8-21 g/L；
水硫酸鎂0.5-2J g/L；
+ 化鉉0.2-10 g/L；
氯化鉀0.1-1 g/L + (化鈣0.05-1 g/L
!酸氣二卿0.1-1 g/Li
硫酸、IE鐵鑛0.005-0.05 g/L! _
+ 化鎳0.0003-0.00! g/L ο在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基包括以下組分:可溶性淀粉6 g/L;
酵付粉8 g/L;
硝酸鈉5 g/L;
M化鈉12.5 g/L；
無水硫酸錢1.67 g/L;
氯化鎂0.32 g/L；
iiC化鉀0.33 g/L；
誠化鈣Cl6g/L;
磷酸氫二卿0.484 g/L；
硫酸亞鐵銨0.01 g/L;和
氣化媒0.0005 g/L；其中，各組分在培養(yǎng)基中的含量可在±10%(更佳地±5%)范圍內(nèi)浮動。在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中，還含有有效量(適于細(xì)菌生長的量)的微量元
素；較佳地，微量元素含量為:
氨三乙酸0.0128-0.256 g/L;
四水合氣化'IR鐵0.001 -0.02 g/L；
四水合氯化猛0.0005-0.01 g/L；
m 水合就化鈷0.0003-0.0( g/L ；:水介就化錒0.00005-0.001 g/L;
1.1 酸_0.00005-0,001 g/L；
碉酸().()()002-0.00()4 g/L； fi!
/\.水 fr Ul 化媒0.00002-0.0004 g/L O在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中，各組分配制于水(較佳地，所述的水是去離子水)中；和/或所述培養(yǎng)基的pH值6±0.5。在本發(fā)明的另一方面，提供前面任一所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.,生產(chǎn)淀粉酶。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備前面任一所述的深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基的方法，所述方法包括: (a)將所述可溶性淀粉進(jìn)行糊化，冷卻；(b)將所述酵母粉、硝酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨混合；(c)將上述兩步驟得到的溶液混合均勻，添加氯化鎳溶液以及可選的微量元素；其中，各組分的用量按照前面任一所述。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述糊化為用少量水(較佳地為去離子水)將所述可溶性淀粉制成懸濁液，然后緩慢倒入90-10(TC去離子水并不斷攪拌，制成半透明狀液體。在另一優(yōu)選例中，步驟(C)之后，進(jìn)一步包括:將pH調(diào)至6±0.5，在121°C滅菌20_30mino在本發(fā)明的另一方面，提供一種利用深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.生產(chǎn)淀粉酶的方法，所述方法包括:利用前面任一所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.,從而生產(chǎn)淀粉酶。在一個優(yōu)選例中，將深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.按體積比1_5%的接種量接種入前面任一所述的培養(yǎng)基，60°C、靜置狀態(tài)下發(fā)酵培養(yǎng)72-96h，靜置培養(yǎng)過程中每隔12h進(jìn)行一次振蕩處理，將培養(yǎng)菌液混勻；培養(yǎng)72h和96h后，離心分離發(fā)酵上清液，其中含有淀粉酶。在另一優(yōu)選例中，用于接種的種子液的0D_為1.8-2.4，菌落數(shù)密度約為2.1Χ106-2.8X106CFU/ml。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的試劑盒，所述試劑盒中包括:前面任一所述的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，研究開發(fā)了一種新的適合于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)使之高效生產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)基配方。本發(fā)明的培養(yǎng)基，適合于深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的生長，且可大大地提高淀粉酶的產(chǎn)量。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。術(shù)語“本發(fā)明的深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基”指含有可溶性淀粉、酵母粉、硝酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳和可選的微量元素的組合物；或基本上由可溶性淀粉、酵母粉、硝酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳和可選的微量元素組成的組合物。在組合物中，所述的可溶性淀粉、酵母粉、硝酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨、氯化鎳和可選的微量元素占培養(yǎng)基總重量的80-100%，較佳地占 90-100%，更佳地占 95-100%，如 98%，99%。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillussp.(更佳地是Geobacillus sp.4j)培養(yǎng)基的各組分的用量如表I所示。
表權(quán)利要求
1.一種深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括以下組分: 可溶性淀 4-20 g/L； _母 2-12 g/L； Λ酸她2-12 g/L； 氣化鈉5-25 g/L; 無水硫酸鎂0.1-4 g/L； 氣化鎂0.1-12 g/L; 鉍化鉀0.01-2 g/L； 氯ftll0.01-2 g/L； 磷酸Μ —:鉀0.02-2 g/L; 硫酸亞鐵銨0.00〗 -0.1 g/L；和 氯化鎳0.0001-0.001 g/L ο
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括以下組分: 可溶性淀粉4-15 g/L； 酵母粉3-10 g/L; 硝酸鈉3-10 g/Li G(化鈉8-21 g/L .尤水硫酸.0.5-2.5 g/L； 氯化錢0.2-10 g/L； ^ 化鉀0.1-1 g/L； (,I(化鈣0.05-1 g/L； 磷酸W:鉀0.1-1 g/L; 硫酸《鐵銨0.005-0.05 g/L;和 氯化鎳0.0003-0.001 g/Lo
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括以下組分:可溶ft淀粉6 g/L;酵母粉8 g/L;硝酸鈉5 g/L;iC化鈉12.5 g/L；尤水硫酸鎂1.67 g/L；氯化鎂0.32 g/L；氯ft鉀0.33 g/L；氯ft#50.6 g/L；鱗酸氫二卿0.484 g/L;硫Pt 德鑛0.01 g/L；和氣化鎳0.0005 g/L； 其中，各組分在培養(yǎng)基中的含量可在±10%范圍內(nèi)浮動。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中，還含有有效量的微量元素；較佳地，微量元素含量為:氨二乙酸0.0128-0.256 g/L;水合 St 化 'IR鐵0.001 -0.02 g/L；_ 水合 St 化錳0,0005-0.01 g/L;水合 St 化鈷0.0003-0.006 g/L；———————:水合 St 化銅0.00005-0.001 g/L；鉬酸鈉0.00005-0.001 g/L；翻酸0.00002-0.0004 g/L；和六水合 IC化鎳0.00002-0.0004 g/Lt!
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中，各組分配制于水中；和/或 所述培養(yǎng)基的pH值6±0.5。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillussp.，生產(chǎn)淀粉酶。
7.一種制備權(quán)利要求1-5任一所述的深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的培養(yǎng)基的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)將所述可溶性淀粉進(jìn)行糊化，冷卻； (b)將所述酵母粉、硝酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨混合； (C)將上述兩步驟得到的溶液混合均勻，添加氯化鎳溶液以及可選的微量元素；其中，各組分的用量按照權(quán)利要求1-5任一所述。
8.—種利用深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.生產(chǎn)淀粉酶的方法,其特征在于,所述方法包括:利用權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillussp.，從而生產(chǎn)淀粉酶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,將深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillussp.按體積比1-5%的接種量接種入權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基，60°C、靜置狀態(tài)下發(fā)酵培養(yǎng)72_96h,靜置培養(yǎng)過程中每隔12h進(jìn)行一次振蕩處理,將培養(yǎng)菌液混勻；培養(yǎng)72h和96h后，離心分離發(fā)酵上清液，其中含有淀粉酶。
10.一種用于培養(yǎng)深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中包括:權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.生產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基，適合于深海海洋嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.的生長，且可大大地提高淀粉酶的產(chǎn)量。
文檔編號C12R1/01GK103232983SQ201310169378
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者周祥山, 蔣濤, 蔡孟浩, 張元興 申請人:華東理工大學(xué)