一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法及其在抗前列腺癌中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種菲律賓蛤仔寡肽，其氨基酸序列為Asp-Trp-Pro-His，公開了該種寡肽的制備方法，即利用胰蛋白酶酶解獲得目標(biāo)寡肽酶解液，再經(jīng)超濾、陰離子交換、及反相高效液相色譜進(jìn)一步分離純化獲得目標(biāo)寡肽；同時還公開了該種寡肽在抗前列腺癌中的應(yīng)用，具體的，可有效抑制體外培養(yǎng)前列腺癌PC-3、DU-145細(xì)胞生長，誘導(dǎo)凋亡，改變細(xì)胞周期。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備菲律賓蛤仔寡肽的方法，工藝過程簡單，雜質(zhì)少，效率高，同時在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，揭示了該種寡肽在抗前列腺癌上的效用。
【專利說明】一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法及其在抗前列腺癌中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菲律賓蛤仔寡肽，尤其涉及這種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法及其 在抗前列腺癌領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum)屬軟體動物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科，一 種廣溫性的小型雙殼貝類，南方俗稱花蛤，與牡蠣、縊蟶、蚶類并列為我國四大養(yǎng)殖貝類，是 近岸灘涂和淺海的主要貝類之一，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白含量高。
[0003] 研究表明，菲律賓蛤仔提取物具有很多生理功效，如抗腫瘤、抗氧化、抑菌和增強(qiáng) 免疫力等，近年來對菲律賓蛤仔提取物的抗腫瘤研究有很大進(jìn)展，如范秀萍等(食品工業(yè) 科技，2003)利用菲律賓蛤仔糖胺聚糖的粗制品（CRG)作用于體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞，發(fā) 現(xiàn)CRG在I. Omg/ml濃度下對HL-60細(xì)胞具有顯著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分別 可達(dá)59. 8%、67. 7%和96. 2%。張莉等(海洋與湖沼，2007)利用菲律賓蛤仔肉提取兩種蛋白 聚糖PGl和PG2,其中PGl在200ug/ml濃度時對人肝癌細(xì)胞SMMC7721的生長抑制率達(dá)到 73. 30%，且不影響人正常肝細(xì)胞HL-7002的生長與功能。前列腺癌是男性最常見的惡性腫 瘤之一，在歐美國家由前列腺癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)占惡性腫瘤引起死亡人數(shù)的第二位，僅次 于肺癌。近年來隨著人民平均壽命的延長和診斷技術(shù)的提高，我國前列腺癌的發(fā)病率呈顯 著增長的趨勢，已經(jīng)嚴(yán)重影響著我國50歲以上男性的生活質(zhì)量和壽命，成為泌尿外科領(lǐng)域 一個越來越重要的研究課題，但關(guān)于菲律賓蛤仔活性提取物對前列腺癌癌細(xì)胞抑制作用的 報道較少，且關(guān)于菲律賓蛤仔活性肽的抗前列腺癌上的應(yīng)用的更少。
[0004] 目前，生物活性肽的制備主要有三種方式：一是從自然界的生物體中提取其本身 固有的各種天然活性肽類物質(zhì)；二是通過蛋白質(zhì)降解的途徑獲得具有各種生理功能的生 物活性物質(zhì)；三是利用生物合成的方法來制備生物活性肽。其中，第一種方式中自然界生 物體重活性肽類物質(zhì)的含量較低，提取過程中產(chǎn)率較低，且需要較多的原料個體，使得成本 較高；第三種方式中生物合成的過程復(fù)雜難控，中間產(chǎn)物較多，不適合大規(guī)模產(chǎn)生；綜合而 言，由于蛋白酶的酶解特異性和高效性，使得酶解法制取生物活性肽的方法安全性高，產(chǎn)率 商。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種利用蛋白酶酶解法制備 菲律賓蛤仔寡肽的方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供該種菲律賓蛤仔寡肽在抗前列腺癌中 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方 法，其特征在于包括以下步驟 ：
[0008] ①將菲律賓蛤仔洗凈，取肉后加超純水?dāng)嚢?，然后去雜質(zhì)勻漿，制得勻漿樣品；
[0009] ②取適量的所述勻漿樣品，加入適量體積的超純水，此時原料與超純水的比值為 1:1?1:4,加入蛋白酶在水浴箱中進(jìn)行酶解反應(yīng)，其中加酶量為300ug?1500ug，酶解反 應(yīng)的pH值為8?9,酶解時間為4h?12h，酶解溫度為40°C?60°C ;
[0010] ③酶解反應(yīng)結(jié)束后滅活、離心、取上清液備用；
[0011] ④將所述上清液加入超濾膜中進(jìn)行超濾，收集分子量小于3KDa的酶解物質(zhì)進(jìn)行 冷凍干燥備用；
[0012] ⑤利用DEAE S印haroseFF陰離子交換，采用磷酸緩沖液和NaCl溶液對所得酶解 液進(jìn)行階段洗脫，在280nm波長處收集最高肽峰冷凍干燥后貯存?zhèn)溆茫?br> [0013] ⑥將DEAE S印haroseFF陰離子交換收集的最高肽峰利用反相高效液相色譜法進(jìn) 行進(jìn)一步純化，在220nm波長處出現(xiàn)唯一峰，收集該峰，冷凍干燥制得所述菲律賓蛤仔寡 肽。
[0014] 作為優(yōu)選，所述原料與超純水的比值為1:2,這樣可使原料在水溶液中充分分離， 在不過分稀釋蛋白酶濃度的前提下，增加了蛋白酶與酶解對象的接觸面積，提高了酶解效 率，同時也可保證原料的生物活性。
[0015] 所述蛋白酶可有多種選擇，作為優(yōu)選，所述蛋白酶為胰蛋白酶，且蛋白酶的最佳酶 解條件組合為：加酶量為1200ug，酶解pH值為8. 0,酶解時間為8h，酶解溫度為50°C。
[0016] 作為優(yōu)選，所述步驟③中為沸水浴中滅活15min，4°C下10000r/min離心15min，沸 水浴即KKTC可使蛋白酶充分滅活，且4°C下高速離心可保證酶解液中相關(guān)物質(zhì)的生物活 性。
[0017] 所述步驟⑤中NaCl溶液的濃度為0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L三種，可對酶解 液分階段進(jìn)行充分洗脫。
[0018] 所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為C18反相柱，填料為0DS，流動相為乙 腈與水（15:85)，流速為0.81111.1^11_ 1，上樣體積為2〇111，檢測波長為22〇11111，洗脫條件為15% 乙腈,20min。
[0019] 由上述方法所得的菲律賓蛤仔寡肽的氨基酸序列為Asp-Trp-Pro-His,該種菲律 賓蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的應(yīng)用，尤其能抑制體外培養(yǎng)前列腺癌PC-3、DU-145細(xì)胞的生 長，作用24h后，PC-3、DU-145細(xì)胞的早、晚期凋亡細(xì)胞便開始增多，且隨著藥液濃度的增 力口，凋亡細(xì)胞逐漸增多。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用胰蛋白酶酶解獲得目標(biāo)寡肽酶解液，再 經(jīng)超濾、陰離子交換、及反相高效液相色譜進(jìn)一步分離純化獲得目標(biāo)寡肽，工藝過程簡單效 率高，且獲得的目標(biāo)寡肽具有抗前列腺癌活性，可有效抑制體外培養(yǎng)前列腺癌PC-3、DU_145 細(xì)胞生長，誘導(dǎo)凋亡，改變細(xì)胞周期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為實(shí)施例1中溫度對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關(guān)系示意圖；
[0022] 圖2為實(shí)施例1中時間對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關(guān)系示意圖；
[0023] 圖3為實(shí)施例1中pH對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關(guān)系示意圖；
[0024] 圖4為實(shí)施例1中加酶量對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關(guān)系示意 圖；
[0025] 圖5為實(shí)施例2中DEAE-s印haroseFF洗脫峰示意圖；
[0026] 圖6為圖5中峰I1經(jīng)RP-HPLC色譜柱洗脫純化結(jié)果示意圖；
[0027] 圖7為目標(biāo)寡肽氨基酸分子結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028] 圖8為實(shí)施例3中PRO對PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用柱狀圖；
[0029] 圖9為實(shí)施例3中DU-145對PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用柱狀圖；
[0030] 圖10為實(shí)施例3中對照組PC-3細(xì)胞Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意圖；
[0031] 圖11為實(shí)施例3中PC-3細(xì)胞經(jīng)10mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意 圖；
[0032] 圖12為實(shí)施例3中PC-3細(xì)胞經(jīng)20mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意 圖；
[0033] 圖13為實(shí)施例3中PC-3細(xì)胞經(jīng)30mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意 圖；
[0034] 圖14為實(shí)施例3中對照組DU-145細(xì)胞Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意圖；
[0035] 圖15為實(shí)施例3中DU-145細(xì)胞經(jīng)10mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意 圖；
[0036] 圖16為實(shí)施例3中DU-145細(xì)胞經(jīng)20mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意 圖；
[0037] 圖17為實(shí)施例3中DU-145細(xì)胞經(jīng)30mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結(jié)果示意 圖；
[0038] 圖18為實(shí)施例3中對照組中PC-3細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0039] 圖19為實(shí)施例3中l(wèi)Omg/mLPRO組中PC-3細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0040] 圖20為實(shí)施例3中20mg/mLPR0組中PC-3細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0041] 圖21為實(shí)施例3中30mg/mLPR0組中PC-3細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0042] 圖22為實(shí)施例3中對照組中DU-145PR0細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0043] 圖23為實(shí)施例3中l(wèi)Omg/mLPRO組中DU-145PR0細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0044] 圖24為實(shí)施例3中20mg/mLPR0組中DU-145PR0細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0045] 圖25為實(shí)施例3中30mg/mLPR0組中DU-145PR0細(xì)胞凋亡率示意圖；
[0046] 圖26為實(shí)施例3中RPO對PC-3細(xì)胞周期影響示意圖；
[0047] 圖27為實(shí)施例3中RPO對DU-145細(xì)胞周期影響示意圖；
[0048] 圖28為實(shí)施例3中對照組PC-3細(xì)胞SubGl峰細(xì)胞凋亡示意圖；
[0049] 圖29為實(shí)施例3中10mg/mLPR0組PC-3SubGl峰細(xì)胞凋亡示意圖；
[0050] 圖30為實(shí)施例3中30mg/mLPR0組PC-3SubGl峰細(xì)胞凋亡示意圖；
[0051] 圖31為實(shí)施例3中對照組DU-145細(xì)胞SubGl峰細(xì)胞凋亡示意圖；
[0052] 圖32為實(shí)施例3中10mg/mLPR0組DU-145細(xì)胞SubGl峰細(xì)胞凋亡示意圖；
[0053] 圖33為實(shí)施例3中30mg/mLPR0組DU-145細(xì)胞SubGl峰細(xì)胞凋亡示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0055] 實(shí)施例I :酶解條件的優(yōu)化
[0056] 蛋白酶的篩選：將新鮮菲律賓蛤仔洗凈后去殼取肉，然后將蛤仔肉放入勻漿機(jī)中， 倒入適量的超純水勻漿。稱取適量勻漿樣品，加入2倍重量的超純水，選用胰蛋白酶、木瓜 蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶作供選酶，采用福臨-酚法測定酶活力（參見楊永芳.貽貝 酶解多肽制備工藝及抗前列腺癌活性研究[D].舟山：浙江海洋學(xué)院，2011)，按照表1所示 蛋白酶各自的最適作用溫度和pH值，加入1000u/g的蛋白酶，酶解反應(yīng)6h，反應(yīng)完成后于沸 水浴滅活15min，冷卻后于4°C，10000r/min預(yù)冷的離心機(jī)離心15min，取上清液備用。
[0057] 樣品酶解液制備完成后，通過酶解液中游離ANN(氨基氮）含量和酶解液腥味值作 為酶的篩選指標(biāo)，ANN含量越高、腥味值越低蛋白酶效果越佳。其中采用甲醛電位滴定法來 測定(參見：楊永芳.貽貝酶解多肽制備工藝及抗前列腺癌活性研究[D].舟山：浙江海洋 學(xué)院，2011.)酶解液中ANN含量，具體方法如下：在60ml的蒸餾水中加入5ml水解液，檢測 pH值。先用0. lmol/L的NaOH溶液滴定pH8. 2,加入已中和的甲醛溶液20ml，記錄滴定至 pH9. 2時所消耗的0. 05mol/LNa0H溶液的體積，計算其含氮量。
[0058] X= (V1-V2) XCX0. 014X100/(5XV)
[0059] 其中：X為樣品中ANN的含量（g/100ml) ;V1為加入甲醛稀釋后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn) 液（ml) ;V2為空白試驗加入甲醛后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液體積（ml) ;V為樣品液取用量（ml); C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mol/L) ;0. 014為氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmoL)。酶解液的腥味評價 及感官評定由10名食品專業(yè)的老師和學(xué)生組成感官評定小組，對菲律賓蛤仔酶解液的腥 味和其他感官特征如顏色、混濁度等進(jìn)行綜合評定。腥味評價以蒸餾水作為參照(無腥味分 值為〇分)，按照腥味很輕、腥味輕、腥味一般、腥味較重和腥味很重5個級別來進(jìn)行評分，滿 分為10分，分?jǐn)?shù)越大，則表明腥味越重，當(dāng)菲律賓蛤仔酶解液的腥味值在4分及以下時認(rèn)為 其可接受。
[0060] 四種蛋白酶酶解菲律賓蛤仔肉后酶解液中的ANN含量和感官腥氣味評價結(jié)果見 表2,從表2可見胰蛋白酶酶解效果最佳，經(jīng)過6h酶解后酶解液中ANN含量最高，且腥味較 輕，在可以接受的范圍之內(nèi)，而且感官顏色也最好；其次是堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶和中性 蛋白酶的酶解效果最差且腥味較重，感官顏色也最差，因此，綜合考慮本實(shí)施例1中選擇胰 蛋白酶作為水解蛋白酶。
[0061] 酶解條件的確定：采用單因素實(shí)驗篩選出胰蛋白酶的最佳作用條件(溫度、時間、 pH、加酶量)，分四組實(shí)驗進(jìn)行。
[0062] 實(shí)驗一：溫度單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，調(diào)節(jié)pH至 8. 0,加入1000u/g的胰蛋白酶，在不同溫度下（40°C，45°C，50°C，55°C，60°C )酶解6h ;
[0063] 實(shí)驗二：時間單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，調(diào)節(jié)pH至 8.0，加入100011/^的胰蛋白酶，在501：下恒溫酶解不同時間（411，611，811，1011，1211) ;
[0064] 實(shí)驗三：pH值單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，不同pH值 (7,7· 5,8,8· 5,9)，加入1000u/g的胰蛋白酶，在50°C下恒溫酶解6h ;
[0065] 實(shí)驗四：加酶量單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，調(diào)節(jié)pH至 8. 0,加入不同量（300u/g，600u/g，900u/g，1200u/g，1500u/g)的胰蛋白酶，在 50°C下恒溫 酶解6h。
[0066] 在初步確定酶解條件的基礎(chǔ)上，選擇酶解時間、溫度、pH值、加酶量四個因素設(shè)立 三個水平設(shè)計正交實(shí)驗L9 (34)正交表，確定胰蛋白酶酶解解菲律賓蛤仔制備寡肽的最佳 酶解條件。
[0067] 實(shí)驗結(jié)果如圖1?4所示，從圖1中可以看出游離ANN含量隨著溫度的升高先是 增加然后達(dá)到一個最大值后接著開始下降，在溫度為40-50°C時不斷地增加，到達(dá)50°C時 達(dá)到最大值，接著隨著溫度升高開始下降，這也正好符合酶促反應(yīng)中溫度對酶活力的變化 規(guī)律；酶解液的腥味隨著溫度的升高不斷下降。因此，綜上考慮，本實(shí)施例最初選擇50°C作 為參考。
[0068] 從圖2中可以得知，酶解液中的ANN含量隨著時間的增加不斷增加，開始增速比較 緩慢，8-10h之間增速突然增大，急劇增加，隨后10-12h之間增速又變得很緩慢。腥味值同 樣隨著時間的增加變小，到達(dá)IOh后隨著時間的推移開始維持不變。因此，本實(shí)施例最初選 取IOh酶解時間作為參考。
[0069] 從圖3可以看出，游離ANN含量隨著pH的升高先增后減，在pH為8. 0時達(dá)到最大， 這也正符合酶活和pH之間的關(guān)系。酶解液的腥味隨著pH的升高與ANN含量和pH的關(guān)系 正好相反，先下降后升高，酶解液在PH值為8. 0時達(dá)到最小，隨后隨著pH升高腥味又增加 且有一定的異味產(chǎn)生。因此，選取pH8. 0最為本實(shí)施例的最初pH值。
[0070] 從圖4中可以得知酶解液中游離ANN含量隨著酶量的增加會不斷地增加，而且增 速由快到慢，酶解液的腥味隨著酶量的增加剛開始會減小達(dá)到一個最小值后又開始增加。 因此，綜合考慮本實(shí)施例選用1200u/g的酶量為最初選用酶量。
[0071] 表3為胰蛋白酶酶解正交實(shí)驗結(jié)果，由表3可知，從酶解液中游離ANN含量可知， 溫度、時間、pH、加酶量四個因素皆會影響胰蛋白酶的酶解效果，其中B (溫度)> D (加酶量） > A (pH) > C (時間），且A2B2C1D3組合效果更好，得到的游離ANN含量最高；從酶解液腥 味值可知看，四種因素的影響也還比較顯著，由極差R'可知知B (溫度）> D (加酶量）=A (PH)=C(時間)，且A2B2C1D2或A2B2C1D3組合效果更好，得到的酶解液腥味值最低。綜合考 慮，得出最佳組合為A2B2C1D3,即蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解pH為8.0,溫度為50°C， 酶解時間為8h，加酶量為1200u/g。在此條件組合下，酶解得到的酶解液中游離ANN含量為 3. 125mg/g，腥味值為7?8之間。
[0072] 為了驗證該優(yōu)化實(shí)驗條件的可靠性，將該優(yōu)化條件參數(shù)放大數(shù)倍，每個實(shí)驗均重 復(fù)3次，測得酶解液中游離ANN含量均值在2. 968mg/g左右，腥味值在7?8之間，驗證了 正交試驗的可靠性。
[0073] 實(shí)施例2 :酶解寡肽的制備與分離純化
[0074]根據(jù)實(shí)施例1獲得的酶解條件制備菲律賓蛤仔寡肽，即：將新鮮菲律賓蛤仔洗凈 后去殼取肉，然后將蛤仔肉放入勻漿機(jī)中，倒入適量的蒸餾水勻漿。稱取適量勻漿樣品，力口 入2倍重量的水，加入1200u/g的胰蛋白酶，于酶解pH8. 0,溫度50°C條件下酶解反應(yīng)8h， 反應(yīng)完成后于沸水浴滅活15min，冷卻后于4°C，10000r/min預(yù)冷的離心機(jī)離心15min，取上 清液。用截取分子量為3KDa的超濾膜，在20°C環(huán)境中超濾Ilh獲得酶解液，冷凍干燥后備 用。用DEAE S印haroseFF陰離子交換，柱型為2. 6X50cm，上樣體積3mL，分別用磷酸緩沖 液、0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為lml/min，280nm 下紫外監(jiān)測，自動部分收集器每管4mL進(jìn)行收集。如圖5所示，取3KDa以下的酶解液經(jīng)DEAE S印haroseFF柱洗脫后，出現(xiàn)2個峰，即峰I (I1)和峰2 (12)，分別為磷酸緩沖液和0· Imol. L-INaCl溶液的洗脫組分，0· 3mol. Γ1和0· 5mol. Γ1的NaCl溶液沒有明顯的洗脫峰。收集 I1，冷凍干燥后得到I. 3g干燥樣品，得率為0. 33%。
[0075] 對收集到的峰I(I1)利用反相高效液相色譜法進(jìn)一步純化及檢測，色譜條件為C18 反相柱，填料為ODS ;柱型是IOX250mm;以乙腈/水（15:85)作為流動相，流速是0.8ml. min-1，上樣體積為20 μ L，波長220nm。洗脫條件為乙腈濃度15%，洗脫時間為20min，重復(fù)上 樣。如圖6所示，保留時間約為6. OOmin時，出現(xiàn)單一峰，峰高為1022. 1，峰面積為5191. 3， 收集該峰，冷凍干燥后得到〇. 37g樣品，得率為0. 1%。
[0076] 氨基酸序列檢測，目標(biāo)肽的氨基酸序列分析檢測采用N末端降解檢測方法， 用氨基酸測序儀進(jìn)行測定，得到菲律賓蛤仔酶解寡肽（Ruditapes philippinarum oligopeptides, RP0)，該目標(biāo)肽的氨基酸序列為：Asp-Trp-Pro-His,分子量為607. 6Da，命 名為菲律賓蛤仔酶解寡肽（Ruditapes philippinarum oligopeptides, RP0)，分子結(jié)構(gòu)式 見圖7。
[0077] 實(shí)施例3 :抗前列腺癌活性檢測
[0078] 前列腺癌PC-3、DU-145細(xì)胞培養(yǎng)：配制1000ml F12培養(yǎng)液，加入I. 176g NaHC03， 各10萬IU的青霉素、鏈霉素，進(jìn)行無菌抽濾，超凈平臺中分裝后于-20°c冰箱中低溫保存， 臨用前IOOml培養(yǎng)液中每加入IOml的胎牛血清。常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌PC-3、DU-145細(xì)胞 株，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2?3天傳代一次。
[0079] 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗：采用MTT法檢測體外培養(yǎng)前列腺癌PC-3、DU_145細(xì)胞存活率。 實(shí)驗時選用細(xì)胞生長到80%以上且形態(tài)較好，處于對數(shù)生長期的PC-3、DU-145細(xì)胞懸液， 以I X 104/mL接種至96孔板，每孔200 μ 1，培養(yǎng)24h后吸棄上清液。設(shè)對照組及10mg/mL、 15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL和30mg/mL RPO加藥組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h和 72h后棄培養(yǎng)液，加藥組加入200 μ Ilmg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄MTT，每孔加入150 μ 1 的DMS0,振蕩10min，置酶標(biāo)儀在490nm波長處測吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)（IR),實(shí)驗 重復(fù)3次，IR=[(對照組A值-加藥組A值）/(對照組A值-調(diào)零孔A值]X 100%。如圖8 和圖9所示，經(jīng)不同濃度的RPO分別作用于PC-3、DU145細(xì)胞后，結(jié)果表明隨著RPO濃度的 增加和作用時間的延長，增殖抑制指數(shù)明顯上升，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05)。因 此，MTT結(jié)果顯示PC-3、DU-145細(xì)胞經(jīng)RPO作用后，呈現(xiàn)出明顯的增殖抑制現(xiàn)象，并隨著藥 物濃度的增加和作用時間的延長，抑制指數(shù)明顯增加，與時間和劑量呈依賴性。
[0080] Α0/ΕΒ熒光染色：于6孔培養(yǎng)板內(nèi)放入經(jīng)經(jīng)處理過的蓋玻片，將PC-3、DU-145細(xì) 胞濃度調(diào)至IX 105/mL，接種于培養(yǎng)板中的蓋玻片上，每孔2ml，24h后觀察并換液，設(shè)立對 照組及10mg/mL、20mg/mL、30mg/mLRP0加藥組，24h后用PBS清洗3次，再用95%乙醇固定 30min。取AO和EB各Img分別溶解于IOml ρΗ7· 2的PBS緩沖液中，搖勻混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，避 光保存。觀察前于載玻片上滴加40 μ I PBS和10 μ I Α0/ΕΒ混合液，10X20熒光顯微鏡下 觀察并拍照。如圖10?17所示，PC-3、DU-145細(xì)胞經(jīng)RPO作用24h后Α0/ΕΒ染色，在熒光 顯微鏡下觀察可見四種細(xì)胞，即①活細(xì)胞：核染色質(zhì)均勻，呈綠色；②早期凋亡細(xì)胞：細(xì)胞 膜完整，核染色質(zhì)固縮，呈較強(qiáng)綠色；③晚期凋亡細(xì)胞：核染色質(zhì)固縮，呈橘黃或橘紅色；④ 壞死細(xì)胞：細(xì)胞呈均一橘紅色；其中圖10?13為PC-3細(xì)胞Α0/ΕΒ細(xì)胞染色形態(tài)變化，而圖 14?17為DU-145細(xì)胞Α0/ΕΒ細(xì)胞染色形態(tài)變化。對照組中細(xì)胞形態(tài)飽滿呈上皮樣生長， 核形態(tài)正常呈亮綠色，如圖10和圖14 ;10mg/mL組的PC-3和DU-145細(xì)胞出現(xiàn)少許早期凋 亡細(xì)胞，核呈綠色，染色質(zhì)固縮成團(tuán)塊狀位于細(xì)胞核一側(cè)或出現(xiàn)新月形等異常變化，如圖11 和圖15 ;20mg/mL組的PC-3和DU-145細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞變圓，核仁數(shù)目減少，染 色質(zhì)固縮，分別呈橘黃色和黃綠色，如圖12和圖16 ;30mg/mL組的PC-3和DU-145細(xì)胞出現(xiàn) 晚期凋亡和死亡細(xì)胞增多，細(xì)胞變圓，核染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的固縮，顏色加深呈橘黃色；胞膜 向外突出形成凋亡小體并且部分細(xì)胞核破碎呈橘紅色，如圖13和圖17。
[0081] 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：PC-3、DU-145細(xì)胞按照I X 105/mL接種于6孔培養(yǎng)板 中，24h后換液。設(shè)立對照組和10mg/mL、20mg/mL和30mg/mL RPO加藥組，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用 0. 25%胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，加入PBS緩沖液，吹打成單細(xì)胞懸液，室溫下1200r/min離 心5min后棄上清液，再用PBS重復(fù)洗滌1次。加入400 μ 1的試劑盒專用緩沖液，吹打成細(xì) 胞懸液，然后向細(xì)胞懸液中加入5μ IAnnexin V-FITC，混勻后再加入5μ 1的ΡΙ，室溫下放 入暗室中靜置5min后上機(jī)分析。
[0082] 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：取PC-3、DU_145單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至I X 105/ mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，培養(yǎng)24h后換液，設(shè)立對照組及10mg/mL、30mg/mL的RPO 加藥組，培養(yǎng)24h，收集各組細(xì)胞。用預(yù)冷的75%乙醇溶液固定，并吹打成單細(xì)胞懸液，4°C 下放置30min，lOOOr/min離心20min ;PBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度為50 μ g/ mL，37°C水浴30min且避光。上機(jī)測試，記錄激發(fā)波長488nm處的紅色熒光。每個樣本利 用亞二倍峰即亞Gl期（SubGl)法分析凋亡細(xì)胞，測定細(xì)胞的凋亡率，數(shù)據(jù)處理采用Cell Quest軟件分析檢測結(jié)果。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)可以將實(shí)驗樣本中正常、 壞死和凋亡細(xì)胞等分開，細(xì)胞分為四個區(qū)：左上象限Annexin V-FITC-PI+，代表的是機(jī)械損 傷細(xì)胞；左下象限Annexin V-FITC-/PI-，代表的是正常細(xì)胞；右上象限Annexin V-FITC+/ PI+為晚期凋亡；右下象限Annexin V-FITC+/PI-，代表的是早期凋亡細(xì)胞。圖18?21為 PRO對PC-3細(xì)胞凋亡率的影響，圖22?25為PRO對DU-145細(xì)胞凋亡率的影響，由圖18? 25所示隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸上升，經(jīng)統(tǒng)計加藥組與對照組 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05)。
[0083] 如圖26?33所示RPO作用于PC-3、DU-145細(xì)胞后，在細(xì)胞周期G0/G1期峰前 出現(xiàn)SubGl期峰(凋亡峰)，記錄SubGl峰細(xì)胞凋亡百分率即為凋亡率。經(jīng)寡肽作用后，GO/ Gl期細(xì)胞變化不大，S期減少，G2/M期細(xì)胞增多，加藥組與對照組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義 (P〈0. 01)。其中流式細(xì)胞術(shù)PI單染檢測PC-3細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，對照組中SubGl峰細(xì)胞凋亡 百分率為0. 69%，如圖28所示；lOmg/mL組SubGl峰細(xì)胞凋亡百分率為4. 23%，如圖29所 示；30mg/mL組SubGl峰細(xì)胞凋亡百分率為5. 63%，如圖30所示。流式細(xì)胞術(shù)PI單染檢測 DU-145細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，.對照組中SubGl峰細(xì)胞凋亡百分率為0. 66%，如圖31所示；IOmg/ mL組SubGl峰細(xì)胞凋亡百分率為3. 67%，如圖32所示；30mg/mL組SubGl峰細(xì)胞凋亡百分 率為5. 74%，如圖33所示。
[0084] 綜上，由實(shí)施例3可知由胰蛋白酶酶解獲得的菲律賓蛤仔寡肽： Asp-Trp-Pro-Hi s，
[0085] 在體外能抑制前列腺癌PC-3和DU-145細(xì)胞生長，誘導(dǎo)凋亡，改變細(xì)胞周期，使S 期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增加，細(xì)胞停滯于G2/M期。
[0086] 除特別說明外，本發(fā)明的實(shí)踐將使用生物技術(shù)、有機(jī)化學(xué)、無機(jī)化學(xué)等的常規(guī)技 術(shù)，顯然除在上述說明和實(shí)施例中所特別描述之外，還可以通過其他方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，其他 在本發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)方案與改進(jìn)將對本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，根 據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，許多改變和變化是可行的，因此都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0087] 表1不同蛋白酶的最適酶解溫度和pH

【權(quán)利要求】
1. 一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： ① 將菲律賓蛤仔洗凈，取肉后加超純水?dāng)嚢瑁缓笕ルs質(zhì)勻漿，制得勻漿樣品； ② 取適量的所述勻漿樣品，加入適量體積的超純水，此時原料與超純水的比值為 1:1?1:4,加入蛋白酶在水浴箱中進(jìn)行酶解反應(yīng)，其中加酶量為300ug?1500ug，酶解反 應(yīng)的pH值為8?9,酶解時間為4h?12h，酶解溫度為40°C?60°C ; ③ 酶解反應(yīng)結(jié)束后滅活、離心、取上清液備用； ④ 將所述上清液加入超濾膜中進(jìn)行超濾，收集分子量小于3KDa的酶解物質(zhì)進(jìn)行冷凍 干燥備用； ⑤ 利用DEAE S印haroseFF陰離子交換，采用磷酸緩沖液和NaCl溶液對所得酶解液進(jìn) 行階段洗脫，在280nm波長處收集最高肽峰冷凍干燥后貯存?zhèn)溆茫? ⑥ 將DEAE S印haroseFF陰離子交換收集的最高肽峰利用反相高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn) 一步純化，在220nm波長處出現(xiàn)唯一峰，收集該峰，冷凍干燥制得所述菲律賓蛤仔寡肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟②中原 料與超純水的比值為1:2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟②中所 述蛋白酶為胰蛋白酶，所述加酶量為1200ug，酶解pH值為8. 0,酶解時間為8h，酶解溫度為 50。。。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟③中為 沸水浴中滅活15min，4°C下10000r/min離心15min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟⑤中 NaCl 溶液的濃度為 0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L 三種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟⑥中 色譜柱為C18反相柱，填料為0DS，流動相為乙腈與水，且乙腈與水的比例為15 :85,流速為 0.81111.1^11-1，上樣體積為2〇111，檢測波長為22〇11111，洗脫條件為15%乙腈，2〇1^11。
7. -種由權(quán)利要求1?7任一權(quán)利要求所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法所得的菲律 賓蛤仔寡肽，其特征在于：所述菲律賓蛤仔寡肽的氨基酸序列為Asp-Trp-Pro-His。
8. -種如權(quán)利要求7所述菲律賓蛤仔寡肽的應(yīng)用，其特征在于：所述菲律賓蛤仔寡肽 在抗前列腺癌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P21/06GK104212861SQ201310207965
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】楊最素, 徐律, 丁國芳, 孫瑜, 黃芳芳, 郁迪, 李連軍 申請人:浙江海洋學(xué)院