花生抗鹽基因AhSOS2、克隆方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種花生抗鹽基因AhSOS2、克隆方法及應(yīng)用。本發(fā)明在花生中分離獲得SOS家族基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ?NO.1所示，該基因編碼蛋白產(chǎn)物屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。本發(fā)明對(duì)該基因在逆境條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建，驗(yàn)證了該基因可在蛋白水平進(jìn)行表達(dá)，利用斑點(diǎn)法和基因原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，同時(shí)檢測(cè)了該基因在鹽處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)曲線，通過將該基因異源轉(zhuǎn)化入水稻并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)基因在抗鹽及抗逆過程中的作用進(jìn)行了初步鑒定，對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)花生進(jìn)行有目的，有針對(duì)性的品質(zhì)、性狀改良，創(chuàng)新花生抗逆新種質(zhì)，具有指導(dǎo)作用。
【專利說明】花生抗鹽基因AhS0S2、克隆方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說，涉及克隆花生中抗鹽的AhS0S2基因并利用其構(gòu)建融合表達(dá)載體，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)基因途徑改變植物性狀的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鹽堿土是地球上廣泛分布的一種土壤類型，我國鹽堿土地主要分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)以及長(zhǎng)江以北沿海地帶。土壤鹽害即鹽脅迫，主要表現(xiàn)為滲透脅迫，通過破壞細(xì)胞的正常離子分布和動(dòng)態(tài)平衡，干擾植物細(xì)胞內(nèi)的各種代謝過程，最終造成植物的傷害甚至死亡，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)均有重要的影響。然而，隨著人口增加和耕地減少，地球表面大面積鹽堿地資源的開發(fā)利用具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。因?yàn)榻^大多數(shù)植物對(duì)鹽堿、干旱的耐受性差，只能生長(zhǎng)在氯化鈉含量為0.3%以下的土壤中，這極大的限制了植物在鹽堿灘地上的生長(zhǎng)。目前，對(duì)植物抗鹽、抗逆機(jī)制的研究及培育作物抗逆新品種已成為廣大植物學(xué)家和育種學(xué)家研究的主要任務(wù)之一。以圍繞抗逆基因?qū)χ参镌谀婢抄h(huán)境下的作用為主的研究，已成為從系統(tǒng)水平上探索脅迫生物學(xué)和提高植物脅迫抗性和耐性的有效手段。
[0003]在鹽脅迫條件下，大量的鹽分進(jìn)入植物細(xì)胞，造成Na+離子毒害和細(xì)胞失水，破壞了植物細(xì)胞中穩(wěn)定的Na+、Cl—平衡，也影響K+的吸收和Ca2+等離子在胞內(nèi)的分布，從而影響細(xì)胞內(nèi)的生理調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等一系列途徑。鹽害引起的滲透脅迫，以及由此產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)虧缺和次級(jí)氧化脅迫，還造成了植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的過量積累。大量的活性氧可引起細(xì)胞膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化，從而造成生物大分子損傷、代謝途徑紊亂，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)停滯甚至死亡。
[0004]鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的離子平衡的調(diào)節(jié)對(duì)于植物的耐鹽性十分重要。離子平衡的建立在細(xì)胞水平上主要包括兩方面=Na+的外排和Na+的區(qū)隔化。Na+外排主要由細(xì)胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如:S0Sl,Salt Overly Sensitivel)利用質(zhì)子泵供能將細(xì)胞內(nèi)的Na+排到胞外而完成。Na+的區(qū)隔化主要是液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如:NHX1)起作用，通過質(zhì)子泵水解ATP供能，將胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化至液泡內(nèi)。Na+的外排和Na+的區(qū)隔化減少了Na+在細(xì)胞內(nèi)的積累，同時(shí)促進(jìn)K+的高親和性吸收，這對(duì)維持植物細(xì)胞內(nèi)K+和Na+的穩(wěn)態(tài)平衡，維持穩(wěn)定的PH值和離子穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。
[0005]美國朱健康實(shí)驗(yàn)室最先從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發(fā)現(xiàn)了參與介導(dǎo)鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)Na+的外排及向液泡內(nèi)的區(qū)隔化的相關(guān)因子。通過快中子轟擊(fast neutronbombardment)、T-DNA誘變以及化學(xué)突變(如EMS誘導(dǎo))等方法，他們創(chuàng)制了大量的擬南芥突變植株，從中篩選并獲得了 5組鹽敏感突變體，并進(jìn)一步鑒定了 5個(gè)相關(guān)基因，因以上基因均在同一信號(hào)通路中，故命名為SOS家族(Salt Overly Sensitive)，其成員即包括AtSOSU AtS0S2、AtS0S3、AtS0S4和AtS0S5。 之后該家族相關(guān)成員在其他物種中也均有報(bào)道。
[0006]其中S0S2類基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其N-末端催化位點(diǎn)與酵母SNFl激酶和哺乳動(dòng)物的AMPK激酶非常相似，正常情況下，該基因在植物體內(nèi)含量很低，但鹽脅迫下，其在擬南芥根中表達(dá)量明顯上調(diào)。植物在受到高鹽脅迫時(shí)，會(huì)打破體內(nèi)的離子平衡，Qiu等通過檢測(cè)擬南芥突變植株與野生型植株細(xì)胞內(nèi)Na+和H+含量，證明了SOS信號(hào)通路對(duì)于植物抗鹽過程具有不可替代作用，S0S3是一個(gè)Ca2+感受器，能夠激活體內(nèi)的S0S2蛋白激酶，并與S0S2結(jié)合形成S0S3-S0S2蛋白激酶復(fù)合物，通過磷酸化激活SOSI，使細(xì)胞膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用，將體內(nèi)的Na+排出體外(Qiu QS，Guo Y, Dietrich MA, Schumaker KS, Zhu JK.Regulation of SOSI, a Plasma MembraneNa+/H+Exchanger in Arabidopsis thaliana, by S0S2and S0S3.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2002,99:8436-8441.)。Quan等通過質(zhì)壁分離和GFP染色技術(shù)證明了 S0S3的同系物SCABP8/CBL10與S0S2蛋白激酶相互作用提高擬南芥芽組織的耐鹽性，并且SCABP8與S0S2共同激活 SOSl 發(fā)揮作用(Ruidang Q, Huixin L, Imelda M, Yuguo Z, Wanhong C, YongqingY, Mei S，Shouyi C，Jose1 M.Pardo, and Yan G, SCABP8/CBL10, a Putative CalciumSensor,Interacts with the Protein Kinase S0S2to Protect Arabidopsis Shoots fromSalt Stress.The Plant Cell, 2007，19:1415-1431.)。[0007]目前已經(jīng)從陸地棉、芥菜及大豆中得到了與擬南芥中的S0S2序列上同源、功能上相同或者相似的基因。這些研究結(jié)果表明S0S2基因在植物界中是廣泛存在的，并且在不同的植物中，它們執(zhí)行著相似或者相同的功能。擬南芥AtSOSl、AtS0S2和AtS0S3同時(shí)在擬南芥中表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，在酵母中，同時(shí)表達(dá)SOSl，S0S2和S0S3大大提高了酵母的耐鹽性，其耐鹽性比只表達(dá)其中一個(gè)蛋白有更加明顯的提高，進(jìn)一步證明SOSl依賴S0S2和S0S3的調(diào)節(jié)，以介導(dǎo)Na+外排，在植物耐鹽中起到重要的作用。
[0008]花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油用兼食用作物,其產(chǎn)量和品質(zhì)與人類生活密切相關(guān)?；ㄉ饕L(zhǎng)于干旱和半干旱地區(qū)，是一種較耐旱作物，能忍耐極低的葉片水勢(shì)，葉片水勢(shì)降到_45Pa時(shí)，植株仍能維持生命力?；ㄉ趹?yīng)對(duì)惡劣環(huán)境中選擇性的積累了脅迫抗性基因，然而對(duì)花生分子生物學(xué)研究進(jìn)展卻很有限，關(guān)于花生耐鹽脅迫及其在離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方面的研究則更少。雖然模式植物擬南芥中的SOS信號(hào)途徑研究較清楚，但對(duì)該途徑在其他物種如何參與抗鹽、耐鹽及相關(guān)機(jī)制的了解還較少。本發(fā)明在花生中分離獲得SOS家族基因AhS0S2，并通過構(gòu)建相應(yīng)的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻對(duì)基因抗鹽及抗逆功能進(jìn)行了驗(yàn)證，該方面工作的開展有助于加深對(duì)SOS途徑及其在植物抗鹽方面的認(rèn)識(shí)和了解，為改良及培育植物抗鹽及抗逆新品種提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了克隆花生中具有抗鹽及抗逆能力的基因AhS0S2的方法，并通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用基因工程手段獲得該基因的轉(zhuǎn)基因植物材料，對(duì)基因生物學(xué)功能及其在植物抗鹽、抗逆等方面的應(yīng)用進(jìn)行研究。同時(shí)通過構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體，檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)情況，并通過在原核菌株中對(duì)該基因的功能進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因在抗逆環(huán)境下發(fā)揮一定的作用，同時(shí)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行鹽脅迫處理，初步對(duì)植株抗鹽能力進(jìn)行了分析，揭示該基因在植物抗逆過程中的作用。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案是:花生抗鹽基因AhS0S2，其核苷酸序列如SEQ N0.1所示，氨基酸序列如SEQ N0.2所示，該基因編碼蛋白產(chǎn)物屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
[0011]花生抗鹽基因AhS0S2的克隆方法，其特征是，首先提取花生葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模版，以下述序列為引物，通過PCR獲得AhS0S2基因的全長(zhǎng)序列。引物序列:
[0012]AhS0S21:5/ ~GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT~3' (SEQ N0.3)；
[0013]AhS0S22:5/ ~TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG~3; (SEQ N0.4)。
[0014]本發(fā)明對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證的熒光定量PCR表明，正常生長(zhǎng)條件下，AhS0S2在花生的根、莖、葉中均有表達(dá)；但在鹽(250mmol PNaCl)處理?xiàng)l件下，基因在花生幼苗的莖中表達(dá)量明顯增強(qiáng)，表達(dá)量約是未經(jīng)處理時(shí)的30倍；且基因?qū)Ω珊堤幚硪伯a(chǎn)生響應(yīng)，經(jīng)30%PEG6000模擬干旱處理后，基因在花生幼苗葉中表達(dá)量有較大程度的升高，顯示基因表達(dá)受鹽及干旱等脅迫條件的誘導(dǎo)，基因在參與植物抗鹽及抗逆過程中可能發(fā)揮作用。
[0015]本發(fā)明還根據(jù)花生AhS0S2基因序列設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR的方法擴(kuò)增目的基因，經(jīng)酶切及連接，將目的基因AhS0S2與PET28a載體成功連接，獲得原核表達(dá)載體pET28a-AhS0S2,并將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，經(jīng)異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析，獲得預(yù)期大小的蛋白條帶，證明該基因在蛋白水平完成了表達(dá)，并同時(shí)對(duì)基因原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。
[0016]本發(fā)明同時(shí)利用斑點(diǎn)法對(duì)AhS0S2基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，將成功轉(zhuǎn)入PET28a質(zhì)粒和pET28a-AhS0S2重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在含NaCl的平板上進(jìn)行點(diǎn)樣，37°C倒置過夜培養(yǎng)，通過比較觀察菌斑的數(shù)量及大小，進(jìn)而對(duì)該基因的原核蛋白表達(dá)菌株的抗鹽能力進(jìn)行驗(yàn)證。
[0017]本發(fā)明還通過液體培養(yǎng)法檢測(cè)AhS0S2基因的生長(zhǎng)曲線，將成功轉(zhuǎn)入PET28a質(zhì)粒和PET28a-AhS0S2重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在含有250mmol T1NaCl的LB中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2h進(jìn) 行取樣，紫外分光光度計(jì)下測(cè)定OD6tltl的吸光值。結(jié)果顯示，含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌比含有空載體的菌株生長(zhǎng)速度快，經(jīng)12h培養(yǎng)后，菌液濃度與含有空載體的菌株的菌液濃度的差值最大，顯示含有AhS0S2基因的菌株具有一定的抗鹽功能，該結(jié)果也是對(duì)前文中斑點(diǎn)法結(jié)果的補(bǔ)充和驗(yàn)證。
[0018]本發(fā)明還提供一個(gè)經(jīng)人工改造的PCAMBIA1301P植物表達(dá)載體。經(jīng)酶切及連接，將目的基因AhS0S2與pCAMBIA1301P構(gòu)建融合表達(dá)載體，即獲得植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301P-AhS0S2。進(jìn)一步借助于基因工程手段，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入受體材料水稻中，進(jìn)而提高水稻的抗鹽及抗逆能力。
[0019]本發(fā)明將篩選獲得的轉(zhuǎn)基因陽性水稻植株的T1代種子進(jìn)行水培培養(yǎng)，待其長(zhǎng)至三葉期時(shí)進(jìn)行Ommol L_\ IOOmmol I/1和250mmol L—1不同濃度梯度的NaCl鹽脅迫處理，觀察幼苗長(zhǎng)勢(shì)和葉片生長(zhǎng)情況，結(jié)果初步證明了該基因在水稻抗鹽及抗脅迫過程中發(fā)揮作用。
[0020]本發(fā)明以花生為材料，克隆得到了 S0S2基因家族的一個(gè)重要基因AhS0S2，并對(duì)該基因在逆境條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建，驗(yàn)證了該基因可在蛋白水平進(jìn)行表達(dá)，利用斑點(diǎn)法和基因原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，同時(shí)檢測(cè)了該基因在鹽處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)曲線，通過將該基因異源轉(zhuǎn)化入水稻并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)基因在抗鹽及抗逆過程中的作用進(jìn)行了初步鑒定，對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)花生進(jìn)行有目的，有針對(duì)性的品質(zhì)、性狀改良，創(chuàng)新花生抗逆新種質(zhì)，具有積極的指導(dǎo)作用。【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1:簡(jiǎn)并引物對(duì)AhS0S2序列的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果；其中1、2和3分別表示AhS0S2在50°C、52°C和54°C不同解鏈溫度下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從圖1中可以看出，其EST序列的長(zhǎng)度為780bp ；
[0022]圖2:AhS0S2全長(zhǎng)序列擴(kuò)增PCR電泳結(jié)果，其中1、2、3和4分別表示AhS0S2的PCR產(chǎn)物；
[0023]圖3:熒光定量PCR分析AhS0S2基因的組織表達(dá)特性；
[0024]圖4:熒光定量PCR對(duì)250mmol T1NaCl處理花生幼苗后基因AhS0S2的誘導(dǎo)表達(dá)模式分析；其中圖A、B、C分別代表根、莖和葉；
[0025]圖5:熒光定量PCR對(duì)30%PEG6000模擬干旱處理花生幼苗后基因AhS0S2的誘導(dǎo)表達(dá)模式分析；其中圖A、B、C分別代表根、莖和葉；
[0026]圖6:基因AhS0S2原核蛋白表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果；其中I代表PET28a空載體誘導(dǎo)12h的電泳結(jié)果，2-8分別代表誘導(dǎo)時(shí)間為0、2、4、6、8、10、12h的電泳結(jié)果；
[0027]圖7:不同濃度NaCl處理?xiàng)l件下，含有PET28a、PET28a_AhS0S2的菌株，在不同濃度條件下(10'10_4)，在LB平板上的菌斑生長(zhǎng)結(jié)果比較；
[0028]圖8:液體培養(yǎng)法，對(duì)含有空載體PET28a的菌株及含有重組質(zhì)粒PET28a_AhS0S2的菌株在鹽溶液(250mmol T1NaCl)中的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果；
[0029]圖9:植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301P_AhS0S2的構(gòu)建過程示意圖；
[0030]圖10:利用⑶S組織化 學(xué)染色法，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻的組織化學(xué)鑒定結(jié)果，其中CK為對(duì)照，T1代表轉(zhuǎn)入AhS0S2基因的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)⑶S染色后顯藍(lán)色；
[0031]圖11:通過PCR分子檢測(cè)法，對(duì)AhS0S2轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定，其中泳道+為陽性對(duì)照，-為陰性對(duì)照，泳道1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15經(jīng)PCR獲得目的條帶，與陽性對(duì)照一致，為轉(zhuǎn)基因植株；
[0032]圖12:AhS0S2轉(zhuǎn)基因水稻抗鹽能力的初步分析，CK為鹽脅迫處理3d后的對(duì)照水稻幼苗，從左至右分別為O、100和250mmol -1不同濃度NaCl脅迫處理J1為鹽脅迫處理3d后的轉(zhuǎn)AhS0S2基因水稻幼苗，從左至右分別為O、100和250mmol L—1不同濃度NaCl脅迫處理。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以下實(shí)驗(yàn)步驟及涉及的培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，試劑均為市售產(chǎn)品。
[0034]實(shí)施例1:花生中AhS0S2基因的克隆
[0035]參考已發(fā)表的擬南芥S0S2基因序列，結(jié)合搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得不同物種中S0S2基因，以基因的氨基酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增，獲得AhS0S2的EST序列(圖1)。在獲得的EST序列的基礎(chǔ)上,分別設(shè)計(jì)5' race和3' race特異性引物,按照試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行AhS0S2的5'末端和3'末端的擴(kuò)增，利用CAP3軟件進(jìn)行ESTs片段拼接，得到AhS0S2序列。以提取花生葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模版，根據(jù)電子拼接的AhS0S2全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)基因特異性引物AhS0S21和AhS0S22，PCR反應(yīng)體系為(20 μ I):PCR πι?χΙΟμ 1、上、下游引物各 0.5 μ 1、cDNA2 μ 1、ddH207 μ 1，PCR 反應(yīng)步驟:94°C 3min ；94°C 30s,56°C 1.5min、72°C 40s、共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin,獲得一個(gè)全長(zhǎng)為 1462bp 的AhS0S2基因的全長(zhǎng)序列(圖2)，其核苷酸序列如SEQ N0.1所示，氨基酸序列如SEQ N0.2所示。該片段全長(zhǎng)為1462bp，包含1341bp的開放閱讀框(ORF)，生物信息學(xué)分析顯示，該基因編碼446個(gè)氨基酸，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。所述特異性引物為:
[0036]AhS0S21:5/ ~GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT~3' (SEQ N0.3)；
[0037]AhS0S22:5/ ~TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG~3; (SEQ N0.4)。
[0038]實(shí)施例2:基因AhS0S2在花生不同組織的表達(dá)模式及受高鹽、干旱脅迫后的誘導(dǎo)表達(dá)模式分析
[0039]一、AhS0S2在花生不同組織中的表達(dá)模式分析
[0040]1.植物中RNA的提取
[0041](I)參照SDS法，向1.5ml離心管中加入0.5ml SDS緩沖液、0.3ml tris平衡酚，
0.25ml氯仿、0.1ml巰基乙醇。植物材料研磨后(充分研磨)迅速轉(zhuǎn)移入離心管中(約0.1g),渦旋震蕩5min ；
[0042](2) 12000rpm離心15min，吸取上清，(注意不能吸進(jìn)中間層，否則DNA污染嚴(yán)重)轉(zhuǎn)移上清液至預(yù)先加有等體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1，下同)的離心管中，渦旋震蕩5min ；
[0043](3) 12000rpm 離心 15min ；
[0044](4)轉(zhuǎn)移上清至新管，加入5mol L—1的LiCl至終濃度2.5mol L—1，混勻，4°C放置2h或過夜，12000rpm離心15min ；
[0045](5)棄上清，絮狀沉淀為DNA，去除。沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺(tái)吹干，加30-50 μ IDEPC-H2O溶解沉淀(不易溶解，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間吹打使之徹底溶解)；
[0046](6)在EP管中配制下列反應(yīng)液:
[0047]
【權(quán)利要求】
1.花生抗鹽基因AhS0S2，其核苷酸序列如SEQN0.1所述。
2.權(quán)利要求1所述的花生抗鹽基因AhS0S2的克隆方法，其特征是，首先提取花生葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模版，以下述序列為引物，通過PCR獲得AhS0S2基因的全長(zhǎng)序列，其引物序列為:
AhS0S21:5/ -GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT-3'
AhS0S22:5/ -TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG-3/ 。
3.權(quán)利要求1所述的花生抗鹽基因AhS0S2在提高作物的抗逆性方面的應(yīng)用。
4.一種含有權(quán)利要求1所述的花生抗鹽基因AhS0S2的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征是，所述表達(dá)載體為重組原核表達(dá)載體pET28a-AhS0S2。
6.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征是，所述表達(dá)載體為植物雙元表達(dá)載體 pCAMBIA1301P-AhS0S2，所述 pCAMBIA1301P 是將 CAMV35S promoter 序列插入到PCAMBIA1301載體的多克隆位點(diǎn)EcoR I和Kpn I之間，改造得到的植物表達(dá)載體。
7.一種提高作物抗鹽性的方法，其特征是，權(quán)利要求6的為植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301P-AhS0S2借助于基因工程手段介導(dǎo)作物遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103468724SQ201310470939
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】劉煒, 張國嘉, 王慶國, 李臻 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心