采用lamp技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法
【專利摘要】采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，該檢測方法包括LAMP引物設(shè)計(jì)、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測方法，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測。該法以嗜吞噬細(xì)胞無漿體16SrRNA為靶基因位點(diǎn)，具有快速、靈敏、高效、低成本等特點(diǎn)。
【專利說明】采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜吞噬細(xì)胞無漿體是立克次氏體目(Rickettsiale)無漿體科(Anaplasmataceae)無衆(zhòng)體屬(Anaplasma)的一種重要的人獸共患病原體。該病原體廣泛寄生于包括人、野生動(dòng)物和家畜和嚙齒動(dòng)物的粒細(xì)胞內(nèi)。人粒細(xì)胞無漿體病(Humangranulocytic anaplasmosis, HGA)就是由嗜吞卩遼細(xì)胞無衆(zhòng)體(A.phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒細(xì)胞引起的(Lj Zhang, Y Liu, et al.Nosocomial Transmission of HumanGranulocytic Anaplasmosis in China[J].The Journal of the American Medical Association, 2008，300(19):2263-2270)。
[0003]目前，無漿體的主要檢測方法有病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷法和分子生物學(xué)診斷法
等ο
[0004]病原學(xué)診斷主要有血涂片檢查和動(dòng)物接種試驗(yàn)。血涂片檢查仍是無漿體檢查最為經(jīng)典的方法，其要求在疑患病動(dòng)物用藥之前體溫較高時(shí)進(jìn)行采血做血涂片，用姬姆薩染色法染色，染色后在1000倍油鏡下觀察結(jié)果。該方法雖簡單可靠，但在實(shí)驗(yàn)過程中需要使用顯微鏡，對(duì)人員要求較高，且檢出率低(黨志勝，蔣錫仕，黃孝玢.我國牛羊邊蟲及邊蟲病的研究現(xiàn)狀[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2003，33 (4):39-41)。臨床上，若被檢動(dòng)物染蟲率很低，不能確診，可通過人工培養(yǎng)病原，接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來人工感染動(dòng)物，然后收集接種動(dòng)物的血液，進(jìn)行診斷(G Ulrike, Munderloh, M Cynthia, M Lynch, et al.1solation of anAnaplasma sp.0rganism from White-Tailed Deer by Tick Cell Culture[J].Journal ofClinical Microbiology, 2003,41(9):4328-4335)。無漿體的體外培養(yǎng)往往需要較好的實(shí)驗(yàn)條件和操作熟練的專業(yè)技術(shù)人員，因此該方法不適用于田間流行病學(xué)調(diào)查，而較適合于病原的實(shí)驗(yàn)室分離。
[0005]血清學(xué)診斷主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。在我國，張其才利用邊緣邊蟲高染蟲率的含蟲血所制備的補(bǔ)反診斷抗原具有敏感性良好和特異性很強(qiáng)的特點(diǎn)，CF方法對(duì)試驗(yàn)條件下人工感染牛的補(bǔ)反檢出率為99%，安全區(qū)無假陽性反應(yīng)(張其才，呂文順，竇惠芳，等.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)診斷邊蟲感染牛的研究[J].中國獸醫(yī)科技.1993,23(5):8-10)。該方法雖然具有其自身的很多優(yōu)點(diǎn)，但其自身仍存在不足，它要求抗原和抗體的比例適當(dāng)，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，另外，由于操作條件和技能等較高要求的限制而不適合于田間流行病學(xué)調(diào)查。2007年Glen等證實(shí)了 ELISA方法能夠有效且可靠的診斷家養(yǎng)羊的綿羊無漿體病和野生有蹄類動(dòng)物的無漿體病(Glen A Scoles1WLGoff,TJ Lysykj et al.Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use inthe diagnosis of A.0vis infections in domestic sheep and Anaplasma sp.1n wildungulates [J].Veterinary Microbiology, 2008，130 (1-2): 184-190)。2010 年徐平源等還對(duì)湖南地區(qū)邊緣無漿體的MSP4基因進(jìn)行了克隆及序列分析，這些都為重組抗原ELISA診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。ELISA多用于樣品的批量篩檢，且特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)在于對(duì)時(shí)間和操作的要求非常嚴(yán)格，必須有專業(yè)人員完成，而且對(duì)于陽性的區(qū)別比較模糊，有時(shí)候需要反復(fù)做(徐平源，何德肆.湖南地區(qū)邊緣無漿體的MSP4基因的克隆及序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(10):815-817)。
[0006]分子生物學(xué)診斷方法主要有核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase ChainReaction, PCR)。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物(如酶與熒光素等)標(biāo)記的DNA片段、單鏈DNA和RNA等。其具有特定的序列，能夠與具有相應(yīng)核苷酸堿基互補(bǔ)序列的核酸片段結(jié)合，可用于樣品中特定基因片段的檢測。中國研究者馬米玲等的研究表明，核酸探針技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以較準(zhǔn)確的區(qū)分形態(tài)相似的病原，但與病原學(xué)檢查和血清學(xué)方法相比，其敏感性并不具有明顯的優(yōu)勢，而且需要特殊設(shè)備，檢出速度又慢，不適應(yīng)于大批量樣品的檢測(馬米玲，羅建勛，殷宏，等.邊緣無漿體病診斷方法的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(07):633-638)。除常規(guī)PCR檢測方法外，還有復(fù)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(JWCourtney, LM Kostelnik, NS Zeidner, et al.Multiplex Real-Time PCR for Detectionof Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi[J].Journal of ClinicalMicrobiology, 2004，42(7):3164-3168)、實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄 PCR(KR Sirigireddy, RR Gant.Multiplex Detection of Ehrlichia and Anaplasma Species Pathogens in PeripheralBlood by Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction[J].Journalof Molecular Diagnostics, 2005，7 (2): 308-316)、雙重 RT-PCR(N Decaro, G Carelli, E.Lorusso,et al.Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneousdetection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale[J].Journa of Veterinary Diagnos tic Investigation, 2008, 20(5):606-611)等方法檢測無漿體，雖然PCR方法的敏感性高，特異性強(qiáng)，但是其操作繁瑣，不適合實(shí)踐應(yīng)用，而更適合用于長期帶蟲動(dòng)物的檢測。
[0007]環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loopmediated isothermal amplification, LAMP)是日本學(xué)者Notomi等在2000年建立的一種快速、簡單、靈敏、特異低成本的全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)(Tsugunori Notomi, Hiroto Okayama, Hatumi Masubuchi, et al.Loop-mediatedisothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Reseach.2000, 28 (12):63),其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNAPolymerase)的作用下，不需要模板的熱變性即可擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR方法相比，LAMP技術(shù)屬于等溫?cái)U(kuò)增，無需昂貴的熱循環(huán)儀，并且由于LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——白色焦磷酸鎂沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物可不經(jīng)過電泳，無需開蓋直接通過肉眼觀察即可判定結(jié)果，在反應(yīng)前、后加入染色劑效果更佳。LAMP技術(shù)敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡便，能夠滿足現(xiàn)場和條件較差的基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速檢測的需求。目前，LAMP方法已用于多種寄生蟲等病原體的檢測，例如，李群等根據(jù)牛巴貝斯蟲的細(xì)胞色素b基因(cyt b)設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了檢測牛巴貝斯蟲的LAMP方法(李群，王素華，周前進(jìn)，等.快速檢測牛巴貝斯焦蟲LAMP方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，10(32):781-784);王中光等根據(jù)瑟氏泰勒蟲表面蛋白基因(P33)設(shè)計(jì)引物，建立了檢測牛瑟氏泰勒蟲的LAMP方法(王中光，張守發(fā)，曹士諾，等.牛瑟氏泰勒蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，2 (32):108-111) ;Ma等根據(jù)綿羊無漿體的表面蛋白4 (MSP4)基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測綿羊無衆(zhòng)體的LAMP方法(Miling Ma, Zhijie Liu, Jianxun Luo, etal.Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal AmplificationMethod for Rapid Detection of Anaplasma ovis[J].JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2011,49 (6):2143-2146) ;Pan等根據(jù)嗜吞噬細(xì)胞無漿體的表面蛋白2 (MSP2)基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測嗜吞曬細(xì)胞無衆(zhòng)體的LAMP方法(Lei Pan, Lijuan Zhang, GuiqiangWang, et al.Rapid, Simple, and Sensitive Detection of Anaplasma phagocytophilumbyLoop-Mediated Isothermal Amplification of the msp2Gene[J].JOURNAL OF CLINICALMICROBIOLOGY.2011，49(12):4117-4120);目前，尚沒有以嗜吞噬細(xì)胞無漿體16S rRNA為靶基因位點(diǎn)的LAMP方法，本發(fā)明以嗜吞噬細(xì)胞無漿體16S rRNA為靶基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，建立針對(duì)嗜吞噬細(xì)胞無漿體的LAMP方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法檢出率低、操作繁瑣等問題，本發(fā)明提供一種LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，該法以嗜吞噬細(xì)胞無漿體16sRNA為靶基因位點(diǎn)，具有快速、靈敏、高效、低成本等特點(diǎn)，為無漿體病的快速診斷提供科學(xué)依據(jù)。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，該檢測方法包括LAMP引物設(shè)計(jì)、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測方法，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測，所述的LAMP引物設(shè)計(jì)利用Primer Explorer V4軟件針對(duì)嗜吞噬細(xì)胞無漿體16S rRNA基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條LAMP引物，引物包括兩條外引物F3和B3、兩條內(nèi)引物FIP和BIP， [0010]F3: GCAAGCCTGATCCAGCTATG ；
[0011 ] B3:AAGCCCTGGCATTTCACC ；
[0012]FIP:TGCCGGGACTTCTTCTGTAGGTTGAGTGAGGAAGGCCTTAGG ；
[0013]BIP:CCAGCAGCCGCGGTAATACGCCTACATGCCCTTTACGCC。
[0014]所述的LAMP反應(yīng)體系包括:
[0015]I)引物混合液:外引物為F3和B3各0.2ymol/L，內(nèi)引物為FIP和BIP各1.6ymol/L，外內(nèi)引物比為1:8 ；
[0016]2)反映混合液:0.6mol/L Betaine,8mmol/L MgSO4,1.4mmol/L dNTP Mixture,8U/25μ L Bst DNA ；
[0017]3) 2μ I DNA 模版；
[0018]加滅菌雙蒸餾水至25 μ I。
[0019]所述LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反映混合液混合均勻后加入 2 μ I DNA 模版，在 60-65 °C 保溫 40_90min。
[0020]所述LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反映混合液混合均勻后加入2 μ I DNA模版，在65°C保溫60min。
[0021]所述的熒光可視化檢測采用SYBR Green I染料，在每個(gè)管蓋內(nèi)側(cè)添加I μ L稀釋10倍的SYRB Green I原液，合上管蓋，反應(yīng)結(jié)束后，輕甩反應(yīng)管，使染料與產(chǎn)物混合。
[0022]本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn):(I)擴(kuò)增效率極高，60min內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)到靶基因的IO9~101°倍；(2)本發(fā)明操作簡單，只需在65°C恒溫條件下將反應(yīng)物混合，不需要復(fù)雜的溫度變化過程；(3)本發(fā)明建立的LAMP方法靈敏性高，擴(kuò)增模板只需10拷貝或更少；(4)本發(fā)明基于嗜吞噬細(xì)胞無漿體16S rRNA建立的LAMP方法特異性高，可檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體，不能檢測牛無漿體、綿羊無漿體、呂氏泰勒蟲、莫氏巴貝斯蟲、血吸蟲；(5)本發(fā)明結(jié)果判定簡單，可以通過添加I μ LlO倍稀釋的SYRB Green I染料，顯色直接肉眼觀察，不經(jīng)過電泳。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體電泳檢測圖及添加熒光染料顯色圖；
[0024]圖A為檢測結(jié)果的電泳圖，M為DL2000DNA Marker, 1、2為陽性結(jié)果，為LAMP擴(kuò)增梯形條帶，N為陰性對(duì)照，無擴(kuò) 增產(chǎn)物；
[0025]圖B加熒光染料檢測結(jié)果，左、中為陽性結(jié)果，具有綠色熒光，右為陰性對(duì)照，為紅褐色；
[0026]圖2是本發(fā)明中不同反應(yīng)溫度條件下測得的LAMP體系試驗(yàn)電泳檢測圖，圖中所示:M:DL2000DNA Marker ；1:60°C ；2:61°C ；3:62°C ；4:63°C ；5:64°C ；6:65°C ；7:陰性對(duì)照，65 °C ；
[0027]圖3是本發(fā)明中不同濃度MgS04條件下測得的LAMP體系試驗(yàn)電泳檢測圖，圖中所不:M:DL2000DNA Marker ；I:2mmol/L；2:4mmol/L；3:6mmol/L；4:8mmol/L ；5:lOmmol/L；6: 12mmol/L ；7:14m mol/L ；8:陰性對(duì)照，8mmol/L ；
[0028]圖4是本發(fā)明中不同濃度dNTP Mixture條件下測得的LAMP體系試驗(yàn)電泳檢測圖，M:DL2000DNA Marker ；1:0.8mmol/L ；2:1.0mmoI/L ；3:1.2mmol/L ；4:1.4mmol/L ；5:1.BmmoI/T, ；6:1.8mmol/L ；7:2.0mmol/L ；8:陰性對(duì)照，1.4mmol/L ；
[0029]圖5是本發(fā)明中在加入不同量的酶的條件下測得的LAMP體系試驗(yàn)電泳檢測圖，M:DL2000DNA Marker ；1:2U ；2:4U ；3:6U ；4:8U ；5:10U ；6:12U ；7:14U ；8:陰性對(duì)照，8U/25μ L ；
[0030]圖6是本發(fā)明檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體敏感性試驗(yàn)電泳檢測圖，圖中M:DL2000DNAMarker ；A圖為LAMP電泳擴(kuò)增圖，1-7代表嗜吞噬細(xì)胞無漿體DNA含量為103-10_3copies/μ L，8為陰性對(duì)照，檢測靈敏度是常規(guī)PCR的1000倍；B圖為常規(guī)PCR電泳擴(kuò)增圖，檢測結(jié)構(gòu)不明顯。
[0031]圖7是本發(fā)明檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體特異性試驗(yàn)電泳檢測圖，圖中M:DL2000DNAMarker ；I:A.phagocytophilum ；2:A.bovis ；3:A.0vis ；4:B.motasi ；5:T.1uwenshuni ；6:Schistosome sp.;7:雙蒸水，I為嗜吞卩遼細(xì)胞無衆(zhòng)體基因組出現(xiàn)LAMP特征性梯狀條帶,展示較好的特異性；
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0033]所述試劑均為市售，所用DNA模版本 申請(qǐng)人:實(shí)驗(yàn)室均有保存。
[0034]主要試劑:BstDNA 聚合酶大片段(Bst DNA polymerase large fragment),New England Biolab ;三甲銨乙內(nèi)酯(Betaine), Sigma公司；Tap DNA聚合酶、脫氧核苷三憐酸(dNTP Mixture)> DL2000DNA Marker、6XLoading buffer, TaKaRa 生物合成公司；DNAGreen7TIANDZ ；SYBR Green I，Solarbio ;基因組DNA快速抽提試劑盒(血液)，上海生工生物合成有限公司。
[0035]試驗(yàn)儀器:電熱恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司，型號(hào)HwS24 ；PCR儀，GeneCompany Limited,型號(hào)9700 ;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY-5 ;紫外成像儀，SYNGENE,型號(hào)InGenius LHR ;數(shù)碼照相機(jī)，佳能公司，型號(hào)IXUSl15HS ;快速混勻器，GENIE，型號(hào)V0RTEX-2 ;高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科技有限公司，型號(hào)TGL-16B ;手掌型離心機(jī)，江蘇海門市麟麟醫(yī)用儀器廠，型號(hào)LX-100 ;分析天平，METTLER TOLEDO公司，型號(hào)AB204-N ;精密PH計(jì)，上海宇隆儀器有限公司，型號(hào)PHS-3C ;超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；雙重純水蒸餾儀，上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)SZ-93 ;移液器，BRAND。
[0036]1.引物設(shè)計(jì)
[0037]首先本發(fā)明人從NCBI上下載了嗜吞噬細(xì)胞無漿體16S rRNA基因序列(登錄號(hào):NR_044762.1),使用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)設(shè)計(jì)多組引物，然后根據(jù)引物序列所在區(qū)域的保守性、引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、GC含量及Tm值等綜合因素選擇引物，共設(shè)計(jì)4條LAMP引物，其中包括2條外引物F3、B3和2條內(nèi)引物FIP、BIP。引物的信息見表1:
[0038]表1引物序列信息
[0039]
【權(quán)利要求】
1.采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，其特征在于:該檢測方法包括LAMP引物設(shè)計(jì)、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測方法，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和突光可視化檢測，所述的LAMP引物設(shè)計(jì)利用Primer Explorer V4軟件針對(duì)嗜吞噬細(xì)胞無漿體16S rRNA基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條LAMP引物，引物包括兩條外引物F3和B3、兩條內(nèi)引物FIP和BIP,
F3:GCAAGCCTGATCCAGCTATG ；
B3:AAGCCCTGGCATTTCACC ；
FIP:TGCCGGGACTTCTTCTGTAGGTTGAGTGAGGAAGGCCTTAGG ；
BIP:CCAGCAGCCGCGGTAATACGCCTACATGCCCTTTACGCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，其特征在于:所述的LAMP反應(yīng)體系包括: O引物混合液:外引物為F3和B3各0.2μπιο1/1，內(nèi)引物為FIP和BIP各1.6Mmol/L,外內(nèi)引物比為1:8 ；
2)反映混合液:0.6mol/L Betaine,8mmol/L MgSO4,1.4mmol/L dNTP Mixture,8U/25M-LBst DNA ； 3)2μ1DNA 模版; 加滅菌雙蒸餾水至25 μ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，其特征在于:所述LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反映混合液混合均勻后加入2μ1 DNA模版，在 58-65°C保溫 40-90min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，其特征在于:所述LAMP反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，將引物引物混合液和反映混合液混合均勻后加入2μ1 DNA模版，在65°C保溫60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用LAMP技術(shù)檢測嗜吞噬細(xì)胞無漿體方法，其特征在于:所述的熒光可視化檢測采用SYBR Green I染料，在每個(gè)管蓋內(nèi)側(cè)添加I μ L稀釋10倍的SYRBGreen I原液,合上管蓋,反應(yīng)結(jié)束后,輕甩反應(yīng)管,使染料與產(chǎn)物混合。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103695538SQ201310656319
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】寧長申, 王金鴻, 菅復(fù)春, 呂亞莉, 張龍現(xiàn), 王榮軍, 張艷, 韓瓊瓊, 張文靜 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)