一株寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas?sp.)，命名為寡養(yǎng)單胞菌F6，保藏號(hào)為CGMCC?NO.6547。從寡養(yǎng)單胞菌F6的代謝產(chǎn)物中分離純化并鑒定了兩種溶藻活性物質(zhì)，分別是環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)和對(duì)苯二酚。環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)抑制銅綠微囊藻9110的半數(shù)有效濃度為9.5mg/L，而對(duì)聚球藻BN60無抑制效果；對(duì)苯二酚抑制銅綠微囊藻9110和聚球藻BN60的半數(shù)有效濃度分別為0.96mg／L和5.6mg／L。寡養(yǎng)單胞菌F6及其溶藻活性物質(zhì)(環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)和對(duì)苯二酚)可用于新型殺藻劑的開發(fā)和生產(chǎn)，最終應(yīng)用于淡水藍(lán)藻水華的控制。
【專利說明】一株寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物，尤其涉及一株寡養(yǎng)單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]因日益加劇的水體富營養(yǎng)化而頻發(fā)的藍(lán)藻水華造成了嚴(yán)重的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問題，因此受到人們的廣泛關(guān)注。在中國，許多淡水湖泊(如太湖、滇池、巢湖等)都受到藍(lán)藻水華的嚴(yán)重影響。因此，有效地控制藍(lán)藻水華顯得非常必要。
[0003] 目前，控制藍(lán)藻水華的方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法主要有人工捕撈、機(jī)械除藻等?；瘜W(xué)方法主要包括加入殺藻化學(xué)物質(zhì)硫酸銅、除草劑等。但是，物理方法和化學(xué)方法由于高成本、二次污染以及對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害從而限制其有效使用。因此，生物方法因其高效性、專一性以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而受到越來越多的關(guān)注。
[0004]溶藻細(xì)菌是一類能殺死藻類細(xì)胞的細(xì)菌的總稱，由于其能有效地殺死造成藍(lán)藻水華中的藍(lán)藻，故被廣泛認(rèn)為可應(yīng)用于藍(lán)藻水華的控制。此外，溶藻細(xì)菌分泌的溶藻活性物質(zhì)也可作為化學(xué)殺藻劑的替代品。因此，從自然水體中篩選出具有抑制甚至滅殺藍(lán)藻水華中優(yōu)勢(shì)藻株的溶藻細(xì)菌，分離純化并鑒定其溶藻活性物質(zhì)，對(duì)于開發(fā)新型殺藻劑具有重要的實(shí)踐價(jià)值，最終可應(yīng)用于控制藍(lán)藻水華。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的，就是為了提供一株寡養(yǎng)單胞菌。
[0006]本發(fā)明中涉及的寡養(yǎng)單胞菌,拉丁文名為:Stenotrophomonas sp.,此菌株為革蘭氏陰性菌，菌體直或略彎，單個(gè)或成對(duì)排列。專性需氧。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落中等大小，圓形，黃色或棕黃色不透明?；墚愷B(yǎng)菌。最適生長(zhǎng)溫度為35°C，4°C不生長(zhǎng)。經(jīng)16S rRNA基因序列分析和同源性比較，其與某寡養(yǎng)單胞菌菌株有97%的同源性，故鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌，命名為寡養(yǎng)單胞菌F6，此菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登錄號(hào)為HQ998863。
[0007]本發(fā)明提供的寡養(yǎng)單胞菌F6保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0.6547，保藏日期2012年9月14日。保藏機(jī)構(gòu)地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，郵編:100101電話:+86-010-64807596。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一株寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.),命名為寡養(yǎng)單胞菌F6，保藏號(hào)為CGMCC N0.6547。
[0009]上述寡養(yǎng)單胞菌F6用于控制藍(lán)藻水華。
[0010]上述應(yīng)用，是通過將寡養(yǎng)單胞菌F6接種于pH7.0的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm條件下發(fā)酵24h得到其發(fā)酵液，應(yīng)用于溶藻。
[0011]上述應(yīng)用，是通過將寡養(yǎng)單胞菌F6的發(fā)酵液經(jīng)過12000g離心20min后再用
0.22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾后得到其無菌發(fā)酵液，應(yīng)用于溶藻。
[0012]上述應(yīng)用，是將寡養(yǎng)單胞菌F6的發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯萃取后得到的萃取物，應(yīng)用于溶藻。
[0013]上述應(yīng)用，是將從寡養(yǎng)單胞菌F6的萃取物中分離得到的兩種溶藻活性物質(zhì)環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)和對(duì)苯二酚，應(yīng)用于溶藻。
[0014]本發(fā)明還提供了寡養(yǎng)單胞菌F6的溶藻活性物質(zhì)的制備方法，將寡養(yǎng)單胞菌F6的發(fā)酵液萃取物通過Waters μ Bondapak?C18制備柱、Dikma Supersil C18-EP半制備柱和分析柱等色譜柱，以水和甲醇(或水和乙腈)為流動(dòng)相的高效液相色譜(HPLC)技術(shù)，可分離純化得到兩種溶藻活性物質(zhì)F6-A和F6-B。
[0015]本發(fā)明還提供了溶藻活性物質(zhì)的鑒定方法，利用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、紫外光譜掃描、核磁共振氫譜(1H NMR)等技術(shù)分析兩種溶藻活性物質(zhì)，鑒定得到F6-A為環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)，F(xiàn)6-B為對(duì)苯二酚。
[0016]本發(fā)明的主要效果及優(yōu)點(diǎn)是:
[0017]1、菌種篩選方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高。篩選到的寡養(yǎng)單胞菌F6溶藻效果具有廣譜性，尤其對(duì)太湖水華中的優(yōu)勢(shì)藻株聚球藻和銅綠微囊藻具有很強(qiáng)的溶藻效果。研究結(jié)果表明寡養(yǎng)單胞菌F6的發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對(duì)銅綠微囊藻具有很強(qiáng)的溶藻效果。
[0018]2、寡養(yǎng)單胞菌F6的溶藻活性物質(zhì)環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)和對(duì)苯二酚對(duì)太湖水華中的優(yōu)勢(shì)藻株銅綠微囊藻和聚球藻都具有很強(qiáng)的溶藻效果。
[0019]3、寡養(yǎng)單胞菌F6及其溶藻活性物質(zhì)均具有很強(qiáng)的溶藻效果，對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)造成二次污染，在控制藍(lán)藻水華方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為寡養(yǎng)單胞菌F6對(duì)銅綠微囊藻9110的溶藻效果圖。
[0021]圖2為不同方式處理后的寡養(yǎng)單胞菌F6發(fā)酵液的溶藻效果圖。
[0022]圖中:A、B、C、D分別為寡養(yǎng)單胞菌F6發(fā)酵液、高溫處理后的發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液、去上清的菌細(xì)胞液對(duì)銅綠微囊藻9110的溶藻效果(6天)。
[0023]圖3為寡養(yǎng)單胞菌F6發(fā)酵液和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的乙酸乙酯萃取物的瓊脂平板實(shí)驗(yàn)圖。
[0024]圖中:a為寡養(yǎng)單胞菌F6發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物的溶藻效果，b為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的乙酸乙酯萃取物的溶藻效果(作對(duì)照)。
[0025]圖4為寡養(yǎng)單胞菌F6的溶藻活性物質(zhì)F6-A的GC-MS分析得到的質(zhì)譜圖(EI) (a)、NMR氫譜(b)、紫外掃描光譜(c)和化學(xué)結(jié)構(gòu)圖(d)。
[0026]圖5為寡養(yǎng)單胞菌F6的溶藻活性產(chǎn)物F6-B的GC-MS分析得到的質(zhì)譜圖(EI) (a)、NMR氫譜(b)、紫外掃描光譜(c)和化學(xué)結(jié)構(gòu)圖(d)。
[0027]圖6為不同濃度的環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)和對(duì)苯二酚對(duì)對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果不意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面用實(shí)施例詳·述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0029]1.溶藻細(xì)菌的篩選[0030]將太湖梅梁灣水域采集的自然水樣ImL接種于IOOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24h (30°C，200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng))，將IOmL培養(yǎng)液加入到IOOmL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻9110(分離自太湖)的藻液(藻細(xì)胞密度約I父107個(gè)/ mL)中。一周后取黃化藻液用梯度稀釋法涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)過夜，取菌落密度適中的平板，根據(jù)菌落形態(tài)的差異從平板中挑選一系列菌株。
[0031]將挑選出來的菌株按照1%的比例接種入IOOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C、200rpm條件下培養(yǎng)24h，隨后將各菌株的IOmL菌液分別加入IOOmL對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻9110藻液中(藻細(xì)胞密度約I父107個(gè)/ mL)。另外將IOmL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加入IOOmL藻液中作為對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藻液均放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后測(cè)定銅綠微囊藻9110細(xì)胞密度，計(jì)算其溶藻率。選取了其中溶藻率最高的一株菌株進(jìn)行后期研究，該菌株命名為F6。
[0032]藻液培養(yǎng)條件:銅綠微囊藻9110用BGll液體培養(yǎng)基培養(yǎng),放置于光照培養(yǎng)箱中，25°C,光照強(qiáng)度40 μ mol photons nT2s'光暗周期比為12: 12。
[0033]溶藻率計(jì)算方法:溶藻率=(對(duì)照組藻細(xì)胞密度-實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度)/對(duì)照組藻細(xì)胞密度X100%。其中使用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度。
[0034]圖1所示為寡養(yǎng)單胞菌F6對(duì)銅綠微囊藻9110的溶藻效果。加入寡養(yǎng)單胞菌F6后，銅綠微囊藻9110的細(xì)胞密度隨時(shí)間不斷下降，而對(duì)照中的銅綠微囊藻9110細(xì)胞密度隨時(shí)間不斷上升，6天后的溶藻率為93.7%。
[0035]2.F6菌株的鑒定
[0036]應(yīng)用形態(tài)觀察、染色、16s rRNA基因序列分析等方法對(duì)溶藻效果最強(qiáng)的菌株F6進(jìn)行鑒定。此菌株為革蘭氏陰性菌，菌體直或略彎，單個(gè)或成對(duì)排列。專性需氧。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落中等大小，圓形，黃色或棕黃色不透明?；墚愷B(yǎng)菌。最適生長(zhǎng)溫度為35°C，4°C不生長(zhǎng)。經(jīng)16s rRNA基因序列分析和同源性比較，得知其與GenBank中某寡養(yǎng)單胞菌屬菌株有97%的同源性，故鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌，命名為寡養(yǎng)單胞菌F6。該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6547，保藏日期為2012年9月14日。該菌株的16S rRNA基因序列在GenBank的登錄號(hào)為HQ998863。
[0037]3.寡養(yǎng)單胞菌F6對(duì)不同藻類的溶藻效果
[0038]將寡養(yǎng)單胞菌F6按照1%的接種量接種于滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C、200rpm條件下?lián)u床發(fā)酵24h得到其發(fā)酵液。將9份培養(yǎng)好的IOmL寡養(yǎng)單胞菌F6發(fā)酵液分別加入到不同藻類(見表1)的IOOmL藻液中(所有藻類均已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期)，同時(shí)將等量的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加入9種藻液中(IOOmL)作為對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，分別測(cè)定所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組藻液的葉綠素濃度(對(duì)于銅綠微囊藻，測(cè)定其藻細(xì)胞密度)，計(jì)算其溶藻率。每個(gè)樣品均有三個(gè)平行樣，以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。
[0039]本實(shí)驗(yàn)中涉及的藻株中有6株分離自太湖梅梁灣水域，其余3株購自武漢淡水藻種庫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，寡養(yǎng)單胞菌F6對(duì)所有測(cè)試藻株都具有溶藻效果，尤其對(duì)太湖水華中的優(yōu)勢(shì)藻株銅綠微囊藻和聚球藻具有很強(qiáng)的溶藻效果(見表1)。此結(jié)
[0040]果表明寡養(yǎng)單胞菌F6的溶藻能力具有廣譜性，是一株具有應(yīng)用前景的溶藻細(xì)菌。
[0041]表1寡養(yǎng)單胞菌F6對(duì)不同藻株的溶藻效果[0042]
【權(quán)利要求】
1.一株寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.),命名為寡養(yǎng)單胞菌F6,保藏號(hào)為CGMCCN0.6547。
2.寡養(yǎng)單胞菌F6在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:通過將寡養(yǎng)單胞菌F6接種于pH7.0的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm條件下發(fā)酵24h得到其發(fā)酵液，應(yīng)用于溶藻。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:通過將寡養(yǎng)單胞菌F6的發(fā)酵液經(jīng)過12000g離心20min后再用0.22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾后得到其無菌發(fā)酵液，應(yīng)用于溶藻。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:將寡養(yǎng)單胞菌F6的發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯萃取后得到的萃取物，應(yīng)用于溶藻。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:將從寡養(yǎng)單胞菌F6的萃取物中分離得到的兩種溶藻活性物質(zhì)環(huán)(甘氨酸-脯`氨酸)和對(duì)苯二酚，應(yīng)用于溶藻。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103667135SQ201310661616
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】楊虹, 林升欽, 柳向龍, 譚晶 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)