用于阻留和回流細(xì)胞的單向分離器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有薄板組件的傾斜通道類型的固體材料分離器中的單層或多層塑料網(wǎng)板的用途。
【專利說明】用于阻留和回流細(xì)胞的單向分離器
[0001] 本發(fā)明涉及含有堆疊板的傾斜通道固體分離器中的單層或多層塑料網(wǎng)板用于阻 留來自反應(yīng)器混合物中的固體的用途。
[0002] 動(dòng)物和植物細(xì)胞的培養(yǎng)在生產(chǎn)生物活性物質(zhì)和藥物活性產(chǎn)品中非常重要。特別需 要通常在生長培養(yǎng)基的游離懸液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，因?yàn)榧?xì)胞與微生物不同，細(xì)胞對(duì)于機(jī)械 剪應(yīng)力和營養(yǎng)供應(yīng)不足高度敏感。
[0003] 動(dòng)物和植物細(xì)胞系通常分批培養(yǎng)。這種方法的缺點(diǎn)是由于不斷改變的底物、產(chǎn)物 和生物質(zhì)的濃度，因此很難達(dá)到細(xì)胞的最佳營養(yǎng)。另外，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，積累了副產(chǎn)物，例如 死細(xì)胞的組分，它們通常需要在后續(xù)處理過程中付出很大努力才能被去除。因此，特別是當(dāng) 生產(chǎn)不穩(wěn)定的產(chǎn)品（例如，可被蛋白水解攻擊而破壞的產(chǎn)品）時(shí)，需要使用連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的生物 反應(yīng)器。
[0004] 連續(xù)的生物反應(yīng)器使得有可能當(dāng)滿足以下要求時(shí)，達(dá)到高細(xì)胞密度和相關(guān)的高生 產(chǎn)率：
[0005] ?為細(xì)胞充足且低剪切地供應(yīng)底物，尤其是溶解氧，
[0006] ?充分去除呼吸作用過程中產(chǎn)生的二氧化碳，
[0007] ?用于建立高細(xì)胞濃度的有效、低剪切、防阻塞的細(xì)胞留滯系統(tǒng)，
[0008] ?長期穩(wěn)定（無菌、流體動(dòng)力學(xué)）的生物反應(yīng)器和留滯系統(tǒng)。
[0009] 除了連續(xù)運(yùn)行模式之外，也可能使用具有有效的細(xì)胞留滯系統(tǒng)的生物反應(yīng)器，例 如甚至用于培養(yǎng)具有特別高的細(xì)胞密度的預(yù)培養(yǎng)物。在這種情況下，細(xì)胞留滯系統(tǒng)以重復(fù) 分批的模式不連續(xù)地使用，以去除實(shí)際上不含有生物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。然后，將所述 預(yù)培養(yǎng)物反應(yīng)器用新鮮的生長培養(yǎng)基重新填滿，從而使培養(yǎng)物具有比簡單分批操作的情況 下更高的細(xì)胞密度。
[0010] 有效的細(xì)胞留滯是需要的，這樣在連續(xù)運(yùn)行的生物反應(yīng)器中可達(dá)到高的細(xì)胞密度 (>每毫升2千萬活細(xì)胞）。在這種情況下，所要求的留滯程度取決于細(xì)胞的生長速率和灌 注速率q/v(培養(yǎng)基通過量q/生物反應(yīng)器容積V)。
[0011] 過去提出了不同的用于連續(xù)運(yùn)行的生物反應(yīng)器的細(xì)胞留滯系統(tǒng)，這些細(xì)胞留滯系 統(tǒng)在大多數(shù)情況下被布置在生物反應(yīng)器外。這樣做的原因是容易接近所述細(xì)胞留滯系統(tǒng)以 達(dá)到維護(hù)和清潔的目的。
[0012] 為了使細(xì)胞損傷最小化，尤其是由于在生物反應(yīng)器外的不充分的氧氣供應(yīng)和二氧 化碳去除所造成的細(xì)胞損傷，需要有具有小工作容積和相關(guān)的短細(xì)胞滯留時(shí)間的細(xì)胞留滯 系統(tǒng)。
[0013] 除了膜過濾器之外，在具體的離心和重力分離器的現(xiàn)有技術(shù)中，還使用根據(jù)交叉 流過濾原理起作用的具有固定膜和可移動(dòng)膜的設(shè)備。
[0014] 在使用膜過濾器的細(xì)胞留滯的情況下，觀察到沉積物或污染，這能夠妨礙可靠 且不需要維護(hù)的長期運(yùn)行。當(dāng)有足夠快速的流體穿過膜表面時(shí)，可以減少沉積物。這可 以在靜止的或振蕩的運(yùn)行過程中實(shí)現(xiàn)。振蕩流體穿過其中的膜系統(tǒng)的實(shí)例為來自Refine Technologies Inc.的 Alternating Tangential Flow (ATF) System。但是，流體快速穿過 膜表面與低剪切細(xì)胞培養(yǎng)的基本前提相反。
[0015] 用于在離心力場中分離出細(xì)胞的低剪切離心機(jī)在不需要維護(hù)的情況下僅能運(yùn)行 數(shù)個(gè)星期，并且需要更換離心元件。這增加了污染風(fēng)險(xiǎn)。
[0016] 主要用于細(xì)胞培養(yǎng)的重力分離器為沉降容器和傾斜通道分離器。與簡單的沉降容 器相比，大規(guī)模使用的傾斜通道分離器具有的優(yōu)勢(shì)在于與分離表面面積有關(guān)的相當(dāng)小的容 積。一篇出版物（Henzler, H. -J.，Chemie-Technik, 1，1992, 3)描述了在傾斜通道分離器中 進(jìn)行的細(xì)胞留滯，其能夠以逆流、交叉流、順流方式運(yùn)行。流體穿過的通道橫截面可以設(shè)置 有板或管。W01994026384 A1要求保護(hù)傾斜通道分離器用于在逆流分離器中阻留細(xì)胞的用 途。W02003020919 A2除了別的以外，描述了用于細(xì)胞留滯的逆流和交叉流分離器，以及還 有它們與各種預(yù)分離器（例如水力旋流器）的組合。這些已知的傾斜通道分離器由不銹鋼 制成，并且其元件被切割、用力磨平、鏡面拋光并且焊接在一起。
[0017] 傾斜通道分離器經(jīng)外部回路連接至生物反應(yīng)器。為此，需要軟管管路和泵。
[0018] 為了降低重力分離器中的細(xì)胞的代謝活性和粘附性，建議在細(xì)胞培養(yǎng)肉湯被送至 重力分離器的過程中冷卻所述細(xì)胞培養(yǎng)肉湯。在細(xì)胞長期處于生物反應(yīng)器外的情況下，低 溫下降低的代謝活性一定是有利的。
[0019] W02009152990(A2)描述了用于在流體穿過的容器中阻留和回流細(xì)胞的細(xì)胞留滯 系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含相互鄰近排列的多個(gè)通道，所述通道形成直立的中空?qǐng)A筒，并且相對(duì)于 所述中空?qǐng)A筒的縱軸線傾斜10° -60°的角度β。流體穿過的容器可以是用于細(xì)胞留滯和 回流的生物反應(yīng)器或生物反應(yīng)器連接的容器。通道在下端有開口。在上端，通道通向具有 至少一條管線的普通環(huán)形空間，收獲流可經(jīng)該環(huán)形空間從容器運(yùn)出。細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液的 分離發(fā)生在通道中。作為所述收獲流從生物反應(yīng)器中被連續(xù)去除的結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì) 胞被吸入通道中。如同在典型的傾斜通道分離器中一樣，細(xì)胞在傾斜的通道中沉淀并滑下， 以相對(duì)于流入的收獲流逆流的方向再次流出通道，從而保留在容器中。與細(xì)胞分離的細(xì)胞 培養(yǎng)液通過通道運(yùn)輸?shù)酵ǖ郎戏降沫h(huán)形空間中，最終從容器中運(yùn)出。
[0020] 在嚴(yán)格管理的藥物生產(chǎn)中，提供凈化且滅菌的生物反應(yīng)器和生物反應(yīng)器元件例如 細(xì)胞留滯系統(tǒng)是非常耗費(fèi)時(shí)間、技術(shù)上復(fù)雜并且耗費(fèi)人力。為了安全地避免多功能單元中 的產(chǎn)品更換過程中或兩個(gè)產(chǎn)品批次之間發(fā)生交叉污染，除了清潔之外還需要非常復(fù)雜的清 潔確認(rèn)，在工序改變的情況下可能需要重復(fù)該清潔確認(rèn)。對(duì)于由不銹鋼制成的常規(guī)分批發(fā) 酵罐、饋入分批發(fā)酵罐或灌注發(fā)酵罐的清潔和滅菌，通常在所謂的永久固件單元中使用與 就地蒸汽處理（SIP)技術(shù)相結(jié)合的就地清潔（CIP)技術(shù)。為了在連續(xù)處理控制的情況下確 保足夠長時(shí)間的無菌，也使用高壓滅菌技術(shù)，但是高壓滅菌技術(shù)需要非常不便地將反應(yīng)器 或反應(yīng)器元件運(yùn)送到高壓滅菌器中，并且只適用于比較小的反應(yīng)器尺寸。在使用老化的消 耗性部件（例如密封攪拌器軸）、不恰當(dāng)?shù)臏缇蜓b置運(yùn)輸、高壓滅菌后將連接線投入運(yùn)行 或與連接線連接、以及常規(guī)取樣的情況下，污染風(fēng)險(xiǎn)特別高。
[0021] 在分批或饋入分批模式中使用CIP/SIP單元的情況下，由準(zhǔn)備過程導(dǎo)致的反應(yīng)器 停工期可以明顯影響反應(yīng)器可用性，尤其是在由于短時(shí)間使用而頻繁改變產(chǎn)品的情況下。
[0022] -次性反應(yīng)器的概念在市場上得到了越來越多的關(guān)注，用以滿足快速且靈活的生 產(chǎn)單元重新裝載的要求，同時(shí)確保最大程度的清潔和無菌。
[0023] 從現(xiàn)有技術(shù)出發(fā)，本發(fā)明的目的是提供有效的用于在連續(xù)或分批運(yùn)行過程中阻留 和回流動(dòng)物（特別是人）和植物細(xì)胞的方法，所述方法考慮細(xì)胞對(duì)機(jī)械剪應(yīng)力和為所述細(xì) 胞供應(yīng)充足營養(yǎng)的敏感性，所述方法可以擴(kuò)大到非常大的規(guī)模，所述方法滿足了制藥工業(yè) 的維護(hù)、清潔和滅菌方面的要求，所述方法的用途降低了復(fù)雜度和差錯(cuò)風(fēng)險(xiǎn)，并且所述方法 允許使用最少的資源而經(jīng)濟(jì)地且環(huán)境上最優(yōu)地使用（生產(chǎn)和處置）一次性系統(tǒng)。
[0024] 通過使用含有堆疊板的傾斜通道固體分離器中的單層或多層塑料網(wǎng)板用于阻留 來自反應(yīng)器混合物中的固體而實(shí)現(xiàn)上述目的。
[0025] 對(duì)于細(xì)胞特別是來自生物反應(yīng)器混合物的細(xì)胞的留滯，本發(fā)明的傾斜通道固體分 離器包含以下元件：
[0026] -固體分離器的上部區(qū)域，具有用于從收獲流收集區(qū)（56)去除與細(xì)胞分離的收獲 流（70)(=收獲物）的一個(gè)或多個(gè)饋入裝置（feed-through) /適配件（fitting) (80)，連接 至
[0027] -由單層或多層塑料網(wǎng)板組成的堆疊板（1)形成的分離區(qū)，所述堆疊板在運(yùn)行過 程中相對(duì)于水平面傾斜30° -80°，連接至
[0028] -所述固體分離器的下段，其具有用于所述反應(yīng)器混合物（74)的流分布的一個(gè)或 多個(gè)饋入裝置或適配件（84)，下方是
[0029] -固體收集區(qū)（57)，其向下漸縮，特別是以圓錐或棱錐的方式，用于通過重力收集 細(xì)胞。
[0030] 優(yōu)選地，向下漸縮（特別是以圓錐或棱錐的方式）的固體收集區(qū)（57)相對(duì)于垂直 面的角度（58, 59)為10° -60°?？梢詥为?dú)選擇角度58和59。
[0031] 為了允許回流，固體收集區(qū)（57)具有一個(gè)或多個(gè)用于去除細(xì)胞的饋入裝置（89) 或可能的適配件（88)。適配件的一個(gè)實(shí)例是中央吸入口。
[0032] 單層或多層塑料網(wǎng)板形成通道，堆疊板1優(yōu)選由相互鄰近排列的多個(gè)通道組成。
[0033] 通道在下端和上端開口。在下端，所述通道通往常用的固體收集區(qū)57,所述固體收 集區(qū)以圓錐的方式向下漸縮。在上端，所述通道通往常用的收獲流收集區(qū)56,所述收獲流收 集區(qū)具有至少一個(gè)饋入裝置80,所述收獲流可從容器中被運(yùn)輸通過該饋入裝置。
[0034] 在本發(fā)明的傾斜通道固體分離器的通道中，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液被分離。由于連續(xù) 地從生物反應(yīng)器中除去收獲流，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞被吸入到通道中。細(xì)胞在傾斜的通道中 沉積，并且如同在典型的傾斜通道分離器中一樣，以相對(duì)于流入的收獲流逆流的方向再次 從通道滑出，并在圓錐形漸縮的固體收集區(qū)57中被收集。通常，固體收集區(qū)57具有一個(gè)或 多個(gè)與生物反應(yīng)器相連的饋入裝置/適配件88/89,用于吸出收集的細(xì)胞并使其回流到生 物反應(yīng)器中。
[0035] 堆疊板1的通道可具有角形的、橢圓形的、圓形的或半圓形的橫截面（圖4)。
[0036] 在每種情況下，通道的尺寸（數(shù)目、直徑、長度）取決于待阻留的細(xì)胞的性質(zhì)、生物 反應(yīng)器的大小和通過量。
[0037] 為了防止通道堵塞，通道寬度d優(yōu)選為d>3mm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用具有通 道寬度為3mm-100mm，優(yōu)選4mm-20mm，特別優(yōu)選3_7mm的通道，以首先安全地避免阻塞狀態(tài)， 并且其次使分離器空間和生物反應(yīng)器空間之間的空間-時(shí)間產(chǎn)率降低的容積比最小化。
[0038] 所需的分離表面面積AOTf按照eq. 1由沉淀速度ws、灌注速度q/V(培養(yǎng)基通過量 q/生物反應(yīng)器容積V)和生物反應(yīng)器容積確定。系數(shù)η考慮了傾斜通道分離器相對(duì)于垂直 分離器的性能降低（eq. 2)。
[0039] 根據(jù)文獻(xiàn)(H. - J. Binder, Sedimentation aus Ein-und Mehrkornsuspensionen in SChfSg stehenden, laminar durchstromten Kreis-und Rechteckrohren[Sedimentation from single grain and multigrain suspensions in inclined, laminar-flow circular and rectangular pipes],Dissertation Berlin, 1980)中公布的方法，可從eq. 3和eq. 4近似確定矩形和圓柱形截面情況下的理論 分離表面面積Ath :
【權(quán)利要求】
1. 含有堆疊板的傾斜通道固體分離器中的單層或多層塑料網(wǎng)板用于阻留來自反應(yīng)器 混合物的固體的用途。
2. -種傾斜通道固體分離器，其用于阻留和回流來自反應(yīng)器混合物的固體，包含以下 元件： -所述固體分離器的上部區(qū)域，其具有一個(gè)或多個(gè)饋入裝置/適配件（80)，用于從收獲 流收集區(qū)（56)去除與細(xì)胞分離的收獲流（70)(=收獲物），連接至 -由單層或多層塑料網(wǎng)板組成的堆疊板（1)形成的分離區(qū)，所述堆疊在運(yùn)行過程中相 對(duì)于水平面傾斜30° -80°的角度（10)，連接至 -所述固體分離器的下段，其具有一個(gè)或多個(gè)饋入裝置或適配件（84)，用于所述反應(yīng) 器混合物（74)的流分布，下方是 -向下漸縮的固體收集區(qū)（57)，其用于借助重力收集所述細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的傾斜通道固體分離器，其中所述固體收集區(qū)（57)以圓錐或棱錐的方式 向下漸縮。
4. 權(quán)利要求2或3的傾斜通道固體分離器，其中所述固體收集區(qū)（57)具有一個(gè)或多個(gè) 用于去除所述固體的饋入裝置（89)或適配件（88)。
5. 權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的傾斜通道固體分離器，包含位于內(nèi)部的至少一個(gè)一次性傳 感器。
6. 權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的傾斜通道固體分離器，其中所述分離區(qū)由堆疊板（1)中相 互鄰近排列的多個(gè)通道組成。
7. 權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的傾斜通道固體分離器，其中支柱高度與通道寬度的比率 hs/d為0. 01 < hs/d < 5,其中兩個(gè)尺寸hs和d的限制為均大于或等于3_。
8. 權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的傾斜通道固體分離器，其包含流體通過的可滅菌的塑 料袋（50)，在所述塑料袋（50)中： -在所述塑料袋（50)的上部區(qū)域，用于從所述收獲流收集區(qū)（56)去除與固體分離的收 獲流（70)的饋入裝置/適配件（80)， -在所述塑料袋（50)的中央?yún)^(qū)域的上段，具有由單層或多層塑料網(wǎng)板組成的堆疊板 (1)的分離區(qū)， -在所述塑料袋（50)的中央?yún)^(qū)域的下段，饋入裝置或適配件（84)具有水平分布器 (85)，用于經(jīng)由橫進(jìn)表面面積（510)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液（74)的均勻水平流分布， -在所述塑料袋（50)的下部區(qū)域，以圓錐的方式向下漸縮的固體收集區(qū)（57)用于借助 重力收集所述固體。
9. 權(quán)利要求8的傾斜通道固體分離器，其中所述通道的通道長度L為所述塑料袋的長 度 LK 的 30% -95%。
10. 權(quán)利要求8或9的傾斜通道固體分離器，其包含用于容納所述固體分離器的容器， 其中所述容器具有至少一個(gè)用于容納所述固體分離器的內(nèi)部和一個(gè)用于將所述固體分離 器從上方裝入所述容器內(nèi)的開口，其中所述內(nèi)部具有與所述固體分離器的形狀相匹配的 壁，所述壁圍繞所述內(nèi)部并將其與外界劃分開。
11. 權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的傾斜通道固體分離器，其中： -所述固體分離器的上部區(qū)域?yàn)榫哂惺斋@流收集區(qū)（56)的收集器，連接至 -由單層或多層塑料網(wǎng)板組成的堆疊板（1)形成的分離區(qū)，該分離區(qū)形成網(wǎng)板基體，所 述網(wǎng)板基體被插塞到頂部和底部處的插塞板中，并連接至 -所述固體分離器的下段，其具有一個(gè)或多個(gè)饋入裝置或適配件（84)，用于所述反應(yīng) 器混合物（74)的流分布，下方是 -固體收集區(qū)（57)，其以圓錐的方式向下漸縮，用于借助重力收集所述細(xì)胞， -其中所述下段和以圓錐方式向下漸縮的固體收集區(qū)（57)是一個(gè)漏斗，并且 -其中所述固體分離器的所有元件都由塑料組成。
12. -種生物反應(yīng)器單元，其包含生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器連接至根據(jù)權(quán)利要求 2-11中任一項(xiàng)的傾斜通道固體分離器。
【文檔編號(hào)】C12M1/04GK104126001SQ201380010084
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月20日
【發(fā)明者】A·帕斯托, J·塞里斯基, H·布羅德, J·考靈, P·康默 申請(qǐng)人:拜耳技術(shù)服務(wù)有限公司, 拜耳知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限責(zé)任公司