基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，發(fā)明人利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出帶有綠色熒光蛋白的重組病毒rRV-eGFP，并運(yùn)用該重組病毒改進(jìn)了國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)抗狂犬病毒中和抗體效價(jià)的RFFIT法，從而建立了行之有效的改良RFFIT-eGFP方法。本發(fā)明改善了RFFIT方法的檢測(cè)效果，與標(biāo)準(zhǔn)的RFFIT法相比具有一致性良好、特異性強(qiáng)、安全性好，無需昂貴的一抗和FITC標(biāo)記的二抗，更加快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)RFFIT法用毒力強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)攻毒株CVS-11株和耗時(shí)較長(zhǎng)等問題。
【專利說明】基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于狂犬病病毒中和抗體的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病(Rabies)是由嗜神經(jīng)性的狂犬病病毒(Rabies Virus, RV)引起的人獸共患的世界性傳染病，是一種古老的疾病，能感染所有溫血?jiǎng)游?。全球每年死于狂犬病的人?shù)約55000人(WHO數(shù)據(jù))，主要集中在亞洲和非洲等一些落后的國(guó)家和地區(qū)。我國(guó)患狂犬病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，僅次于印度，狂犬病已成為我國(guó)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。一旦出現(xiàn)狂犬病癥狀，致死率接近100%，目前尚無有效治療藥物。犬是我國(guó)人類狂犬病的主要傳染源，占85%?95%，因此，加強(qiáng)犬的暴露前免疫和人暴露后處理是防制狂犬病的根本措施。WHO規(guī)定，人和動(dòng)物血清中狂犬病病毒中和抗體效價(jià)大于0.5IU/mL時(shí)，即可獲得完全保護(hù)。70%的犬獲得免疫時(shí)，基本上可控制犬對(duì)人類的傳播。隨著免疫密度的加大，需要建立有效的檢測(cè)手段來監(jiān)控免疫效果。
[0003]目前，狂犬病病毒中和抗體定量檢測(cè)的方法主要有小鼠血清中和試驗(yàn)、空斑減少中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、快速免疫熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)和熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)。其中，WHO和OIE分別推薦RFFIT和FAVN作為狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。這兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性好，在結(jié)果判定時(shí)，受主觀因素影響較小。然而，RFFIT和FAVN以狂犬病病毒CVS-1l株作為標(biāo)準(zhǔn)攻毒株,毒力較強(qiáng),存在潛在的安全隱患；同時(shí)操作較復(fù)雜，需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件和熟練的操作人員；而且需要質(zhì)量好且昂貴的特異性抗狂犬病病毒的一抗和FITC標(biāo)記的二抗，不利于基層檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體水平。因此，建立新型安全、經(jīng)濟(jì)、快速的狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)方法是現(xiàn)實(shí)需要。
[0004]我國(guó)的家犬?dāng)?shù)量龐大，主要養(yǎng)于農(nóng)村，狂犬病也主要發(fā)生在農(nóng)村。目前對(duì)狂犬病血清抗體的監(jiān)測(cè)主要依賴于地級(jí)市和縣二級(jí)的疫控中心或動(dòng)物疫控中心，因此盡可能簡(jiǎn)便、易操作、特異、敏感的方法才可能被推廣應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、安全經(jīng)濟(jì)、操作快速簡(jiǎn)便的基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，以方便基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)人和犬等動(dòng)物血清中狂犬病中和抗體滴度。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出具有融合表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)的狂犬病弱毒株 rRV-eGFP,將該毒株與560C 30min滅活的待檢血清37°C作用一小時(shí)后，接種到BHK-21細(xì)胞上，48小時(shí)后直接在熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
[0007]上述基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，利用兩倍系列稀釋的預(yù)滅活的犬或人血清與等體積的10TCID5ci的rRV-eGFP株混勻，于37°C 5% CO2作用I小時(shí)后接種到約2X 14個(gè)BHK-21的96孔板中，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光。
[0008]上述基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0009](I)血清的準(zhǔn)備
[0010]將待檢測(cè)和OIE標(biāo)準(zhǔn)血清于56°C水浴作用30分鐘，取100 μ L犬或人血清按兩倍系列稀釋(2—1?2_7)；
[0011](2)血清與重組病毒相互作用
[0012]分別取50 μ L系列稀釋好的血清于滅菌離心管中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每管加入等體積10TCID5ci的重組病毒液，混勻，于37°C培養(yǎng)箱作用I小時(shí)；
[0013](3)取上述處理的100 μ L血清與病毒混合液加入到事先培養(yǎng)成2 X 14個(gè)ΒΗΚ-21細(xì)胞的96孔板中，于37°C 5% CO2孵育I小時(shí)，吸出血清與病毒混合液，加入含2%胎牛血清的DMEM，于37°C 5% CO2溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光。
[0014]狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制備方法，包括以下步驟:
[0015](I)重組狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA構(gòu)建
[0016]利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將eGFP基因與狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具體操作過程按以下步驟進(jìn)行:
[0017]以prRC_HL(+)質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增出P-1基因和M-2基因部分，以peGFP-Nl質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出eGFP部分，利用重疊PCR將這三段基因融合擴(kuò)增在一起，命名為P+eGFP，克隆到pMD18-T載體中，隨后利用酶切位點(diǎn)Spe I和Sac II將融合的P+eGFP基因片段置換到prRC-HL(+)質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pRV-eGFP ；
[0018](2)制備拯救重組病毒rRV-eGFP
[0019]于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BSR-T7細(xì)胞至70%單層，約為I X 15個(gè)細(xì)胞時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用無血清的Opt1-MEM(IX)洗滌細(xì)胞兩次，然后加入室溫已靜置20分鐘的混合轉(zhuǎn)染試劑:2 μ g pRV-eGFP,0.4 μ g ρ_Ν、0.1 μ g ρ_Ρ、0.2 μ g p_L 和 3 μ L 的脂質(zhì)體混勻物，4 小時(shí)后吸出轉(zhuǎn)染試劑加入5%胎牛血清培養(yǎng)基，3天后補(bǔ)加200 μ L的維持液，5天后收獲病毒。
[0020]擴(kuò)增的引物具有以下堿基序列:
[0021]P-F:5，-tcaacccagatcactagtcaagagcc-3，，
[0022]P-R:5，-catggtggcgctagcgcaagatgcatagcgat-3，；
[0023]eGFP-F:5?-gcatcttgcgctagcgccaccatggtgagcaag-3’ ，
[0024]eGFP-R:5’ -agttcggagcggccgcttacttgtacagctcgt-3’ ；
[0025]M-F:5’-caagtaagcggccgctccgaactcttaaactcag-3’，
[0026]M-R:5，-caagtgatgagcccgcgggatatagt-3，。
[0027]P+eGFP融合基因，具有序列表SEQ.1D.N0.1的減基序列。
[0028]上述P+eGFP融合基因在制備基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)試劑盒方面的應(yīng)用。
[0029]上述P+eGFP融合基因的制備方法，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將eGFP基因與狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合。
[0030]針對(duì)目前狂犬病毒中和抗體檢測(cè)方法存在的問題，發(fā)明人利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出帶有綠色熒光蛋白的重組病毒rRV-eGFP，并運(yùn)用該重組病毒改進(jìn)了國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)抗狂犬病毒中和抗體效價(jià)的RFFIT法，從而建立了行之有效的基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法(改良RFFIT-eGFP方法)。本發(fā)明改善了 RFFIT方法的檢測(cè)效果，與標(biāo)準(zhǔn)的RFFIT法相比具有一致性良好、特異性強(qiáng)、安全性好，無需昂貴的一抗和FITC標(biāo)記的二抗，更加快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)RFFIT法用毒力強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)攻毒株CVS-1l株和耗時(shí)較長(zhǎng)等問題。
[0031]本發(fā)明具有以下突出優(yōu)勢(shì):
[0032](I)安全穩(wěn)定:標(biāo)準(zhǔn)的RFFIT法使用的是強(qiáng)毒株CVS-1l株，存在一定的散毒隱患；而本發(fā)明以日本動(dòng)物用疫苗株RC-HL為基礎(chǔ)，該毒株毒力低，腦內(nèi)注射不能致小白鼠死亡。拯救出表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒rRV-eGFP與親本株rRC_HL生長(zhǎng)特性相近，與CVS-1l株相比毒力弱，安全性好，不存在散毒隱患。
[0033](2) rRV-eGFP的P蛋白融合表達(dá)eGFP，使eGFP成為RV核衣殼構(gòu)造的一部分，易于跟蹤RV。
[0034](3)能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，特異性熒光分布在細(xì)胞核周邊，呈點(diǎn)狀，較大的圓形、橢圓形斑點(diǎn)狀或顆粒狀，熒光點(diǎn)清晰，亮度高。最直接觀測(cè)病毒發(fā)出的熒光，直觀判斷效果好，易于識(shí)別，不需考慮非特異熒光，排除假陽性或假陰性結(jié)果。
[0035](4)特異性好:本發(fā)明與標(biāo)準(zhǔn)的RFFIT法一致性良好，操作步驟更加簡(jiǎn)單，結(jié)果判斷直觀、更加易行。
[0036](5)經(jīng)濟(jì)快速:本發(fā)明無需固定和免疫染色細(xì)胞，也節(jié)約了昂貴的一抗和FITC標(biāo)記的二抗，減少了 IFA(—抗、二抗反應(yīng)步驟)染色步驟,更加快速簡(jiǎn)便。
[0037](6)材料易獲取:rRV-eGFP病毒可接種至易感細(xì)胞NA上，進(jìn)行大量增殖，容易獲取。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1是重組狂犬病病毒rRV-eGFP株的構(gòu)建示意圖。
[0039]圖2是重疊PCR擴(kuò)增P+eGFP基因產(chǎn)物電泳圖。
[0040]圖3是構(gòu)建P+eGFP基因重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。
[0041]圖4是拯救的重組病毒rRV-eGFP接種NA細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察圖。
[0042]圖5是RT-PCP鑒定重組病毒rRV-eGFP接毒細(xì)胞后上清的eGFP基因鑒定電泳圖。
[0043]圖6是重組病毒rRV-eGFP的eGFP表達(dá)穩(wěn)定性的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0044]圖7是Western blot鑒定rRC-HL的P蛋白結(jié)果圖。
[0045]圖8是免疫染色定位P蛋白結(jié)果圖。
[0046]圖9是rRV-eGFP與rRC_HL兩種病毒的多步生長(zhǎng)曲線。
[0047]圖10是rRV-eGFP與rRC-HL —步生長(zhǎng)曲線。
[0048]圖11是rRV-eGFP與rRC_HL病毒感染昆明小鼠的體重變化圖。
[0049]圖12是運(yùn)用本發(fā)明建立的RFFIT-eGFP法與RFFIT檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0050]以下結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0051]實(shí)施例1
[0052]1、材料的準(zhǔn)備
[0053]狂犬病毒株RC-HL、pRC-HL(+)、輔助質(zhì)粒p_N、p_P和p_L由日本岐阜大學(xué)惠贈(zèng)，BSR-T7細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、NA細(xì)胞和peGFP-Nl載體由 申請(qǐng)人:保存，抗狂犬病病毒P多克隆抗體由 申請(qǐng)人:制備并保存，狂犬病疫苗(法國(guó)梅里亞)免疫和未免疫的犬血清樣品由廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，血清來源于隆安縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。4周齡昆明小鼠購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0054]2、構(gòu)建重組病毒的引物設(shè)計(jì)與合成
[0055]根據(jù)GenBank中RC-HL毒株P(guān)和M序列及eGFP序列，利用01igo6.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)重疊PCR的引物。引物P-F和P-R擴(kuò)增P-1基因，引物M-F和M-R擴(kuò)增M-2基因，引物eGFP-F和eGFP-R擴(kuò)增綠色熒光蛋白(eGFP)基因，其序列如表I。
[0056]表I構(gòu)建新型重組質(zhì)粒pRV-eGFP所使用的引物
[0057]
jJ I物名稱1JI種!序列(5’到3’)位置 |^度

Tcaacccagatcaclagtcaagagcc SEQ.1D.No, I
P'F(_底線部分為Spc Ilfi切.位點(diǎn))1947-1972 必9
P-R Calgglggcgctagcgcaagatgcatagcgat SEQ.lD.N0.22389-2405
M-F Caaglaagcggccgclccgaactcttaaaclcag SEQ.1D.N0.52409-2426
Caaglgalgagcccgcgggatatagl SEQJD.N0.6777
'—(劃底線部分為Sae II酶切位點(diǎn))311.3135
eGFP-F Gcatcttgcgclagcgccaccatggtgagcaag SEQiD.No,3




745
eGFP-R AgitcggagcggccgcUacUgtacagctcgi SEQJD,No,4'
[0058]3、重組質(zhì)粒pRV-eGFP的構(gòu)建(圖1、圖2和圖3)
[0059]利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將eGFP基因與狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具體操作過程按以下步驟進(jìn)行:
[0060]以pRC-HL (+)質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增出P-1基因和M-2基因部分，以peGFP-Nl質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出eGFP部分，利用重疊PCR法將這三段基因融合擴(kuò)增在一起，命名為P+eGFP (SEQ.1D.N0.7)，克隆到pMD18_T載體中，隨后利用酶切位點(diǎn)Spe I和Sac II將融合的P+eGFP基因片段插入到pRC-HL (+)質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pRV-eGFP。
[0061 ] 4、重組病毒rRV-eGFP的拯救
[0062]于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BSR-T7細(xì)胞至70%單層約I X 15個(gè)細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，用無血清的Opt1-MEM(IX)洗滌細(xì)胞2次，然后加入室溫已靜置20分鐘的混合轉(zhuǎn)染試劑:
2μ gpRV-eGFP、0.4 μ g ρ_Ν、0.1 μ g ρ_Ρ、0.2 μ g p_L 和 3 μ L 的脂質(zhì)體混勻物；4 小時(shí)后吸出轉(zhuǎn)染試劑加入5%胎牛血清培養(yǎng)基，3天后補(bǔ)加200 μ L的維持液，5天后收獲重組病毒。拯救的重組病毒rRV-eGFP第5天的細(xì)胞上清接種NA細(xì)胞后24小時(shí)直接在熒光顯微鏡下直接觀察特異性熒光(圖4)，證明成功拯救出重組病毒。
[0063]4.1重組病毒攜帶eGFP基因的鑒定
[0064]為了確認(rèn)拯救的重組病毒攜帶有eGFP基因，從收獲的病毒上清抽提得到RNA，用Oligo (dT) 18作為下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以引物eGFP-F和eGFP-R擴(kuò)增得到包括eGFP基因ORF在內(nèi)的745bp的基因片段，將其克隆到pMD_18T載體上，經(jīng)測(cè)序完全正確(圖5)。
[0065]eGFP表達(dá)穩(wěn)定性的檢測(cè):將rRV-eGFP在NA細(xì)胞中連續(xù)傳代5次，分別取各代次細(xì)胞上清，倍比系列稀釋后，接種96孔板上NA細(xì)胞，12小時(shí)后在熒光顯微鏡下可見明亮的特異性綠色熒光，36小時(shí)后可見細(xì)胞全部出現(xiàn)特異性綠色熒光，表明rRV-eGFP能夠穩(wěn)定表達(dá) eGFP (圖 6)。
[0066]4.2拯救重組病毒rRV-eGFP的P蛋白與eGFP蛋白融合表達(dá)的鑒定
[0067]為了確定P基因與eGFP基因?yàn)槿诤媳磉_(dá),Western blot檢測(cè)顯不rRC_HL的P蛋白分子量大約為40kDa，eGFP的分子量為27KDa，而rRV-eGFP的P蛋白大約為67kDa，表明重組的病毒P基因與eGFP為融合表達(dá)(圖7)。
[0068]同時(shí)用免疫染色定位P蛋白，結(jié)果證實(shí)rRV-eGFP的P蛋白與eGFP在細(xì)胞內(nèi)共定位，細(xì)胞熒光為P蛋白的顆粒狀蛋白顆粒，確認(rèn)P基因與eGFP融合表達(dá)(圖8)。
[0069]4.3重組病毒的特異性熒光鑒定
[0070]重組病毒rRV-eGFP感染細(xì)胞(NA或BHK-21)后，可在熒光顯微鏡下直接觀察病毒熒光，特異性病毒熒光主要分布在細(xì)胞核周邊，呈點(diǎn)狀，較大的圓形、橢圓形斑點(diǎn)狀或顆粒狀，熒光點(diǎn)清晰，亮度高(圖4)。
[0071 ] 4.4重組病毒rRV-eGFP生長(zhǎng)特性
[0072]將拯救重組病毒rRV-eGFP和親本毒株rRC_HL分別按MOI = 0.1或2接種于NA細(xì)胞，37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)，分別于感染后0、6、12、24、36和48小時(shí)收獲上清，并在BHK-21細(xì)胞上測(cè)定病毒滴度，繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。rRV-eGFP與親本毒株rRC-HL生長(zhǎng)特性比較，兩種病毒的一步或多步生長(zhǎng)曲線相似，顯示兩種病毒的生長(zhǎng)特性相近，表明P基因與eGFP的融合表達(dá)對(duì)毒株的生長(zhǎng)特性無顯著影響(圖9和圖10)。
[0073]4.5重組rRV-eGFP病毒致病性試驗(yàn)
[0074]分別取1000FFU/mL的狂犬病病毒rRV-eGFP和rRC_HL稀釋到30 μ L的PBS里，腦內(nèi)注射4周齡的昆明小鼠，每組注射5只，同時(shí)以DMEM做空白對(duì)照，每日觀察小鼠的體重和存活率變化，連續(xù)觀察21天。結(jié)果顯示rRV-eGFP與親本毒株rRC-HL都為弱毒株，都未致死昆明小鼠，體重變化也無明顯差異(圖11)。
[0075]5、標(biāo)準(zhǔn)RFFIT法檢測(cè)犬血清抗狂犬病毒中和抗體的主要步驟
[0076]將33份待檢測(cè)的犬血清于56°C水浴作用30分鐘，取100 μ L犬血清在96孔板中按兩倍系列稀釋(2—1?2_7)，分別取50 μ L血清于滅菌離心管中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每管加入等體積10TCID5ci的狂犬病毒株rRC-HL混勻，于37°C培養(yǎng)箱作用I小時(shí)；取上述處理的100 μ L血清與病毒混合液加入到約含2X 14個(gè)ΒΗΚ-21細(xì)胞的96孔板中，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育I小時(shí)，PBS洗滌2次，吸出血清與病毒混合液，加入含2%胎牛血清的DMEM，于37°C 5% CO2培養(yǎng)48小時(shí)，棄上清，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的丙酮甲醇(1:1)固定液固定，棄去固定液，加入30 μ L抗狂犬病毒P多克隆抗體，37°C孵育I小時(shí)；用PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，每孔加入30 μ L FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗，37°C孵育I小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察突光。
[0077]6、本發(fā)明新型改良RFFIT-eGFP法檢測(cè)犬血清抗狂犬病毒中和抗體的主要步驟
[0078](I)血清的準(zhǔn)備
[0079]將待檢測(cè)和OIE標(biāo)準(zhǔn)血清于56°C水浴作用30分鐘，取100 μ L犬或人血清按兩倍系列稀釋(2—1?2_7)；
[0080](2)血清與重組病毒相互作用
[0081 ] 分別取50 μ L系列稀釋好的血清于滅菌離心管中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每管加入等體積10TCID5ci的rRV-eGFP株重組病毒液，混勻，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱作用I小時(shí)；
(3)取上述處理的100 μ L血清與病毒混合液加入到事先培養(yǎng)成2 X 14個(gè)BHK-21細(xì)胞的96孔板中，于37°C 5% CO2孵育I小時(shí)，吸出血清與病毒混合液，PBS洗滌2次，加入含2%胎牛血清的DMEM，于37°C 5% CO2溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光。
[0082]若有綠色熒光，則該稀釋度的血清不能完全中和病毒；若無綠色熒光，則該稀釋度的血清能完全中和病毒；根據(jù)能中和病毒的血清最高稀釋度對(duì)比OIE標(biāo)準(zhǔn)血清算出該血清的抗狂犬病毒中和抗體效價(jià)。
[0083]取33份待檢測(cè)的犬血清，按上述步驟檢測(cè)，結(jié)果如圖12。
[0084]7、RFFIT法和RFFIT-eGFP法檢測(cè)結(jié)果的比較(表2和圖12)
[0085]用二種方法對(duì)33份犬血清狂犬病毒中和抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，盡管檢測(cè)值稍有差異，對(duì)疫苗免疫的23份血清結(jié)果分析顯示，12份血清的RFFIT值略為高于RFFIT-eGFP法。其它11份血清的RFFIT值則輕度低于RFFIT-eGFP法，而未免疫犬血清的中和抗體均為O?？傮w結(jié)果相關(guān)性一致，表明本發(fā)明新型的RFFIT-eGFP法檢測(cè)犬血清抗狂犬病毒中和抗體具有很高的準(zhǔn)確性。由于應(yīng)用拯救的重組病毒rRV-eGFP，毒力比CVS-1l更弱而穩(wěn)定，說明本發(fā)明的方法與WHO標(biāo)準(zhǔn)RFFIT法相比更具有安全、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)。
[0086]表2 RFFIT法和RFFIT-eGFP法檢測(cè)犬血清狂犬病毒中和抗體效價(jià)的比較
[0087]

【權(quán)利要求】
1.一種基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，其特征在于:利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出具有融合表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的狂犬病弱毒株rRV-eGFP，將該毒株與560C 30min滅活的待檢血清37°C作用一小時(shí)后，接種到BHK-21細(xì)胞上，48小時(shí)后直接在熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，其特征在于:利用兩倍系列稀釋的預(yù)滅活的犬或人血清與等體積的10TCID5ci的rRV-eGFP株混勻，于37°C 5% CO2作用I小時(shí)后接種到約2 X 14個(gè)BHK-21的96孔板中，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)血清的準(zhǔn)備 將待檢測(cè)和OIE標(biāo)準(zhǔn)血清于56°C水浴作用30分鐘，取100 μ L犬或人血清按兩倍系列稀釋； (2)血清與重組病毒相互作用 分別取50 μ L系列稀釋好的血清于滅菌離心管中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每管加入等體積10TCID5ci的重組病毒液，混勻，于37°C培養(yǎng)箱作用I小時(shí)； (3)取上述處理的100μ L血清與病毒混合液加入到事先培養(yǎng)成2 X 14個(gè)BHK-21細(xì)胞的96孔板中，于37°C 5% CO2孵育I小時(shí)，吸出血清與病毒混合液，加入含2%胎牛血清的DMEM，于37°C 5% CO2溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光。
4.一種狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)重組狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA構(gòu)建 利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將eGFP基因與狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具體操作過程按以下步驟進(jìn)行: 以prRC-HL(+)質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增出P-1基因和M-2基因部分，以peGFP-Nl質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出eGFP部分，利用重疊PCR將這三段基因融合擴(kuò)增在一起，命名為P+eGFP，克隆到pMD18-T載體中，隨后利用酶切位點(diǎn)Spe I和Sac II將融合的P+eGFP基因片段置換到prRC-HL(+)質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pRV-eGFP ； (2)制備拯救重組病毒rRV-eGFP 于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BSR-T7細(xì)胞至70%單層，約為I X 15個(gè)細(xì)胞時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用無血清的Opt1-MEM(IX)洗滌細(xì)胞兩次，然后加入室溫已靜置20分鐘的混合轉(zhuǎn)染試劑:2μ g pRV-eGFP、0.4μ g ρ_Ν、0.1 μ g ρ-Ρ,Ο.2μ g p_L 和 3 μ L 的脂質(zhì)體混勻物，4 小時(shí)后吸出轉(zhuǎn)染試劑加入5%胎牛血清培養(yǎng)基，3天后補(bǔ)加200 μ L的維持液，5天后收獲病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制備方法，其特征在于:所述擴(kuò)增的引物具有以下喊基序列:
P-F:5’-tcaacccagatcactagtcaagagcc-3’，
P-R:5’-catggtggcgctagcgcaagatgcatagcgat-3’ ；
eGFP-F:5?-gcatcttgcgctagcgccaccatggtgagcaag-3’ ，
eGFP-R:5’-agttcggagcggccgcttacttgtacagctcgt-3’ ；
M-F:5J-caagtaagcggccgctccgaactcttaaactcag-3J，
M-R:5?-caagtgatgagcccgcgggatatagt-3J 0
6.P+eGFP融合基因，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列。
7.權(quán)利要求1所述P+eGFP融合基因在制備基于拯救重組狂犬病弱毒的新型中和抗體檢測(cè)試劑盒方面的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述P+eGFP融合基因的制備方法，其特征在于利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將eGFP基因與狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104198446SQ201410348108
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】羅廷榮, 唐海波, 鐘一治, 韋顯凱, 陸專靈, 李曉寧, 廖素環(huán), 梁晶晶 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)