一種高效提取動(dòng)物組織dna的方法
一種高效提取動(dòng)物組織dna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，包括以下步驟：（1）選取動(dòng)物組織樣品，加入緩沖液A和蛋白酶K溶液，得混合物；（2）將混合物置于孵育設(shè)備中，調(diào)節(jié)溫度為55~58℃，孵育2~5h，得樣品懸濁液；（3）將樣品懸濁液震蕩后，加入氯化鈉溶液，混勻，離心，取上清液；（4）在步驟（3）所得的上清液中加入異丙醇，混勻，離心，去上清液，得沉淀；（5）采用乙醇水溶液洗去沉淀中殘留的異丙醇，離心后靜置除去乙醇，所得沉淀物即為動(dòng)物組織DNA。該方法抽提動(dòng)物組織樣品DNA得率高，步驟簡(jiǎn)單，對(duì)人體無(wú)危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，能快速抽提大量樣本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于DNA提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)物組織中含有大量的DNA，DNA是染色體的主要化學(xué)成分，同時(shí)也是組成基因的 材料。DNA分子的功能是貯存決定物種性狀的幾乎所有蛋白質(zhì)和RNA分子的全部遺傳信息， 編碼和設(shè)計(jì)生物有機(jī)體在一定的時(shí)空中有序地轉(zhuǎn)錄基因和表達(dá)蛋白完成定向發(fā)育的所有 程序，初步確定了生物獨(dú)有的性狀和個(gè)性以及和環(huán)境相互作用時(shí)所有的應(yīng)激反應(yīng)。因此通 過(guò)對(duì)DNA的研究，如DNA甲基化、堿基缺失、突變等狀況、可以間接了解或評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體的生 理狀態(tài)及對(duì)外界的反應(yīng)情況。而建立高效、準(zhǔn)確的DNA抽提方法也成為了動(dòng)物分子機(jī)理研 究的一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵所在。
[0003] 動(dòng)物組織DNA的提取的主要目標(biāo)是獲取最高含量及最高純度的DNA回收，并進(jìn)一 步應(yīng)用DNA作為研究對(duì)象通過(guò)各種方法進(jìn)行研究。但是動(dòng)物組織構(gòu)成復(fù)雜，包括脂類(lèi)、蛋白 質(zhì)，碳水化合物，維生素、礦物元素等，對(duì)DNA的提取有影響，尤其是脂類(lèi)、蛋白質(zhì)與DNA交 織在一起，難以去除干凈。此外，細(xì)胞裂解后抽提DNA的每一個(gè)步驟都會(huì)有DNA的損失，因 此步驟越多，損失的幾率就越大。另外，目前大多沿用的方法中，均涉及酚/氯仿試劑的應(yīng) 用，容易造成環(huán)境污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者的人體健康也有危害。而且操作步驟復(fù)雜，DNA收率 低，難以快速抽提大量樣本。
[0004] 因此，需要研究適用于動(dòng)物組織DNA提取的方便、快捷、實(shí)用的方法，以解決使用 常規(guī)方法所獲取的DNA樣品得率低，操作步驟繁瑣等問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用于高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，該 方法抽提動(dòng)物組織樣品DNA得率高，步驟簡(jiǎn)單，對(duì)人體無(wú)危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，能快速抽提 大量樣本。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)問(wèn)題來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種高效提取動(dòng)物組 織DNA的方法，包括以下步驟： (1) 選取動(dòng)物組織樣品，加入緩沖液A和蛋白酶K溶液，得混合物； (2) 將混合物置于孵育設(shè)備中，調(diào)節(jié)溫度為55~58°C，孵育2~5h，得樣品懸池液； (3) 將樣品懸濁液震蕩后，加入氯化鈉溶液，混勻，離心，取上清液； (4) 在步驟（3)所得的上清液中加入異丙醇，混勻，離心，去上清液，得到沉淀物； (5) 采用乙醇水溶液洗去沉淀物中殘留的異丙醇，離心后靜置除去乙醇，所得沉淀物即 為動(dòng)物組織DNA。
[0007] 步驟（1)中所述的緩沖液 A 由 30~80mM Tris、50~200mM EDTA、50~200mM NaCl、 1~3% (質(zhì)量體積百分含量）十二烷基磺酸鈉SDS組成，其pH為7. 5~8.0。
[0008] 在該緩沖液A中，各組分具有如下作用： 由于DNA在弱的堿性環(huán)境中最穩(wěn)定，因此緩沖液A的pH值有益于DNA的穩(wěn)定，Tris的 作用主要是與NaCl形成一定的弱堿性緩沖液，維持溶液pH平衡。
[0009] EDTA中的螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，可以抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作 用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基)。
[0010] NaCl主要是與Tris形成一定的弱堿性緩沖液，維持溶液pH平衡，提供一定的鹽離 子濃度，維持DNA所處的環(huán)境穩(wěn)定。
[0011] SDS是離子型表面活性劑，它主要功能有：（1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因 而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；（2)解聚細(xì)胞中的核蛋白；（3) SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為 R-0-S03-…R + -蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。
[0012] 蛋白酶K的作用是消化蛋白，由于DNA與蛋白質(zhì)交織在一起，需要將蛋白消化后， DNA游離出來(lái)，才能進(jìn)行抽提。
[0013] 步驟（1)中動(dòng)物組織樣品、緩沖液A和蛋白酶K溶液的用量關(guān)系優(yōu)選為5~10mg : 50~100ML :2~4ML，其中蛋白酶K溶液的濃度為10~20mg/mL。
[0014] 步驟（3)中氯化鈉溶液的濃度優(yōu)選為3~6 mol噸'其與樣品懸濁液的體積比優(yōu)選 為1:2?4。
[0015] 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaCl，使Na+中和 DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽 沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉 淀不完全。因此高濃度的氯化鈉溶液有利于去除蛋白質(zhì)，沉淀DNA。
[0016] 步驟（3)中離心時(shí)的條件優(yōu)選為在4°C條件下10000~14000rpm離心10~15min。
[0017] 步驟（4)中異丙醇與上清液的體積比優(yōu)選為1:1. 2~1. 6。異丙醇的作用：使蛋白 質(zhì)與DNA進(jìn)行徹底分離。
[0018] 步驟（4)中離心時(shí)的條件優(yōu)選為在4°C條件下10000~14000rpm離心15~20min。
[0019] 步驟（5)中所述的乙醇水溶液的體積百分含量?jī)?yōu)選為70~75%。
[0020] 步驟（5)中離心時(shí)的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心5~10min。
[0021] 本發(fā)明獲得的動(dòng)物組織DNA可以加入H20,混勻，置于-20°C條件下保存或直接用 于DNA分析。
[0022] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明中的DNA提取方法操作簡(jiǎn)單，不需要較為復(fù)雜的設(shè)備，常規(guī)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 就可完成；并且涉及的試劑均為常規(guī)分析、分子生物學(xué)使用的試劑，相對(duì)于市場(chǎng)上的試劑盒 成本低； (2 )本發(fā)明中的DNA提取方法適用性強(qiáng)，提取的DNA的0D260/0D280接近標(biāo)準(zhǔn)值，可直 接應(yīng)用于分子操作，效果較好； (3 )本發(fā)明中的DNA提取方法提取過(guò)程不使用酚、氯仿，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康傷 害、所獲DNA較為完整，產(chǎn)量較高。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0024] Tris (三羧基甲基氨基甲烷）、1^8、11(：14014(乙二胺四乙酸二鈉）、恥(：1、乙醇、 SDS (十二烷基硫酸鈉）、異丙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純藥品，蛋白酶K來(lái)源于sigma公司。
[0025] 實(shí)施例1提取豬的肌肉組織DNA (1) 剪取l〇〇mg豬的肌肉組織樣品，加入750 y L緩沖液A，37. 5 y L質(zhì)量濃度為10mg/ mL的蛋白酶K溶液，其中緩沖液A由30mM Tris、50mM EDTA、50mM NaCl、l% (質(zhì)量體積百分 含量）十二烷基磺酸鈉SDS組成，其pH為7. 5~8. 0 ; (2) 將上述混合物置于55~58°C孵育器(水浴鍋或小型電子孵育設(shè)備)中3小時(shí)，得樣品 懸濁液； (3) 震蕩約1分鐘，在樣品懸濁液中加入250 y L濃度為6 mol ? I71的氯化鈉溶液，混 勻，4°C條件下14000rpm離心10分鐘； (4) 轉(zhuǎn)移上清液750 y L至新的離心管中； (5) 在上清液中加入500 yL異丙醇，用力混合均勻(漩渦震蕩1分鐘)，4°C條件下 14000rpm離心20分鐘，去上清液，得沉淀物； (6) 加入lmL體積百分含量為75%的乙醇水溶液洗掉管中殘余的異丙醇，在4°C條件下 14000rpm離心10分鐘； (7) 室溫下放置，讓乙醇揮發(fā)干凈，管底部即為分離到的豬的肌肉組織DNA ; (8) 加100 ii LH20，混勻，用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及0D260/0D280值，結(jié)果如下： 表1本實(shí)施例方法獲得的DNA和用目前市面上的DNA抽提試劑盒的對(duì)比
【權(quán)利要求】
1. 一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是包括以下步驟： (1) 選取動(dòng)物組織樣品，加入緩沖液A和蛋白酶K溶液，得混合物； (2) 將混合物置于孵育設(shè)備中，調(diào)節(jié)溫度為55~58°C，孵育2~5h，得樣品懸池液； (3) 將樣品懸濁液震蕩后，加入氯化鈉溶液，混勻，離心，取上清液； (4) 在步驟（3)所得的上清液中加入異丙醇，混勻，離心，去上清液，得沉淀； (5) 采用乙醇水溶液洗去沉淀中殘留的異丙醇，離心后靜置除去乙醇，所得沉淀物即為 動(dòng)物組織DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（1)中所述 的緩沖液A由30~80mM Tris、50~200mM EDTA、50~200mM NaCl和質(zhì)量體積百分含量為1~3% 十二烷基磺酸鈉 SDS組成，其pH為7. 5~8. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（1)中動(dòng)物 組織樣品、緩沖液A和蛋白酶K溶液的用量關(guān)系為5~10mg :50~100ML :2~4ML，其中蛋白酶K 溶液的濃度為10~20mg/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（3)中氯化鈉 溶液的濃度為3~6 mol ? L'
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（3)中離心時(shí) 的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心10~15min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（4)中異丙醇 與上清液的體積比為1:1. 2~1. 6。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（4)中離心時(shí) 的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心15~20min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（5)中所述的 乙醇水溶液的體積百分含量為70~75%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（5)中離心時(shí) 的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心5~10min。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104450676SQ201410414369
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】蔣宗勇, 馬現(xiàn)永, 胡友軍 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所, 廣東新南都飼料科技有限公司
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，包括以下步驟：（1）選取動(dòng)物組織樣品，加入緩沖液A和蛋白酶K溶液，得混合物；（2）將混合物置于孵育設(shè)備中，調(diào)節(jié)溫度為55~58℃，孵育2~5h，得樣品懸濁液；（3）將樣品懸濁液震蕩后，加入氯化鈉溶液，混勻，離心，取上清液；（4）在步驟（3）所得的上清液中加入異丙醇，混勻，離心，去上清液，得沉淀；（5）采用乙醇水溶液洗去沉淀中殘留的異丙醇，離心后靜置除去乙醇，所得沉淀物即為動(dòng)物組織DNA。該方法抽提動(dòng)物組織樣品DNA得率高，步驟簡(jiǎn)單，對(duì)人體無(wú)危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，能快速抽提大量樣本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于DNA提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)物組織中含有大量的DNA，DNA是染色體的主要化學(xué)成分，同時(shí)也是組成基因的 材料。DNA分子的功能是貯存決定物種性狀的幾乎所有蛋白質(zhì)和RNA分子的全部遺傳信息， 編碼和設(shè)計(jì)生物有機(jī)體在一定的時(shí)空中有序地轉(zhuǎn)錄基因和表達(dá)蛋白完成定向發(fā)育的所有 程序，初步確定了生物獨(dú)有的性狀和個(gè)性以及和環(huán)境相互作用時(shí)所有的應(yīng)激反應(yīng)。因此通 過(guò)對(duì)DNA的研究，如DNA甲基化、堿基缺失、突變等狀況、可以間接了解或評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體的生 理狀態(tài)及對(duì)外界的反應(yīng)情況。而建立高效、準(zhǔn)確的DNA抽提方法也成為了動(dòng)物分子機(jī)理研 究的一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵所在。
[0003] 動(dòng)物組織DNA的提取的主要目標(biāo)是獲取最高含量及最高純度的DNA回收，并進(jìn)一 步應(yīng)用DNA作為研究對(duì)象通過(guò)各種方法進(jìn)行研究。但是動(dòng)物組織構(gòu)成復(fù)雜，包括脂類(lèi)、蛋白 質(zhì)，碳水化合物，維生素、礦物元素等，對(duì)DNA的提取有影響，尤其是脂類(lèi)、蛋白質(zhì)與DNA交 織在一起，難以去除干凈。此外，細(xì)胞裂解后抽提DNA的每一個(gè)步驟都會(huì)有DNA的損失，因 此步驟越多，損失的幾率就越大。另外，目前大多沿用的方法中，均涉及酚/氯仿試劑的應(yīng) 用，容易造成環(huán)境污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者的人體健康也有危害。而且操作步驟復(fù)雜，DNA收率 低，難以快速抽提大量樣本。
[0004] 因此，需要研究適用于動(dòng)物組織DNA提取的方便、快捷、實(shí)用的方法，以解決使用 常規(guī)方法所獲取的DNA樣品得率低，操作步驟繁瑣等問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用于高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，該 方法抽提動(dòng)物組織樣品DNA得率高，步驟簡(jiǎn)單，對(duì)人體無(wú)危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，能快速抽提 大量樣本。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)問(wèn)題來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種高效提取動(dòng)物組 織DNA的方法，包括以下步驟： (1) 選取動(dòng)物組織樣品，加入緩沖液A和蛋白酶K溶液，得混合物； (2) 將混合物置于孵育設(shè)備中，調(diào)節(jié)溫度為55~58°C，孵育2~5h，得樣品懸池液； (3) 將樣品懸濁液震蕩后，加入氯化鈉溶液，混勻，離心，取上清液； (4) 在步驟（3)所得的上清液中加入異丙醇，混勻，離心，去上清液，得到沉淀物； (5) 采用乙醇水溶液洗去沉淀物中殘留的異丙醇，離心后靜置除去乙醇，所得沉淀物即 為動(dòng)物組織DNA。
[0007] 步驟（1)中所述的緩沖液 A 由 30~80mM Tris、50~200mM EDTA、50~200mM NaCl、 1~3% (質(zhì)量體積百分含量）十二烷基磺酸鈉SDS組成，其pH為7. 5~8.0。
[0008] 在該緩沖液A中，各組分具有如下作用： 由于DNA在弱的堿性環(huán)境中最穩(wěn)定，因此緩沖液A的pH值有益于DNA的穩(wěn)定，Tris的 作用主要是與NaCl形成一定的弱堿性緩沖液，維持溶液pH平衡。
[0009] EDTA中的螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，可以抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作 用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基)。
[0010] NaCl主要是與Tris形成一定的弱堿性緩沖液，維持溶液pH平衡，提供一定的鹽離 子濃度，維持DNA所處的環(huán)境穩(wěn)定。
[0011] SDS是離子型表面活性劑，它主要功能有：（1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因 而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；（2)解聚細(xì)胞中的核蛋白；（3) SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為 R-0-S03-…R + -蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。
[0012] 蛋白酶K的作用是消化蛋白，由于DNA與蛋白質(zhì)交織在一起，需要將蛋白消化后， DNA游離出來(lái)，才能進(jìn)行抽提。
[0013] 步驟（1)中動(dòng)物組織樣品、緩沖液A和蛋白酶K溶液的用量關(guān)系優(yōu)選為5~10mg : 50~100ML :2~4ML，其中蛋白酶K溶液的濃度為10~20mg/mL。
[0014] 步驟（3)中氯化鈉溶液的濃度優(yōu)選為3~6 mol噸'其與樣品懸濁液的體積比優(yōu)選 為1:2?4。
[0015] 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaCl，使Na+中和 DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽 沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉 淀不完全。因此高濃度的氯化鈉溶液有利于去除蛋白質(zhì)，沉淀DNA。
[0016] 步驟（3)中離心時(shí)的條件優(yōu)選為在4°C條件下10000~14000rpm離心10~15min。
[0017] 步驟（4)中異丙醇與上清液的體積比優(yōu)選為1:1. 2~1. 6。異丙醇的作用：使蛋白 質(zhì)與DNA進(jìn)行徹底分離。
[0018] 步驟（4)中離心時(shí)的條件優(yōu)選為在4°C條件下10000~14000rpm離心15~20min。
[0019] 步驟（5)中所述的乙醇水溶液的體積百分含量?jī)?yōu)選為70~75%。
[0020] 步驟（5)中離心時(shí)的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心5~10min。
[0021] 本發(fā)明獲得的動(dòng)物組織DNA可以加入H20,混勻，置于-20°C條件下保存或直接用 于DNA分析。
[0022] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明中的DNA提取方法操作簡(jiǎn)單，不需要較為復(fù)雜的設(shè)備，常規(guī)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 就可完成；并且涉及的試劑均為常規(guī)分析、分子生物學(xué)使用的試劑，相對(duì)于市場(chǎng)上的試劑盒 成本低； (2 )本發(fā)明中的DNA提取方法適用性強(qiáng)，提取的DNA的0D260/0D280接近標(biāo)準(zhǔn)值，可直 接應(yīng)用于分子操作，效果較好； (3 )本發(fā)明中的DNA提取方法提取過(guò)程不使用酚、氯仿，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康傷 害、所獲DNA較為完整，產(chǎn)量較高。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0024] Tris (三羧基甲基氨基甲烷）、1^8、11(：14014(乙二胺四乙酸二鈉）、恥(：1、乙醇、 SDS (十二烷基硫酸鈉）、異丙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純藥品，蛋白酶K來(lái)源于sigma公司。
[0025] 實(shí)施例1提取豬的肌肉組織DNA (1) 剪取l〇〇mg豬的肌肉組織樣品，加入750 y L緩沖液A，37. 5 y L質(zhì)量濃度為10mg/ mL的蛋白酶K溶液，其中緩沖液A由30mM Tris、50mM EDTA、50mM NaCl、l% (質(zhì)量體積百分 含量）十二烷基磺酸鈉SDS組成，其pH為7. 5~8. 0 ; (2) 將上述混合物置于55~58°C孵育器(水浴鍋或小型電子孵育設(shè)備)中3小時(shí)，得樣品 懸濁液； (3) 震蕩約1分鐘，在樣品懸濁液中加入250 y L濃度為6 mol ? I71的氯化鈉溶液，混 勻，4°C條件下14000rpm離心10分鐘； (4) 轉(zhuǎn)移上清液750 y L至新的離心管中； (5) 在上清液中加入500 yL異丙醇，用力混合均勻(漩渦震蕩1分鐘)，4°C條件下 14000rpm離心20分鐘，去上清液，得沉淀物； (6) 加入lmL體積百分含量為75%的乙醇水溶液洗掉管中殘余的異丙醇，在4°C條件下 14000rpm離心10分鐘； (7) 室溫下放置，讓乙醇揮發(fā)干凈，管底部即為分離到的豬的肌肉組織DNA ; (8) 加100 ii LH20，混勻，用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及0D260/0D280值，結(jié)果如下： 表1本實(shí)施例方法獲得的DNA和用目前市面上的DNA抽提試劑盒的對(duì)比
【權(quán)利要求】
1. 一種高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是包括以下步驟： (1) 選取動(dòng)物組織樣品，加入緩沖液A和蛋白酶K溶液，得混合物； (2) 將混合物置于孵育設(shè)備中，調(diào)節(jié)溫度為55~58°C，孵育2~5h，得樣品懸池液； (3) 將樣品懸濁液震蕩后，加入氯化鈉溶液，混勻，離心，取上清液； (4) 在步驟（3)所得的上清液中加入異丙醇，混勻，離心，去上清液，得沉淀； (5) 采用乙醇水溶液洗去沉淀中殘留的異丙醇，離心后靜置除去乙醇，所得沉淀物即為 動(dòng)物組織DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（1)中所述 的緩沖液A由30~80mM Tris、50~200mM EDTA、50~200mM NaCl和質(zhì)量體積百分含量為1~3% 十二烷基磺酸鈉 SDS組成，其pH為7. 5~8. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（1)中動(dòng)物 組織樣品、緩沖液A和蛋白酶K溶液的用量關(guān)系為5~10mg :50~100ML :2~4ML，其中蛋白酶K 溶液的濃度為10~20mg/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（3)中氯化鈉 溶液的濃度為3~6 mol ? L'
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（3)中離心時(shí) 的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心10~15min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（4)中異丙醇 與上清液的體積比為1:1. 2~1. 6。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（4)中離心時(shí) 的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心15~20min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（5)中所述的 乙醇水溶液的體積百分含量為70~75%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取動(dòng)物組織DNA的方法，其特征是：步驟（5)中離心時(shí) 的條件為在4°C條件下10000~14000rpm離心5~10min。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104450676SQ201410414369
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】蔣宗勇, 馬現(xiàn)永, 胡友軍 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所, 廣東新南都飼料科技有限公司
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0訪客 來(lái)自[未知地區(qū)] 2020年02月04日 09:57組織基因組DNA提取一般有離心柱型，溶液型和磁珠法三種，原理及步驟基本相同。雖然各公司推出了多種類(lèi)似產(chǎn)品，讓人不知如何去選擇，但從原理和操作步驟看，基本就是離心柱型，溶液型或者磁珠法。一般來(lái)說(shuō)，離心柱BIOG DNA Tissue Kit方法的提取比磁珠法純度高一些，處理量也能達(dá)到1000ul。
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