一種植物內(nèi)生菌的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)植物組織預(yù)處理；(2)植物組織培養(yǎng)；(3)內(nèi)生菌的分離。本發(fā)明公開的植物內(nèi)生菌的分離方法，可以有效除去表面細(xì)菌、真菌、放線菌以及其他微生物，避免混入雜菌影響內(nèi)生菌分離效果。經(jīng)過組織培養(yǎng)后，植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌恢復(fù)生長，且在分離內(nèi)生菌的操作中，無需再進(jìn)行消毒處理，從而大大減少了消毒劑對植物組織和內(nèi)生菌的傷害作用，增加了內(nèi)生菌的生存概率，能夠顯著提高分離得到的內(nèi)生菌的數(shù)目。
【專利說明】一種植物內(nèi)生菌的分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種植物內(nèi)生菌的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，植物內(nèi)生菌分離的方法大多是將植物組織直接消毒后通過物理、化學(xué)等途 徑破碎，然后提取其滲出液，并將液體作為菌源進(jìn)行內(nèi)生菌的培養(yǎng)和分離。內(nèi)生菌分離的關(guān) 鍵是消除植物體表面微生物的污染，為了確保所分離到的微生物為植物內(nèi)生菌，常采用非 常嚴(yán)格的消毒措施。目前，在植物內(nèi)生菌分離中使用的消毒方法大多數(shù)采用植物體表面消 毒法去除非內(nèi)生菌的污染。如中國發(fā)明專利CN103122331A，公開了一種植物內(nèi)生菌的分離 方法，包括采樣、表面滅菌、組織研磨、分離及純化等步驟。由于消毒劑（如次氯酸鈉、過氧 化氫、乙醇、升汞等）不僅對植物體有傷害，而且也會對內(nèi)生菌造成不良影響。原因在于：消 毒劑對植物的傷害會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，活性氧對植物本身及其內(nèi)生菌的生存都不 利，嚴(yán)重時產(chǎn)生超敏反應(yīng)，導(dǎo)致植物和內(nèi)生菌一起死亡。在植物內(nèi)生菌分離過程中，如果能 減少使用消毒劑或者不使用消毒劑，無疑將增加內(nèi)生菌的生存概率，有利于分離到更多、更 全面的內(nèi)生菌。而現(xiàn)有的內(nèi)生菌分離方法，如果減少或不使用消毒劑，將導(dǎo)致對植物表面消 毒不徹底，在內(nèi)生菌分離中容易引人雜菌，影響內(nèi)生菌的分離效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提出了 一種植物內(nèi)生菌的分離方法，減少了消毒劑對植物組織和內(nèi)生菌的 傷害作用，增加了內(nèi)生菌的生存概率，有助于分離到更多的內(nèi)生菌。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0005] -種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0006] (1)植物組織預(yù)處理
[0007] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌，晾干表面水分，將其切段，長度 0. 5-2. 0cm，然后把切好的材料置于體積濃度為70-75 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗，再 用體積濃度為〇.1-〇.3%升汞浸泡1-311^11或者質(zhì)量濃度為4-6%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗，瞭干表面水分后備用；
[0008] (2)植物組織培養(yǎng)
[0009] 將消毒后的植物組織置于培養(yǎng)基上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，直至植物組織恢復(fù)生長； [0010] ⑶內(nèi)生菌的分離
[0011] 組織培養(yǎng)后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋1-5倍，分別取100-200uL稀釋液涂布于內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基、內(nèi)生真菌培養(yǎng) 基、內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)、純化，即得內(nèi)生菌單菌落。
[0012] 進(jìn)一步，步驟（2)所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
[0013] 進(jìn)一步，步驟（2)培養(yǎng)條件為溫度15-30°C，濕度20-70%。
[0014] 進(jìn)一步，培養(yǎng)植物莖、葉、花、果實(shí)時，控制光照強(qiáng)度1000-6000LUX，光照時間 8-14h/d ;培養(yǎng)植物根時，光照強(qiáng)度0-800Lux。
[0015] 進(jìn)一步，步驟（3)內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為PDA培 養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基。
[0016] 進(jìn)一步，步驟（3)所述純化內(nèi)生菌的方法為劃線培養(yǎng)法。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] 本發(fā)明所述的內(nèi)生菌分離方法先通過對消毒后的植物組織進(jìn)行培養(yǎng)，待植物體恢 復(fù)生長后，直接對植物組織進(jìn)行物理、化學(xué)等途徑破碎，然后利用從組織中滲出的汁液進(jìn)行 內(nèi)生菌的培養(yǎng)和分離。對植物組織的預(yù)處理，可以有效除去表面細(xì)菌、真菌、放線菌以及其 他微生物，從而避免混入雜菌影響內(nèi)生菌分離效果。經(jīng)過培養(yǎng)后，植物組織可以在較短時間 內(nèi)恢復(fù)正常生長，植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌也可恢復(fù)生長，減少了消毒劑對內(nèi)生菌的損傷。經(jīng)過 組織培養(yǎng)的植物組織，其表面的微生物已經(jīng)除去了，因此在下一步分離內(nèi)生菌的操作中，無 需再進(jìn)行消毒處理，從而大大減少了消毒劑對植物組織和內(nèi)生菌的傷害作用，增加了內(nèi)生 菌的生存概率，能夠顯著提高分離得到的內(nèi)生菌的數(shù)目。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然， 所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施 例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于 本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0022] (1)植物組織預(yù)處理
[0023] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌2-3次，晾干表面水分，將其切割 成0. 5cm的小段，然后把切好的材料置于體積濃度為70 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗2-3 次，再用體積濃度為〇.1%升汞浸泡1-311^11或者質(zhì)量濃度為4%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗3-5次，瞭干表面水分后備用；
[0024] (2)植物組織培養(yǎng)
[0025] 將消毒后的植物組織置于MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)1-2周，直至植物組織恢復(fù) 生長；培養(yǎng)條件為溫度15°C，濕度20%，光照強(qiáng)度lOOOLux，光照時間8-10h/d ; (3)內(nèi)生菌 的分離
[0026] 組織培養(yǎng)后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋1倍，分別取l〇〇uL稀釋液涂布于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一 號培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)分離出內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌，通過劃線培養(yǎng)進(jìn)行純化，即 得內(nèi)生菌單菌落。
[0027] 實(shí)施例2
[0028] -種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0029] (1)植物組織預(yù)處理
[0030] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌2-3次，晾干表面水分，將其切割 成1. 3cm的小段，然后把切好的材料置于體積濃度為73 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗2-3 次，再用體積濃度為〇.2%升汞浸泡1-311^11或者質(zhì)量濃度為5%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗3-5次，瞭干表面水分后備用；
[0031] (2)植物組織培養(yǎng)
[0032] 將消毒后的植物組織置于MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)1-2周，直至植物組織恢復(fù) 生長；培養(yǎng)條件為溫度25°C，濕度50%，光照強(qiáng)度3000LUX，光照時間10-12h/d ;
[0033] (3)內(nèi)生菌的分離
[0034] 組織培養(yǎng)后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋3倍，各取150uL稀釋液分別涂布于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏 一號培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)分離出內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌，通過劃線培養(yǎng)進(jìn)行純化， 即得內(nèi)生菌單菌落。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0037] (1)植物組織預(yù)處理
[0038] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌2-3次，晾干表面水分，將其切割 成2. 0cm的小段，然后把切好的材料置于體積濃度為75 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗2-3 次，再用體積濃度為〇.3%升汞浸泡1-311^11或者質(zhì)量濃度為6%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗3-5次，瞭干表面水分后備用；
[0039] (2)植物組織培養(yǎng)
[0040] 將消毒后的植物組織置于MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)1-2周，直至植物組織恢復(fù) 生長；培養(yǎng)條件為溫度30°C，濕度70%，光照強(qiáng)度6000LUX，光照時間12-14h/d ;
[0041] (3)內(nèi)生菌的分離
[0042] 組織培養(yǎng)后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋5倍，分別取200uL稀釋液涂布于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一 號培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)分離出內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌，通過劃線培養(yǎng)進(jìn)行純化，即 得內(nèi)生菌單菌落。
[0043] 實(shí)施例4
[0044] 一種植物內(nèi)生菌的分離方法，步驟（2)組織培養(yǎng)過程中不進(jìn)行光照，其他操作同 實(shí)施例1。
[0045] 實(shí)施例5
[0046] -種植物內(nèi)生菌的分離方法，步驟（2)組織培養(yǎng)過程中光照強(qiáng)度為400LUX，其他 操作同實(shí)施例2。
[0047] 實(shí)施例6
[0048] 一種植物內(nèi)生菌的分離方法，步驟（2)組織培養(yǎng)過程中光照強(qiáng)度為SOOLux，其他 操作同實(shí)施例3。
[0049] 本發(fā)明所述的內(nèi)生菌分離方法對不同植物內(nèi)生菌的分離效果
[0050] 對橡膠樹幼嫩枝條內(nèi)生菌的分離效果
[0051] 實(shí)驗組取橡膠樹幼嫩枝條，采用實(shí)施例2的方法，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2周后，采 用劃線培養(yǎng)的方法純化，分離其內(nèi)生菌。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕 度等特征判斷分離出的菌落種類并計數(shù)。對照組以常規(guī)方法分離橡膠樹幼嫩枝條內(nèi)生菌。 實(shí)驗組和對照組均設(shè)置3個重復(fù)。從橡膠樹幼嫩枝條中分離的各種內(nèi)生菌的統(tǒng)計結(jié)果如表 1所示。
[0052] 表1橡膠幼嫩枝條中分離內(nèi)生菌的統(tǒng)計結(jié)果
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 植物組織預(yù)處理 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌，晾干表面水分后將其切段，長度 0. 5-2. Ocm，然后把切好的材料置于體積濃度70-75%乙醇消毒3-5min，無菌水清洗，再用 體積濃度〇. 1-0. 3 %升汞浸泡l-3min或者質(zhì)量濃度4-6 %次氯酸鈉浸泡5-10min，接著用無 菌水沖洗，晾干表面水分后備用； (2) 植物組織培養(yǎng) 將消毒后的植物組織置于培養(yǎng)基上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，直至植物組織恢復(fù)生長； (3) 內(nèi)生菌的分離 組織培養(yǎng)后的植物組織，在無菌條件下切碎或剪碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲 出液用無菌水稀釋1-5倍，分別取100-200UL稀釋液涂布于不同微生物培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)、 純化，即得內(nèi)生菌單菌落。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于：步驟（2)所用培 養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于：步驟（2)培養(yǎng)條 件為溫度15_30°C，濕度20-70%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于：培養(yǎng)植物莖、葉、 花、果實(shí)時，控制光照強(qiáng)度1000-6000Lu X，光照時間8-14h/d ;培養(yǎng)植物根時，控制光照強(qiáng)度 0-800Lux〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于：步驟（3)內(nèi)生菌 培養(yǎng)基為內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基、內(nèi)生真菌培養(yǎng)基、內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于：步驟（3)內(nèi)生細(xì) 菌培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基為高氏 一號培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，其特征在于：步驟（3)所述純 化內(nèi)生菌的方法為劃線培養(yǎng)法。
【文檔編號】C12N1/00GK104250616SQ201410444348
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】馮仁軍, 盧利方, 云天艷, 張銀東 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所