一種末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，所述方法包括：首先根據(jù)單鏈模板合成引物，與單鏈模板退火，然后在四種脫氧核苷三磷酸中的一種的存在下進(jìn)行TdT酶催化的3’端加尾反應(yīng)，反應(yīng)完成后在足量沒有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下進(jìn)行聚合反應(yīng)生成雙鏈DNA，最后測定聚合反應(yīng)完成后反應(yīng)體系中雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量，并通過該檢測結(jié)果推導(dǎo)出Poly(A)聚合酶活性程度，其中所用單鏈模板上引物3’方向上第一位的堿基與加尾反應(yīng)中所用的那種脫氧核苷三磷酸不互補(bǔ)。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有方法相比，無放射性污染，操作簡單快捷，試劑準(zhǔn)備成本低，并且靈敏度高。
【專利說明】一種末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 末端脫氧核苷醜轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一 種特殊的DNA聚合酶。TdT可不依賴模板，催化脫氧核苷三磷酸（dNTP)，逐個(gè)聚合至單鏈或 雙鏈DNA片段的3' -OH端上。該酶特異分布于哺乳類動(dòng)物的胸腺、骨髓及某些類型的白血 病患者的惡性細(xì)胞中，通過測定其活性，可用于白血病的診斷及預(yù)后。（Rudzka E et al.， Folia Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch. 1985;112 (6):864-71) (Hutton JJ et al.，Blood. 1982 Dec;60 (6) :1267-76.)。因此，測定體內(nèi)的TdT活性具有十分重要的 臨床診斷價(jià)值。
[0003] TdT也是基因工程技術(shù)以及生命科學(xué)研究中一種重要的工具酶。在細(xì)胞凋亡的過 程中，染色體的DNA被內(nèi)源核酸內(nèi)切酶有規(guī)律的降解成長度約為180-200bp的整倍數(shù)的片 段，產(chǎn)生游離的3'-OH末端。TdT可在這些末端上摻入熒光標(biāo)記的dUTP，因此可在熒光顯微 鏡下直接觀察到凋亡細(xì)胞。這種被稱為TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 的方法是目前原位檢測細(xì)胞凋亡最重要、最準(zhǔn)確的方法，而TdT酶是TUNEL實(shí)驗(yàn)中的核心。 目前商品化的TUNEL試劑盒中通常采用的是基因工程重組表達(dá)的TdT酶，其質(zhì)量、活性決定 了 TUNEL結(jié)果的好壞。如果一個(gè)反應(yīng)中加入的TdT酶活性過高，會(huì)導(dǎo)致非特異性染色；而加 入的TdT酶活性過低則會(huì)導(dǎo)致染色失敗。因此，準(zhǔn)確測定重組TdT酶的活性，保證批次活性 的穩(wěn)定性，對(duì)于TUNEL試劑盒的質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。
[0004] 經(jīng)典的TdT酶活力測定法采用放射性底物摻入法，即采用以32P標(biāo)記的dATP為底 物，經(jīng)TdT催化使其摻入到oligo (ClA)25上，其反應(yīng)式如下： --· η [ a -32p] -dATP + oligo (dA) 25 oligo (dA) 25 ([ a-32p]-dAMP) η + nppi 通過測定酸不溶性產(chǎn)物中放射性同位素的量，計(jì)算出TdT酶的活性。這種方法靈敏度 雖高，但受標(biāo)記物質(zhì)量所限，且操作過程繁瑣，易產(chǎn)生放射性污染。
[0005] 張華等（生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1990, 17:387-389)將放射性底物 [a -32p] -dATP替換為熒光標(biāo)記底物ε dATP，經(jīng)TdT催化使其摻入到oligo (dA) 25上，其反 應(yīng)式如下： .......................................................................................§?_ η ε dATP + oligo (dA)25 oligo (dA)25( ε dAMP) η + nppi 通過測定酸不溶性產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出TdT酶的活性。這種方法無需放射性同位 素操作，但其熒光標(biāo)記底物ε dATP無商品化試劑，需要實(shí)驗(yàn)者自行合成，合成難度大、周期 長，質(zhì)量難以控制；此外反應(yīng)產(chǎn)物需要經(jīng)過蛇毒磷酸二酯酶水解，才能測定熒光強(qiáng)度，操作 步驟的繁瑣程度更甚于放射性同位素法。
[0006] 目前，以上述兩種方法為代表性的TdT測活方法本質(zhì)上還是通過測定摻入的標(biāo)記 dATP的量來計(jì)算酶活，這些方法可以統(tǒng)稱為"摻入法"。"摻入法"的關(guān)鍵在于摻入產(chǎn)物和標(biāo) 記dATP (放射性同位素或熒光標(biāo)記）的分離。三氯乙酸TCA可使oligo (dA)25沉淀，而標(biāo) 記的dATP不被沉淀；將TCA處理的產(chǎn)物加在Whatman濾紙上，就可以實(shí)現(xiàn)摻入產(chǎn)物和標(biāo)記 dATP的分離。再經(jīng)過洗滌、干燥、洗脫，最后測定放射性同位素或者熒光強(qiáng)度。因此，所有基 于"摻入法"的測活方法，都存在步驟多、周期長的缺陷，難以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是建立一種簡便、快速、非放射性的TdT酶測活方法。本發(fā)明采用了 一種全新的"轉(zhuǎn)化法"替代傳統(tǒng)的"摻入法"，其原理如圖1所示。
[0008] 具體來說，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根據(jù)單鏈 模板合成引物，與單鏈模板退火，然后在四種脫氧核苷三磷酸中的一種的存在下進(jìn)行TdT 酶催化的3'端加尾反應(yīng)，反應(yīng)完成后在足量沒有3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶存在下進(jìn) 打聚合反應(yīng)生成雙鏈DNA，最后測定聚合反應(yīng)完成后反應(yīng)體系中雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì) 量，并通過該檢測結(jié)果推導(dǎo)出TdT酶活性程度，其中所用單鏈模板上引物3'方向上第一位 的堿基與加尾反應(yīng)中所用的那種脫氧核苷三磷酸不互補(bǔ)。
[0009] 優(yōu)選地，反應(yīng)體系中雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是利用僅與雙鏈DNA或僅與單 鏈DNA結(jié)合的熒光染料，利用熒光法檢測得到的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒 光強(qiáng)度表示的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所采用的熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料。更優(yōu) 選，所用熒光染料是成熟的市售雙鏈DNA特異性熒光染料，例如picogreen染料。
[0010] 優(yōu)選地，所采用的單鏈模板是單鏈環(huán)狀DNA模板。更優(yōu)選，所采用的單鏈模板是 M13噬菌體單鏈DNA，以便于建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測體系。在一個(gè)相應(yīng)的實(shí)施方案中，所用的引 物是 _aagccatccgcaaaaatgacctct_3,〇 [0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所采用的DNA聚合酶是Taq酶。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1. 無放射性污染； 2. 所有試劑均可購買，無需自己制備，成本低； 3. 操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的 活性測定。
[0013] 4.靈敏度高，可檢測到0· I U的TdT活性。
[0014] 5.可用于不同種屬來源的TdT酶活的測定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明測定方法的原理圖。
[0016] 圖2是根據(jù)采用本發(fā)明方法測得的結(jié)果繪制的熒光活性曲線圖。
[0017] 圖3是不同來源的TdT酶的熒光活性曲線圖。
[0018] 圖4是基因工程重組小牛胸腺TdT酶活性測定的熒光活性曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明的目的是建立一種簡便、快速、非放射性的TdT酶測活方法。本發(fā)明擯棄了 傳統(tǒng)的"摻入法"，采用了一種全新的"轉(zhuǎn)化法"，其原理如圖1所示。
[0020] 如圖所示，無3'_5'外切酶活性的DNA聚合酶可以末端匹配的模板/引物為底物， 進(jìn)行聚合反應(yīng)，生成M13雙鏈DNA。M13雙鏈DNA可被雙鏈特異性的picogreen染料結(jié)合， 產(chǎn)生熒光。TdT酶可在引物的末端加上數(shù)量不等的dATP，從而使得引物末端與M13單鏈DNA 不匹配。這種末端不匹配的模板/引物不能作為無3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶的底 物；picogreen染料不能結(jié)合單鏈DNA，從而不能產(chǎn)生突光。
[0021] TdT酶的活性在一定范圍內(nèi)同末端不匹配模板/引物的量成正比；而在DNA聚合 酶活性一定的情況下，末端不匹配模板/引物的量同熒光強(qiáng)度成反比。因此，本發(fā)明將TdT 的測活體系同DNA聚合酶測活體系偶聯(lián)起來。
[0022] 在本發(fā)明測定方法的一個(gè)實(shí)例中，測定程序包括以下方面： I. M13單鏈DNA模板/引物的制備： M13 單鏈 DNA: M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物：M13 引物 5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； M13模板引物/復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13引物按摩爾比1:1混合，在退火緩 沖液（10 mM Tris-HCl pH8. 0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降至室溫，使模板 引物退火。
[0023] 2. TdT 反應(yīng)：

【權(quán)利要求】
1. 一種末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根據(jù) 單鏈模板合成引物，與單鏈模板退火，然后在四種脫氧核苷三磷酸中的一種的存在下進(jìn)行 TdT酶催化的3'端加尾反應(yīng)，反應(yīng)完成后在足量沒有3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶存在 下進(jìn)行聚合反應(yīng)生成雙鏈DNA，最后測定聚合反應(yīng)完成后反應(yīng)體系中雙鏈DNA或單鏈DNA的 相對(duì)量，并通過該檢測結(jié)果推導(dǎo)出Poly (A)聚合酶活性程度，其中所用單鏈模板上引物3' 方向上第一位的堿基與加尾反應(yīng)中所用的那種脫氧核苷三磷酸不互補(bǔ)。
2. 如權(quán)利要求1所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，反應(yīng)體系 中雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是利用僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結(jié)合的熒光染料，利 用熒光法檢測得到的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。
3. 如權(quán)利要求2所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所述熒光 染料是pi cogreen染料。
5. 如權(quán)利要求1所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 單鏈模板是單鏈環(huán)狀DNA模板。
6. 如權(quán)利要求5所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 單鏈模板是Ml3噬菌體單鏈DNA。
7. 如權(quán)利要求6所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所用的引 物是 _aagccatccgcaaaaatgacctct_3,〇
8. 如權(quán)利要求1所述的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 DNA聚合酶是Taq酶。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK104293883SQ201410502145
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】徐曉昱, 王靜 申請(qǐng)人:南京諾唯贊生物科技有限公司