一種檢測山羊dqa1基因外顯子4的單核苷酸多態(tài)性的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQA1基因的單核苷酸多態(tài)性的引物及方法，引物由上游引物和下游引物組成，檢測時(shí)以山羊基因組DNA為模板，利用上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，用變性劑處理PCR產(chǎn)物，對變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，應(yīng)用銀染法染膠，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果即可判定山羊DQA1基因外顯子4的等位基因。通過本發(fā)明設(shè)計(jì)的核苷酸引物以及建立的檢測體系，可較為準(zhǔn)確、快捷的擴(kuò)增群體中不同等位基因型，可以準(zhǔn)確的分析得到山羊DQA1基因外顯子4的不同單核苷酸突變位點(diǎn)。
【專利說明】—種檢測山羊DQA1基因外顯子4的單核苷酸多態(tài)性的弓I物及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及山羊分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，具體涉及一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的引物及方法。

【背景技術(shù)】
[0002]山羊DQAl基因位于MHC II類基因的DQ亞區(qū)，具有豐富的多態(tài)性。MHC (主要組織相容性復(fù)合體，major histocompatibility complex),是脊椎動(dòng)物中一個(gè)與免疫相關(guān)的多基因家族，具有共顯性、連鎖不平衡等遺傳特性，其主要功能是編碼細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)膜蛋白，通過傳遞抗原給T淋巴細(xì)胞參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。MHC基因由1、II和III類基因組成。山羊的MHC基因稱之為GOLA (Goat lymphocyte antigen),即山羊白細(xì)胞抗原。MHC基因多態(tài)性賦予動(dòng)物極大的應(yīng)變能力，長期自然選擇使動(dòng)物具有應(yīng)變多變的環(huán)境條件及各種病原體的侵襲的能力，若動(dòng)物具有高的MHC多態(tài)性，則能夠識別更多的抗原，從而抵抗更多種類的病原體。因此，MHC可以作為抗病育種的遺傳標(biāo)記輔助選擇的重要位點(diǎn)，以培育出高產(chǎn)、抗病力強(qiáng)的家畜品種。
[0003]單核苷酸多態(tài)性(SNP)指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。位于編碼區(qū)的SNPs的錯(cuò)義突變可能對基因的功能有重要的影響，不僅如此，這些SNPs位點(diǎn)多為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。單核苷酸多態(tài)性具有數(shù)量多，分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，是一種進(jìn)行分子遺傳育種的優(yōu)良手段?，F(xiàn)在人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術(shù)等，SSCP它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。該方法具有簡單、快速、靈敏，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。但對于像DQAl基因外顯子2這種呈高度多態(tài)性的基因，基因型的判定成為難點(diǎn)。
[0004]貴州白山羊是貴州省的優(yōu)良地方山羊品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、繁殖力高、育肥性能好、肉質(zhì)好、板皮質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，宜于在山地丘陵等地勢放牧飼養(yǎng)。但國內(nèi)對于貴州白山羊免疫性狀的研究還鮮見報(bào)道，所以如何利用分子生物學(xué)的技術(shù)快速高效的篩選培育出具有較高抗病能力的貴州白山羊成為改良我國優(yōu)良地方山羊品種的重中之重。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的引物及方法，為不同品種山羊DQAl基因外顯子4多態(tài)性的PCR-SSCP篩選及判型提供一種方便、快捷、準(zhǔn)確的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:
本發(fā)明檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測引物，由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物的DNA序列為:
上游引物:5’ -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’ 下游引物:5’ -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’。
[0007]本發(fā)明檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括以下步驟:以山羊基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，用變性劑處理PCR產(chǎn)物，對變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，應(yīng)用銀染法染膠，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果即可判定山羊DQAl基因外顯子4的等位基因。
[0008]更進(jìn)一步，PCR反應(yīng)條件為:在15μ L總體系中，2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下游引物各為0.75 μ L，DQA模板為2 μ L，余量為ddH20，PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性3min ;95°C變性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C保存。
[0009]上述的變性劑由98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025% 二甲苯青，100 μ L5mol/L EDTA 組成。
[0010]具體的電泳檢測步驟為:采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠在250V電壓下預(yù)電泳30min ;點(diǎn)樣后，常溫下，250V電泳1min, IlOv電泳16h。
[0011]上述非變性聚丙烯酰胺凝膠由26.6 mL29%的丙烯酰胺_1%N，N-雙丙烯酰胺、20mL 的 5ΧΤΒΕ、720 μ L10% 的過硫酸銨、52.8 mL 的 ddH20、44 μ L 的 TEMED 組成。
[0012]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明引物能夠特異性的結(jié)合到山羊基因組DNA目的片段的模板鏈上，可以擴(kuò)增得到含有等位基因突變的目的基因。通過設(shè)計(jì)的核苷酸引物以及建立的檢測體系，可較為準(zhǔn)確、快捷的擴(kuò)增群體中不同等位基因型，可以準(zhǔn)確的分析得到山羊DQAl基因外顯子4的不同單核苷酸突變位點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是貴州白山羊DQAl基因第4外顯子G+87T位點(diǎn)的PCR-SSCP檢測凝膠圖；
圖2是貴州白山羊DQAl基因第4外顯子G+149A位點(diǎn)的PCR-SSCP檢測凝膠圖；
圖3是貴州白山羊DQAl Exon 4- G+87T位點(diǎn)的測序圖；
圖4是貴州白山羊DQAl Exon 4- G+149A位點(diǎn)的測序圖；
其中，附圖中標(biāo)記
1DQAl Exon 4- G+87T
2DQAl Exon 4- G+87G
3DQAl Exon 4- Τ+87Τ
4DQAl Exon 4- G+149G
5DQAl Exon 4- Α+149Α
6DQAl Exon 4- G+149A。

【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例:
下面結(jié)合具體實(shí)施方案對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)施方案只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面以貴州白山羊免疫性狀相關(guān)基因DQAl基因外顯子4的多態(tài)性分析為例，對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0015]一種貴州白山羊DQAl Exon4等位基因PCR-SSCP檢測方法，其主要特點(diǎn)在于，具體的檢測步驟如下:
1、樣品的采集:采集健康狀況好的成年貴州白山羊，抗凝管進(jìn)行頸靜脈采血8mL，冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后_20°C保存；
2、基因組DNA的提取:應(yīng)用血液基因組提取試劑盒(上海生工生物)提取基因組DNA；
3、引物設(shè)計(jì)與PCR反應(yīng):總體系為15yL，其中2XEsTaq MasterMix為7.5 μ L，上下游引物各0.75 μ L，DQA模板2 μ L，ddH20補(bǔ)充體積至15 μ L ；PCR反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性3min ;95°C變性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C保存。I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
[0016]引物序列為:
上游引物:5 ’ -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3，
下游引物:5’ -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’
4PCR產(chǎn)物的SSCP檢測:
取8 μ LPCR產(chǎn)物加入10 μ L的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA (PH=8.0)。98°C變性 15min，立即冰浴 15min ；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，250V電壓下預(yù)電泳30min ;點(diǎn)樣后，常溫下，250V電泳lOmin，IlOv電泳16h，銀染法顯色并拍照。
[0017](I)電泳使用凝膠配制:8%非變性聚丙烯酰胺凝膠
29%丙烯酰胺-1%N，N-雙丙烯酰胺26.6 mL
5X TBE20 mL 10%過硫酸銨 720 μ L ddH20 52.8 mL TEMED 44 μ L
(2)銀染方法及步驟
固定液:無水乙醇25 mL
冰乙酸12.5 mL
ddH20200 mL
銀染液:硝酸銀0.3g
ddH20200 mL
顯色液:氫氧化鈉3g
甲醛2.2 mL
ddH20200 mL
電泳結(jié)束后取下凝膠。用蒸餾水清洗凝膠，倒入固定液，固定10-12min ;用蒸餾水清洗凝膠一次，倒入銀染液，避光銀染10-12min ;蒸餾水清一次，倒入顯色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，搖床顯色，待條帶清晰后用蒸餾水清洗，拍照保存。
[0018](3)測序分析
這一過程是為了檢測獲得的結(jié)果的可靠性，在實(shí)際操作中可憑借帶型來區(qū)分基因型，無需此過程。
[0019]在非變性聚丙烯酰胺凝膠帶型顯示如附圖所示，將不同基因型的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示與預(yù)期的結(jié)果相同。
[0020]以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方案，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換，改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測引物，由上游引物和下游引物組成，其特征在于:所述上游引物和下游引物的DNA序列為: 上游引物:5’ -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’ 下游引物:5’ -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’。
2.一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:包括以下步驟:以山羊基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，用變性劑處理PCR產(chǎn)物，對變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，應(yīng)用銀染法染膠，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果即可判定山羊DQAl基因外顯子4的等位基因。
3.如權(quán)利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:PCR反應(yīng)條件為:在15 μ L總體系中，2 XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下游引物各為0.75 μ L，DQA模板為2 μ L，余量為ddH20，PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性3min ；95°C變性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min，4°C保存。
4.如權(quán)利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:所述的變性劑由98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA 組成。
5.如權(quán)利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:電泳檢測步驟為:采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠在250V電壓下預(yù)電泳30min ;點(diǎn)樣后，常溫下，250V電泳1min, IlOv電泳16h。
6.如權(quán)利要求2或5所述的一種檢測山羊免疫相關(guān)基因DQAl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:非變性聚丙烯酰胺凝膠由26.6 mL29%的丙烯酰胺_1%N，N-雙丙烯酰胺、20 mL 的 5ΧΤΒΕ、720 μ L10% 的過硫酸銨、52.8 mL 的 ddH20、44 μ L 的 TEMED 組成。
【文檔編號】C12N15/11GK104450880SQ201410526748
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】羅衛(wèi)星, 劉彬, 蔡慧芬, 康建兵, 孫巖巖, 錢成 申請人:貴州大學(xué)