一種優(yōu)化信號肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種優(yōu)化信號肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法，屬于基因工程【技術領域】。本發(fā)明通過與胰蛋白酶融合表達8種畢赤酵母胞外分泌信號肽，甲醇誘導啟動子(pAOX)在Pichia pastoris GS115染色體上表達重組胰蛋白酶。本發(fā)明的αmf信號肽與原始的α-factor信號肽相比，胰蛋白酶酶活提高了2.75倍，解決了胰蛋白酶胞外分泌量低的問題。應用本發(fā)明方法生產(chǎn)胰蛋白酶，產(chǎn)量高、工藝簡化、便于工業(yè)化應用。
【專利說明】一種優(yōu)化信號肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種優(yōu)化信號肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法，屬于基因工程技 術領域。

【背景技術】
[0002] 胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶中的較早被發(fā)現(xiàn)應用的一種重要類型，最早被發(fā)現(xiàn)于 哺乳動物的腸道消化液中。商品化的胰蛋白酶多從哺乳動物胰臟提取，由于胰臟中含豐富 的蛋白酶，對胰蛋白酶分離提純帶來困難。另外，哺乳動物來源的胰蛋白酶多為胰酶混合 物，在醫(yī)藥應用上存在對人體的免疫原性危害。
[0003] 近年，動物來源的胰蛋白酶通過基因工程手段在大腸桿菌、畢赤酵母中得到表 達，但是，大腸桿菌表達常出現(xiàn)包涵體，畢赤酵母酶原表達豬、牛胰蛋白酶需要外源的腸激 酶、胰蛋白酶體外激活?；疑溍咕鹊鞍酌秆芯?，Koo-Bon-Joon等利用鏈霉菌常用宿主 Streptomyces lividansl326及鏈霉菌常用的pWHM3質(zhì)粒（Ermp，紅霉素啟動子）獲得在同 屬菌中分泌表達的重組胰蛋白酶，Chi-Won-Jae等將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到能夠產(chǎn)胰蛋白酶的灰色 鏈霉菌 Streptomyces griseus IF013350 中表達，Daisuke Nohara 等人（1998)將鏈霉菌 胰蛋白酶以包涵體形式在E. coli系統(tǒng)中進行了表達。已有研究在畢赤酵母中以胰蛋白酶 形式表達了灰色鏈霉菌來源的胰蛋白酶。
[0004] 異源表達胰蛋白酶突出的問題是，蛋白表達量低、胰蛋白酶酶活低。因此，構建用 于畢赤酵母胞外分泌信號肽，提高胰蛋白酶胞外酶活，對于滿足胰蛋白酶工業(yè)化成產(chǎn)需求 和降低生產(chǎn)成本有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種產(chǎn)胰蛋白酶的重組酵母菌，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示 序列的胰蛋白酶基因前融合核苷酸序列是SEQ ID NO. 7所示序列的信號肽形成重組基因， 將重組基因在宿主菌中進行表達得到的重組酵母菌。
[0006] 所述信號肽，其核苷酸序列為以下所示序列的任意一種：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 或者 SEQ ID NO. 8。
[0007] 所述信號肽，在本發(fā)明的一種實施方式中，其核苷酸序列是SEQIDN0. 7所不的序 列。
[0008] 所述重組酵母菌的出發(fā)宿主菌是以下任意一種：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastorisX-33、pichia pastoris SMD1168。
[0009] 所述重組酵母菌，在本發(fā)明的一種實施方式中，其出發(fā)宿主菌是pichia pastoris GS115。
[0010] 本發(fā)明還提供一種所述重組酵母菌的構建方法，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9 所示的序列的胰蛋白酶基因之前添加核苷酸序列是SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 或者 SEQ ID NO. 8 任一所示 序列的信號肽形成重組基因，將該重組基因連接到表達質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到酵 母菌中得到重組菌。
[0011] 所述重組菌的構建方法具體如下：依據(jù)合成的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示的來源于灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus)的胰蛋白酶基因（mt)、 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 8所示的8種信號肽（分別命名為 a as, Sas, Ipr, Iss, Lss, nsB, a mf, Kps)設計引物，采用兩步PCR方法分別將信號肽添加到 膜蛋白酶基因前獲得重組基因 （α as-mt, Sas-mt, Ipr-mt, Iss-mt, Lss-mt, nsB-mt, a mf-mt ，Kps-mt);將所述的重組基因連接到畢赤酵母表達載體，得到重組質(zhì)粒；將所述的重組質(zhì)粒 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichia pastoris GSl 15,獲得重組酵母工程菌株。
[0012] 所述重組基因是采用兩步PCR方法獲得的含有信號肽序列和胰蛋白酶基因序列 的的重組基因。
[0013] 所述表達質(zhì)粒是以下任意一種：pGAPZA、pA0815、pGAPaA、pPIC9K、pPICZB。
[0014] 所述表達載體，在本發(fā)明的一種實施方式中是PPIC9K質(zhì)粒。
[0015] 所述表達載體和宿主菌購自Invitrogen公司。
[0016] 本發(fā)明還提供一種提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法，是使用上述構建的重組酵 母菌進行發(fā)酵，表達胰蛋白酶。
[0017] 所述提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，將核苷酸 序列如SEQ ID NO. 7所示的信號肽添加到核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示的胰蛋白酶基因 前得到重組基因 amf-mt，重組基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達載體后得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到畢赤酵母中，即獲得重組菌，進行表達。
[0018] 所述提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，具體是： ⑴合成序列是SEQ ID NO. 9所示序列的基因片段；（2)以步驟1的基因片段為模板，使用 序列是SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示的引物進行PCR，PCR產(chǎn)物回收后作為模板，用序 列是SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12所示的引物進行PCR獲得重組基因；（3)用Notl、BamH I雙酶切步驟2得到的重組基因和pPIC9K質(zhì)粒，用連接酶連接得到重組質(zhì)粒；(4)將步驟3 得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到pichia pastoris GS115中，即得到重組畢赤酵母菌，進行表達。
[0019] 前期研究工作中，本研究團隊已獲得以a-factor作為分泌信號肽的胰蛋白酶的 重組畢赤酵母工程菌（CN 102094040A)。
[0020] 本發(fā)明通過在構建了含有胞外分泌信號肽的胰蛋白酶，實現(xiàn)了胰蛋白酶畢赤 酵母高效分泌表達，解決了胰蛋白酶產(chǎn)量低的問題。可能是因為α-facotor信號肽的 pre-region序列在異源蛋白胞外分泌過程中起重要作用。a -factor包括pre-region、 pro-region兩部分，且a -factor的pre-region序列與a mf信號肽的序列一致， Pre-region序列引導異源蛋白從胞質(zhì)中定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，異源蛋白在此完成翻譯后修飾后 以胞吐的形式分泌到胞外。而a-factor信號肽在引導異源蛋白胞外分泌過程中需要兩 步分泌過程：l)pre-region序列切割；2)pro_region序列切割。融合表達a mf信號肽與 a-factor信號肽相比，切割效率更高。應用本發(fā)明方法得到的重組基因工程菌生產(chǎn)胰蛋白 酶，產(chǎn)量高，便于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明為畢赤酵母胞外高效分泌胰蛋白酶研究工作奠定了基 礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1 :克隆表達載體構建圖
[0022] 圖2 :重組畢赤酵母工程菌的胰蛋白酶酶活
[0023] 圖3 : a -factor信號肽序列分析

【具體實施方式】
[0024] 胰蛋白酶酶活測定方法：胰蛋白酶特異性切割ΒΑΡΝΑ (Na-苯甲酰-DL-對-硝基 苯酰胺）羧基端的酰胺鍵，產(chǎn)物對硝基苯胺（在410nm處有最大吸收值）。在37°C下，測 定100 μ L粗酶液同900 μ L IOmM ΒΑΡΝΑ溶液（溶于50mM pH8. 0 Tris-HCl緩沖液）在光 徑0.5cm的反應池中，在410nm下IOmin內(nèi)的吸光值變化。酶活定義為：在37°C下，每分鐘 410nm處光吸收值升高0. 1所需要的酶量為1個胰蛋白酶水解單位。
[0025] 實施例1重組質(zhì)粒的構建
[0026] 灰色鏈霉菌膜蛋白酶基因 （Gen Bank Accession No. M64471)全長672bp。根據(jù) 8種信號肽的核酸序列設計引物。經(jīng)過兩步PCR將信號肽序列與SEQ ID NO. 9所示的基因 序列進行同和，獲得融合基因片段（以SEQ ID NO. 9所示胰蛋白酶基因為模板用F2、R引物 PCR后柱回收，再用FI、R引物PCR柱回收產(chǎn)物獲得融合片段，F(xiàn)I、F2、R引物的序列分別如 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示），按照如圖1所示的構建方法，用Notl、 BamH I雙酶切融合片段和pPIC9K質(zhì)粒，純化后T4連接酶16°C過夜連接。連接產(chǎn)物化學法 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素（50mg/L) LB平板，提取質(zhì)粒測序驗證構建 的重組質(zhì)粒。測序工作由上海生工完成。
[0027] 實施例2產(chǎn)胰蛋白酶酵母工程菌構建
[0028] 將含有胰蛋白酶基因前添加了信號肽的重組基因的重組質(zhì)粒用Sal I線性化，電 擊轉(zhuǎn)化pichia pastoris GS115感受態(tài)細胞，具體方法如下：
[0029] 1)接種 YPD 平板活化的 pichia pastoris GS115 于 25mL/250mL 三角瓶，30°C過夜 培養(yǎng)；1%接種上述培養(yǎng)液于50mL/500mL三角瓶，培養(yǎng)菌體濃度0D600為1. 3?1. 5 ;
[0030] 2) 5000r/min，4°C離心IOmin收集菌體，分別用50mL、25mL無菌水懸浮細胞；
[0031] 3)5mL IM山梨醇重懸上述細胞，5000r/min，4°C離心IOmin收集菌體；
[0032] 4) 500 μ L IM山梨醇重懸上述細胞，分裝80 μ L/1.5mL EP管用于電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細 胞；
[0033] 5) 20 μ L線性化質(zhì)粒與上述80 μ L感受態(tài)細胞混合，冰上靜置15min ;
[0034] 6)上述混合物加入預冷的無菌電轉(zhuǎn)化杯（0. 2cm)，1500V、25 μ F、200 Ω電擊一次， 加入ImL IM山梨醇；
[0035] 7)取上述混合物150 μ L涂布MD平板，30°C培養(yǎng)3天；
[0036] 8)挑取上述平板中白色菌落，分別點種在l、2、3、4mg/mL(遺傳霉素）YPD平板中， 挑選在4mg/mL遺傳霉素平板中的單菌落用于搖瓶發(fā)酵。
[0037] 實施例3重組菌的構建
[0038] 采用與實施例1類似的兩步PCR的方法將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 8 的信號肽（分別命名為 a as, Sas, Ipr, Iss, Lss, nsB, a mf, Kps)融合到 SEQ ID NO. 9 所示的胰蛋白酶基因前，獲得8個重組基因 a as-mt、Sas-mt、Ipr-mt、Iss-mt、Lss-mt、 nsB-mt、amf-mt、Kps-mt ;將所述的重組基因分別連接到畢赤酵母表達載體，得到重組質(zhì) 粒；將所述的重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichia pastoris GS115,獲得重組酵母工程菌 株。
[0039] 實施例4重組畢赤酵母搖瓶培養(yǎng)
[0040] 將本發(fā)明構建的工程菌作為生產(chǎn)菌株，以CN 102094040A中構建的含a -factor 信號肽胰蛋白酶重組菌為對照，在ΥΗ)平板活化。種子液培養(yǎng)，接種50mL/250mL種子培養(yǎng) 基，30°C，220r/min培養(yǎng)24h。離心種子液，按發(fā)酵培養(yǎng)基中種子終濃度為0D600 = 1接種發(fā) 酵培養(yǎng)基，30°C，220r/min培養(yǎng)5d。每隔24h取樣測胰蛋白酶胰蛋白酶酶活。結(jié)果如圖2所 示，本發(fā)明構建的含有不同信號肽的8種重組菌中有六種都不同程度地提高了胰蛋白酶酶 活，其中含有amf信號肽的重組菌的酶活最高。融合amf信號肽的胰蛋白酶與a-factor 信號肽（CK)相比，胰蛋白酶酶活提高了 2. 75倍。圖3為α-factor信號肽的序列，可以看 至丨J, a -factor 包括 pre-region、pro-region 兩部分，且 a -factor 的 pre-region 序列與 amf信號肽的序列一致。這表明，α-facotor信號肽的pre-region序列在異源蛋白胞外 分泌過程中起重要作用。Pre-region序列引導異源蛋白從胞質(zhì)中定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，異源蛋 白在此完成翻譯后修飾后以胞吐的形式分泌到胞外。而a-factor信號肽在引導異源蛋白 胞外分泌過程中需要兩步分泌過程：l)pre-region序列切割；2)pro_region序列切割。融 合表達a mf信號肽與a -factor信號肽相比，切割效率更高。
[0041] 種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20。
[0042] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L) =K2HPO4 ·3Η201. 51 ;KH2P045. 91 ;生物素 0. 2 ;YNB (酵母無氨基酸 氮源）13. 4 ;胰蛋白胨10 ;酵母粉5 ;生物素4X KT4 ;甲醇1 %。
[0043] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1. 一種產(chǎn)胰蛋白酶的重組酵母菌，其特征在于，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示序 列的胰蛋白酶基因前融合核苷酸序列是SEQ ID NO. 7所示序列的信號肽形成重組基因，將 重組基因在宿主菌中進行表達得到的重組酵母菌。
2. 根據(jù)權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌的出發(fā)宿主菌是 以下任意一種：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X_33、 pichia pastoris SMD1168。
3. 根據(jù)權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌的出發(fā)宿主菌是 pichia pastoris GS115。
4. 根據(jù)權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述信號肽被核苷酸序列為以下 任意一種的信號肽所替代：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或者 SEQ ID NO. 8。
5. -種權利要求I所述重組酵母菌的構建方法，是在核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示 的序列的胰蛋白酶基因之前添加核苷酸序列是SEQ ID NO. 7所示序列的信號肽形成重組基 因，將該重組基因連接到表達質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到宿主酵母菌中得到重組菌。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述表達質(zhì)粒是以下任意一種：pGAP ZA、 pA0815、pGAPaA、pPIC9K、pPIC ZB。
7. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述表達質(zhì)粒pPIC9K。
8. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述構建方法為：（1)合成序列是SEQ ID NO. 9所示序列的基因片段；（2)以步驟1的基因片段為模板，使用序列是SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12所示的引物進行PCR，PCR產(chǎn)物回收后作為模板，用序列是SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12所示的引物進行PCR獲得重組基因；（3)用NotI、BamHI雙酶切步驟2得到的重組基因 和pPIC9K質(zhì)粒，用連接酶連接得到重組質(zhì)粒；(4)將步驟3得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到pichia pastoris GS115中，即得到重組畢赤酵母菌。
9. 權利要求1所述重組酵母菌在胰蛋白酶生產(chǎn)方面的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK104312933SQ201410555749
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權日:2014年10月17日
【發(fā)明者】康振, 陳堅, 張云豐, 堵國成 申請人:江南大學