一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法，改進(jìn)之處是在苯酚提取前，先用蛋白酶K對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行處理，將肽段降解成更小的單元以便于進(jìn)行苯酚提取。提純過程中的DNA酶活性經(jīng)低溫操作并用SDS解聚或檸檬酸三鈉和EDTA.Na2等螯合劑抑制。逐漸純化的DNA經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀而收集，最終實(shí)現(xiàn)DNA分離純化之目的。
【專利說明】一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法，屬分子遺傳育種領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]提取DNA的基本程序包括細(xì)胞破碎一解聚核蛋白并去除蛋白質(zhì)一沉淀核酸并去除其它雜質(zhì)三步。破碎細(xì)胞的方法很多，高等動(dòng)植物材料常用液氮研磨。除去細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法是，加入苯酚或1:1的苯酚與氯仿的混合物。這些有機(jī)溶劑能夠沉淀出蛋白質(zhì)但仍保留核酸在溶液中。對(duì)于某些細(xì)胞提取物來說，其中的蛋白質(zhì)成分含量如此之多，以至于單使用苯酚提取并不足以徹底純化核酸。正確的處理方法是在苯酚提取前，先用蛋白酶K對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行處理，將肽段降解成更小的單元以便于進(jìn)行苯酚提取。提純過程中的DNA酶活性經(jīng)低溫操作并用SDS解聚或檸檬酸三鈉和EDTA.Na2等螯合劑抑制。逐漸純化的DNA經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀而收集，最終實(shí)現(xiàn)DNA分離純化之目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法，其特征在于它的溶液有以下組分:
氯仿、無水乙醇、Tr i s飽和酚、異戊醇、醋酸鈉、飽和氯化鈉、7 5%冰乙醇、裂解液、Tris-HCl、EDTA、SDS 和雙蒸水。
[0004]一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法，其特征在它包括以下步驟:
1、將組織樣剪碎保存；
2、向組織塊的離心管中加入預(yù)冷TE；
3、離心后棄上清液；
4、加入飽和Nacl、裂解液,混勻后至室溫5min；
5、加入等體積的酚:氯仿:異戊醇抽提一次，離心后吸出上層水相，移至另一干凈離心管中。再用等體積的氯仿:異戊醇抽提一次，離心后用抽提至無蛋白沉淀產(chǎn)生；
6、吸上清，加入NaAc，混勻后，再加入預(yù)冷的無水乙醇，冰浴、離心，棄上清液；
7、用冰乙醇漂洗I次，離心后棄上清液，將離心管倒置于滅菌的濾紙上使乙醇揮發(fā)，風(fēng)干至無酒精味；
8、加入TE，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保存。

【具體實(shí)施方式】
[0005]一、試劑配制
氯仿、無水乙醇、Tr i s飽和酚、異戊醇、醋酸鈉、飽和氯化鈉、7 5%冰乙醇、裂解液、Tris-HCl.EDTA, SDS 和雙蒸水。
[0006]1、配置 10mlTE 溶液
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml ；
EDTA (0.5 mol/1, pH8.0) ,200ul ；
雙蒸水98.8ml ；
2、配置100ml裂解液(注意會(huì)腐蝕手)
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml
SDS (10% )，1ml 或 I 克
EDTA (0.5mol/l，ρΗ8.0)，20ml
滅菌雙蒸水定容至于100ml。
[0007] 二、操作步驟
1、將組織樣剪碎-70°C保存，(稱取0.03g-0.05g加入1.5ml離心管中)；
2、向組織塊的離心管中加入900ul預(yù)冷TE，要防止組織塊聚成團(tuán)，盡可能制成細(xì)胞懸液；
3>3000r/min離心五分鐘后棄上清液；
4、加入10ul飽和Nacl、400ul裂解液，混勻后至室溫5min；
5、加入等體積的酹:氯仿:異戍醇(25:24:1體積比)，抽提一次，4°C13000rpm/min離心lOmin，用大口的移液管頭(用剪刀將Iml移液管頭口剪成大于3mm中的口)小心吸出上層水相(不可碰到蛋白質(zhì)層)，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面。再用等體積的氯仿:異戍醇(24:1),抽提一次，4°C 13000rpm/min離心1min,用大口的移液管頭(用剪刀將Iml移液管頭口剪成大于3mm中的口)抽提至無蛋白沉淀產(chǎn)生；
6、用剪過頭的移液管吸上清，加入1/10體積的3Mol/L的NaAc(PH=5.2)，混勻后，再加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,冰浴10-20min, 13000rpm離心5分鐘，棄上清液；
7、用50ul，70%冰乙醇漂洗I次，13000rpm離心5分鐘，棄上清液，將離心管倒置于滅菌的濾紙上10-15min使乙醇揮發(fā)，風(fēng)干至無酒精味；
8、加入50ulTE, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(電泳或紫外分光光度法)，-20°C保存。
【權(quán)利要求】
1.一種改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法，其特征在于它的溶液: 氯仿、無水乙醇、Tr i s飽和酚、異戊醇、醋酸鈉、飽和氯化鈉、7 5%冰乙醇、裂解液、Tris-HCl、EDTA、SDS 和雙蒸水； 上述改進(jìn)的動(dòng)物組織基因組DNA提取方法包括以下步驟: (1)將組織樣剪碎_70°C保存(稱取0.03g-0.05g加入1.5ml離心管中)； (2)向組織塊的離心管中加入900ul預(yù)冷TE，要防止組織塊聚成團(tuán)，盡可能制成細(xì)胞懸液； (3)3000r/min離心五分鐘后棄上清液； (4)加入10ul飽和Nacl、400ul裂解液，混勻后至室溫5min； (5)加入等體積的酹:氯仿:異戍醇(25:24:1體積比)，抽提一次，4°C13000rpm/min離心lOmin，用大口的移液管頭(用剪刀將Iml移液管頭口剪成大于3mm中的口)小心吸出上層水相(不可碰到蛋白質(zhì)層)，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，抽提一次，41: 13000rpm/min離心lOmin，用大口的移液管頭(用剪刀將Iml移液管頭口剪成大于3mm中的口)抽提至無蛋白沉淀產(chǎn)生； (6)用剪過頭的移液管吸上清，加入1/10體積的3Mol/L的NaAc(PH=5.2)，混勻后，再加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,冰浴10-20min, 13000rpm離心5分鐘，棄上清液； (7)用50ul，70%冰乙醇漂洗I次，13000rpm離心5分鐘，棄上清液，將離心管倒置于滅菌的濾紙上10-15min使乙醇揮發(fā)，風(fēng)干至無酒精味； (8)加入50ulTE, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(電泳或紫外分光光度法)，-20°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液，其配制方法為: Cl)配置10mlTE溶液
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml ；
EDTA (0.5 mol/1, pH8.0) ,200ul ； 雙蒸水98.8ml ； (2)配置100ml裂解液(注意會(huì)腐蝕手)
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml
SDS (10% )，1ml 或 I 克
EDTA (0.5mol/l，ρΗ8.0)，20ml
滅菌雙蒸水定容至于100ml。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104232623SQ201410561561
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】焦婷, 趙生國, 車攏杰, 權(quán)金強(qiáng), 郭永博, 汪文強(qiáng), 鄭王山 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)