脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗及其生產(chǎn)方法。所述的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗是應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器以Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的，具體包括：在籃式生物反應(yīng)器中加入M199培養(yǎng)基，接種Vero細胞培養(yǎng)，至長成致密單層后，用Earle's平衡鹽溶液洗換；洗換結(jié)束后注入M199培養(yǎng)基液，接種脊髓灰質(zhì)炎病毒，病毒接種MOI為0.01～0.3，繼續(xù)培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)溫度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培養(yǎng)階段體系pH值為7.4～7.6；接種后培養(yǎng)42～72小時收獲病毒液。本發(fā)明通過選擇合適的培養(yǎng)基并控制適宜的培養(yǎng)溫度、pH值、接種比例、溶氧等條件，病毒滴度高、抗原含量高，批間差異高度可控，質(zhì)量均一。
【專利說明】脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗及其生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗及其生產(chǎn)方法，具體是一種應(yīng)用籃式生物 反應(yīng)器以Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的方法，以及利用該方法生產(chǎn)得到的 脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗。

【背景技術(shù)】
[0002] 脊髓灰質(zhì)炎（簡稱脊灰）是由脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所引起的、以肢體麻痹為主的 急性腸道傳染病。脊髓灰質(zhì)炎的主要易感人群為兒童。目前仍然沒有有效的治療脊灰的方 法，控制與消滅脊灰最重要的是有效的脊髓灰質(zhì)炎疫苗。
[0003] 國內(nèi)外已應(yīng)用的脊髓灰質(zhì)炎疫苗有兩種：口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（Oral poliovirus vaccine，0PV)和滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗（Inactivated poliovirus vaccine， IPV)。其中，IPV不會產(chǎn)生疫苗相關(guān)麻搏型脊灰（Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis, VAPP)及疫苗衍生脊灰病毒（Vaccine-Derived Poliovirus, VDPV)引起 的脊髓灰質(zhì)炎病毒循環(huán)iVDPV感染，且IPV可與其他疫苗聯(lián)合使用；并且，由于OPV對于有 免疫缺陷的兒童會引起一定比例的脊髓灰質(zhì)炎，WHO建議在全球證實消滅脊灰后盡早停止 OPV的使用。因此，對于IPV的研究迫在眉睫。
[0004] 傳統(tǒng)的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗是采用發(fā)酵罐或轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)，相關(guān)工藝可參見 CN1647822A、CN1297314C等，采用傳統(tǒng)工藝，每批次的細胞質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度都不同，較 難控制，且存在勞動強度大、占地空間大、隱性污染引起高內(nèi)毒素的隱患大、細胞生長環(huán)境 (溫度、pH值、溶氧等）不易控制、細胞生長密度低等缺點。
[0005] 近年來，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞的技術(shù)日趨成熟。目前已有關(guān)于以Sabin減毒 株作為生產(chǎn)用毒種、以Vero細胞的微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)滅活疫苗的技術(shù)報道， 但該現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的疫苗安全性尚存在爭議。CN102406928A公開了一種人二倍體細胞脊 髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其中采用多級微載體生物反應(yīng)器擴增傳代培養(yǎng)人二倍體細 胞，每級生物反應(yīng)器的細胞生長達到IO 6個/ml以上濃度時，消化細胞制備細胞懸液，按照 1 :10?1 :20的放大比例進入下一級的生物反應(yīng)器進行擴增培養(yǎng)直至達到生產(chǎn)所需規(guī)模， 再接種脊髓灰質(zhì)炎病毒、增殖培養(yǎng)、收獲病毒培養(yǎng)液并進行純化和滅活，但該技術(shù)生產(chǎn)的收 獲液病毒滴度較低，且并沒有公開具體的培養(yǎng)條件。
[0006] 目前并未有應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器以Vero細胞為基質(zhì)高效生產(chǎn)高質(zhì)量脊髓灰質(zhì)炎 滅活疫苗的技術(shù)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的是提供一種應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器以Vero細胞為基質(zhì)高效生產(chǎn) 高質(zhì)量脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的方法。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器生產(chǎn)Vero細胞脊髓灰 質(zhì)炎滅活疫苗的方法。事實上，以Vero細胞為基質(zhì)接種脊髓灰質(zhì)炎病毒的培養(yǎng)條件相對較 難控制。發(fā)明人經(jīng)過反復摸索實驗，最終確定了有利的細胞培養(yǎng)條件和脊髓灰質(zhì)炎病毒繁 殖條件，成功地制備出了以Vero細胞為基質(zhì)的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，該疫苗具有良好的穩(wěn) 定性。根據(jù)本發(fā)明所提供的應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器制備Vero細胞脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的方 法，其工藝步驟主要包括：細胞接種、洗換、病毒接種、病毒液收獲。具體地，本發(fā)明的應(yīng)用籃 式生物反應(yīng)器生產(chǎn)Vero細胞脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的方法包括步驟 ：
[0009] 在籃式生物反應(yīng)器中加入M199培養(yǎng)基作為細胞生長液，接種Vero細胞進行培養(yǎng)， 至長成致密單層后，應(yīng)用Earle's平衡鹽溶液進行洗換；
[0010] 洗換結(jié)束后注入M199培養(yǎng)基液作為細胞生長液，進行脊髓灰質(zhì)炎病毒的接種，病 毒接種MOI為0. 01?0. 3,繼續(xù)培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)溫度33±0. 5°C，溶氧40?80%，并控制病 毒培養(yǎng)階段體系PH值為7. 4?7. 6 ;
[0011] 病毒接種后培養(yǎng)42?72小時，收獲病毒液。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法還包括：
[0013] 收獲的病毒液經(jīng)適當稀釋后配制脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，配制后凍干，即為Vero細 胞脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗制品。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法中，所述 脊髓灰質(zhì)炎病毒為I型、II型、或III型脊髓灰質(zhì)炎病毒。具體而言，I型脊髓灰質(zhì)炎病毒 的收獲時間為病毒接種后培養(yǎng)48-66小時，II型脊髓灰質(zhì)炎病毒的收獲時間為病毒接種后 培養(yǎng)30-54小時，III脊髓灰質(zhì)炎病毒的收獲時間為病毒接種后培養(yǎng)42-72小時。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法中，，控制 籃式反應(yīng)器攪拌槳轉(zhuǎn)速為：接種細胞階段攪拌槳轉(zhuǎn)速為110?130rpm ;培養(yǎng)細胞階段轉(zhuǎn)速 為70?90rpm ;接種病毒階段轉(zhuǎn)速為90?IlOrpm ;培養(yǎng)病毒階段轉(zhuǎn)速為70?90rpm。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法中，采用 籃式反應(yīng)器控制系統(tǒng)的"4Gas"模式進行Vero細胞及病毒培養(yǎng)。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法中，所述 Vero細胞培養(yǎng)階段中的生長液為高糖M199培養(yǎng)基，其初始葡萄糖含量為5. 0?6. Og/L ;在 Vero細胞培養(yǎng)過程中，當接種細胞40?60小時后，開啟灌流生長液，并設(shè)定灌流量為2? 6L/day，維持細胞生長體系中的葡萄糖含量在2. 0?3. Og/L。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法中，Vero 細胞接種密度為：〇. 5X106?3. 0X106cells/ml ;培養(yǎng)體系pH 7. 4?7. 6,溫度37土rc ; 培養(yǎng)6?8天至長成致密單層。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法中，是在 接種病毒后第42-72小時采取連續(xù)或半連續(xù)灌流病毒維持液的方式開啟流加并進行病毒 液的連續(xù)收獲，所述病毒維持液為M199培養(yǎng)基；病毒維持液的灌流量為2?6L/day，維持 病毒生長體系中的葡萄糖含量大于等于2. Og/L。
[0020] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種按照本發(fā)明所述的方法制備得到的Vero細胞脊 髓灰質(zhì)炎滅活疫苗。
[0021] 本發(fā)明的應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器以Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的方 法中，未詳細提及的步驟（例如，以所收獲的病毒液經(jīng)純化、滅活和/或凍干等制備疫苗制 品的步驟）可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進行（例如，根據(jù)北京天壇生物制品股份有限公 司或其他公司或文獻記載的現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)收獲液進行相同的配制制備疫苗制品）；未詳細 提及的反應(yīng)器的操作方法及其他工藝參數(shù)可以參照反應(yīng)器的說明書確定。本發(fā)明的關(guān)鍵在 于確定了對以籃式生物反應(yīng)器以Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗所得病毒收獲 液有重要影響的因素條件：確定籃式反應(yīng)器培養(yǎng)I、II、III型脊髓灰質(zhì)炎病毒的培養(yǎng)基、PH 值、培養(yǎng)溫度；病毒接種時間、病毒接種MOI ;溶氧條件；病毒收獲時間等。通過控制這些因 素條件在本發(fā)明的范圍內(nèi)，能夠成功地制備出以Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫 苗，所得病毒收獲液在具有較高收獲量的情況下具有較高的病毒滴度。
[0022] 整體而言，本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果：采用籃式反應(yīng)器成功培養(yǎng)脊髓灰質(zhì) 炎病毒，細胞接種密度大，病毒滴度高、抗原含量高，批間差異高度可控，質(zhì)量均一。且本發(fā) 明的以Vero細胞為基質(zhì)的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗具有良好的穩(wěn)定性。

【具體實施方式】
[0023] 為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于 解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。
[0024] 以下各實施例中所用原始材料均可商購獲得，主要實驗材料與主要檢定方法如 下：
[0025] 一、主要實驗材料
[0026] 病毒株：脊髓灰質(zhì)炎病毒I、II、III型，由北京天壇生物制品股份有限公司提供；
[0027] 細胞：Vero細胞，由北京天壇生物制品股份有限公司提供；
[0028] 199培養(yǎng)基：由北京天壇生物制品股份有限公司培養(yǎng)基室提供；
[0029] MEM培養(yǎng)基：購自宜興賽爾生物科技有限公司；
[0030] DMEM培養(yǎng)基：購自SAFC公司。
[0031] 二、主要檢定方法
[0032] 病毒滴度：采用微量滴定細胞病變法，karber法計算LogCCID5tl值。
[0033] 有效抗原含量檢測：ELISA雙抗體夾心法。以脊髓灰質(zhì)炎病毒的單克隆抗體包板， HRP標記的多克隆抗體作為酶標記物。
[0034] Vero細胞蛋白殘留（HCP)含量檢測：采用ELISA雙抗體夾心法，應(yīng)用市售Vero細 胞HCP檢測試劑盒進行檢測。
[0035] 以下各實施例中，采用籃式反應(yīng)器控制系統(tǒng)的"4Gas"模式，根據(jù)培養(yǎng)工藝要求的 PH值及溶氧范圍，自動分配和調(diào)整空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳的通氣量，維持反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng) 液的PH值及溶氧，為細胞和病毒提供適宜的生長環(huán)境。
[0036] 實施例一、不同培養(yǎng)液及pH值條件下籃式反應(yīng)器培養(yǎng)脊髓灰質(zhì)炎病毒試驗
[0037] 1不同培養(yǎng)基及每種培養(yǎng)基的不同pH值條件下培養(yǎng)脊髓灰質(zhì)炎病毒試驗
[0038] 采用M199、DEME和MEM三種不同的培養(yǎng)基配制細胞生長液和病毒維持液，各培養(yǎng) 基配制成4個pH值梯度，分別為ρΗ7· 2、ρΗ7· 4、ρΗ7· 6和ρΗ7· 8。接種Vero細胞進行培養(yǎng)，待 細胞培養(yǎng)6?8天，長成致密單層后，采用Earle's液洗滌三次，以相同的MOI (Μ0Ι = 0. 01) 分別接種I、Π 、III型脊髓灰質(zhì)炎病毒進行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)不同時間的病毒滴度和Vero細 胞殘余蛋白（HCP)含量。
[0039] I. 1不同培養(yǎng)基和pH值條件下I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的培養(yǎng)試驗
[0040] I型脊髓灰質(zhì)炎病毒在M199、DEME和MEM三種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，以M199和 DMEM的病毒滴度較高，均可達8. 51gCCID5(l/ml，其中又以M199的病毒高峰維持時間較長；并 且不同PH值條件下的M199其病毒滴度的差別相對較小，病毒增殖情況更平穩(wěn)，DMEM在不 同pH值條件下其病毒滴度的波動較大，對pH值的要求較嚴格。雖然在DMEM培養(yǎng)時HCP含 量較低，但病毒滴度這一主要指標低于M199。
[0041] 結(jié)果見表1。
[0042] 表1不同培養(yǎng)基和pH值下I型脊髓灰質(zhì)炎病毒培養(yǎng)試驗
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法，該方法包括步驟： 在籃式生物反應(yīng)器中加入M199培養(yǎng)基作為細胞生長液，接種Vero細胞進行培養(yǎng)，至長 成致密單層后，應(yīng)用Earle's平衡鹽溶液進行洗換； 洗換結(jié)束后注入M199培養(yǎng)基液作為細胞生長液，進行脊髓灰質(zhì)炎病毒的接種，病毒接 種MOI為0. 01?0. 3,繼續(xù)培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)溫度33±0. 5°C，溶氧40?80%，并控制病毒培 養(yǎng)階段體系PH值為7. 4?7. 6 ; 病毒接種后培養(yǎng)42?72小時，收獲病毒液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括： 收獲的病毒液經(jīng)適當稀釋后配制脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，配制后凍干，即為Vero細胞脊 髓灰質(zhì)炎滅活疫苗制品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為I型、II型、或III 型脊髓灰質(zhì)炎病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的收獲時間為病毒接種后培 養(yǎng)48-66小時，II型脊髓灰質(zhì)炎病毒的收獲時間為病毒接種后培養(yǎng)30-54小時，III脊髓灰 質(zhì)炎病毒的收獲時間為病毒接種后培養(yǎng)42-72小時。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，控制籃式反應(yīng)器攪拌槳轉(zhuǎn)速為： 接種細胞階段攪拌槳轉(zhuǎn)速為110?130rpm ;培養(yǎng)細胞階段轉(zhuǎn)速為70?90rpm ;接種病 毒階段轉(zhuǎn)速為90?IlOrpm ;培養(yǎng)病毒階段轉(zhuǎn)速為70?90rpm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，采用籃式反應(yīng)器控制系統(tǒng)的"4Gas"模式進 行Vero細胞及病毒培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述Vero細胞培養(yǎng)階段中的生長液為高 糖M199培養(yǎng)基，其初始葡萄糖含量為5. 0?6. Og/L ;在Vero細胞培養(yǎng)過程中，當接種細胞 40?60小時后，開啟灌流生長液，并設(shè)定灌流量為2?6L/day，維持細胞生長體系中的葡 萄糖含量在2. 0?3. Og/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，Vero細胞接種密度為：0. 5X IO6? 3. OX 106cells/ml ;培養(yǎng)體系pH 7. 4?7. 6,溫度37 ±1°C;培養(yǎng)6?8天至長成致密單層。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，是在接種病毒后第42-72小時采取連續(xù)或半連續(xù) 灌流病毒維持液的方式開啟流加并進行病毒液的連續(xù)收獲，所述病毒維持液為M199培養(yǎng) 基；病毒維持液的灌流量為2?6L/day，維持病毒生長體系中的葡萄糖含量大于等于2. Og/ L0
10. -種按照權(quán)利要求1?9任一項所述的方法制備得到的Vero細胞脊髓灰質(zhì)炎滅活 疫苗。
【文檔編號】C12R1/93GK104312981SQ201410570519
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】王輝, 趙玉秀, 李愛靈, 梁宏陽, 劉小娟, 趙碩, 董圓, 曾令冰 申請人:北京天壇生物制品股份有限公司