基于磁珠法提取土壤微生物dna的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方法，本發(fā)明的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方法，是利用氫氧化鋁來去除土壤中的各種雜質(zhì)，再使用玻璃珠破碎土壤微生物細(xì)胞后，通過磁珠吸附土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA。本發(fā)明方法所用時(shí)間短，步驟少，能獲得純度高的土壤微生物DNA，無需再進(jìn)一步純化即可直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
【專利說明】基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA 的試劑盒及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤除了為陸生植物提供營(yíng)養(yǎng)源和水分之外，還是植物生長(zhǎng)，進(jìn)行光合作用、能量 交換的主要場(chǎng)所；同時(shí)也具有微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及各種條件，是微生 物良好的生活場(chǎng)所，有"微生物的天然培養(yǎng)基"之稱。
[0003] 土壤是微生物的主要棲息地，是自然環(huán)境中最復(fù)雜的異質(zhì)體系，這決定了土壤微 環(huán)境的多樣化和土壤微生物的高度多樣性。每克土壤含有大約107個(gè)原核生物細(xì)胞，但僅 有0. 1%?10%的土壤微生物是可以培養(yǎng)的。在微生物學(xué)研究領(lǐng)域中，因?yàn)?9%以上的微 生物都是目前未（難）被純培養(yǎng)的，過去人們對(duì)微生物世界的認(rèn)識(shí)基本上都集中在不到1% 的微生物上。對(duì)這些未培養(yǎng)微生物多樣性及群落功能的研究將大大擴(kuò)展我們對(duì)生命的了 解，包括了解生命如何耐受極端環(huán)境、新的生物能源、生命進(jìn)化以及微生物與環(huán)境之間的相 互作用。
[0004] 微生物環(huán)境基因組學(xué)為最大限度地挖掘微生物資源帶來了前所未有的機(jī)遇，已經(jīng) 成為國(guó)際生命科學(xué)技術(shù)研究和開發(fā)最重要的熱點(diǎn)和前沿。為了充分認(rèn)識(shí)不可培養(yǎng)微生物的 豐富資源，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已建立起了許多不需要對(duì)微生物進(jìn)行獨(dú)立培 養(yǎng)的新方法和新技術(shù)。如變性梯度凝膠電泳（DGGE)法是將目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成信息；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù) (RAPD)是應(yīng)用不同的隨機(jī)引物在非嚴(yán)格的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過分析PCR產(chǎn)物在凝膠 電泳上的條帶多態(tài)性來反映樣品中微生物的多樣性。
[0005] 關(guān)于土壤宏基因組學(xué)技術(shù)的構(gòu)建已有許多研究報(bào)道，主要的突破在于需要足夠高 質(zhì)量的DNA，因此直接從土壤環(huán)境中提取和純化DNA是其中最關(guān)鍵的步驟。土壤宏基因組學(xué) 技術(shù)在我國(guó)土壤及環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)方面的研究才剛起步，對(duì)這一新技術(shù)的跟蹤和應(yīng)用， 將會(huì)有力地促進(jìn)我國(guó)土壤微生物生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展。因此，研究一種高效提取土壤宏基因 組DNA的試劑盒，對(duì)于大規(guī)模開展土壤宏基因組學(xué)研究顯得十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種能高效、快速的基于磁珠法提取土壤微 生物DNA的試劑盒及方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種基于磁珠法提取土 壤微生物DNA的方法，包括如下步驟：
[0008] 土壤樣品的前處理：取0. 25-lg的土壤于2ml的離心管中，加入50_150iilBuffer A, 300-900ill無菌水，300-900illBufferB，渦旋震蕩 30-60s，加入 50-150illBufferC， 200-400ii1BufferD，渦旋震蕩 30-60s，8000-10000g離心 2-5min，去上清得沉淀A;
[0009] 所述BufferA為pH為 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl緩沖液；
[0010] 所述BufferB為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液；
[0011] 所述BufferC為為包含2-6M的OF離子的溶液；
[0012]所述BufferD為pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl緩沖液；
[0013] 土壤微生物DNA的提取：所述沉淀A加入300-400illBufferD，0? 2-lg的0? 5mm 玻璃珠，300-400iilBufferE，300-400iilBufferF，渦旋震蕩l-3min，4°C溫度條件下 11000-12000g離心l-3min，取 500-1000ul上清液至 1. 5ml離心管，加入 500-1000ii1 的 酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積份數(shù)比為25:24:1，渦 旋震蕩30-60s，4°C溫度條件下13000-16000g離心l-3min，將上清液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管， 加入上清液等體積的BufferG，震蕩10-30s，放置5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上， 進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入0. 5-2mlBufferH， 打勻后室溫靜止5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁 珠。往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入30-60ylBufferI，即得土壤微生物DNA溶液；
[0014] 所述BufferE為 5_15% 的SDS溶液；
[0015] 所述BufferF由以下方法配制而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH為7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0016] 所述BufferG為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0017] 所述BufferH為 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液與50-100ml的無水乙醇混合而成；
[0018] 所述BufferI為pH為 7-8 的 6-10mMTris溶液。
[0019] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，所 述試劑盒包括如下試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、BufferG、BufferH和BufferI;
[0020] 所述BufferA為pH為 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl緩沖液；
[0021] 所述BufferB為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液；
[0022] 所述BufferC為為包含2-6M的OF離子的溶液；
[0023] 所述BufferD為pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl緩沖液；
[0024] 所述BufferE為 5_15% 的SDS溶液；
[0025] 所述BufferF由以下方法配制而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH為7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0026] 所述BufferG為4_50ml異丙醇與l_3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0027] 所述BufferH為 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液與50-100ml的無水乙醇混合而成；
[0028] 所述BufferI為pH為 7-8 的 6-1OmMTris溶液。
[0029] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方 法，是利用氫氧化鋁來去除土壤中的各種雜質(zhì)，再使用玻璃珠破碎土壤微生物細(xì)胞后，通過 磁珠吸附土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA。本發(fā)明方法所用時(shí)間短，步驟少， 能獲得純度高的土壤微生物DNA，無需再進(jìn)一步純化即可直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為利用本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的方法對(duì)4種不同土壤樣品的微生物基因組DNA 提取結(jié)果圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中4種不同土壤樣品的微生物基因組16srDNA擴(kuò)增 結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附 圖予以說明。
[0033] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：利用氫氧化鋁來去除土壤中的各種雜質(zhì)，再使用玻璃 珠破碎土壤微生物細(xì)胞后，通過磁珠吸附土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] -種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，具體步驟如下：
[0036] (1)原料：新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際土壤，新鮮花生 根際土壤。
[0037] (2) 土壤樣品的前處理：用天平稱取0? 25-lg的土壤于2ml的離心管中，加入 50-150illBufferA，300-900ill無菌水，300-900illBufferB，渦旋震蕩 30-60s;加入 50-150illBufferC，200-400illBufferD，渦旋震蕩 30-60s;8000-10000g離心 2-5min， 去上清。前處理主要是去除腐殖質(zhì)等土壤雜質(zhì)，防治雜質(zhì)對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的影響。
[0038] (3)磁珠吸附土壤微生物DNA及洗脫：加入 300-400illBufferD，0? 2-lgO. 5mm 玻璃珠，300-400illBufferE，300-400illBufferF，渦旋震蕩l-3min，4°C11000_12000g 離心l_3min。吸取500-1000ii1上清至1. 5ml離心管，加入500-1000ii1酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1)，渦旋震蕩30-60s，4°C13000-16000g離心l-3min。將上清轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管， 加入與上清液等體積的BufferG。震蕩10-30s。室溫放置5-10min，將離心管放在磁力架 上,進(jìn)行磁珠分離。吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入0. 5-2mlBufferH，打 勻后室溫靜止5-10min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。吸去液體，保留磁珠。往含 有磁珠的離心管中加入30-60ylBufferI，此溶液即為土壤微生物DNA。于1-2%瓊脂糖 凝膠中電泳檢測(cè)。
[0039] 磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為0. 5-2um硅基生物磁珠就是指磁珠微珠表面包裹一 層硅材料來吸附核酸，選用磁珠法來純化核酸的最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化。磁珠在磁場(chǎng)條件下 可以發(fā)生聚集或分散，從而可擺脫離心等所需的手工操作流程。不同粒徑大小的磁珠，其表 面積大小不一，吸附效果不一。
[0040] BufferA溶液的配置：0? 5-2MTris-Cl(pH= 4-6);
[0041] 所述BufferB為0? 1-2M為包含0? 1-2M的A13+離子的溶液；
[0042] 所述BufferC為包含2-6M的OF離子的溶液；所述BufferB可為Al2 (S04) 3與所 述BufferC可為NaOH,他們反應(yīng)生成氫氧化錯(cuò)吸附雜質(zhì)；直接加入氫氧化錯(cuò)的話，因?yàn)闅溲?化鋁是固狀膠體，其與土壤反映不充分。先加入Al2 (S04) 3溶液，并將其與土壤溶液混勻，再 加入氫氧化鈉溶液后與其反映，能更加充分地吸附土壤中的雜質(zhì)；
[0043] BufferD溶液的配置：0? 1-1MTris-Cl(pH= 7-9)偏堿性緩沖液使核酸更容易從 細(xì)胞中游離出來；
[0044] BufferE溶液的配置：5_15%SDS，其作用為破碎細(xì)胞壁；
[0045] BufferF溶液的配置：稱取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入適當(dāng)體積的雙 蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH= 7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0046]BufferG溶液的配置：4-50ml異丙醇，l-3ml磁珠混懸液。（其中磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置），結(jié)合液：其作用為使核酸與磁珠結(jié)合；
[0047]BufferH溶液的配置：10-30mmol/LTris，5-10mmol/LEDTA，100-200mmol/L Nacl的溶液10-40ml與50-100ml的無水乙醇混合配置而成。其作用為洗漆雜質(zhì)；
[0048] BufferI溶液的配置：6-10mmol/LTris，PH= 7. 0-8. 0,其作用為把核酸從磁珠 中洗脫下來；
[0049] 本實(shí)施例還公開了一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒 包括上述方法中的試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI。
[0050] 實(shí)施例2
[0051] 一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，具體步驟如下：
[0052] 原料：新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際土壤，新鮮花生根際 土壤。
[0053] 土壤樣品的前處理：取0. 25-lg的土壤于2ml的離心管中，加入50_150iilBuffer A, 300-900ill無菌水，300-900illBufferB，渦旋震蕩 30-60s，加入 50-150illBufferC， 200-400ii1BufferD，渦旋震蕩 30-60s，8000-10000g離心 2-5min，去上清得沉淀A;
[0054] 所述BufferA 為 pH為 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl緩沖液；
[0055] 所述BufferB為 0? 1-1M的Al2 (S04) 3 溶液；
[0056] 所述BufferC 為 2_5M的NaOH溶液；
[0057] 所述BufferD 為 pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl緩沖液；
[0058] 土壤微生物DNA的提?。核龀恋鞟加入300-400illBufferD，0. 2-lg的0. 5mm 玻璃珠，300-400iilBufferE，300-400iilBufferF，渦旋震蕩l-3min，4°C溫度條件下 11000-12000g離心l-3min，取 500-1000ul上清液至 1. 5ml離心管，加入 500-1000ii1 的 酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積份數(shù)比為25:24:1，渦 旋震蕩30-60s，4°C溫度條件下13000-16000g離心l-3min，將上清液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管， 加入上清液等體積的BufferG，震蕩10-30s，放置5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上， 進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入0. 5-2mlBufferH， 打勻后室溫靜止5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁 珠。往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入30-60ylBufferI，即得土壤微生物DNA溶液；
[0059] 所述BufferE為 5_15% 的SDS溶液；
[0060] 所述BufferF由以下方法配制而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH為7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0061] 所述BufferG為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0062] 所述BufferH為 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液與50-100ml的無水乙醇混合而成；
[0063] 所述BufferI為pH為 7-8 的 6-1OmMTris溶液。
[0064] 本實(shí)施例還公開了一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒 包括上述方法中的試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI。
[0065] 實(shí)施例3
[0066] 本發(fā)明提供一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，該方法能通過磁珠吸附 土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA，利用該方法能夠有效地從土壤中提取出微 生物DNA。具體步驟如下：
[0067] (1)原料：新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際土壤，新鮮花生 根際土壤。
[0068] (2) 土壤樣品的前處理：用天平稱取0. 5g的土壤于2ml的離心管中，加入100ill BufferA，600ii1 無菌水，300ii1BufferB，渦旋震蕩 30s;加入 100ii1BufferC，300ii1 BufferD，潤(rùn)旋震蕩30s;8000g離心2min，去上清。
[0069] (3)磁珠吸附土壤微生物DNA及洗脫：加入325illBufferD，0. 5g0? 5謹(jǐn)玻璃珠， 325illBufferE，325illBufferF，渦旋震蕩lmin，，4°CllOOOg離心 2min。吸取 750ill 上清至1.51111離心管，加入750111酚：氯仿：異戊醇（25 :24:1)，渦旋震蕩308,41：1600(^ 離心lmin。將上清轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管，加入等體積的BufferG。震蕩10s。室溫放置 5min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中 加入lmlBufferH，打勻后室溫靜止8min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。吸去液 體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入50illBufferI，此溶液即為土壤微生物DNA。 于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。
[0070] ⑷擴(kuò)增土壤微生物16srDNA基因：通過PCR的方式進(jìn)行土壤微生物16srDNA基 因的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系如下：rTaq酶0?3ia，PCRbuffer2?5ia，DNTPlia，引物Rlia， 弓丨物Fliil，土壤微生物基因組DNAliil，滅菌水18. 21110PCR擴(kuò)增程序如下：95°C5min; 95°C30s，58°C30s，72°C30s，35個(gè)循環(huán)；72°C5min。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝 膠中電泳檢測(cè)。
[0071] 磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為lum
[0072]BufferA溶液的配置：1MTris-Cl(pH= 5. 5)
[0073]BufferB溶液的配置：0? 2MA12 (S04) 3
[0074]BufferC溶液的配置：4MNaOH
[0075] BufferD溶液的配置：0? 1MTris-Cl(pH=8)
[0076] BufferE溶液的配置：325ii1 10%SDS
[0077] BufferF溶液的配置：稱取2.416gLiCl，1.211gTris，3.506gEDTA，加入適當(dāng)體 積的雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH= 8. 0,定容至100ml
[0078] BufferG溶液的配置：48ml異丙醇，2ml磁珠混懸液。（其中磁珠混懸液由磁珠和 水按照1:2體積比配置）
[0079]BufferH溶液的配置：20mmol/LTris, 8mmol/LEDTA，140mmol/LNacl的溶液 30ml與70ml的無水乙醇混合配置而成
[0080]BufferI溶液的配置：8mmol/LTris,PH=8. 0
[0081] 本實(shí)施例還公開了一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒包括如下試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI;
[0082] 所述 BufferA為pH為5. 5的 1M的Tris-Cl緩沖液；
[0083] 所述 BufferB為 0? 2M的Al2 (S04) 3 溶液；
[0084] 所述BufferC為 4M的NaOH溶液；
[0085] 所述 BufferD為pH=8的0?1M的Tris-Cl緩沖液；
[0086] 所述 BufferE為 10 % 的SDS溶液；
[0087]所述BufferF由以下方法配制而成：取 2.416gLiCl，1.211gTris，3.506gEDTA， 加入雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH為8. 0,定容至100ml;
[0088] 所述BufferG為48ml異丙醇與2ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0089]所述BufferH為 30ml的包含 20mMTris，8mMEDTA，140mMNacl的溶液與 70ml 的無水乙醇混合而成；
[0090] 所述BufferI為pH為8的8mMTris溶液。
[0091] 利用實(shí)施例3所述方法對(duì)新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際 土壤，新鮮花生根際土壤進(jìn)行提取土壤微生物的DNA，4種不同土壤樣品的微生物基因組 DNA提取結(jié)果見圖1，泳道1，2, 3,4分別表示新鮮水稻根際土壤微生物基因組DNA，新鮮玉米 根際土壤微生物基因組DNA，新鮮甘蔗根際土壤微生物基因組DNA，新鮮花生根際土壤微生 物基因組DNA。從圖中可看出本方法能提取到土壤微生物基因組DNA。4種不同的土壤樣品 的微生物基因組的0D(260 :280)值結(jié)果見表1，4種土壤微生物基因組的0D(260 :280)值在 1. 78-1. 80范圍內(nèi)，從表1中可看出本方法可以提取到純度高的土壤微生物基因組DNA。
[0092] 表 1
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： 土壤樣品的前處理：取〇.25-lg的土壤于2ml的離心管中，加入50-150 ill Buffer A， 300-900 ii 1 無菌水，300-900 ii 1 Buffer B，渦旋震蕩 30-60s，加入 50-150 ii 1 Buffer C， 200-400 ii 1 Buffer D，渦旋震蕩 30-60s，8000-10000g 離心 2-5min，去上清得沉淀 A ; 所述Buffer A為pH為4-6的0? 5-2M的Tris-Cl緩沖液； 所述Buffer B為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液； 所述Buffer C為包含2-6M的OIT離子的溶液； 所述 Buffer D 為 pH = 7-9 的 0? 1-1M 的 Tris-Cl 緩沖液； 土壤微生物DNA的提?。核龀恋鞟加入300-400 ill Buffer D，0. 2-lg的0. 5mm玻 璃珠，300-400iil Buffer E，300-400iil Buffer F，渦旋震蕩 l-3min，4°C 溫度條件下 11000-12000g 離心 l-3min，取 500-1000ul 上清液至 1. 5ml 離心管，加入 500-1000 ii 1 的 酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積份數(shù)比為25:24:1，渦 旋震蕩30-60s，4°C溫度條件下13000-16000g離心l-3min，將上清液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管， 加入上清液等體積的Buffer G，震蕩10-30s，放置5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上， 進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入0. 5-2mlBuffer H， 打勻后室溫靜止5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁 珠。往含有磁珠的1.5ml離心管中加入30-60 yl Buffer I，即得土壤微生物DNA溶液； 所述Buf f er E為5-15 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配制而成：取2-3g LiCl，l-2g Tris，3-5g EDTA，加入雙蒸 水溶解并調(diào)節(jié)pH為7. 0-8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 10-40ml 的包含 10-30mM Tris，5-10mM EDTA，100-200mM Nacl 的溶 液與50-100ml的無水乙醇混合而成； 所述 Buffer I 為 pH 為 7-8 的 6-1 OmM Tris 溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，其特征在于，包括如 下步驟： 土壤樣品的前處理：取〇. 5g的土壤于2ml的離心管中，加入lOOiil Buffer A，600iil 無菌水，300 ill Buffer B，渦旋震蕩 30s，加入 100 ill Buffer C，300 ill Buffer D，渦旋震 蕩30s，8000g離心2min，去上清得沉淀A ; 所述Buffer A為pH為5. 5的1M的Tris-Cl緩沖液； 所述 Buffer B 為 0? 1-1M 的 Al2 (S04) 3 溶液； 所述Buf f er C為2-5M的NaOH溶液； 所述Buffer D為pH = 8的0? 1M的Tris-Cl緩沖液； 土壤微生物DNA的提?。核龀恋鞟加入325 ill Buffer D，0. 5g的0. 5mm玻璃珠， 325iil Buffer E，325iil Buffer F，潤(rùn)旋震蕩 lmin，4°C溫度條件下 11000g 離心 2min，取 750ul上清液至1. 5ml離心管，加入750 yl的酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液 中酚、氯仿和異戊醇的體積份數(shù)比為25:24:1，渦旋震蕩30s，4°C溫度條件下16000g離心 lmin，將上清液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管，加入上清液等體積的Buffer G，震蕩10s，放置5min， 將1. 5ml離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離 心管中加入lmlBuffer H，打勻后室溫靜止8min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠 分離，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入50 ill Buffer I，即得土壤 微生物DNA溶液； 所述Buf f er E為10 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配制而成：取2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506gEDTA，加入 雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH為8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為48ml異丙醇與2ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁珠和 水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 30ml 的包含 20mM Tris，8mM EDTA，140mM Nacl 的溶液與 70ml 的無 水乙醇混合而成； 所述Buffer I為pH為8的8mM Tris溶液。
3. -種基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下 試劑：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G、Buffer H 和 Buffer I ; 所述Buffer A為pH為4-6的0? 5-2M的Tris-Cl緩沖液； 所述Buffer B為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液； 所述Buffer C為包含2-6M的OIT離子的溶液； 所述 Buffer D 為 pH = 7-9 的 0? 1-1M 的 Tris-Cl 緩沖液； 所述Buf f er E為5-15 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配制而成：取2-3g LiCl，l-2g Tris，3-5g EDTA，加入雙蒸 水溶解并調(diào)節(jié)pH為7. 0-8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 10-40ml 的包含 10-30mM Tris，5-10mM EDTA，100-200mM Nacl 的溶 液與50-100ml的無水乙醇混合而成； 所述 Buffer I 為 pH 為 7-8 的 6-1 OmM Tris 溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒包括如下試劑：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、 Buffer G、Buffer H 和 Buffer I ; 所述Buffer A為pH為5. 5的1M的Tris-Cl緩沖液； 所述 Buffer B 為 0? 2M 的 Al2 (S04) 3 溶液； 所述Buf f er C為4M的NaOH溶液； 所述Buffer D為pH = 8的0? 1M的Tris-Cl緩沖液； 所述Buf f er E為10 %的SDS溶液； 所述 Buffer F 由以下方法配制而成：取 2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506g EDTA，力口 入雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)pH為8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為48ml異丙醇與2ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁珠和 水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 30ml 的包含 20mM Tris，8mM EDTA，140mM Nacl 的溶液與 70ml 的無 水乙醇混合而成； 所述Buffer I為pH為8的8mM Tris溶液。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104328110SQ201410581883
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)