本發(fā)明涉及一株細(xì)菌的應(yīng)用，具體涉及來(lái)源于大菱鲆腸道的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用，屬于微生物。

背景技術(shù)：

1、大菱鲆(scophthalmus?maximus)又名多寶魚(yú)，具有生長(zhǎng)速度快、耐低溫、飼料轉(zhuǎn)化率高、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，是重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類。養(yǎng)殖規(guī)模的迅速發(fā)展伴隨產(chǎn)生大菱鲆病害問(wèn)題，減少抗生素類漁藥使用、尋求綠色健康防病手段尤為重要。

2、生物防病具有綠色無(wú)污染的特點(diǎn)，在畜牧、種植等領(lǐng)域病害防治中得到廣泛應(yīng)用。益生菌即有益微生物，作為生物防病的首選，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中改善養(yǎng)殖生物健康狀況的有效策略之一。益生菌的使用在減少病原菌侵害、提高消化性能、增強(qiáng)機(jī)體抗逆性能以及改善養(yǎng)殖水體環(huán)境等方面發(fā)揮了積極作用，可實(shí)現(xiàn)病害源頭防控。

3、現(xiàn)有對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的研究主要集中于外源性或非魚(yú)類本身來(lái)源的益生菌或益生元，與內(nèi)源性益生菌相比，無(wú)法有效地在魚(yú)類腸道定植或主導(dǎo)腸道菌群，從而不能充分發(fā)揮益生作用。鹽單胞菌屬應(yīng)用于生態(tài)改良研究較多，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究較少。鐵達(dá)尼鹽單胞菌廣泛分布于廢水、污泥和油田等有機(jī)污染嚴(yán)重的區(qū)域，表明其可能具有降解水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中有機(jī)污染物的能力。篩選分離魚(yú)源鐵達(dá)尼鹽單胞菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于：提供一株來(lái)源于大菱鲆腸道并且對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、提高消化能力、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)以及增強(qiáng)抗病力作用的有益微生物——鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

3、來(lái)源于大菱鲆腸道的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用，將保藏編號(hào)為cctcc?no：m20231666的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3制成凍干菌粉，并按照5wt‰的比例將制得的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3凍干菌粉添加到配合飼料中，然后對(duì)處于仔魚(yú)期的大菱鲆進(jìn)行投喂，配合飼料的每日投喂量為大菱鲆體重的5％，分兩次投喂，早晚各投喂一次，至少投喂60天。

4、其中，將保藏編號(hào)為cctcc?no：m20231666的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3制成凍干菌粉的方法具體如下：

5、(1)活化菌株：將保藏編號(hào)為cctcc?no：m20231666的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3接種于mrs液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)24h；

6、(2)收集菌體并制成菌懸液：將活化好的菌液置于4℃離心機(jī)中離心，棄上清，沉淀用無(wú)菌pbs緩沖液洗滌，收集菌體并制成濃度為1.0×1010cfu/ml的菌懸液；

7、(3)添加凍干保護(hù)劑：將凍干保護(hù)劑與菌懸液混合均勻，得到添加有凍干保護(hù)劑的菌懸液；

8、(4)預(yù)凍：將添加有凍干保護(hù)劑的菌懸液置于冷凍機(jī)內(nèi)-80℃預(yù)凍4h，得到預(yù)凍后的菌體；

9、(5)凍干：將預(yù)凍后的菌體放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24h，得到鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3凍干菌粉。

10、優(yōu)選的，在步驟(3)中，所用的凍干保護(hù)劑由脫脂乳粉、海藻糖、谷氨酸鈉和甘油以質(zhì)量比3：2：1：1組成；凍干保護(hù)劑與菌懸液按照35g：100ml的比例混合。

11、本發(fā)明的有益之處在于：

12、(1)鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3從健康的養(yǎng)殖大菱鲆腸道中篩選獲得，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該菌株為革蘭氏陰性桿菌，對(duì)健康大菱鲆無(wú)致病性；

13、(2)將鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3制成凍干菌粉后，經(jīng)拌飼投喂實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源補(bǔ)充鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3提高了養(yǎng)殖大菱鲆的生長(zhǎng)性能、免疫能力和消化能力，該菌株對(duì)大菱鲆腸道產(chǎn)生了積極影響(增加了腸絨毛高度、腸絨毛寬度和肌層厚度)，同時(shí)還增加了大菱鲆腸道幾種潛在有益菌的相對(duì)豐度及腸道微生物多樣性水平；

14、(3)經(jīng)攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源補(bǔ)充鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3可以延緩大菱鲆因感染殺鮭氣單胞菌bhas-1而導(dǎo)致的發(fā)病死亡，有效降低養(yǎng)殖大菱鲆死亡率，增強(qiáng)養(yǎng)殖大菱鲆的抗病力，證明鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3具有良好的定植性能，能夠在養(yǎng)殖大菱鲆體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮益生作用。

技術(shù)特征：

1.來(lái)源于大菱鲆腸道的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于，將保藏編號(hào)為cctcc?no：m20231666的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3制成凍干菌粉，并按照5wt‰的比例將制得的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3凍干菌粉添加到配合飼料中，然后對(duì)處于仔魚(yú)期的大菱鲆進(jìn)行投喂，配合飼料的每日投喂量為大菱鲆體重的5％，分兩次投喂，早晚各投喂一次，至少投喂60天。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將保藏編號(hào)為cctcc?no：m20231666的鐵達(dá)尼鹽單胞菌ht-tc3制成凍干菌粉的方法具體如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(3)中，所用的凍干保護(hù)劑由脫脂乳粉、海藻糖、谷氨酸鈉和甘油以質(zhì)量比3：2：1：1組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(3)中，凍干保護(hù)劑與菌懸液按照35g：100ml的比例混合。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了來(lái)源于大菱鲆腸道的鐵達(dá)尼鹽單胞菌HT?Tc3在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。其中，鐵達(dá)尼鹽單胞菌HT?Tc3(保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M20231666)制成凍干菌粉后，經(jīng)拌飼投喂實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源補(bǔ)充鐵達(dá)尼鹽單胞菌HT?Tc3提高了養(yǎng)殖大菱鲆的生長(zhǎng)性能、免疫能力和消化能力，該菌株對(duì)大菱鲆腸道產(chǎn)生積極影響，增加了腸道幾種潛在有益菌的相對(duì)豐度及腸道微生物多樣性水平，經(jīng)攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源補(bǔ)充鐵達(dá)尼鹽單胞菌HT?Tc3可以延緩大菱鲆因感染殺鮭氣單胞菌BHAS?1而導(dǎo)致的發(fā)病死亡，增強(qiáng)養(yǎng)殖大菱鲆的抗病力。

技術(shù)研發(fā)人員：王鶴,許瀚之,趙曉偉,黃華,張麗文,趙延寧,王涵,李五
受保護(hù)的技術(shù)使用者：煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院（煙臺(tái)市漁業(yè)技術(shù)推廣站、煙臺(tái)市海洋捕撈增殖管理站）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/12