專利名稱：一種生產(chǎn)六氨基青霉烷酸的膜反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于生化反應(yīng)工程中的膜反應(yīng)器及該反應(yīng)器用于固定化細(xì)胞裂解青霉素(PG)生產(chǎn)六氨基青霉烷酸(6APA)技術(shù)。
6APA是半合成青霉素的基本原料，目前它主要由酶法裂解青霉素制備。酶法生產(chǎn)6APA有固定化青霉素酰化酶和固定化含有青霉素?；傅募?xì)胞兩種技術(shù)。用固定化細(xì)胞裂解PG生產(chǎn)6APA省去了酶的分離提取等繁雜步驟，工藝簡單、成本低廉，但由于酶包含在整細(xì)胞內(nèi)，以常規(guī)方法制得的固定化細(xì)胞顆粒大，比活低。通過菌株篩選和基因重組雖然能得到高活力的細(xì)胞，但固定化細(xì)胞比活低于固定化酶，應(yīng)用遠(yuǎn)沒有固定化酶廣泛。在酶法生產(chǎn)6APA中多采用填充床反應(yīng)器。線度為幾個(gè)毫米的顆粒狀或纖維狀的固定化酶或固定化細(xì)胞裝填于圓筒式反應(yīng)器內(nèi)，青霉素溶液流過固定化酶，固定化細(xì)胞床層被催化裂解后流出。由于一次轉(zhuǎn)化率不高，出料經(jīng)PH調(diào)節(jié)返回反應(yīng)器，如此反復(fù)循環(huán)直至底物接近完全轉(zhuǎn)化。這種常規(guī)的填充床反應(yīng)器在放大時(shí)，床層高度和固定化酶或細(xì)胞的裝填量都有限制，否則將因流動(dòng)阻力過大而難以正常操作。同時(shí)因固定化酶或細(xì)胞的粒度較大，裝填的不均勻性和反應(yīng)時(shí)的擴(kuò)散限制都影響酶活力的有效發(fā)揮。此外底物溶液對(duì)床層的反復(fù)沖刷會(huì)引起固定化酶或細(xì)胞的破碎和酶的脫落，并污染物料導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降。近年來出現(xiàn)采用膜反應(yīng)器濃集游離青霉素酰化酶生產(chǎn)6APA的研究，由于游離酶的不穩(wěn)定性，反應(yīng)過程又采用擴(kuò)散控制或超濾模式操作，反應(yīng)器效率不高，表現(xiàn)在裂解轉(zhuǎn)化時(shí)間長或裂解濃度過低，難以長期穩(wěn)定操作。
本發(fā)明為固定化細(xì)胞裂解PG生產(chǎn)6APA提供一種膜反應(yīng)器及利用該反應(yīng)器的操作技術(shù)，從而提高了單位反應(yīng)器體積內(nèi)細(xì)胞的裝填密度和催化活力，實(shí)現(xiàn)了膜反應(yīng)器生產(chǎn)6APA的長期穩(wěn)定操作，并可在高底物濃度下獲得高的產(chǎn)品收率和高純優(yōu)質(zhì)6APA產(chǎn)品。
本發(fā)明反應(yīng)器所用的膜為聚砜中空纖維或平板微濾、超濾膜，也可采用孔徑為30～80μm的濾紙，濾布。由采用膜的不同可分為中空纖維膜反應(yīng)器和為獲得高面體比而將平板膜折迭定形后制成的折迭式平板膜反應(yīng)器，其膜孔徑大小可按與實(shí)際所用的固定化細(xì)胞的粒度來確定。


圖1是中空纖維膜反應(yīng)器的示意圖，圖中1、上下封蓋;2、殼體;3、中空纖維膜束;4、環(huán)氧樹脂固定層，反應(yīng)器上下封蓋1上各帶有一管口，殼體2上帶有連接管口。成束的中空纖維3用環(huán)氧樹脂4固定在反應(yīng)器殼體2內(nèi)，將反應(yīng)器隔成內(nèi)外兩個(gè)腔室。物料從反應(yīng)器殼體2的兩個(gè)連接管口進(jìn)入外腔，透過膜集流至反應(yīng)器上下封蓋1。中空纖維膜的外徑越小，裝填根數(shù)越多，膜的總面積越大，外徑以0.5～1mm，膜厚為150±10μm為佳。
圖2是折選式平板膜反應(yīng)器示意圖。圖中5、上下封蓋;6、殼體;7、9、分配隔網(wǎng);8、膜;10、中心管;11、環(huán)氧樹脂固定層，反應(yīng)器上下封蓋5上各帶有一管口，殼體6上帶有連接管口。將平板膜按定長、定寬折迭定形后裝入中心集流管10和反應(yīng)器殼體6之間的環(huán)形空間，膜8和中心管10、殼體6之間插有尼龍分配隔網(wǎng)9和7。環(huán)氧樹脂11將膜8、中心管10、殼體6、分配隔網(wǎng)7、9與反應(yīng)器上下蓋5粘接固定。膜將反應(yīng)器分隔成內(nèi)外兩腔，物料從殼體6的兩個(gè)連接口進(jìn)入外腔，依靠隔網(wǎng)分配至膜8與隔網(wǎng)之間形成的各個(gè)扇形柱空間，物料透過膜后依靠隔網(wǎng)，進(jìn)入中心集流管10并通過上下蓋5的兩上管口流出。為保證各個(gè)扇形較均勻地排布，扇形間可填充厚0.5mm左右的尼龍網(wǎng)。膜的折迭總數(shù)可按公式πd/δ計(jì)算，d為隔網(wǎng)的外徑、δ一般取1mm左右。
折迭式平板膜的反應(yīng)器的折迭平板膜可設(shè)計(jì)成雙層或多層結(jié)構(gòu)。圖3為雙層折迭膜結(jié)構(gòu)的橫截面示意圖。圖中6、殼體;7、9、11分配隔網(wǎng);8、外膜、10、中心管;14、內(nèi)膜;12、支撐網(wǎng);13、集注板。中心集管10、支撐網(wǎng)筒12和反應(yīng)器殼體6之間形成內(nèi)外兩個(gè)環(huán)形空間，折迭膜8、14分內(nèi)、外兩層裝入兩上環(huán)形柱空間。內(nèi)層折選膜8在集流板13處反向折迭成半圓形并從支撐網(wǎng)筒12的引流口處伸出與外層折迭網(wǎng)連成一片。反應(yīng)器的上下兩端用環(huán)氧樹脂與上下蓋固定。膜將反應(yīng)器分隔成兩腔。物料從反應(yīng)器殼體6的兩上管道連接口進(jìn)入，一部分通過分配隔網(wǎng)7流入外層膜與隔網(wǎng)7間的各個(gè)扇形柱空間，另一部分通過隔網(wǎng)15從支撐網(wǎng)筒12的引流口流入內(nèi)層膜的膜外扇形空間，由外層膜滲出的物料流通過集流板13間的入口進(jìn)入中心管10，由內(nèi)層膜14滲出的物流通過隔網(wǎng)9進(jìn)入中心管10，并從反應(yīng)器上下蓋的管口流出。
多層結(jié)構(gòu)與雙層結(jié)構(gòu)類似，由于零部件的增多對(duì)反應(yīng)器的組裝帶來困難，多層或雙層結(jié)構(gòu)的折迭平板膜各膜等長折迭、較佳的折迭長度為中心管10外隔網(wǎng)外徑的1/2，這時(shí)所得到的膜面積最大。在殼體內(nèi)徑相同時(shí)，雙層結(jié)構(gòu)比單層的膜面積約增加30%。
利用本發(fā)明的膜反應(yīng)器由PG生產(chǎn)6APA的工藝方法，其特點(diǎn)是將含有毒霉素?；傅募?xì)胞直接通過交聯(lián)截留的方法固定化在膜反應(yīng)器內(nèi)，膜反應(yīng)器采取反沖操作，反應(yīng)器無放大效應(yīng)，物料在反應(yīng)時(shí)反復(fù)過濾，以獲得高純度6APA。圖4為膜反應(yīng)器裂解PG生產(chǎn)6APA的流程示意圖。圖中16、調(diào)節(jié)罐;17、泵;18、反應(yīng)器;19、堿罐;20、自動(dòng)電位滴定儀。其工藝采用反沖操作模式，具體地說，含有青霉素?；傅募?xì)胞在PH調(diào)節(jié)罐16內(nèi)配成細(xì)胞懸浮液，用泵17將懸浮液輸入反應(yīng)器19的外腔，當(dāng)液體透過膜滲出時(shí)，細(xì)胞因膜的阻擋截留在膜表面形成固定化細(xì)胞床層，為避免細(xì)胞自溶，可用戊二醛交聯(lián)。細(xì)胞固定化后，在罐16內(nèi)配制濃度為8%左右，PH在7.8～8.0的PG溶液，在38～40℃下泵入反應(yīng)器18，PG被細(xì)胞裂解為6APA和苯乙酸(PAA)，并透過膜返回罐16，用自動(dòng)電位滴定儀20控制堿罐19中NaOH的加入以維持反應(yīng)體系的最佳PH值，堿濃度為1～4N，經(jīng)PH調(diào)節(jié)的溶液循環(huán)返回反應(yīng)器17直至加堿終止，停止反應(yīng)。
從反應(yīng)系統(tǒng)中排出反應(yīng)液，加入甲醇、乙醇或醋酸丁脂等溶劑，在0℃左右滴加6NHCl，調(diào)節(jié)PH至4.0～4.2，6APA即從溶液中析出，經(jīng)抽濾，干燥后，得白色針狀6APA產(chǎn)品。
在上述流程中，細(xì)胞依靠交聯(lián)截留固定化在膜的表面，細(xì)胞在膜各部分的截留量與懸浮液通過膜各部分的通量有關(guān)，而細(xì)胞的截留又降低了膜各部分的滲透通量，這種約制和調(diào)節(jié)使細(xì)胞以一種動(dòng)態(tài)的形式相對(duì)均勻地分布在膜表面，反應(yīng)過程中不會(huì)出現(xiàn)短路或溝流現(xiàn)象。此外，膜反應(yīng)器效率與截留的固定化細(xì)胞裝填密度有關(guān)，當(dāng)固定化細(xì)胞的線度控制在5～100μm時(shí)，其裝填密度較高，這時(shí)的固定化細(xì)胞活力與游離細(xì)胞相近，穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于游離細(xì)胞，可以長期使用。
進(jìn)一步講，反應(yīng)器的效率取決于固定化細(xì)胞的有效裝填密度。而細(xì)胞的有效裝填密度與反應(yīng)器的面體比及單位膜表面的細(xì)胞負(fù)載密度有關(guān)。本發(fā)明的中空纖維膜反應(yīng)器和折迭式平板膜反應(yīng)器都具有高的面體比，固定化細(xì)胞的線度又有利于提高細(xì)胞在膜表面的負(fù)載密度。因此，本發(fā)明的膜生物反應(yīng)器的效率高于常規(guī)固定化細(xì)胞反應(yīng)器，并達(dá)到與固定化酶反應(yīng)器相當(dāng)?shù)乃?。由于反?yīng)器中，總的有效酶活提高，采用本發(fā)明的技術(shù)可以裂解高濃度青霉素底物，產(chǎn)品可不經(jīng)濃縮而直接結(jié)晶，并獲得高的產(chǎn)品收率。
本發(fā)明采用反沖操作模式，從外腔進(jìn)入的PG溶液在透過膜前先通過固定化細(xì)胞床層。按此方式操作的膜反應(yīng)實(shí)質(zhì)上是一個(gè)大面積的薄層填充床。放大時(shí)，膜的總面積擴(kuò)大，床層的面積增加，床層的厚度可維持不變，無放大效應(yīng)。此外，采用反沖操作，物料經(jīng)過膜的反復(fù)過濾使產(chǎn)品的質(zhì)量提高。下面通過實(shí)例對(duì)本發(fā)時(shí)給予進(jìn)一步地說明。
實(shí)例1取聚砜中空纖維超濾膜564根，用環(huán)氧樹脂固定在φ36×344的不銹鋼管件內(nèi)，構(gòu)成膜反應(yīng)器，膜的內(nèi)徑0.66，外徑0.96，有效長275(單位mm)。反應(yīng)器的體積285ml，有效膜面積4600cm2。
細(xì)胞采用中國科學(xué)院上海藥物所提供的青霉素酰化酶基因工程菌大腸桿菌A56(PPA22)。取菌體50g在PH4.0條件下用戊二醛交聯(lián)，交聯(lián)后的菌體活力為原菌體的87%。用2.5l，PH7.8的磷酸鹽緩沖液將交聯(lián)菌體配成菌體懸浮液，輸入反應(yīng)器內(nèi)，固定化在反應(yīng)器的外腔。
在充滿PH7.8磷酸鹽緩沖液中加入醫(yī)用青霉素鈉鹽29.4g，在8.2%濃度，38℃，PH7.8的穩(wěn)定條件下以200ml/min的流量泵入已固定化細(xì)胞的膜反應(yīng)器，反應(yīng)過程中滴加4N NaOH溶液借助自動(dòng)電位滴定儀維持PH恒定。待加堿速度緩慢，加堿量接近理論值時(shí)，終止反應(yīng)。收集裂解液，并加入1/2體積的甲醇，在0-2℃時(shí)滴加6NHCl，調(diào)節(jié)PH至4.0～4.2，即得6APA的結(jié)晶液。結(jié)晶液經(jīng)過濾洗滌，干燥后得到白色針形產(chǎn)品。連續(xù)裂解50批結(jié)果見表1。
表1批號(hào) 反應(yīng)時(shí)間(分) 產(chǎn)品(g) 收率% 純度% 殘余酶活%1 75 15.8 88.6 98.9 100.010 80 15.75 88.3 100.0 96.020 80 16.60 93.1 99.9 93.330 80 16.20 90.8 99.6 91.040 80 16.40 91.9 96.3 83.150 80 15.80 88.6 97.9 84.0實(shí)例2將聚砜平板超濾膜按雙層結(jié)構(gòu)固定在φ156×1070mm3的不銹鋼管件內(nèi)。內(nèi)層膜寬20共314面，外層膜寬28共690面，膜約有效長約0.95米。反應(yīng)器的體約為17.7l，膜面積的24.3米2。
細(xì)胞采用江西樂風(fēng)制藥廠生產(chǎn)的大腸桿菌A56(PPA22)。取菌體3kg在PH4.0條件下用戊二醛交聯(lián)，交聯(lián)后菌體活力為原菌體的82%。用PH7.0磷酸鹽緩沖液將交聯(lián)菌體配成懸浮液，輸入反應(yīng)器內(nèi)，固定化在膜外表面。
2.1kg工業(yè)青霉素鉀鹽倒入PH調(diào)節(jié)罐內(nèi)，在PH7.8-8.0，溫度38-40℃，濃度7.4%條件下反應(yīng)。反應(yīng)終止后，收集裂解液加入1/6體積乙醇，1/2體積的醋酸丁脂，在0℃左右下調(diào)PH至4.0。結(jié)晶液抽濾，洗絳、干燥。連續(xù)裂解51批的結(jié)果見表2。
表2批號(hào) 產(chǎn)品(kg) 收率% 純度% 透光度%1 1.111 90.7 97.6 9910-11 2.188 89.8 94.7 98.720-21 2.153 88.4 98.1 10030-31 2.083 85.5 95.3 10040-41 2.143 88.0 96.1 10050-51 2.208 90.6 98.5 100
權(quán)利要求
1.一種用于固定化細(xì)胞裂解表霉素生產(chǎn)六氨基青霉烷酸的膜反應(yīng)器，其特征在于所說的膜為聚砜中空纖維濾膜，制成中纖維膜反應(yīng)器或聚砜平板膜濾膜，將平板膜折迭定形后制成折迭式平板膜反應(yīng)器。
2.按照權(quán)利要求1所述的膜反應(yīng)器，其特征在于所用的中空纖維膜的較佳外徑為0.5～1mm，膜厚150±10μm。
3.按照權(quán)利要求1所述的膜反應(yīng)器，其特征在于折迭式平板膜反應(yīng)器中平板膜可采取雙層或多層結(jié)構(gòu)的折迭式平板膜反應(yīng)器。
4.按照權(quán)利要求3所述的折迭式平板膜反應(yīng)器，其特征在于雙層或多層結(jié)構(gòu)的折迭平板膜各層膜等長折迭，較佳的折迭長度為中心管，外隔網(wǎng)外徑的1/2。
5.按照權(quán)利要求1所述的膜反應(yīng)器，其特征在于所說的膜也可采用孔徑為30～80μm的濾紙、濾布。
6.一種利用權(quán)利要求1所述的膜反應(yīng)器，用于固定化細(xì)胞裂解青霉素生產(chǎn)六氨基青霉烷酰的工藝方法，其特征是將含有青霉素?；傅募?xì)胞直接通過交聯(lián)截留的方法固定化在膜上，膜反應(yīng)器采取反沖操作。
7.按權(quán)利要求6所述的工藝方法，其特征在于較佳的固定化細(xì)胞的線度控制在5～100μm。
全文摘要
一種用于固定化細(xì)胞裂解解青霉素生產(chǎn)六氨基青霉烷酸的膜反應(yīng)器，該膜為聚砜中空纖維或平板微濾、超濾膜，利用該膜反應(yīng)器將含有青霉素?；傅恼?xì)胞經(jīng)交聯(lián)截留固定化在具有高面體比的中空纖維和平板膜上、采用反沖模式操作。該反應(yīng)器的效率與固定化酶反應(yīng)器相當(dāng)，可長期穩(wěn)定裂解高濃度青霉素溶液，獲得高的產(chǎn)品收率，物料經(jīng)膜反復(fù)過濾，使產(chǎn)品得以純化。此類反應(yīng)器實(shí)質(zhì)為大面積薄層填充床，在放大時(shí)，無放大效應(yīng)、適宜于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12M1/00GK1056122SQ9010507
公開日1991年11月13日 申請(qǐng)日期1990年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1990年3月29日
發(fā)明者袁權(quán), 虞星炬, 馬士洪, 都絳英, 曲天明, 時(shí)國棟 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所