專利名稱：：利用膠德克斯氏菌生產(chǎn)富氨基酸、維生素e、b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物工業(yè)發(fā)酵技術(shù)，特別是利用膠德克斯氏抗氨固氮菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)富氨基酸、維生素E、B2單細(xì)胞蛋白，有機(jī)鍺營(yíng)養(yǎng)液的方法。利用微生物進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵，生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，目前已引起有關(guān)科學(xué)家的重視，并已取得了一些進(jìn)展，如DonaldO.Hitzman，BartlesvilleoklaL.U.SPatentDocuments4302542，1981利用嗜熱細(xì)菌進(jìn)行混合發(fā)酵，以乙醇等醇類化合物作為碳源和能源來(lái)產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白;楊振華“851”口服液利用人工誘變處理維氏固氮菌(AzotobacterVinelandii)而得到一組命名為851黃的抗氨固氮菌，作為工業(yè)發(fā)酵的生產(chǎn)用菌株，利用所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基生產(chǎn)富硒單細(xì)胞蛋白、維生素和菌肥(以上內(nèi)容參見(jiàn)1987年9月30日CN86100490B，發(fā)明專利申請(qǐng)審定說(shuō)明書(shū)，《利用抗氨固氮菌生產(chǎn)富硒單細(xì)胞蛋白，維生素E和菌肥的方法》一文)，利用該方法已生產(chǎn)出“851超級(jí)口服液”產(chǎn)品，作為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N很有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的保健飲料。本發(fā)明的目的是篩選出一種新的具有抗氨固氮性能的微生物菌種以及設(shè)計(jì)出適合于該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，要求這種菌不但具有851黃維氏抗氨固氮菌的性能，而且利用其作為生產(chǎn)用菌，采用所設(shè)計(jì)出的培養(yǎng)基生產(chǎn)出的產(chǎn)品有效成分更為豐富，營(yíng)養(yǎng)比例更為合理。本發(fā)明的技術(shù)方案1.菌株在對(duì)某組維氏抗氨固氮菌進(jìn)行提純復(fù)壯過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)了一組邊緣無(wú)色(或白色)菌落，其細(xì)胞型態(tài)從顯微鏡上觀察是小桿狀，0.2～0.5×1微米，單生。廣東省微生物所對(duì)該菌進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞以極生鞭毛運(yùn)動(dòng)，在含有結(jié)合態(tài)氮的液體培養(yǎng)基中有大量運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞，但在缺乏氮的培養(yǎng)基中罕有運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。培養(yǎng)特征菌落小桿狀，平滑，有光澤，透明;在阿氏貝(Ashby)培養(yǎng)基面上可以生長(zhǎng)，呈無(wú)色;無(wú)機(jī)鹽氮液培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng);甘露醇-酵母培養(yǎng)基斜面上，生長(zhǎng)很好，菌落無(wú)色;大豆培養(yǎng)基、有機(jī)氮豐富液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，呈灰黃色;洋菜培養(yǎng)基上的菌落透明無(wú)色，液體培養(yǎng)基上形成菌膜。生理特征在無(wú)氮液體培養(yǎng)基中，能固定大氣中分子態(tài)氮，接觸酶陽(yáng)性，無(wú)芽孢，孢囊或莢膜，吲哚試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，不利用淀粉，葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)生酸，不產(chǎn)氣、V.P.陰性，甲基紅陰性，石蕊牛奶胨化還原，在16℃～37℃能生長(zhǎng)，最適PH為6～8，依據(jù)V.B.D.斯克爾曼《細(xì)菌屬的鑒定指導(dǎo)》發(fā)現(xiàn)該菌符合Berger氏鑒定手冊(cè)所描述的固氮菌科(Azotobacteraceac)德克斯氏屬(Derxia)的膠德克斯氏菌(DerxiagummosaJenson，Petersem，De&Bhattacharya1960)(我們命名其為“健字N型菌”1991年2月7日送交武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC№M91027)。2.培養(yǎng)基健字N型菌對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)范圍很廣，可采用多種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。(1)大豆培養(yǎng)基大豆粉5～15%氯化鈉0.01～0.02%硫酸鎂0.03～0.05%鉬酸鈉5～10ppm硫酸鋅10～30ppm酵母膏0.05～0.1%磷酸氫二鉀0.04～0.08%磷酸二氫鉀0.03～0.05%亞硒酸鈉1～5ppm二氧化鍺4～20ppm硼酸5～10ppm(2)甘露醇-酵母膏培養(yǎng)基甘露醇1%酵母膏0.05%K2HPO40.06%MgSO40.03%NaCl0.03%CaCO30.05%NaMoO410ppmH3BO310ppm(3)有機(jī)氮豐富液體培養(yǎng)基干淀粉1～5%酵母浸出汁0.05～0.10%K2HPO40.05～0.08%KH2PO40.02～0.05%MgSO40.02～0.04%NaCl0.02～0.04%NaMoO410～20ppmH3BO310ppmZnSO45～10ppm3.工藝流程把上述健字N型菌接種到本發(fā)明所設(shè)計(jì)的大豆培養(yǎng)基或本發(fā)明所使用的甘露醇-酵母培養(yǎng)基或有機(jī)氮豐富液體培養(yǎng)基中，即先把鍵字N型菌接種到由附表一“斜面”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)93～98小時(shí)后，轉(zhuǎn)入裝有由附表一“三角瓶”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)22～26小時(shí)，在上述過(guò)程中培養(yǎng)環(huán)境溫度控制在30～33℃之間，然后再轉(zhuǎn)入裝有由附表一“一級(jí)種子罐”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，再轉(zhuǎn)入裝有由附表一“二級(jí)發(fā)酵罐”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配在的培養(yǎng)基的二級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)36～44小時(shí)，在這過(guò)程中，溫度應(yīng)保持在30～32℃之間，將經(jīng)上述處理后的培養(yǎng)液裝入高位槽中，用90℃溫度處理使菌體滅活后過(guò)濾，裝入經(jīng)預(yù)先處理好的玻璃瓶，再用120℃的高溫滅菌30分鐘便成。利用上述方法制成的培養(yǎng)液，還可以進(jìn)一步加工，用濃縮干燥法生產(chǎn)N型851膠囊或沖劑，其具體的工藝流程如附圖二所示。本發(fā)明由于采用了健字N型菌作為生產(chǎn)用菌，由于該菌的代謝物含磷(P)較低，其脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)(LPR)產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物可引起多種細(xì)胞損傷，因此利用該菌及所能制成的培養(yǎng)基工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品(下稱N型851口服液)，除了具有楊振華851口服液所具有的營(yíng)養(yǎng)成分外，而且其大部分有效成分的合量比楊振華851口服液高(見(jiàn)附表2)，而且易被人體所吸收，有利于人體對(duì)鈣的吸收，其主要營(yíng)養(yǎng)成分的含量氨基酸≥60mg/100ml，干物質(zhì)≥4～12%，維生素B2≥0.2mg/100mg其產(chǎn)品還含較豐富的有機(jī)鍺;有較強(qiáng)的過(guò)氧化脂質(zhì)作用，能提高抗過(guò)氧化物酶的含量(見(jiàn)附表3)，保護(hù)脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞模、小動(dòng)脈和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害;該產(chǎn)品還具有識(shí)別癌細(xì)胞的功能，尤其對(duì)胃癌FGC的試驗(yàn)，其結(jié)果比楊振華851口服液高20%以上。因其營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富，對(duì)正常細(xì)胞又是一種極好的營(yíng)養(yǎng)品。圖一是本發(fā)明生產(chǎn)N型851口服液的工藝流程圖。圖二是本發(fā)明采用濃縮干燥法生產(chǎn)N型851膠囊或沖劑的工藝流程圖。表1是本發(fā)明生產(chǎn)N型851口服液工藝流程中不同工序的培養(yǎng)基配方情況表。表2是本發(fā)明生產(chǎn)的N型851口服液與原楊振華851口服液各種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比表。表3是本發(fā)明生產(chǎn)的N型851口服液對(duì)不同組小白鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響情況表下面結(jié)合附圖表說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施把健字N型菌接種到由附表一“斜面”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基斜面上，在30～33℃溫度環(huán)境下培養(yǎng)93～98小時(shí)，然后把培養(yǎng)后的菌移至裝有由附表一“三角瓶”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基的三角瓶中，在30～33℃溫度環(huán)境中培養(yǎng)22～26小時(shí)后，再把培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)入一級(jí)種子罐中，該罐中裝有由附表一“一級(jí)種子罐”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基，這一流程培養(yǎng)基溫度應(yīng)控制在30～32℃，培養(yǎng)時(shí)間18～24小時(shí)，經(jīng)過(guò)這一流程后便可把該培養(yǎng)菌及培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)入二級(jí)發(fā)酵罐中，二級(jí)發(fā)酵罐中裝有由由附表一“二級(jí)發(fā)酵罐”一欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基，在這流程中培養(yǎng)基溫度應(yīng)控制在30～32℃，培養(yǎng)時(shí)間36～44小時(shí)，經(jīng)過(guò)上述處理后再把培養(yǎng)液及培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)入高位槽中，在90℃的溫度下進(jìn)行菌體滅活處理之后，再過(guò)濾，裝入經(jīng)清洗、消毒后的瓶子中，再在120℃溫度下滅菌30分鐘便可貼標(biāo)、裝箱出售。利用上述方法制成的培養(yǎng)液，可以直接作為一種營(yíng)養(yǎng)飲料，也可以進(jìn)一步加工，用濃縮干燥法生產(chǎn)N型851膠囊或沖劑，其具體的工藝流程如附圖二所示。表1廣東N型851口服液工藝流程中不同工序的培養(yǎng)基配方表2廣東N型851口服液與福建851口服液營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比表</tables>權(quán)利要求1.本發(fā)明涉及一種利用微生物生產(chǎn)富氨基酸、維生素E、B2及有機(jī)鍺培養(yǎng)液的方法，其特征在于利用膠德克斯氏抗氨固氮菌(CCTCC№M91027)(我們命名其為健字N型菌)接種到本發(fā)明所設(shè)計(jì)的大豆培養(yǎng)基或本發(fā)明所使用的甘露醇--酵母培養(yǎng)基、有機(jī)氮豐富液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)液。即先把鍵字N型菌接種到由附表-“斜面”-欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)93～98小時(shí)后，轉(zhuǎn)入裝有由附表-“三角瓶”-欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)22～26小時(shí)，在上述過(guò)程中培養(yǎng)環(huán)境溫度控制在30～33℃之間，然后再轉(zhuǎn)入裝有由附表-“一級(jí)種子罐”-欄的具體培養(yǎng)基配方所配成的培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，再轉(zhuǎn)入裝有由附表一“二級(jí)發(fā)酵罐”-欄的具體培養(yǎng)基配方所配在的培養(yǎng)基的二級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)36～44小時(shí)，在這過(guò)程中，溫度應(yīng)保持在30～32℃之間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆培養(yǎng)基，其特征在于含有大豆粉5～15%，氯化鈉0.01～0.02%，硫酸鎂0.03～0.05%，鉬酸鈉5～10ppm，硫酸鋅10～30ppm，酵母膏0.05～0.1%，磷酸氫鉀0.04～0.08%，磷酸二氫鉀0.03～0.05%，亞硒酸鈉1～5ppm，有機(jī)鍺4～20ppm，硼酸5～10ppm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液其特征在于還可以進(jìn)一步加工，用濃縮干燥法生產(chǎn)N型851膠囊或沖劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用膠德克斯氏抗氨固氮菌，利用大氣中的氮作為氮源在本發(fā)明所設(shè)計(jì)的大豆培養(yǎng)基及所使用的甘露醇、酵母膏培養(yǎng)基、有機(jī)氮豐富液體培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)液的技術(shù)，采用該技術(shù)生產(chǎn)出的產(chǎn)品含有豐富的氨基酸、維生素E、B文檔編號(hào)C12P1/04GK1059757SQ9110319公開(kāi)日1992年3月25日申請(qǐng)日期1991年5月17日優(yōu)先權(quán)日1991年5月17日發(fā)明者武傳斌,曾慶坤,羅鑄崇,張志明,林紹其,朱思聰申請(qǐng)人:惠州市嶺南生物工程公司