專利名稱：通過膜從發(fā)酵肉湯中去除細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種方法，即通過膜處理培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬微生物所獲得的發(fā)酵肉湯以去除細胞、細胞碎片或溶解的高分子雜質(zhì)時，通過在溫和條件下的預(yù)處理提高膜的滲透率。也就是說，本發(fā)明涉及一種方法，即預(yù)先處理使膜阻塞的物質(zhì)，并且當通過膜除去細胞時提高膜的滲透率，由此縮短處理時間并使設(shè)備規(guī)模減至最小程度。
近些年，使用重組菌株技術(shù)生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品獲得了進步，并為了這個目的常常使用便于遺傳操作的大腸桿菌(此后簡寫作E.Coli)。當發(fā)酵完畢所需產(chǎn)品被分沁到細胞外部時，通常是在滅菌后通過膜分離或離心除去細胞，并且將得到的不含細胞的溶液拿去作下一步處理，當所需產(chǎn)品存在于細胞內(nèi)部時，通過冷凍或使用均質(zhì)機、研磨機等將細胞研碎，然后通過膜分離或離心除去細胞及細胞碎片。
一般來講，與離心相比膜分離可以完全去除細胞、得到不含細胞的澄清溶液。但是，在膜分離時滲透率低時，則需要大型的設(shè)備。用于去除細胞的膜通常為微濾膜(此后簡稱作MF)、超濾膜(此后簡稱作UF)等等。但是，對于培養(yǎng)E Coli菌株獲得的發(fā)酵肉湯(本文述為“E.Coli發(fā)酵肉湯)，這些膜的問題是無論怎樣研磨其滲透率都低。
迄今人們早已知道在通過膜以發(fā)酵肉湯除去細胞的過程中，加熱可以作為有效提高滲透率的預(yù)處理手段。例如，JP特許公開91,196/1982描述了當通過超濾膜分離細胞和高分子物質(zhì)時，在90至110℃下加熱處理PH值為5.5至9.0的次黃嘌呤核苷或烏嘌呤核苷發(fā)酵肉湯，提高膜的滲透率。此外，JP特許公開78,588/1985中描述了通過在50至100℃下加熱氨基酸發(fā)醇肉湯提高超濾膜滲透率的方法。
但是，正如上面提到的那樣，當通過膜從E.Coli發(fā)酵肉湯中去除細胞時，滲透率非常低需要大型膜處理設(shè)備。通過上述的方法包括調(diào)整PH及熱處理E.Coli發(fā)酵肉湯也可能會提高滲透率。但是就E.Coli發(fā)酵肉湯而言，該方法并不那么有效。此外，不時地進行加熱處理易引起發(fā)酵肉湯變色或者形成少量副產(chǎn)物雜質(zhì)。還有當所需產(chǎn)品熱不穩(wěn)定時，該方法便不適用了。
因此，為了從培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬微生物所得發(fā)酵肉湯中分離細胞，開發(fā)一種通過在較溫和條件下的預(yù)處理過程以提高膜滲透率的方法已勢在必需。
本發(fā)明涉及一種通過膜從培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬微生物而獲得的發(fā)酵肉湯中除去細胞、細胞碎片或溶解的高分子雜質(zhì)以分離細胞等的方法，其特征在于向發(fā)酵肉湯中添加聚乙烯亞胺(此后簡稱作PEI)，然后通過膜過濾混合物分離出細胞等。
用于本發(fā)明的屬于埃希氏桿菌屬的微生物可以是野生菌株或者突變株。還可以使用細胞融合或遺傳操作而誘導(dǎo)出的重組菌株。屬于埃希氏桿菌屬的微生物其中一個例子是大腸桿菌。該微生物可以產(chǎn)生能滲透過用于本發(fā)明的UF膜或MF膜的所需產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的例子包括氨基酸如賴氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸；核酸如次黃嘌呤核苷和烏嘌呤核苷；有機酸如乳酸和蘋果酸；以及維生素。
用于本發(fā)明的發(fā)酵肉湯可以通過在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)上述微生物而制備。對培養(yǎng)基不作特別的限定，并且它可以是含有碳源、氮源、無機離子的普通培養(yǎng)基，還可以選擇性地含有有機營養(yǎng)成分。發(fā)酵過程可以通過如W 095/16042、EP 0685,555或JP待許公開047,397/1996中描述的方法在適合于上述微生物生長的條件下進行。
只要適用于上述微生物的任何碳原都可以使用。碳原特定的例子包括糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖；有機酸，如富馬酸、檸檬酸、乙酸和丙酸；以及它們的鹽。
只要適用于上述微生物的任何氮源都可以使用。氮原特定的例子包括無機酸銨鹽，如硫酸銨和氯化銨；有機酸銨鹽，如富馬酸銨和檸檬酸銨；硝酸鹽，如硝酸鈉和硝酸鉀；有機氮化合物，如蛋白胨、酵母浸膏、肉浸膏和玉米浸泡液的濃縮液；以及它們的混合物。
若需要，可以使用常規(guī)發(fā)酵中所使用的營養(yǎng)源。營養(yǎng)源的例子包括無機鹽、痕量金屬鹽和維生素。
一般情況下可以得到水溶液形式的PEI。但是，當把PEI加到E.Coli發(fā)酵肉湯中時，可行的方法是添加含有1至50％PEI的水溶液，從而控制PEI水溶液粘度的增加并防止稀釋發(fā)酵肉湯。就添加PEI而言，發(fā)酵完畢時邊攪拌發(fā)酵肉湯邊加入預(yù)先定量的10％PEI水溶液。但對添加的方法不作特別的限定，只要能夠獲得均勻的混合物。
PEI的添加量介于0.0005和0.5％重量之間，基于E.Coli發(fā)酵肉湯，優(yōu)選0.001和0.05％重量之間。
用來添加的PEI可以是水溶液，其平均分子量不作特別限定。容易獲得且容易處理的PEI所具有的平均分子量大約從10,000至100,000。
當添加PEI之后進行膜分離時，膜的滲透率可以得到提高。此外，當添加完P(guān)EI之后將E.Coli發(fā)醇肉湯的PH值調(diào)至3-9，優(yōu)選4-7時，膜的滲透率可以得到進一步提高。當添加完P(guān)EI后收酵肉湯的PH接近中性范圍時，就沒有必要再調(diào)整PH。但是，如果再調(diào)整PH至上述范圍，那么經(jīng)常會得到較高的膜滲透率。這樣的話，可以按需要實施再調(diào)整PH的過程。
可以使用常規(guī)PH調(diào)節(jié)劑來調(diào)整PH值。其例包括酸，如鹽酸、硫酸和磷酸；堿化合物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀和氨。
在添加PEI之前或加PEI之后，發(fā)酵肉湯可以經(jīng)加熱處理。適宜的加熱處理溫度介于50至130℃間，且適宜的加熱處理時間為10至20分鐘。該加熱處理過程能夠提高PEI的混合效率以及滲透率。
所用的膜可以是MF，也可以是UF。可用的膜有平板膜、空心纖維膜、管膜或螺旋膜。膜材料可以是有機材料，如聚砜、聚烯烴、聚偏二氟乙烯或特氟??；或者是無機材料如陶瓷。若使用UF，具有1,000至500,000分子量極限的膜實際很適用。若使用MF，具有0.05至1μm孔徑的膜很合適。
實施例以下有關(guān)實施例將對本發(fā)明作具體地闡述。
在實施例1和2中，膜滲透性的測試是通過在Millipore制造的Minitan組件上安置兩個PTTK膜(Millipore，U.S.A.制造的UF膜，分子量極限30,000)進行的。此外，關(guān)于PEI，使用通過純凈水稀釋具有50,000分子量的50％PEI溶液(Sigma制造)而獲得的10％水溶液。實施例1通過PCT申請WO 95/16042實施例中描述的方法，使用將質(zhì)粒/RSFD80導(dǎo)入E.Coli B-399菌株獲得的399/RSFD80菌株，生產(chǎn)L-賴氨酸。在37℃下使用，以下配方的培養(yǎng)基進行48小時的發(fā)酵，發(fā)酵的同時以114至116rpm的速率攪拌。
用于制備L-賴氨酸的培養(yǎng)基配方A(NH4)2SO416g/lKH2PO41g/lMgSO4·7H2O 1g/lFeSO4·7H2O 0.01g/lMnSO4·5H2O 0.01g/l酵母浸膏(Difco) 2g/lL-蛋氨酸 0.5g/l用KOH調(diào)PH至7.0，且混合物在115℃下高壓滅菌10分鐘(16/20體積)。
B20％葡萄糖(115℃高壓滅菌10分鐘)(4/20體積)。
C通過日本藥典的CaCO3(180℃干熱滅菌2天)(30g/l)(A和B以4∶1比例混合，C添加量為30g/l。混合物中加入抗生素(100μg/ml鏈霉素和5μg/ml卡那霉素)。使用所獲得的混合物作為制備L-賴氨酸用的培養(yǎng)基)。
當發(fā)酵完畢，產(chǎn)生的L-賴氨酸濃度按鹽酸賴氨酸計算為9.2g/l。
分別向每300ml如此獲得的賴氨酸發(fā)醇肉湯添加0.32g、0.91g或1.6g上述10％的PEI溶液。用98％硫酸調(diào)節(jié)混合物的PH至4.0，并且加熱至60℃同時攪拌20分鐘。按上述量添加PEI后，發(fā)酵肉湯中PEI的濃度大約分別是100ppm、300ppm和500ppm。
將如此處理過的發(fā)酵肉湯拿來作膜滲透測試。這個膜滲透測試是這樣進行的將每份經(jīng)上述處理的發(fā)酵肉湯以1,000ml/min的速率給入上述提及的UF組件，給入的同時保持發(fā)酵肉湯為50℃，并且在0.9kgf/cm2平均壓力下將其滲透過膜。在整個30分鐘時間的滲透過程中測定滲透率的變化。結(jié)果示于

圖1。
正如圖1呈現(xiàn)的那樣，當使用E.Coli發(fā)酵肉湯時，在除去細胞的開始階段(開始后5分鐘之內(nèi))膜滲透率陡然下降，后來逐漸穩(wěn)定。就30分鐘之后的滲透率相比，添加了PEI的滲透率最高是未添加PEI滲透率的4倍?？梢悦黠@觀察到添加100ppm的PEI后滲透率的提高，這時，其滲透率是未添加PEI滲透率的2倍。實施例2使用EP 0685,555或JP特許公開047,397/1996中描述的E.Coli AJ12919菌株制備L-異亮氨酸。AJ12919株生長在含有1％細菌胰蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％NaCl、1.5％瓊脂、100μg/ml鏈霉素和100μg/mlα-氨基芐青霉素的培養(yǎng)基上，并在37℃下培養(yǎng)18至24小時。用白金圈在300ml發(fā)酵介質(zhì)(含有4％葡萄糖、1.6％硫酸銨、0.1％磷酸二氫鉀、0.1％七水硫酸鎂、0.001％七水硫酸亞鐵、0.001％五水硫酸錳、0.2％酵母浸膏和3％碳酸鈣。PH7.0)中接種一部分肉湯，并且在37℃下以300ml/min透氣率且400rpm攪拌培養(yǎng)16小時，獲得種子培養(yǎng)肉湯。將得到的種子培養(yǎng)肉湯接種于含有6％葡萄糖、1.6％硫酸銨。0.1％磷酸二氨鉀、0.1％七水硫酸鎂、0.001％七水硫酸亞鐵、0.001％五水硫酸錳、和2％酵母浸膏的發(fā)酵培養(yǎng)基(PH7.0)。葡萄糖要在37℃下以300ml/min透氣率同時控制旋轉(zhuǎn)量的條件下添入，以便使培養(yǎng)基中溶解氧的濃度達到5％或更多。混合物培養(yǎng)23小時同時用氨氣保持PH在7.0左右。發(fā)酵完畢時L-異亮氨酸積累到37g/l的濃度。
當發(fā)酵完畢時，加熱如此獲得的L-異亮氨酸發(fā)酵肉湯至120℃，時間10分鐘，并且用鹽酸調(diào)節(jié)PH至4.0。向300ml如此處理過的發(fā)酵肉湯中添加0.3g10％PEI溶液，并重新加熱混合物至60℃，時間20分鐘。將60℃下加熱20分鐘未加入PEI的發(fā)酵肉湯作為對照樣。按照實施例1同樣的方式進行膜滲透測試。結(jié)果示于表1。
表1
表1清楚地證明使用異亮氨酸發(fā)酵肉湯時，添加100ppm的PEI后膜滲透率也有提高。實施例3用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍將屬于埃希氏桿菌屬、對β-2-噻吩丙氨酸有抗性且具產(chǎn)生L-亮氨酸能力的E.Coli FERM-P5274菌株(JP特許公開34,397/1987公開)作突變處理。除了突變株外，分離對4-氮雜亮氨酸有抗性的菌株，得到的菌株具有增進產(chǎn)生L-亮氨酸的能力。
如此獲得的菌株在31℃下攪拌培養(yǎng)72小時，所用培養(yǎng)基(含有5g/dl葡萄糖·(NH4)2SO42.5g/dl，KH2PO40.2g/dlMgSO47H2O0.1g/dl、酵母浸膏0.05g/dl、維生素B1 1mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1mg/dl，MnSO4·4H2O1mg/dl，CaCO32.5g/dl，PH7.0)。發(fā)酵完畢時L-亮氨酸積累至3.1g/dl濃度。
向每300ml上述獲得的發(fā)酵肉湯添加上述提及的10％PEI溶液，分別制備具有PEI濃度為0.200和1000ppm的發(fā)酵肉湯。用98％硫酸調(diào)節(jié)所得肉湯的PH至4.0，并且邊攪拌邊于60℃下加熱30分鐘。
用上述處理過的肉湯作膜滲透測試。膜滲透測試這樣進行在進口壓力為1.0kgf/cm2下將每份經(jīng)上述處理的肉湯以600ml/min的速率給入A sahi Chemical Industry Co.Ltd.制造的筆型PSP-003組件(孔徑0.3μm，膜面積150cm2)。在整個60分鐘時間的過程中測定滲透率的變化。
結(jié)果示于圖2。從圖2看出，當使用L-亮氨酸發(fā)酵肉湯時，添加了PEI后膜滲透率也同樣有所提高。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法，發(fā)酵肉湯的膜滲透率可以不用大型設(shè)備而得以提高。此外，還可以提高運用膜從發(fā)酵肉湯中去除細胞這一方法的效率。并且使用于除去細胞的膜分離設(shè)備的規(guī)模限制至最小。
圖1是UF過濾賴氨酸發(fā)酵肉湯時，整個時間過程中膜滲透率變化和PEI添加量之間的關(guān)系曲線。
圖2表示MF過濾高氨酸發(fā)酵肉湯時，整個時間過程中膜滲透率變化和PEI添加量之間的關(guān)系曲線。
權(quán)利要求
1.一種通過膜從培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬微生物而獲得的發(fā)酵肉湯中去除細胞以分離細胞的方法，其特征在于發(fā)酵肉湯中添加聚乙烯亞胺，然后通過膜過濾混合物，分離出細胞。
2.一種通過膜從培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬微生物而獲得的發(fā)酵肉湯中去除細胞以分離細胞的方法，其特征在于發(fā)酵肉湯中添加聚乙烯亞胺，調(diào)整肉湯的PH為3至7，然后通過膜過濾混合物，分離出細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所用的膜是超過濾膜或微濾膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求的方法，其中聚乙烯亞胺的添加量基于發(fā)酵肉湯為0.0005至0.5重量之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求的方法，其中在加入聚乙烯亞胺之前及/或之后，加熱發(fā)酵肉湯至50-130℃。
全文摘要
當從培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬微生物而獲得的發(fā)酵肉湯中通過使用膜分離細胞時，開發(fā)一種在較溫和預(yù)處理條件下提高膜滲透率的方法。本發(fā)明涉及一種使用膜從上述提及發(fā)酵肉湯中除去細胞的方法，其特征在于向發(fā)酵肉湯中添加聚乙烯亞胺，然后通過膜分離細胞。與未進行本發(fā)明處理過程相比，本發(fā)明的方法可以使利用膜從發(fā)酵肉湯中除細胞的滲透率提高1.5-4.0倍。這使得不用大型設(shè)備而輕易提高膜滲透率并且提高膜滲透設(shè)備的效率成為可能。
文檔編號C12M1/12GK1155580SQ96121049
公開日1997年7月30日 申請日期1996年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月12日
發(fā)明者田邊俊哉, 中村徹 申請人:味之素株式會社