專利名稱：：制備d-天門冬氨酸的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明闡述一種從消旋的天門冬氨酸中制備D-天門冬氨酸的方法。更具體來說，本發(fā)明闡述通過消旋的天門冬氨酸的酶促脫羧作用，制備D-天門冬氨酸和β-丙氨酸的方法。相關(guān)技術(shù)描述L-天門冬氨酸-α-脫羧酶催化從L-天門冬氨酸中產(chǎn)生β-丙氨酸。Nakano等表明了來自大腸桿菌B株的粗提取物中有此酶活性。Nakano，Y.等，生物化學(xué)雜志；70卷，327-334頁(1971)。Williamson等進(jìn)一步研究了把大腸桿菌中的該酶純化到表觀均一后的酶活性。Williamson，J等，生物化學(xué)雜志，254(16)卷，8074-8082頁(1979年8月)。這些發(fā)明的文獻(xiàn)并不說明除了實(shí)驗(yàn)的好奇外，能產(chǎn)生任何可實(shí)際應(yīng)用的酶量。正如下面更全面討論的那樣，本發(fā)明利用一種組合物，使L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性為Nakano等和Williamson等文獻(xiàn)中發(fā)表的該酶活性的100～2000倍。在給Rozzell的美國(guó)專利號(hào)5,019,509中公開了產(chǎn)生L-丙氨酸和其衍生物的方法和組合物。然而，Rozzell公開了編碼天門冬氨酸-β-脫羧酶的基因以及用于產(chǎn)生L-丙氨酸。在給Houng的美國(guó)專利號(hào)5,552,317和5,552,318中，公開了用來自小麥胚或解脂假絲酵母(Candidalipolytica)的脂肪酶制備旋光活性氨基酸和其酯類的方法。相比之下，本發(fā)明的方法不是如Houng等方法那樣的常見轉(zhuǎn)變方法，常見的方法是，氨基酸的轉(zhuǎn)變實(shí)際上依靠氨基酸的衍生物進(jìn)行，因而需要額外的化學(xué)步驟。最為常見的方法是，外消旋酯類用酯酶/脂肪酶處理，或N-乙酰氨基酸用?；柑幚怼Ｒ阎钠渌D(zhuǎn)變程序是應(yīng)用酰胺酶，作用于消旋的氨基酸酰胺，其中該酶恰特異地針對(duì)一種異構(gòu)體。見美國(guó)專利號(hào)4,880,737。然而，本發(fā)明提供一種更為簡(jiǎn)單的方法，因?yàn)椴挥妙~外的化學(xué)修飾以制備底物。本發(fā)明提供容易的途徑，從豐富的資源D，L-天門冬氨酸中，產(chǎn)生2種廣泛使用的化合物。在藥用中，已有大量的文獻(xiàn)描述D-天門冬氨酸和其衍生物。這些應(yīng)用包括，但不局限于抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性和用作免疫抑制劑。抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性，可用于預(yù)防或治療膿毒癥或細(xì)胞因子誘導(dǎo)的系統(tǒng)性低血壓。D-天門冬氨酸的其它應(yīng)用包括作食物的味覺修飾組合物，和由Pfizer開發(fā)的一種新甜味劑，AlitameTM。另外，β-丙氨酸用于泛酸的合成，而泛酸對(duì)輔酶A的合成是必需的。也已知β-丙氨酸用作手性合成子合成α-替代的β氨基酸。β-丙氨酸的衍生物已被用作電鍍業(yè)中的緩沖液。發(fā)明概述天門冬氨酸異構(gòu)體(D和L)的消旋混合物和一種微生物或合適來源的酶溫育，該微生物含有編碼L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因。該酶催化下列的反應(yīng)該酶立體特異性地把L-天門冬氨酸脫羧成β-丙氨酸和CO2，而D-天門冬氨酸仍沒有反應(yīng)。因?yàn)殡S著CO2的釋放，該反應(yīng)基本上是不可逆的，從而實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的高轉(zhuǎn)化率。該反應(yīng)能在溫和條件下如室溫和中性pH下進(jìn)行，因而使該方法十分有利于保護(hù)環(huán)境，會(huì)有廣泛的需求。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示質(zhì)粒pIF309的產(chǎn)生過程。圖2顯示D，L-天門冬氨酸底物溶液生物轉(zhuǎn)變成D-天門冬氨酸和β-丙氨酸，通過本發(fā)明制備的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶催化使L-天門冬氨酸減少，用溶液中剩余的L-天門冬氨酸的數(shù)量加以說明。圖3顯示L-天門冬氨酸-α-脫羧酶制備物的新鮮細(xì)胞，對(duì)圖2說明的反應(yīng)完成后留下的上清液作用的活性。圖4顯示前已用過的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶，作用于新鮮的D，L-天門冬氨酸底物溶液的活性。圖5顯示不同上樣量50g/l和100g/l的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶，作用于1.0MD，L-天門冬氨酸溶液的活性。圖6顯示L-天門冬氨酸-α-脫羧酶，作用于NH4OH中和的D，L-天門冬氨酸底物的活性。圖7顯示L-天門冬氨酸-α-脫羧酶，作用于各種氨基酸底物，D，L-天門冬氨酸、D，L-谷氨酰胺和D，L-丙氨酸的活性。圖8比較在37℃、45℃和50℃溫度下，D，L-天門冬氨酸生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種從D，L-天門冬氨酸中制備D-天門冬氨酸的方法，該方法包括將D，L-天門冬氨酸或其鹽類和包括微生物細(xì)胞或其提取物的組合物進(jìn)行溫育、其中在產(chǎn)生D-天門冬氨酸和β-丙氨酸的合適條件下，組合物具有的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞100μmolL-天門冬氨酸。L-天門冬氨酸-α-脫羧酶，在此也稱作L-天門冬氨酸-1-脫羧酶、天門冬氨酸-1-脫羧酶或E.C.4.1.1.11，在本發(fā)明中根據(jù)下列反應(yīng)式，用于從消旋的天門冬氨酸中制備D-天門冬氨酸。底物和反應(yīng)產(chǎn)物，在此可替代地稱為它們的酸形式和鹽形式。例如底物D，L-天門冬氨酸在此也稱作D，L-天門冬氨酸鹽。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到根據(jù)所存在的溶液pH不同，酸的形式及其名稱不同。正如下面更全面討論的一樣，本發(fā)明的方法用于廣泛的pH范圍，可提供應(yīng)用酸和鹽兩種形式的底物。作為本發(fā)明的公開內(nèi)容的目的，在此所用的基于酸和鹽的名稱，設(shè)定為同義語。編碼該酶的大腸桿菌K12panD基因被克隆到大腸桿菌多拷貝質(zhì)粒載體上，用在全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，以產(chǎn)生β-丙氨酸和D-天門冬氨酸?！叭?xì)胞生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)”指的是使用含有未被抽提純化的該酶的細(xì)胞，和從發(fā)酵培養(yǎng)基中超過濾或其它方式分離的酶，直接加到溶液中催化反應(yīng)，以產(chǎn)生β-丙氨酸和D-天門冬氨酸。其他“系統(tǒng)”能用于實(shí)踐本公開的發(fā)明，并設(shè)有偏離本發(fā)明的范圍。上述方法包括，但不局限于使用固定化細(xì)胞級(jí)分、固定化全酶或酶級(jí)分。形成細(xì)胞級(jí)分和純化的酶以及酶級(jí)分的方法，在本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員中眾所周知。優(yōu)選的固定化方法在下面討論。L-天門冬氨酸-α-脫羧酶，在此也稱作L-天門冬氨酸-1-脫羧酶或EC4.1.1.11，催化從L-天門冬氨酸移去α羧基，以產(chǎn)生β-丙氨酸。本發(fā)明也提供包括微生物細(xì)胞或其提取物的組合物，其中組合物具有的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞100μmolL-天門冬氨酸。在一實(shí)施方案中，組合物包括微生物細(xì)胞或細(xì)胞的提取物、該細(xì)胞用包含編碼L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因的載體轉(zhuǎn)化。例如，載體可能是質(zhì)粒，如在此描述的pIF309。然后，載體用于轉(zhuǎn)化諸如細(xì)菌的微生物，例如大腸桿菌。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括大腸桿菌NS3291細(xì)胞或細(xì)胞提取物。本發(fā)明的組合物具有的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞100μmolL-天門冬氨酸，優(yōu)選的是大約每小時(shí)每克細(xì)胞100～2000μmolL-天門冬氨酸。所說的組合物的酶活性，是用如上所注明的Williamson等方法說明的活性作為參考點(diǎn)計(jì)算。在那篇參考文獻(xiàn)中，粗提取物顯示的活性為400克細(xì)胞6700U，而1U等同于42℃下每分鐘釋放1nmol的CO2。因此，16.75U/g細(xì)胞等同于每克細(xì)胞每分鐘釋放16.75nmolCO2。假定1摩爾的L-天門冬氨酸完全轉(zhuǎn)化成1摩爾的β-丙氨酸和1摩爾的CO2，每分鐘每克細(xì)胞所用的16.75nmol的L-天門冬氨酸，將大約每小時(shí)每克細(xì)胞用去1μmol的L-天門冬氨酸。如在此實(shí)施例說明的那樣，本發(fā)明的組合物提供的活性，比已知的現(xiàn)有技術(shù)制備的酶活性高100倍以上。根據(jù)Williamson論文表III，純酶的比活性為650U/mg蛋白。假定50％的總細(xì)胞蛋白有該活性，本方法和組合物提供的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性，達(dá)到每小時(shí)每克細(xì)胞2000μmolL-天門冬氨酸。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物具有的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性，大約為每小時(shí)每克細(xì)胞100-2000μmolL-天門冬氨酸。在另一實(shí)施方案中，組合物具有的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性，大約為每小時(shí)每克細(xì)胞100～1000μmolL-天門冬氨酸。L-天門冬氨酸-α-脫羧酶基因的克隆可通過下列方法完成，從合適的供體微生物中，分離編碼帶有L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性的多肽的DNA片段，然后把DNA片段整合到合適的載體中，該方法在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員中眾所周知。合適的供體微生物包括攜帶如下基因的所有微生物，該基因編碼的多肽能催化L-天門冬氨酸的α-脫羧化變成β-丙氨酸。實(shí)施例包括，但不局限于，來自大腸桿菌(“E.coli”)的細(xì)菌，包括大腸桿菌B株、大腸桿菌K12株、大腸桿菌NIHJ株和大腸桿菌Tennessee株；普通變形菌、尸胺桿菌、棕色固氮菌、豌豆根瘤菌、三葉草根瘤菌、或來自桿菌屬的細(xì)菌。用于本發(fā)明實(shí)踐中的合適克隆載體，一般含有復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)志，以維持載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性，和便于鑒定轉(zhuǎn)化體。用于克隆L-天門冬氨酸-α-脫羧酶基因的一些方法和材料的描述，可在分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)〔T.Maniatis，E.Fritsch和J.Sambrook，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)〕和其中的參考文獻(xiàn)中找到，在此引入僅作參考。然后表達(dá)編碼具有L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性的多肽的DNA片段。表達(dá)L-天門冬氨酸-α-脫羧酶基因的一般策略，包括把編碼具有L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性的多肽的DNA片段，連接到適于所需的宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中，其中許多實(shí)施例在本領(lǐng)域中眾所周知。一般而言，合適的表達(dá)載體的特征為，存在復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子或其它轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。表達(dá)載體也可以包括賦予對(duì)抗生素抗性的基因作選擇性標(biāo)記；不過，如果需要，含有任何其它編碼宿主微生物生長(zhǎng)和存活需要的蛋白的基因的質(zhì)粒，也可用作選擇性標(biāo)記。用于重組DNA構(gòu)建的啟動(dòng)子的實(shí)施例包括，但不局限于，色氨酸、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶、和PL啟動(dòng)子系統(tǒng)，和來自2個(gè)或更多已知的啟動(dòng)子系統(tǒng)如tac的組分或結(jié)構(gòu)組成的雜交啟動(dòng)子系統(tǒng)。盡管這些是用于細(xì)菌宿主菌株的最常見啟動(dòng)子，也可使用便于遺傳操作的其它菌株和微生物種類，和用于那些宿主菌株的其它啟動(dòng)子。連接后，本發(fā)明產(chǎn)生的載體含有操作性和啟動(dòng)子相連接的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶基因，如果用載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，能指導(dǎo)產(chǎn)生L-天門冬氨酸-α-脫羧酶。合適的用載體轉(zhuǎn)化的宿主包括任何微生物，例如細(xì)菌，該微生物允許編碼L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的基因表達(dá)。實(shí)施例包括但不局限于，大腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、變形菌屬、固氮菌屬和根瘤菌屬的細(xì)菌。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)L-天門冬氨酸-α-脫羧酶基因的宿主菌株為任一種大腸桿菌菌株，尤其是大腸桿菌W3110株，啟動(dòng)子系統(tǒng)是修飾過的pheA啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的描述見美國(guó)專利號(hào)5,120,837(Fotheringham等)，其內(nèi)容在此引入僅作參考。因此，基因表達(dá)通過把基因連接到所選擇的宿主菌株中進(jìn)行基因表達(dá)的載體中而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于在大腸桿菌中表達(dá)L-天門冬氨酸-α-脫羧酶基因的載體是pBR322，或衍生自pBR322的質(zhì)粒，如pIF309。質(zhì)粒pBR322含有編碼氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因，可允許方便的鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。如果使用pIF309的優(yōu)選實(shí)施方案，酶的表達(dá)是組成性的。如果用熱敏感的啟動(dòng)子，如λcI857抑制子/啟動(dòng)子系統(tǒng)，誘導(dǎo)L-天門冬氨酸-α-脫羧酶合成能通過溫度改變實(shí)現(xiàn)，例如把發(fā)酵溫度從30℃提高到40℃?？深A(yù)期產(chǎn)生的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的水平，大約為細(xì)胞總蛋白的5％～40％，因而產(chǎn)生了含有非常高L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性的酶組合物的全細(xì)胞?；虮磉_(dá)出現(xiàn)的酶是否在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生，對(duì)本發(fā)明來說并不關(guān)鍵，因?yàn)樗璧漠a(chǎn)物可方便地回收，如果需要，在任一情況下用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)一步純化。在一不同的優(yōu)選實(shí)施方案中，該基因能整合到熱穩(wěn)定的微生物中，以鑒定增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性的基因突變，因而允許本方法在提高的溫度下操作。在本發(fā)明的實(shí)施中，產(chǎn)生提高水平的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的細(xì)胞，可以和含D，L-天門冬氨酸或其鹽的溶液，結(jié)果至少使部分L-天門冬氨酸在反應(yīng)混合液中轉(zhuǎn)化成β-丙氨酸，放出CO2而留下D-天門冬氨酸?？蓪?duì)細(xì)胞進(jìn)行滲透化處理，以利于底物的擴(kuò)散和產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞。該滲透作用可通過用低濃度的表面活性劑處理細(xì)胞而完成，這些表面活性劑包括但不局限于，吐溫80、TritonX-100、NonidetP40、氯化十六烷基吡啶鎓脫氧膽酸、十六烷基二甲溴銨或氯芐烷銨。此外，有機(jī)溶劑在低濃度下也被用于增加滲透作用，這些有機(jī)溶劑包括但不局限于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙醇或丙酮。L-天門冬氨酸-α-脫羧酶也可以含粗制、部分純化或純化的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的細(xì)胞提取物方式，加到含有D，L-天門冬氨酸的反反混合液中。細(xì)胞提取物按本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法制備，該方法為破碎細(xì)胞，重新獲得該酶。細(xì)胞破碎可通過機(jī)械或非機(jī)械的方法完成。最常見的情況，對(duì)細(xì)菌懸浮液來說，機(jī)械裝置如弗氏細(xì)胞壓力器、超聲、珠研磨或Manton-Gaulin勻漿器可以使用，這些方法的特點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知。見，Scopes，R.K“蛋白純化”，(1982)(Springer-Verlag，紐約)。然后，用細(xì)胞提取物的反應(yīng)，以上述討論的全細(xì)胞方法相似的方式進(jìn)行。如果需要，含L-天門冬氨酸-α-脫羧酶細(xì)胞或其提取物、或純化的酶或酶級(jí)分，也可固定化。可用于本發(fā)明實(shí)施中的固定化方法，包括眾所周知的方法，如聚合膠包埋、共價(jià)連接、交聯(lián)、吸附和微囊化。這些方法的一些實(shí)施例由A.M.Klihanov科學(xué)219722-727(1983)中描述，參考文獻(xiàn)見酶學(xué)方法(1976)，第44卷(K.Mosbach主編)，在此引入僅作參考。固定化的一種方法在美國(guó)專利號(hào)5,019,509中公開其內(nèi)容，至少含重量為20％的二氧化硅或氧化鋁的支持材料與氨基烷基化合物如氨基烷基硅烷、聚亞乙基亞胺、或聚烷基胺接觸，接著用戊二醛活化。然后，含酶溶液和活化的支持物接觸，以產(chǎn)生具有L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性的固定化酶組合物。用于本發(fā)明實(shí)施中的其他固定化支持物包括但不局限于、多孔玻璃和多孔陶瓷、皂土、硅藻土、活性炭Sepharose和Sepharose衍生物、纖維素和纖維素衍生物、聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺衍生物、聚氮雜環(huán)丁烷、藻酸鹽、角叉藻聚糖、和Chromosorb。Sepharose(Pharmacia精細(xì)化學(xué)公司，UppsalaSweden)是一種從瓊脂糖中制備的珠形凝膠。制造商產(chǎn)物文獻(xiàn)報(bào)道，在其天然狀態(tài)，瓊脂糖為稱為瓊脂的帶電荷和中性多糖的復(fù)雜混合物的一部分。用于制取Sepharose瓊脂糖通過移去帶電荷的多糖的純化方法獲得，以形成僅具有非常小數(shù)目的殘留帶電荷基因的凝膠。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)正確評(píng)價(jià)，適用于固定化細(xì)胞或來源于細(xì)胞的提取物的許多其它材料，也可用于固定本發(fā)明的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶。如果有必要，這些支持物可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)活化。利用含有L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的細(xì)胞或包括來源于所述細(xì)胞提取物的組合物，產(chǎn)生D-天門冬氨酸的反應(yīng)按下列方法進(jìn)行。該方法把含D，L-天門冬氨酸的溶液和L-天門冬氨酸-α-脫羧酶接觸，反應(yīng)條件允許至少部分的L-天門冬氨酸轉(zhuǎn)變成β-丙氨酸。D，L-天門冬氨酸的濃度在該反應(yīng)中并不關(guān)鍵，預(yù)期高達(dá)2M的濃度也有用。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞提取物與具有0.5M濃度的D，L-天門冬氨酸水溶液接觸。在一不同的優(yōu)選實(shí)施方案中，D，L-天門冬氨酸溶液的濃度為1.0M。本發(fā)明的酶催化反應(yīng)在大約4℃～70℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選的溫度范圍大約為20℃～60℃。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)溫度是環(huán)境溫度。作為本發(fā)明的目的，“環(huán)境溫度”意指為不使用各種方法或裝置，根據(jù)反應(yīng)容器靜置時(shí)其自然環(huán)境的溫度，提高或降低反應(yīng)容器的溫度。反應(yīng)的最適pH范圍，大約為2.0～12.0，較優(yōu)選的范圍大約為4.0～9.0，最優(yōu)選的為pH7.0。D-天門冬氨酸和β-丙氨酸可用本領(lǐng)域熟知的方法分離和重新獲得，或D-天門冬氨酸/β-丙氨酸混合物可重新獲得或直接用作混合物。本發(fā)明的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶組合物可進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)含有放射性或非放射性同位素標(biāo)記的β-丙氨酸或β-丙氨酸/D-天門冬氨酸混合物中。通過應(yīng)用適當(dāng)標(biāo)記的天門冬氨酸前體，和/或通過同位素標(biāo)記溶劑存在下進(jìn)行反應(yīng)，上述產(chǎn)物可容易地產(chǎn)生。能摻入到β-丙氨酸和/或D-天門冬氨酸產(chǎn)物的同位素標(biāo)記的實(shí)施例，包括但不局限于14C、13C、13N、15N、2H、3H、17O和18O?，F(xiàn)在，將通過下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不在于也不應(yīng)該理解為是對(duì)本發(fā)明的范圍限制，在接后的權(quán)利要求中限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1質(zhì)粒pIF309的制備編碼L-天門冬氨酸-1-脫羧酶的panD基因，從大腸桿菌K12染色體中，用下列PCR方法分離A.染色體DNA制備大腸桿菌W3110菌株從Coli遺傳貯存中心(耶魯大學(xué)，Newhaven，CT)獲得。菌株按照提供者的指示復(fù)蘇，在500ml培養(yǎng)瓶中37℃下，50ml體積的Luria肉湯中搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。10ml等份培養(yǎng)物10,000×g離心4分鐘。棄去上清液，沉淀重新懸浮在1ml的含50mMTris/HClpH8.0，10mMEDTA和100μg/mlRNaseA(Sigma)的溶液中。溶液在室溫下溫育10分鐘。加入2ml的含0.4％(w/v)十二烷基硫酸鈉(“SDS”)和100μg/ml蛋白酶K(Sigma)的溶液。37℃下溫育溶液20分鐘。加入pH5.2的乙酸鈉至終濃度為300mM。然后，該溶液用37℃的等體積的苯酚抽提3次，用2.5倍體積的乙醇沉淀。然后用無菌環(huán)移取DNA，DNA重新溶解在400μlpH5.2的300mM乙酸鈉中。然后，DNA用2.5倍體積的乙醇重新沉淀，按前述的方法移取，干燥，溶在500μl的10mMTrispH8.0和1mMEDTA中。終濃度大約為200μg/ml。B.通過PCR擴(kuò)增panD通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌panD基因，用0.2mlMicroAmpTM反應(yīng)管(PerkinElmer，Norwalk，CT)完成，在反應(yīng)管中加入100ng如上述制備的大腸桿菌染色體DNA，dATP、dGTP、dCTP和dTTP(每種10mM)各2μl，10μl含有15mMMgCl、500mMKCl、100mMTrispH8.3的緩沖液和0.01％(w/v)明膠，5UTaqDNA聚合酶(AmpliTaqTM)和5μl10nmol/ml的下列每種寡核苷酸引物溶液，寡核苷酸引物根據(jù)已知的方法，用應(yīng)用生物系統(tǒng)380BDNA合成儀合成。(MB1682)5′CGCGGATCCACTATGATTCGCACGATGCTGCAGGGC3′(MG1683)5′CAGCGTGCATGCTCAAGCAACCTGTACCGGAATCGC3′反應(yīng)在PerkinElmer9600TMPCR熱循環(huán)儀(PerkinElmer)中進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)按下列方法進(jìn)行，94℃預(yù)熱3分鐘，接著94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。然后反應(yīng)混合液貯存在4℃。C.panD的克隆擴(kuò)增的panD基因克隆到來源于質(zhì)粒pBR322的質(zhì)粒載體上。該質(zhì)粒命名為pIF309。含有panD基因的片段用限制性酶BamHI和SphI完全消化，連接到相似方式切割的載體單獨(dú)BamHI和SphI位點(diǎn)之間。在HindIII和BamHI之間插入合成的DNA片段，該DNA片段帶有大腸桿菌K12pheA啟動(dòng)子區(qū)的修飾變體。該片段完全在應(yīng)用生物系統(tǒng)380BDNA合成儀上合成，資料來源于與Fotheringham等共有的美國(guó)專利5,120,837。上述序列見如下HindIIIAAGCTTTTTTGTTGACAGCGTGAAAACAGTACGGGTATAATACTAAAGTCACAAGGAGGATCCBamHI質(zhì)粒pIF309在圖1中顯示。限制性消化用由新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司提供的酶進(jìn)行，根據(jù)制造商的具體說明(NEB，Beverly，MA)使用。使用由Takara生物化學(xué)公司(PanveraCorp.，MadisonWI)提供的連接反應(yīng)試劑盒，根據(jù)制造商的具體說明進(jìn)行DNA片段連接。通過從按如下描述生長(zhǎng)的NS3291菌株培養(yǎng)物制備的提取液中，生物學(xué)測(cè)定L-天門冬氨酸-1-脫羧酶活性確定panD的表達(dá)。實(shí)施例2大腸桿菌NS3291菌株的產(chǎn)生和發(fā)酵質(zhì)粒pIF309用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110菌株，所用的條件在美國(guó)專利號(hào)5,354,672中描述，其內(nèi)容在此引入僅作參考，結(jié)果產(chǎn)生了NS3291菌株。NS3291菌株被接種到2800ml馮巴赫瓶中，瓶中含1L下列生長(zhǎng)培養(yǎng)基磷酸氫二鉀13g磷酸二氫鉀2g磷酸銨4g檸檬酸鐵銨0.24g酵母提取物2g硫酸鎂(7·H2O)1g水930ml滅菌后加下列成分葡萄糖(50％w/v貯液)70ml氨芐青霉素0.2g培養(yǎng)瓶在搖動(dòng)培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)。菌株生長(zhǎng)至800-1100kletl單位，用于接種發(fā)酵罐。發(fā)酵罐是Biolafite78-100(St.GermainenLaye，法國(guó))20L。發(fā)酵罐在下列條件下操作攪拌速度500rpm溫度37℃反壓(backpressure)0.7BarpH(用NH3調(diào)整)7.2通氣量1vvm設(shè)定體積10L接種量100ml運(yùn)行時(shí)間16hr除非另有說明，發(fā)酵培養(yǎng)基的每升培養(yǎng)基包括下列成分硫酸鎂(7·H2O)5.35g檸檬酸鐵銨0.13g磷酸氫二鉀4.6g硫酸鎂0.023g碘化鉀0.74mg硫酸鎳0.74mg消泡劑(MazurMazuDF204)0.4ml酵母提取物5gL-天門冬氨酸10g自來水10L接種前，加葡萄糖至25g/l的濃度。當(dāng)初始葡萄糖完全消耗后，以變化的速率添加葡萄糖，在余下的時(shí)間內(nèi)不低于1g/l，在16小時(shí)內(nèi)所加葡萄糖的總量為290克。罐的終體積為12.2L。發(fā)酵達(dá)到10,352Kletl單位，干細(xì)胞重量為24.2g/l。發(fā)酵液冷卻到10℃以下，用中空纖維柱(截留分子量500,000)超濾至干細(xì)胞重量為158g/l。濃縮的細(xì)胞精華貯存在4℃。該菌株用在下列實(shí)施例中。實(shí)施例3用L-天門冬氨酸-α-脫羧酶生物轉(zhuǎn)化D/L天門冬氨酸將重為66.5g(0.5M)D/L-天門冬氨酸(Sigma，A-9006)加到2L燒杯中，用10NNaOH調(diào)pH至7.0。加去離子水加至體積963ml。以裝罐細(xì)胞體積(“PCV”)7.31g/10ml細(xì)胞加137ml的細(xì)胞(NS3291，如上描述)，得到終體積1.1L。隔一段時(shí)間移取樣品(每次大約1ml)，離心，上清液用HPLC分析D-和L-天門冬氨酸的含量。在此所有的實(shí)施例中，D-和L-天門冬氨酸異構(gòu)體通過HPLC，用下列預(yù)置柱衍生方法定性。天門冬氨酸用鄰苯二醛和N-乙酰-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)變成非對(duì)應(yīng)異構(gòu)物。在SupelcosilTMLC-18DB，3μ，150×4.6mm柱上，用A流動(dòng)相20％甲醇/80％磷酸三乙基銨和B甲醇以及如下的階梯梯度，獲得分離的非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體。時(shí)間(min)A(％)B(％)6.510007.0406011.5406012.01000衍生化反應(yīng)用Hewlett-Packard1090M層析儀自動(dòng)進(jìn)行，在338nm(帶寬4)和流速1.0ml/分下檢測(cè)。對(duì)D-天門冬氨酸和L-天門冬氨酸的滯留時(shí)間、分別為4.19分和4.54分。來自生物轉(zhuǎn)化的樣品在微量離心機(jī)中離心以移去細(xì)胞，上清液適當(dāng)稀釋，這樣由HPLC測(cè)定的值落入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)之中。這些稀釋率通常為1∶100和1∶200之間，用去離子水稀釋。所有實(shí)施例中，術(shù)語“D-Asp”和“L-Asp”用作天門冬氨酸不同異構(gòu)體的縮寫記號(hào)。表1在圖2中用圖表示表1中的數(shù)據(jù)。大約24小時(shí)，剩余的L-天門冬氨酸百分率大約0.17mg/ml，基本上可忽略不計(jì)。用在生物轉(zhuǎn)化中組合物的酶活性，按下列算式計(jì)算0.5MD，L-Asp＝0.25MD-Asp+0.25ML-Asp0.25molL&times;1.1L=0.275mol,L-Asp]]>后面該值等于每小時(shí)每克細(xì)胞114.6μmolL-天門冬氨酸，或大于現(xiàn)有技術(shù)已知的酶活性的100倍。在這時(shí)對(duì)映異構(gòu)體的富集值按下列計(jì)算29.25-0.1729.25+0.17=0.988,D-Asp]]>接著全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，細(xì)胞通過離心或超過濾移去。無細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化混合液的pH值用無機(jī)酸，通常硫酸，調(diào)整至D-天門冬氨酸以固體沉淀而β-丙氨酸仍在溶液中的pH值，典型的pH值2.0-2.5。固體通過過濾或其他方法收集，用冷水清洗以提供D-天門冬氨酸?；厥章蕿?0％～90％。實(shí)施例4用新鮮細(xì)胞重新處理上清液在本實(shí)施例中，來自實(shí)施例3的上清液用新鮮細(xì)胞重新處理。來自實(shí)施例3，停止在68小時(shí)的反應(yīng)液，在GS-3轉(zhuǎn)子中7000rpm離心45分鐘。從細(xì)胞中分離到了上清液990ml。963ml的該上清液和137ml新鮮細(xì)胞混合，置在2L發(fā)酵罐中。用300rpm攪拌，不用自動(dòng)pH控制和在37℃溫度下，發(fā)生生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。隔一段時(shí)間移取樣品大約1ml，按實(shí)施例3的方法分析。表2在圖3中圖示表2的數(shù)據(jù)。盡管L-天門冬氨酸的濃度在t＝0時(shí)不高(0.43mg/ml)，到23.5小時(shí)時(shí)，濃度基本上降低到零(0.07mg/ml)?？梢韵嘈?，23.5小時(shí)后顯示的L-天門冬氨酸的濃度增加是由于蒸發(fā)作用，盡管不能排除外來的酶類相伴的合成。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)(68.5小時(shí))，僅有0.55mg/ml的L-天門冬氨酸。實(shí)施例5細(xì)胞的重新利用在實(shí)施例3中已經(jīng)使用的細(xì)胞，放在新鮮的底物中，確定它們是否仍有活性。新鮮的D/L-天門冬氨酸底物，按實(shí)施例3中前已描述的方法制備。來自實(shí)施例3的細(xì)胞，重新懸浮在去離子水中，加至100ml。底物(900ml，0.5MD/LAsp)的pH，用NaOH調(diào)至7.0。放入在2L的發(fā)酵罐中后，加細(xì)胞(100ml)。沒有pH控制，用去離子水作底物。隔一定時(shí)間移取樣品，離心，適當(dāng)稀釋上清液，進(jìn)行D-和L-天門冬氨酸測(cè)定。溫度設(shè)定在37℃。表3在圖4中也圖示表3的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果顯示，甚至一個(gè)循環(huán)后，L-天門冬氨酸-α-脫羧酶仍然存有活性，因此結(jié)果表明該生物催化劑能重新循環(huán)使用。實(shí)施例6D/L天門冬氨酸作底物以針對(duì)不同的酶細(xì)胞裝載量1.0MD/L-天門冬氨酸作底物，測(cè)定對(duì)2種酶細(xì)胞裝載量的反應(yīng)，100g/ml的細(xì)胞在此指定為反應(yīng)“A”，50g/ml的細(xì)胞在此指定為反應(yīng)“B”。133.1gD/L-天門冬氨酸用大約600ml去離子水溶解，用NaOH調(diào)整pH至7.0，用了100ml10NNaOH和少量的1.0NNaOH。反應(yīng)A中的底物量用去離子水加到963ml。反應(yīng)加貯存在冷室中的137ml的細(xì)胞開始。對(duì)于反應(yīng)B，底物量加至總體積981.5ml。反應(yīng)用65.0ml細(xì)胞開始。二種反應(yīng)在2L發(fā)酵罐中，pH7.0不作連續(xù)調(diào)節(jié)pH，37℃下進(jìn)行。隔一定時(shí)間移取樣品，離心，稀釋上清液，送交進(jìn)行D-和L-天門冬氨酸的HPLC分析。表4顯示反應(yīng)A的結(jié)果，表5顯示反應(yīng)B的結(jié)果。表4<p>表5在圖5中圖示表4和表5的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，100g/l的轉(zhuǎn)化率比50g/l更快。然而，在1.0MD/L-天門冬氨酸的底物濃度下的轉(zhuǎn)化率，比在0.5M底物濃度慢。(見實(shí)施例3和圖2)。另外，1.0M底物下72.0小時(shí)后，L-天門冬氨酸從起始濃度53.6mg/ml降低到5.39mg/ml，降低率為90％。實(shí)施例7L-天門冬氨酸-α-脫羧酶NH4OH中和底物該實(shí)施例顯示，按前面實(shí)施例的操作方法，用NH4OH代替NaOH，中和底物D/L-天門冬氨酸的影響。細(xì)胞冷凍貯存在-80℃。133.1g(1mol)的D/L-天門冬氨酸溶解在大約600ml的去離子水中，用濃NH4OH調(diào)pH至大約7。底物的終體積達(dá)963ml，然后加入137ml新鮮融化的細(xì)胞?；旌衔锓旁?L的發(fā)酵罐中，溫度調(diào)整至37℃。不用自動(dòng)溫度控制，然而，移取樣品監(jiān)控pH值，用50％NH4OH調(diào)pH。隔一定時(shí)間移取樣品大約1ml，離心，稀釋前上清液冷凍貯存，進(jìn)行HPLC分析。表6在圖6中圖示表6中的數(shù)據(jù)。與Na+鹽相比較，在用NH4+鹽時(shí)L-Asp利用率較慢。實(shí)施例8L-天門冬氨酸-α-脫羧酶針對(duì)D/L-谷氨酰胺和D/L-丙氨酸的活性本實(shí)施例顯示L-天門冬氨酸-α-脫羧酶針對(duì)2種潛在的氨基酸底物，D/L-谷氨酰胺和D/L-丙氨酸的活性。D/L-天門冬氨酸用作對(duì)照。底物的制備，通過把固體氨基酸消旋物溶解在大約75ml的去離子水中，用10NNaOH調(diào)整pH到7.0進(jìn)行。然后，用去離子水加體積至100ml。所用的細(xì)胞冷凍貯存大約1個(gè)月，然后融化，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，貯存在冰箱中大約1個(gè)月。反應(yīng)按前面實(shí)施例所述的相同方法進(jìn)行。隔一定時(shí)間移取上清液樣品大約0.20ml，離心，HPLC分析前冷凍貯存，按前面實(shí)施例中所述的方法進(jìn)行HPLC分析。表7顯示反應(yīng)結(jié)果。表7<p>在圖7中圖示表7的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在所用的除了L-天門冬氨酸外的所有異構(gòu)體底物中，權(quán)利要求的方法的特異性和酶制備物，在酶存在下，直至55小時(shí)都是穩(wěn)定不變的，表明L-天門冬氨酸是該酶的唯一底物。L-天門冬氨酸，正如整個(gè)具體過程說明的那樣，降低到起始原料量的1.23％。實(shí)施例9溫度研究本實(shí)施例顯示L-天門冬氨酸-α-脫羧酶反應(yīng)在37℃、45℃和50℃的活性133.1g(1mol)的D/L-天門冬氨酸用去離子水溶解、用10NNaOH調(diào)整pH至7.0。大約為100ml。新鮮從-80℃融化的細(xì)胞，加到終濃度為100g/l。用3個(gè)2L發(fā)酵罐，每個(gè)發(fā)酵罐裝填963ml底物溶液和137ml的細(xì)胞，然后在300rpm攪拌下加熱到37℃和45℃，或者在450rpm攪拌下加熱到50℃。隔一定時(shí)間移取樣品大約1ml，用NaOH或HCl調(diào)pH至7.0。離心移去細(xì)胞后，測(cè)定上清液的D-和L-天門冬氨酸的含量。表8顯示37℃下的反應(yīng)結(jié)果，表9顯示45℃的反應(yīng)結(jié)果，表10顯示50℃的反應(yīng)結(jié)果。表8</tables>表9表10在圖8中一起圖示表8、9和10的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果顯示，所有3種溫度下，D-異構(gòu)體是穩(wěn)定不變的。37℃下，L-異構(gòu)體到99.75小時(shí)幾乎完全被消耗。在45℃和50℃下，顯示起始速率隨較高溫度而增加，但似乎延長(zhǎng)時(shí)間后，酶變得不穩(wěn)定并且失活。雖然對(duì)本權(quán)利要求的方法和組合物，中等溫度是優(yōu)選的，反應(yīng)速率可通過提高反應(yīng)溫度而增加。權(quán)利要求1.一種制備D-天門冬氨酸的方法，該方法包括在合適的產(chǎn)生D-天門冬氨酸和β-丙氨酸的條件下，把D，L-天門冬氨酸或其鹽的溶液與包括微生物細(xì)胞或其提取物的組合物接觸，其中組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞用去100μmolL-天門冬氨酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性大約為每小時(shí)每克細(xì)胞用去100～2000μmol的L-天門冬氨酸。3.權(quán)利要求1的方法，其中組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性大約為每小時(shí)每克細(xì)胞用去100～1000μmol的L-天門冬氨酸。4.權(quán)利要求1的方法，其中組合物包括用編碼L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因轉(zhuǎn)化的微生物的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。5.權(quán)利要求4的方法，其中的生物是細(xì)菌。6.權(quán)利要求5的方法，其中的細(xì)菌是選自大腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌族、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、變形菌屬、固氮菌屬和根瘤菌屬的細(xì)菌。7.權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)菌是大腸桿菌W3110菌株。8.權(quán)利要求4的方法，其中panD基因來源于選自大腸桿菌B株、大腸桿菌K12株、大腸桿菌NIHJ株、大腸桿菌Tennessee株、普通變形菌、尸胺桿菌、棕色固氮菌、豌豆根瘤菌和三葉草根瘤菌的細(xì)菌。9.權(quán)利要求7的方法，其中細(xì)菌是大腸桿菌K12菌株。10.權(quán)利要求4的方法，其中組合物包括大腸桿菌NS3291的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。11.權(quán)利要求1的方法，其中的接觸包括在大約4℃～70℃溫度和大約2～12的pH下溫育D，L-天門冬氨酸或其鹽和該組合物。12.權(quán)利要求11的方法，其中的接觸包括在環(huán)境溫度和大約pH7.0下溫育D，L-天門冬氨酸或其鹽和組合物。13.權(quán)利要求1的方法，其中組合物包括固定在活化基質(zhì)上的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。14.權(quán)利要求13的方法，其中活化基質(zhì)選自多孔玻璃、多孔陶瓷、皂土、硅藻土、活性炭、瓊脂糖和瓊脂糖衍生物、纖維素和纖維素衍生物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺衍生物、聚氮雜環(huán)丁烷、藻酸鹽、角叉藻聚糖和Chromosorb。15.一種制備D-天門冬氨酸的方法，包括(a)制備D，L-天門冬氨酸或其鹽的水溶液；(b)把D，L-天門冬氨酸或其鹽的水溶液，在大約4℃～70℃溫度和大約2～12pH下，與組合物溫育，該組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞用去100μmol的L-天門冬氨酸；以及(c)重新獲得D-天門冬氨酸和β-丙氨酸。16.權(quán)利要求15的方法，其中組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性大約為每小時(shí)每克細(xì)胞用去100～2000μmol的L-天門冬氨酸。17.權(quán)利要求15的方法，其中組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性大約為每小時(shí)每克細(xì)胞用去100～1000μmol的L-天門冬氨酸。18.權(quán)利要求15的方法，其中組合物包括一種用編碼L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的基因轉(zhuǎn)化的生物體的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。19.權(quán)利要求17的方法，其中的生物體是細(xì)菌。20.權(quán)利要求19的方法，其中的細(xì)菌選自大腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌族、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、變形菌屬、固氮菌屬和根瘤菌屬。21.權(quán)利要求20的方法，其中的細(xì)菌是大腸桿菌W3110菌株。22.權(quán)利要求18的方法，其中panD基因來源于選自大腸桿菌B株、大腸桿菌K12株、大腸桿菌NIHJ株、大腸桿菌Tennessee株、普通變形菌、尸胺桿菌、棕色固氮菌、豌豆根瘤菌和三葉草根瘤菌的細(xì)菌。23.權(quán)利要求22的方法，其中細(xì)胞是大腸桿菌K12菌株。24.權(quán)利要求18的方法，其中組合物包括大腸桿菌NS3291的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。25.權(quán)利要求15的方法，其中的接觸包括在環(huán)境溫度和大約pH7.0下溫育D，L-天門冬氨酸或其鹽和組合物。26.組合物，其L-天門冬氨酸-α-脫羧酶活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞用去100μmol的L-天門冬氨酸。27.權(quán)利要求26的組合物，包括用載體轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞或細(xì)胞提取物，該載體包含有編碼L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因。28.權(quán)利要求27的組合物，其中載體是質(zhì)粒。29.權(quán)利要求28的組合物，其中質(zhì)粒是pIF309。30.權(quán)利要求27的組合物，其中的微生物是細(xì)菌。31.權(quán)利要求30的組合物，其中細(xì)菌選自大腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌族、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、變形菌屬、固氮菌屬和根瘤菌屬的細(xì)菌。32.權(quán)利要求31的方法，其中細(xì)菌是大腸桿菌K12菌株。33.權(quán)利要求27的組合物，其中panD基因來源于選自大腸桿菌B株、大腸桿菌K12株、大腸桿菌NIHJ株、大腸桿菌Tennessee株、普通變形菌、尸胺桿菌、棕色固氮菌、豌豆根瘤菌和三葉草根瘤菌的細(xì)菌。34.權(quán)利要求27的組合物，該組合物包括大腸桿菌NS3291的細(xì)胞或細(xì)胞提取物。35.權(quán)利要求26的組合物，其中該組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性大約為每小時(shí)每克細(xì)胞用去100～2000μmol的L-天門冬氨酸。36.權(quán)利要求26的組合物，其中該組合物的L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性大約為每小時(shí)每克細(xì)胞用去100～1000μmol的L-天門冬氨酸。全文摘要從D,L－天門冬氨酸制備D－天門冬氨酸和β－丙氨酸的方法和組合物,其中在適合產(chǎn)生D－天門冬氨酸和β－丙氨酸的條件下將D,L－天門冬氨酸或其鹽與一組合物接觸,該組合物的L－天門冬氨酸－α－脫羧酶活性大于每小時(shí)每克細(xì)胞用去100μmolL－天門冬氨酸。文檔編號(hào)C12P13/06GK1242054SQ97199247公開日2000年1月19日申請(qǐng)日期1997年10月28日優(yōu)先權(quán)日1997年10月28日發(fā)明者D·P·龐塔萊翁,I·G·福瑟林哈姆,J·L·湯申請(qǐng)人:Nsc技術(shù)有限公司