一種水產(chǎn)品天然生物保鮮劑及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)品天然生物保鮮劑，按重量份數(shù)計(jì)由以下成分組成：硫酸軟骨素寡糖16～24份，抗氧化肽35～40份，姜黃提取物41～45份，除菌水300～450份；還涉及該生物保鮮劑的制備方法和在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用。本發(fā)明中的生物保鮮劑無(wú)毒、無(wú)殘留、低成本，可有效避免水產(chǎn)品脂肪、蛋白質(zhì)等不被氧化破壞，并保持水產(chǎn)品鮮亮的色澤；同時(shí)，充分利用姜黃提取物的廣譜抗菌活性，防止各種水產(chǎn)品常見(jiàn)菌在水產(chǎn)品中保藏過(guò)程中的滋生和繁殖，從而對(duì)水產(chǎn)品起到有效的保鮮作用，顯著延長(zhǎng)水產(chǎn)品的保鮮期。此外，該保鮮劑的制備過(guò)程中，硫酸軟骨素寡糖和抗氧化肽均以水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為原料，可降低生產(chǎn)成本，提升水產(chǎn)品加工的產(chǎn)值，改善環(huán)境，具有顯著的社會(huì)效益。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種水產(chǎn)品天然生物保鮮劑及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)品保鮮技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水產(chǎn)品天然生物保鮮劑及其制備 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)品由于味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，富含對(duì)心血管病具有療效的n~3不飽和脂肪酸 和其他活性物質(zhì)，因此越來(lái)越受到人們的喜歡。由于魚(yú)蝦等水產(chǎn)品的肌肉中水分含量約 70%，組織脆弱、天然免疫物質(zhì)少、不飽和脂肪酸易氧化及可溶性蛋白質(zhì)含量高，因此比一 般的動(dòng)物肉組織不易貯藏，容易降低品質(zhì)，甚至腐敗。
[0003] 保鮮劑處理是水產(chǎn)品儲(chǔ)運(yùn)處理中的常用手段，它不僅能有效減緩水產(chǎn)品鮮度下 降，并且能增加水產(chǎn)品的持水性，防止在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中變色。目前，常用的水產(chǎn)品保鮮劑一般 為化學(xué)保鮮劑，如專(zhuān)利號(hào)為ZL200710066793.7(授權(quán)公告號(hào)為CN 101002579B)的中國(guó)發(fā)明 專(zhuān)利《蝦類(lèi)保鮮劑及其應(yīng)用》公開(kāi)了一種蝦類(lèi)保鮮劑，該保鮮劑以亞硫酸鹽類(lèi)結(jié)合一定量的 分散劑制成，雖然解決了蝦類(lèi)保鮮冰中保鮮劑(包括亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、焦亞硫酸鹽、低 亞硫酸鹽)分布不均勻的問(wèn)題，但亞硫酸鹽有毒性，不僅影響食用者的身體健康，而且也會(huì) 使得使用該種化學(xué)保鮮劑的蝦類(lèi)產(chǎn)品不符合一些西方國(guó)家的食品安全規(guī)定，從而給生產(chǎn)企 業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 生物保鮮劑是近幾年興起的一種新型保鮮劑，一般從動(dòng)植物、微生物中提取或利 用現(xiàn)代生物工程技術(shù)得到，其以安全、健康等特點(diǎn)受到人們的關(guān)注。如申請(qǐng)?zhí)枮?201410639965.5(申請(qǐng)公布號(hào)為CN 104322648 A)的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《一種冰保鮮鯧魚(yú)的方 法》公開(kāi)了一種茶多酚生物保鮮劑；申請(qǐng)?zhí)枮?00910234813.6(申請(qǐng)公布號(hào)為CN 102038270 A)的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《貝類(lèi)生物保鮮劑》公開(kāi)了一種貝類(lèi)生物保鮮劑，該生物保鮮劑由丙氨 酸、溶菌酶、甘氨酸、抗壞血酸、磷酸鎂組成。
[0005] 現(xiàn)有的生物保鮮劑與傳統(tǒng)水產(chǎn)品保鮮劑相比，安全性顯著提高，但大多數(shù)的生物 保鮮劑的保鮮效果不理想，還有待進(jìn)一步提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種保鮮效果好的水 產(chǎn)品天然生物保鮮劑。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述水產(chǎn)品天然 生物保鮮劑的制備方法。
[0008] 本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述水產(chǎn)品天然 生物保鮮劑在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明解決上述第一技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種水產(chǎn)品天然生物保鮮 劑，其特征在于，按重量份數(shù)計(jì)由以下成分組成:硫酸軟骨素寡糖16~24份，抗氧化肽35~ 40份，姜黃提取物41~45份，除菌水300~450份。
[0010] 上述方案中的硫酸軟骨素寡糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠保護(hù)機(jī)體細(xì)胞膜免受 氧化損傷，同時(shí)也能防止水產(chǎn)品中脂肪的氧化;抗氧化肽能夠抑制空氣中的氧氣導(dǎo)致的水 產(chǎn)品脂肪氧化和變色，能夠保持食品的良好風(fēng)味和鮮亮的色澤;姜黃乙醇提取物中含有姜 黃素、姜黃酮、龍腦、姜黃烯、石竹烯等多種活性成分，這些成分具有很好地抑菌和抗氧化作 用，能夠顯著抑制大腸桿菌、鰻弧菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌和霉菌等多種水產(chǎn) 品中常見(jiàn)菌的生長(zhǎng)和增殖，同時(shí)姜黃提取物中的姜黃素、姜黃酮均是良好的天然抗氧化成 分，與上述硫酸軟骨素寡糖和抗氧化肽配合作用，能夠抑制氧氣、自由基等對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)、 DNA和色素的氧化損傷。
[0011] 作為優(yōu)選，所述硫酸軟骨素寡糖以水產(chǎn)品加工中產(chǎn)生的骨質(zhì)副產(chǎn)物為原料制得， 降低生產(chǎn)成本，環(huán)保、經(jīng)濟(jì)。
[0012] 本發(fā)明解決第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:上述水產(chǎn)品天然生物保鮮劑的 制備方法，包括以下步驟:分別制備上述硫酸軟骨素寡糖、抗氧化肽以及姜黃提取物，按上 述質(zhì)量份數(shù)將硫酸軟骨素寡糖、抗氧化肽以及姜黃提取物混合，加入除菌水，攪拌均勻得所 需的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑。
[0013] 作為優(yōu)選，所述硫酸軟骨素寡糖通過(guò)以下步驟制得：
[0014] (1)以金槍魚(yú)骨、魷魚(yú)喉骨為原料，煮沸后剔除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織， 搗碎勻漿后得勻漿液；
[0015] ⑵按照體積比1:1~2在上述勾衆(zhòng)液中加入丙酮，攪拌脫脂2~3h，靜置，棄去丙酮 層，得脫脂固形物；
[0016] (3)按固液比1:1~3g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié) pH為5.0~7.0，攪拌均勻，得混合物；
[0017] (4)將上述混合物升溫至50~60°C，加入菠蘿蛋白酶，加酶量為1000~2000U/g，酶 解時(shí)間為6~10h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第一次酶解液；
[0018] (5)調(diào)節(jié)上述第一次酶解液的pH為8.0~9.0，加入堿性蛋白酶，加酶量為1500~ 3000U/g，酶解溫度為50~55°C，攪拌酶解3~6h，升溫至75°C處理lOmin得第二次酶解液；
[0019] (6)將上述第二次酶解液4000~5000rpm離心10min，取上清液；
[0020] (7)在上述上清液中加入體積分?jǐn)?shù)60~90 %的乙醇，pH6.0~8.5條件下，沉淀獲得 硫酸軟骨素；
[0021] (8)按料液比1:20~25g/mL向上述硫酸軟骨素中加入上0.4mol/L鹽酸溶液，65~ 80°C水浴攪拌酸解18~24h;冷卻至室溫，加入氫氧化鈉中和，冷凍干燥，得硫酸軟骨素寡 糖。
[0022]作為優(yōu)選，所述抗氧化肽通過(guò)以下步驟制得：
[0023] (1)取洗凈后的金槍魚(yú)、魷魚(yú)加工副產(chǎn)物，組織搗碎勻漿后的勻漿液，備用；
[0024] (2)按照料液比1:6~9g/mL向上述勾衆(zhòng)液中加入異丙醇，于35~40 °C下攪拌脫脂 24~48h，然后5000~8000rpm離心15min，棄去上清，收集脫脂固形物沉淀；
[0025] (3)按固液比1:3~5g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié) pH為5.0~7.0，攪拌均勻，得混合物。
[0026] (4)上述混合物攪拌升溫至50~60°C，加入風(fēng)味蛋白酶，加酶量為1000~2000U/g， 50~60°C酶解3~6h，得到酶解產(chǎn)物;將上述酶解產(chǎn)物升溫至75°C以上，并保持10~15min， 滅酶，冷卻至室溫，于5000rpm離心1 Omin，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；
[0027] (5)將上述酶解物干粉溶于pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液，配成20~25mg/mL的溶 液，于0.1~〇.15MPa的工作壓力和20~25°C的溫度下，分別采用截留分子量7kDa、5kDa、 3kDa和lkDa的超濾膜對(duì)所得酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾處理，收集各組分，通過(guò)測(cè)定各組分對(duì)DPPH 自由基的清除能力，確定各組分的抗氧化能力，收集抗氧化能力最強(qiáng)的組分并制得干粉； [00 28] (6)將上述抗氧化能力最強(qiáng)的組分用pH 6? 5~7? 5的磷酸鹽緩沖液配成20~25mg/ mL的溶液，經(jīng)葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù) 220nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠過(guò)濾酶解 抗氧化肽，凍干得抗氧化肽。
[0029]作為優(yōu)選，所述姜黃提取物通過(guò)以下步驟制得：
[0030] (1)姜黃塊根粉碎后過(guò)40~50目篩，制得姜黃粉；
[0031] (2)將上述姜黃粉與60~85%乙醇以質(zhì)量體積比1: 5~10混合均勻，旋轉(zhuǎn)提取2小 時(shí)，離心或者過(guò)濾，取清液，得姜黃提取液，將該姜黃提取液濃縮20~25倍，得姜黃提取濃縮 液；
[0032] (4)按照藥液輔料比1:4~8,向上述濃縮液中加入糊精或玉米淀粉，混合均勻；
[0033] (5)65~8(TC烘干10~12h，得干燥產(chǎn)物；
[0034] (6)將上述干燥產(chǎn)物粉碎，過(guò)100目篩，得姜黃提取物干粉制劑。
[0035]本發(fā)明技術(shù)第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:上述水產(chǎn)品天然生物保鮮劑在 水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用:新鮮水產(chǎn)品預(yù)處理后噴灑或浸泡于上述保鮮劑中，密封包裝后置于1 ~4°C保藏。
[0036]作為優(yōu)選，所述的水產(chǎn)品為魚(yú)類(lèi)，應(yīng)用上述保鮮劑對(duì)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行處理時(shí)包括以下步 驟:新鮮魚(yú)類(lèi)去除內(nèi)臟，洗凈瀝干，將上述保鮮劑均勻地噴灑于魚(yú)體表面，接著將其進(jìn)行真 空氣調(diào)包裝，最后將包裝后的魚(yú)類(lèi)冷藏，冷藏溫度為1~4°C。如此處理，可使魚(yú)肉保持較好 的新鮮度和口感。
[0037] 進(jìn)一步，作為優(yōu)選，所述的水產(chǎn)品為蝦類(lèi)，應(yīng)用上述保鮮劑對(duì)蝦類(lèi)進(jìn)行處理時(shí)包括 以下步驟:將鮮活蝦類(lèi)用冰水猝死，接著將其浸泡于濃度為20~30%的保鮮劑溶液中50~ 60min，將蝦類(lèi)從保鮮劑溶液中撈出瀝干，密封保藏后置于4 °C保藏。如此處理，可有效避免 蝦體黑變、腐敗變質(zhì)，保持蝦體的新鮮度。
[0038]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明中的生物保鮮劑無(wú)毒、無(wú)殘留、低成 本，選用硫酸軟骨素寡糖、抗氧化肽和姜黃提取物三種物質(zhì)進(jìn)行合理組配，使三者的生物活 性有機(jī)結(jié)合，充分利用他們的抗氧化活性，可有效避免水產(chǎn)品脂肪、蛋白質(zhì)等不被氧化破 壞，并保持水產(chǎn)品鮮亮的色澤；同時(shí)，充分利用姜黃提取物的廣譜抗菌活性，防止各種水產(chǎn) 品常見(jiàn)菌在水產(chǎn)品中保藏過(guò)程中的滋生和繁殖，從而對(duì)水產(chǎn)品起到有效的保鮮作用，顯著 延長(zhǎng)水產(chǎn)品的保鮮期。此外，該保鮮劑的制備過(guò)程中，硫酸軟骨素寡糖和抗氧化肽均以水產(chǎn) 品加工副產(chǎn)物為原料，可降低生產(chǎn)成本，提升水產(chǎn)品加工的產(chǎn)值，改善環(huán)境，具有顯著的社 會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0040] 實(shí)施例1:水產(chǎn)品天然生物保鮮劑的制備
[0041] 本實(shí)施例中的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑通過(guò)以下步驟制備：
[0042] 1、硫酸軟骨素寡糖的制備
[0043] (1)以金槍魚(yú)骨、魷魚(yú)喉骨為原料，將該原料煮沸l(wèi)h，然后剔除殘留的肌肉、脂肪和 其他結(jié)締組織，用高速組織搗碎機(jī)勻漿，得勻漿液；
[0044] (2)按照體積比1:1在上述勻漿液中加入丙酮，150rpm攪拌脫脂2h，靜置，棄去丙酮 層，得脫脂固形物；
[0045 ] (3)按固液比1:1 g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mo 1 /L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 5.0, 攪拌均勻，得混合物；
[0046] (4)將上述混合物升溫至50°C，加入菠蘿蛋白酶，加酶量為1000U/g，酶解時(shí)間為 6h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第一次酶解液；
[0047] (5)調(diào)節(jié)上述第一次酶解液的pH為8.0，加入堿性蛋白酶，加酶量為1500U/g，酶解 溫度為50°C，攪拌酶解3h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第二次酶解液；
[0048] (6)將上述第二次酶解液4000rpm離心10min，取上清液；
[0049] (7)在上述上清液中加入體積分?jǐn)?shù)60 %的乙醇，pH6.0條件下，沉淀獲得硫酸軟骨 素；
[0050] (8)按料液比1: 20g/mL向上述硫酸軟骨素中加入濃度0.4mo 1/L鹽酸溶液，65°C水 浴攪拌酸解24h;冷卻至室溫，加入氫氧化鈉中和，冷凍干燥，得硫酸軟骨素寡糖。
[00511 2、抗氧化肽的制備
[0052] (1)取洗凈后的金槍魚(yú)、魷魚(yú)加工副產(chǎn)物（魚(yú)皮、碎肉以及魚(yú)頭），用高速組織搗碎 機(jī)勻漿，得勻漿液，備用；
[0053] (2)按照料液比1: 9g/mL向上述勻漿液中加入異丙醇，于40 °C下攪拌脫脂24h，然后 5000rpm離心15min，棄去上清，收集脫脂固形物沉淀；
[OOM] (3)按固液比l:3g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 5.0, 攪拌均勻，得混合物；
[0055] (4)上述混合物攪拌升溫至60°C，加入風(fēng)味蛋白酶，加酶量為1000U/g，60°C酶解 3h，得到酶解產(chǎn)物;將上述酶解產(chǎn)物升溫至75 °C以上，并保持10~15min，滅酶，冷卻至室溫， 于5000rpm離心10min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；
[0056] (5)將上述酶解物干粉溶于pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液，配成20mg/mL的溶液，于 0.1~0.15MPa的工作壓力和20~25°C的溫度下，分別采用截留分子量7kDa、5kDa、3kDa和 lkDa的超濾膜對(duì)所得酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾處理，收集各組分，通過(guò)測(cè)定各組分對(duì)DPPH自由基 的清除能力，確定各組分的抗氧化能力，收集抗氧化能力最強(qiáng)的組分并制得干粉;本實(shí)施例 中，分子量小于lkDa的肽類(lèi)組分抗氧化能力最強(qiáng)；
[0057] (6)將上述分子量小于lkDa的超濾酶解物干粉用pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配 成20mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗 脫，根據(jù)220nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠過(guò) 濾酶解抗氧化肽，凍干得抗氧化肽。
[0058] 3、姜黃提取物的制備
[0059] (1)姜黃塊根粉碎后過(guò)50目篩，制得姜黃粉；
[0060] (2)將上述姜黃粉與60%乙醇以質(zhì)量體積比1:5混合均勻，lOOrpm旋轉(zhuǎn)提取2小時(shí)， 3000rpm離心1 Omin，重復(fù)提取3次，取清液，得姜黃提取液，將該姜黃提取液濃縮20倍，得姜 黃提取濃縮液；
[0061 ] (4)按照藥液輔料比1:4，向上述濃縮液中加入糊精或玉米淀粉，混合均勻；
[0062] (5) 65 °C烘干12小時(shí)，得干燥產(chǎn)物；
[0063] (6)上述干燥產(chǎn)物粉碎，過(guò)100目篩，得姜黃提取物干粉制劑。
[0064] 4、取16份上述制備的硫酸軟骨素寡糖、40份上述制備的抗氧化肽、44份上述姜黃 提取物，混合均勻，加入300份除菌水，得所需的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑。
[0065] 實(shí)施例2:水產(chǎn)品天然生物保鮮劑的制備
[0066] 本實(shí)施例中的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑通過(guò)以下步驟制備：
[0067] 1、硫酸軟骨素寡糖的制備
[0068] (1)以金槍魚(yú)骨、魷魚(yú)喉骨為原料，將該原料煮沸l(wèi)h，然后剔除殘留的肌肉、脂肪和 其他結(jié)締組織，用高速組織搗碎機(jī)勻漿，得勻漿液；
[0069] (2)按照體積比1:2在上述勻漿液中加入丙酮，150rpm攪拌脫脂3h，靜置，棄去丙酮 層，得脫脂固形物；
[0070] (3)按固液比1: 2g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 6.0,攪拌均勻，得混合物；
[0071] (4)將上述混合物升溫至60 °C，加入菠蘿蛋白酶，加酶量為1500U/g，酶解時(shí)間為 8h，升溫至75 °C處理1 Omin滅酶，得第一次酶解液；
[0072] (5)調(diào)節(jié)上述第一次酶解液的pH為9.0，加入堿性蛋白酶，加酶量為2100U/g，酶解 溫度為55°C，攪拌酶解4h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第二次酶解液；
[0073] (6)將上述第二次酶解液5000rpm離心10min，取上清液；
[0074] (7)在上述上清液中加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，pH8.5條件下，沉淀獲得硫酸軟骨 素；
[0075] (8)按料液比1: 25g/mL向上述硫酸軟骨素中加入濃度為0.4mo 1/L鹽酸溶液，80°C 水浴攪拌酸解21h;冷卻至室溫，加入氫氧化鈉中和，冷凍干燥，得硫酸軟骨素寡糖。
[0076] 2、抗氧化肽的制備
[0077] (1)取洗凈后的金槍魚(yú)、魷魚(yú)加工副產(chǎn)物（魚(yú)皮、碎肉以及魚(yú)頭），用高速組織搗碎 機(jī)勻漿，得勻漿液，備用；
[0078] (2)按照料液比l:8g/mL向上述勻漿液中加入異丙醇，于35°C下攪拌脫脂48h，然后 8000rpm離心15min，棄去上清，收集脫脂固形物沉淀；
[0079 ] (3)按固液比1: 5g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mo 1 /L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 6.0，攪拌均勻，得混合物。
[0080] (4)上述混合物攪拌升溫至50°C，加入風(fēng)味蛋白酶，加酶量為1500U/g，50°C酶解 6h，得到酶解產(chǎn)物;將上述酶解產(chǎn)物升溫至75 °C以上，并保持10~15min，滅酶，冷卻至室溫， 于5000rpm離心10min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；
[0081 ] (5)將上述酶解物干粉溶于pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液，配成25mg/mL的溶液，于 0.1~0.15MPa的工作壓力和20~25°C的溫度下，分別采用截留分子量7kDa、5kDa、3kDa和 lkDa的超濾膜對(duì)所得酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾處理，收集各組分，通過(guò)測(cè)定各組分對(duì)DPPH自由基 的清除能力，確定各組分的抗氧化能力，收集抗氧化能力最強(qiáng)的組分并制得干粉;本實(shí)施例 中，分子量小于lkDa的肽類(lèi)組分抗氧化能力最強(qiáng)；
[0082] (6)將上述分子量小于lkDa的超濾酶解物干粉用pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配 成25mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗 脫，根據(jù)220nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠 過(guò)濾酶解抗氧化肽，凍干得抗氧化肽。
[0083] 3、姜黃提取物的制備
[0084] (1)姜黃塊根粉碎后過(guò)40目篩，制得姜黃粉；
[0085] (2)將上述姜黃粉與60~85%乙醇以質(zhì)量體積比1:10混合均勻，200rpm旋轉(zhuǎn)提取2 小時(shí)，過(guò)濾，重復(fù)提取3次，取清液，得姜黃提取液，將該姜黃提取液濃縮20~25倍，得姜黃提 取濃縮液；
[0086] (4)按照藥液輔料比1:6，向上述濃縮液中加入糊精或玉米淀粉，混合均勻；
[0087] (5) 80 °C烘干10小時(shí)，得干燥產(chǎn)物；
[0088] (6)上述干燥產(chǎn)物粉碎，過(guò)100目篩，得姜黃提取物干粉制劑。
[0089] 4、取18份上述制備的硫酸軟骨素寡糖、37份上述制備的抗氧化肽、43份上述姜黃 提取物，混合均勻，加入350份除菌水，攪拌均勻，得所需的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑。
[0090] 實(shí)施例3:水產(chǎn)品天然生物保鮮劑的制備
[0091] 本實(shí)施例中的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑通過(guò)以下步驟制備：
[0092] 1、硫酸軟骨素寡糖的制備
[0093] (1)以金槍魚(yú)骨、魷魚(yú)喉骨為原料，將該原料煮沸l(wèi)h，然后剔除殘留的肌肉、脂肪和 其他結(jié)締組織，用高速組織搗碎機(jī)勻漿，得勻漿液；
[0094] (2)按照體積比1:1在上述勻漿液中加入丙酮，150rpm攪拌脫脂2h，靜置，棄去丙酮 層，得脫脂固形物；
[0095] (3)按固液比l:3g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 7.0,攪拌均勻，得混合物；
[0096] (4)將上述混合物升溫至50°C，加入菠蘿蛋白酶，加酶量為2000U/g，酶解時(shí)間為 l〇h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第一次酶解液；
[0097] (5)調(diào)節(jié)上述第一次酶解液的pH為8 ? 0，加入堿性蛋白酶，加酶量為3000U/g，酶解 溫度為50°C，攪拌酶解6h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第二次酶解液；
[0098] (6)將上述第二次酶解液4000rpm離心10min，取上清液；
[0099] (7)在上述上清液中加入體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇，pH7.0條件下，沉淀獲得硫酸軟骨 素；
[0100] (8)按料液比l:23g/mL向上述硫酸軟骨素中加入上0.4mol/L鹽酸溶液，65~80°C 水浴攪拌酸解24h;冷卻至室溫，加入氫氧化鈉中和，冷凍干燥，得硫酸軟骨素寡糖。
[0101] 2、抗氧化肽的制備
[0102] (1)取洗凈后的金槍魚(yú)、魷魚(yú)加工副產(chǎn)物(魚(yú)皮、碎肉以及魚(yú)頭），用高速組織搗碎 機(jī)勻漿，得勻漿液，備用；
[0103] (2)按照料液比l:9g/mL向上述勻漿液中加入異丙醇，于40°C下攪拌脫脂36h，然后 7000rpm離心15min，棄去上清，收集脫脂固形物沉淀；
[0104] (3)按固液比1: 4g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 7.0,攪拌均勻，得混合物。
[0105] (4)上述混合物攪拌升溫至60°C，加入風(fēng)味蛋白酶，加酶量為2000U/g，55°C酶解 4.5h，得到酶解產(chǎn)物;將上述酶解產(chǎn)物升溫至75 °C以上，并保持10~15min，滅酶，冷卻至室 溫，于5000rpm離心10min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；
[0106] (5)將上述酶解物干粉溶于pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液，配成20~25mg/mL的溶 液，于0.1~〇.15MPa的工作壓力和20~25°C的溫度下，分別采用截留分子量7kDa、5kDa、 3kDa和lkDa的超濾膜對(duì)所得酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾處理，收集各組分，通過(guò)測(cè)定各組分對(duì)DPPH 自由基的清除能力，確定各組分的抗氧化能力，收集抗氧化能力最強(qiáng)的組分并制得干粉;本 實(shí)施例中，分子量小于lkDa的肽類(lèi)組分抗氧化能力最強(qiáng)；
[0107] (6)將上述分子量小于lkDa的超濾酶解物干粉用pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配 成25mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗 脫，根據(jù)220nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠 過(guò)濾酶解抗氧化肽，凍干得抗氧化肽。
[0108] 3、姜黃提取物的制備
[0109] (1)姜黃塊根粉碎后過(guò)50目篩，制得姜黃粉；
[0110] (2)將上述姜黃粉與60~85%乙醇以質(zhì)量體積比1:7混合均勻，150rpm旋轉(zhuǎn)提取2 小時(shí)，3000rpm離心10min，重復(fù)提取3次，取清液，得姜黃提取液，將該姜黃提取液濃縮20~ 25倍，得姜黃提取濃縮液；
[0111] (4)按照藥液輔料比1:8，向上述濃縮液中加入糊精或玉米淀粉，混合均勻；
[0112] (5) 70 °C烘干11小時(shí)，得干燥產(chǎn)物；
[0113] (6)上述干燥產(chǎn)物粉碎，過(guò)100目篩，得姜黃提取物干粉制劑。
[0114] 4、取20份上述制備的硫酸軟骨素寡糖、35份上述制備的抗氧化肽、45份上述姜黃 提取物，混合均勻，加入400份除菌水，攪拌均勻，得所需的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑。
[0115]實(shí)施例4:水產(chǎn)品天然生物保鮮劑的制備
[0116] 與實(shí)施例1不同的是，實(shí)施例4中，取24份上述制備的硫酸軟骨素寡糖、35份上述制 備的抗氧化肽、41份上述姜黃提取物，混合均勻，加入450份除菌水，攪拌均勻，得所需的水 產(chǎn)品天然生物保鮮劑。
[0117] 實(shí)施例5:對(duì)大黃魚(yú)的保鮮處理實(shí)驗(yàn)
[0118] 實(shí)驗(yàn)組:取實(shí)施例1~實(shí)施例4中制備的生物保鮮劑進(jìn)行大黃魚(yú)的保鮮處理:將新 鮮大黃魚(yú)去除內(nèi)臟，清洗干凈，瀝干后將該生物保鮮劑均勻噴灑于大黃魚(yú)體和魚(yú)肉表面，然 后包裝入袋。包裝入袋后，用氣調(diào)包裝機(jī)抽真空、充氣和熱封口進(jìn)行氣調(diào)包裝。將包裝好的 大黃魚(yú)進(jìn)行冷藏，冷藏溫度為1~4°C。
[0119] 對(duì)照組：與實(shí)驗(yàn)組不同的是，對(duì)照組采用市售的常規(guī)水產(chǎn)品保鮮劑對(duì)大黃魚(yú)進(jìn)行 處理，其他處理方式與實(shí)驗(yàn)組相同。處理60天后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組中的大黃魚(yú)進(jìn)行檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。
[0120] (1)感官評(píng)價(jià)效果檢驗(yàn)
[0121]表1魚(yú)肉感官評(píng)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0123]表2大黃魚(yú)感官評(píng)定結(jié)果
[0125] 由表2可知，本發(fā)明的水產(chǎn)品生物保鮮劑能夠顯著提高大黃魚(yú)的保鮮效果，保證了 大黃魚(yú)的氣味、色澤和質(zhì)地，延長(zhǎng)保鮮期。
[0126] (2)菌落總數(shù)的測(cè)定
[0127] 測(cè)定方法參考GB/T4789.2-2010操作，無(wú)菌條件下取25g大黃魚(yú)魚(yú)肉，放于225ml含 玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻，制成1:10的稀釋液，根據(jù)樣品腐敗程度，選擇合適稀 釋度，每個(gè)稀釋度做三次平行，采用倒平板法測(cè)定菌落總數(shù)，4個(gè)實(shí)施例的菌落總數(shù)測(cè)定結(jié) 果分別為8.67 X 104CFU/g、1.19 X 105CFU/g、9.45 X 104CFU/g，對(duì)照組的平均測(cè)定結(jié)果為 3.17X105CFU/g。可見(jiàn)，本發(fā)明中的水產(chǎn)品生物保鮮劑具有良好的抗菌性，能夠顯著抑制大 黃魚(yú)保鮮過(guò)程中細(xì)菌的增殖。
[0128] (3)揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定
[0129] 將魚(yú)去鱗、去皮沿背脊取肌肉部分，組織搗碎機(jī)搗碎，按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.44-2003，測(cè)定肉中TVB-N的含量，結(jié)果參見(jiàn)表3。
[0130]表3生物保鮮劑對(duì)大黃魚(yú)揮發(fā)性鹽基氮含量的影響
[0132] 由表4可見(jiàn)，采用本發(fā)明的生物保鮮劑的實(shí)驗(yàn)組中（實(shí)施例1至實(shí)施例4)，揮發(fā)性鹽 基氮的含量均比對(duì)照組顯著下降，表明本發(fā)明中的生物保鮮劑能夠顯著延長(zhǎng)大黃魚(yú)的保鮮 期。
[0133] 實(shí)施例6:對(duì)南美白對(duì)蝦的保鮮處理實(shí)驗(yàn)
[0134] 實(shí)驗(yàn)組:取實(shí)施例1~實(shí)施例4中制備的生物保鮮劑進(jìn)行南美白對(duì)蝦的保鮮處理： 將鮮活南美白對(duì)蝦放入冰水中猝死，接著將對(duì)蝦浸泡在配制好的20 %保鮮劑中60min，瀝干 后用聚乙烯食品袋包裝密封后置于4°C冰箱中。
[0135] 對(duì)照組：與實(shí)驗(yàn)組不同的是，對(duì)照組采用市售的常規(guī)水產(chǎn)品保鮮劑對(duì)南美白對(duì)蝦 進(jìn)行處理，其他處理方式與實(shí)驗(yàn)組相同。處理10天后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組中的南美白對(duì)蝦進(jìn) 行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果如表4、表5所示。
[0136] (1)菌落總數(shù)的測(cè)定
[0137] 參考GB/T4789.2-2010進(jìn)行操作，測(cè)定對(duì)蝦的菌落總數(shù)，結(jié)果如表4所述。
[0138] 表4保鮮劑對(duì)南美白對(duì)蝦菌落總數(shù)的影響(CFU/g)
[0140] (2)揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定
[0141] 對(duì)蝦去頭、去殼取肌肉切碎，按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.44-2003測(cè)定蝦肉中TVB-N的含 量。
[0142] 表5生物保鮮劑對(duì)南美白對(duì)蝦肉中揮發(fā)性鹽基氮含量的影響
[0144] 由表4和表5可見(jiàn)，本發(fā)明生物保鮮劑能夠顯著抑制南美白對(duì)蝦菌落總數(shù)的增長(zhǎng)， 同時(shí)也顯著抑制了蝦肉中揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生，具有顯著的保鮮效果。
[0145] 綜上可見(jiàn)，本發(fā)明中的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑保鮮效果較好，具有顯著的抗氧化 活性和抗菌性，可有效避免水產(chǎn)品脂肪、蛋白質(zhì)等不被氧化破壞，并保持水產(chǎn)品鮮亮的色 澤，能有效防止各種水產(chǎn)品常見(jiàn)菌在水產(chǎn)品中保藏過(guò)程中的滋生和繁殖，從而對(duì)水產(chǎn)品起 到有效的保鮮作用，顯著延長(zhǎng)水產(chǎn)品的保鮮期。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水產(chǎn)品天然生物保鮮劑，其特征在于，按重量份數(shù)計(jì)由以下成分組成:硫酸軟骨 素寡糖16~24份，抗氧化肽35~40份，姜黃提取物41~45份，除菌水300~450份。2. 如權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑，其特征在于，所述硫酸軟骨素寡糖以水 產(chǎn)品加工中產(chǎn)生的骨質(zhì)副產(chǎn)物為原料制得。3. -種如權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑的制備方法，其特征在于包括以下 步驟:分別制備上述硫酸軟骨素寡糖、抗氧化肽以及姜黃提取物，按上述質(zhì)量份數(shù)將硫酸軟 骨素寡糖、抗氧化肽以及姜黃提取物混合，加入除菌水，攪拌均勻得所需的水產(chǎn)品天然生物 保鮮劑。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述硫酸軟骨素寡糖通過(guò)以下步驟制 得： (1) 以金槍魚(yú)骨、魷魚(yú)喉骨為原料，煮沸后剔除殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織，搗碎 勻漿后得勻漿液； (2) 按照體積比1:1~2在上述勻漿液中加入丙酮，攪拌脫脂2~3h，靜置，棄去丙酮層， 得脫脂固形物； (3) 按固液比1:1~3g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mo 1 /L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 5.0~7.0，攪拌均勻，得混合物； (4) 將上述混合物升溫至50~60°C，加入菠蘿蛋白酶，加酶量為1000~2000U/g，酶解時(shí) 間為6~10h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第一次酶解液； (5) 調(diào)節(jié)上述第一次酶解液的pH為8.0~9.0，加入堿性蛋白酶，加酶量為1500~3000U/ g，酶解溫度為50~55°C，攪拌酶解3~6h，升溫至75°C處理10分鐘滅酶，得第二次酶解液； (6) 將上述第二次酶解液4000~5000rpm離心10min，取上清液； (7) 在上述上清液中加入體積分?jǐn)?shù)60~90%的乙醇，pH6.0~8.5條件下，沉淀獲得硫酸 軟骨素； (8) 按料液比1:20~25g/mL向上述硫酸軟骨素中加入上0.4mol/L鹽酸溶液，65~80°C 水浴攪拌酸解18~24h;冷卻至室溫，加入氫氧化鈉中和，冷凍干燥，得硫酸軟骨素寡糖。5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述抗氧化肽通過(guò)以下步驟制得： (1) 取洗凈后的金槍魚(yú)、魷魚(yú)加工副產(chǎn)物，組織搗碎勻漿后的勻漿液，備用； (2) 按照料液比1:6~9g/mL向上述勾衆(zhòng)液中加入異丙醇，于35~40 °C下攪拌脫脂24~ 48h，然后5000~8000rpm離心15min，棄去上清，收集脫脂固形物沉淀； (3) 按固液比1: 3~5g/mL向上述脫脂固形物中加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH為 5.0~7.0，攪拌均勻，得混合物。 (4) 上述混合物攪拌升溫至50~60°C，加入風(fēng)味蛋白酶，加酶量為1000~2000U/g，50~ 60 °C酶解3~6h，得到酶解產(chǎn)物;將上述酶解產(chǎn)物升溫至75 °C以上，并保持10~15min，滅酶， 冷卻至室溫，于5000rpm離心10min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉； (5) 將上述酶解物干粉溶于pH 6 · 5~7 · 5的磷酸鹽緩沖液，配成20~25mg/mL的溶液，于 0.1~0.15MPa的工作壓力和20~25°C的溫度下，分別采用截留分子量7kDa、5kDa、3kDa和 lkDa的超濾膜對(duì)所得酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾處理，收集各組分，通過(guò)測(cè)定各組分對(duì)DPPH自由基 的清除能力，確定各組分的抗氧化能力，收集抗氧化能力最強(qiáng)的組分并制得干粉； (6) 將上述抗氧化能力最強(qiáng)的組分用pH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配成20~25mg/mL的 溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220nm 下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠過(guò)濾酶解抗氧化 肽，凍干得抗氧化肽。6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述姜黃提取物通過(guò)以下步驟制得： (1) 姜黃塊根粉碎后過(guò)50目篩，制得姜黃粉； (2) 將上述姜黃粉與60~85%乙醇以質(zhì)量體積比1:5~10混合均勻，旋轉(zhuǎn)提取2小時(shí)，離 心或者過(guò)濾，取清液，得姜黃提取液，將該姜黃提取液濃縮20~25倍，得姜黃提取濃縮液； (4) 按照藥液輔料比1:4~8,向上述濃縮液中加入糊精或玉米淀粉，混合均勻； (5) 65~80 °C烘干10~12小時(shí)，得干燥產(chǎn)物； (6) 上述干燥產(chǎn)物粉碎，過(guò)100目篩，得姜黃提取物干粉制劑。7. -種如權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)品天然生物保鮮劑在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用，其特征在 于，新鮮水產(chǎn)品預(yù)處理后噴灑或浸泡于上述保鮮劑中，密封包裝后置于1~4°C保藏。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水產(chǎn)品為魚(yú)類(lèi)，應(yīng)用上述保鮮劑對(duì)魚(yú) 類(lèi)進(jìn)行處理時(shí)包括以下步驟:新鮮魚(yú)類(lèi)去除內(nèi)臟，洗凈瀝干，將上述保鮮劑均勻地噴灑于魚(yú) 體表面，接著將其進(jìn)行真空氣調(diào)包裝，最后將包裝后的魚(yú)類(lèi)冷藏，冷藏溫度為1~4°C。9. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水產(chǎn)品為蝦類(lèi)，應(yīng)用上述保鮮劑對(duì)蝦 類(lèi)進(jìn)行處理時(shí)包括以下步驟:將鮮活蝦類(lèi)用冰水猝死，接著將其浸泡于濃度為20~30%的 保鮮劑溶液中50~60min，將蝦類(lèi)從保鮮劑溶液中撈出瀝干，密封保藏后置于4°C保藏。
【文檔編號(hào)】A23L3/3562GK105851200SQ201610256480
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】王進(jìn)波, 齊莉莉, 梅樂(lè)和, 胡升, 喻鵬飛
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院