專利名稱：嵌合的免疫原性組合物及其編碼核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及免疫學(xué)和藥物。本發(fā)明提供了使用嵌合分子，包括熱激蛋白(HSP)，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic translocationdomain)(ETA dII)，和抗原性多肽，例如與腫瘤相關(guān)的抗原或者病原體衍生的抗原以便增強抗原-特異性免疫應(yīng)答，例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的組合物和方法。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及DNA疫苗。
背景抗原特異性免疫治療最近成為控制癌癥的一個途徑，因為它能夠產(chǎn)生抗致瘤細(xì)胞的特異免疫性而不攻擊正常細(xì)胞。DNA接種不同于傳統(tǒng)接種之處在于編碼抗原的DNA(不是抗原本身)被注射給受治者?？乖漠a(chǎn)生，即疫苗中DNA編碼的抗原的表達(dá)，在接種的個體的體內(nèi)發(fā)生。但是，傳統(tǒng)的DNA疫苗具有局限性。例如，大多數(shù)DNA疫苗的主要缺點是它們的效價。
概述本發(fā)明提供編碼一種嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。該嵌合核酸的融合蛋白產(chǎn)物也可以具有幾個結(jié)構(gòu)域，包括HSP結(jié)構(gòu)域的羧基末端片段，F(xiàn)L結(jié)構(gòu)域，ETA dII結(jié)構(gòu)域，或者GM-CSF結(jié)構(gòu)域以任何順序的任何組合。也可以加上其它結(jié)構(gòu)域，例如為了有助于純化所述融合蛋白或者原位鑒定所述多肽等等的結(jié)構(gòu)域。在可供選擇的實施方案中，編碼第一多肽結(jié)構(gòu)域的核酸是5′端連接編碼第二多肽結(jié)構(gòu)域的核酸，和，編碼第二多肽結(jié)構(gòu)域的核酸是5′端連接編碼第一多肽結(jié)構(gòu)域的核酸。因此，這種嵌合核酸的融合蛋白產(chǎn)物可以具有或者氨基末端或者羧基末端與第一多肽結(jié)構(gòu)域連接的抗原性多肽；各個結(jié)構(gòu)域的任何順序都是可接受的，即使所述嵌合核酸編碼兩個以上的結(jié)構(gòu)域。
在一個實施方案中，熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段具有陪伴蛋白活性，例如肽陪伴蛋白活性。熱激蛋白(HSP)(或者其核酸編碼序列)可以來自任何生物體，包括，例如，人或細(xì)菌HSP。HSP可以包括熱激蛋白70(HSP 70)，例如來自分枝桿菌屬，例如人結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的HSP70。所述熱激蛋白(HSP)可以包括SEQ ID NO9的殘基312-625所示的序列，或者SEQ ID NO9的大約殘基517至大約殘基625給出的序列，或者其功能等價物。
在可供選擇的實施方案中，F(xiàn)lt-3配體多肽(或者其核酸編碼序列)來自任何生物體，包括，例如，人或細(xì)菌。Flt-3配體多肽可以包括SEQ ID NO25的大約殘基1至大約殘基189給出的序列。
在可供選擇的實施方案中，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(或者其核酸編碼序列)來自任何生物體，包括，例如，人或細(xì)菌。胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域可以來自毒素，例如來自細(xì)菌，例如，假單孢桿菌屬的毒素，例如假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)，例如包括SEQ ID NO3的大約殘基247至大約殘基417給出的序列的ETA dII。假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域也可以包括SEQ ID NO3的大約殘基253至大約殘基364給出的序列。
在可供選擇的實施方案中，GM-CSF序列(或者其核酸編碼序列)來自任何生物體，包括，例如，人或細(xì)菌。所述GM-CSF序列可以是GM-CSF片段，例如含有二硫鍵的片段。GM-CSF片段可以包括SEQ ID NO1的大約殘基18至大約殘基22，或者大約殘基34至大約殘基41，或者大約殘基38至大約殘基48，或者大約殘基52至大約殘基61，或者大約殘基94至大約殘基115，或者大約殘基95至大約殘基111給出的序列。
在一個實施方案中，抗原性多肽包括I類MHC-結(jié)合肽表位。所述I類MHC-結(jié)合肽表位的長可以是大約8個氨基酸殘基至大約11個，或者大約15個，或者大約25個，或者大約50個氨基酸殘基之間。抗原性多肽可以來自任何病原體或微生物。在可供選擇的實施方案中，抗原性多肽來自病毒，例如人病毒，例如，人乳多空病毒。所述乳多空病毒可以是人乳頭瘤病毒(HPV)，例如人乳頭瘤病毒-16(HPV-16)。所述抗原性多肽可以包括人乳頭瘤病毒E6多肽或者人乳頭瘤病毒E7多肽。所述病毒也可以是慢病毒，例如人免疫缺陷型病毒(HIV)，例如HIV-1。
所述抗原性多肽來自其中的其它病原體包括瘧疾，牛病毒性腹瀉病毒，巨細(xì)胞病毒，腦炎病毒，肝炎病毒，單純皰疹病毒或者流感病毒，這些只是其中的幾種。
抗原性多肽也可以是腫瘤特異性或者與腫瘤相關(guān)的多肽。所述腫瘤特異性或者與腫瘤相關(guān)的多肽可以包括在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原。所述腫瘤特異性或者與腫瘤相關(guān)的多肽可以是突變體p53，MAGE-1或者M(jìn)AGE-3。
在一個實施方按中，所述核酸編碼進(jìn)一步包括包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic translocation polypeptide domain)的第三多肽結(jié)構(gòu)域的嵌合多肽。因此，本發(fā)明提供編碼一種嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)序列(或者其任何組合)的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域，和包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域的第三多肽結(jié)構(gòu)域。如上所述，這些結(jié)構(gòu)域可以以任何順序存在于嵌合核酸或者多肽中。
胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域可以來自任何來源，例如，人，細(xì)菌等等。胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域可以包括假單孢桿菌屬外毒素A(ETA)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。假單孢桿菌屬外毒素A(ETA)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域可以包括SEQ IDNO3的大約殘基253至大約殘基364給出的序列。胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域可以包括病原體毒素的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，所述毒素例如細(xì)菌毒素，例如，來自白喉(Diptheria)，梭狀芽孢桿菌屬，Botulinum，芽孢桿菌屬，耶爾森氏菌屬，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，或者百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)。編碼第三多肽結(jié)構(gòu)域的核酸位于編碼第一或者第二結(jié)構(gòu)域的核酸5′端，或者位于編碼第一或者第二結(jié)構(gòu)域的核酸之間，或者位于編碼第一或者第二結(jié)構(gòu)域的核酸的3′端。
所述核酸可以進(jìn)一步包括調(diào)控核酸序列，例如轉(zhuǎn)錄(例如啟動子或者增強子)或者翻譯調(diào)控序列。
本發(fā)明提供一種表達(dá)盒(例如質(zhì)粒，載體，病毒)，其包括本發(fā)明的嵌合核酸，包括例如編碼一種嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的第一多肽結(jié)構(gòu)域；和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。所述表達(dá)盒至少包括啟動子和編碼序列。所述啟動子可以是組成型的，可誘導(dǎo)型的，組織特異性的，等等。所述表達(dá)盒還可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的編碼序列。所述表達(dá)盒還可以包括自主復(fù)制RNA復(fù)制子，例如Sindbis病毒自主復(fù)制RNA載體，例如，自主復(fù)制RNA載體SINrep5。
本發(fā)明提供了包括編碼一種嵌合多肽的核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述嵌合多肽包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的第一多肽結(jié)構(gòu)域；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。該核酸還可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的編碼序列。
本發(fā)明提供了包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的第一多肽結(jié)構(gòu)域；和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域的嵌合多肽。所述融合蛋白可以是多個結(jié)構(gòu)域的，類似于本發(fā)明的嵌合核酸。所述融合蛋白也可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。第一多肽結(jié)構(gòu)域可以與第二多肽結(jié)構(gòu)域非共價連接?；蛘?，第一多肽結(jié)構(gòu)域可以與第二多肽結(jié)構(gòu)域共價連接，例如，它可以是重組蛋白。如果嵌合多肽是多個結(jié)構(gòu)域的，可以設(shè)計連接/融合蛋白的任何組合的方案。
本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有編碼一種嵌合多肽的核酸(本發(fā)明嵌合核酸)，包括編碼本發(fā)明的嵌合多肽的核酸的表達(dá)盒(例如質(zhì)粒，載體，病毒)，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域；和，藥學(xué)可接受的賦形劑。所述融合蛋白還可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。
所述藥物組合物可以包括任何劑型，例如，其可以用磷脂配制形成脂質(zhì)體。例如對于口服或者腸胃外施用或者彈道給藥等等是合適的。其可以是任何合適的劑量或劑型，例如，片劑，液體，吸入劑，用于注射/彈道輸送的顆粒劑等等。
本發(fā)明提供一種DNA疫苗，其包括編碼一種嵌合多肽的核酸，包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域；和，藥學(xué)可接受賦形劑。所述融合蛋白還可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明提供一種顆粒(particle)，其包括編碼一種嵌合多肽的核酸或者包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。所述融合蛋白還可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。所述顆粒可以包括任何適合顆粒轟擊的材料，例如金。
本發(fā)明提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用有效量的一種組合物，該組合物含有編碼一種嵌合多肽的核酸，包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域，或者包括所述核酸，載體，嵌合多肽或者其組合的DNA疫苗，其中施用有效量的組合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。融合蛋白還可以包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。該方法能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞應(yīng)答，例如主要地T細(xì)胞應(yīng)答，例如主要地細(xì)胞毒素T細(xì)胞應(yīng)答。在該方法中，編碼嵌合多肽的核酸或者載體可以作為裸DNA分子被施用。通過基因槍或者等價物可以施用本發(fā)明的核酸，例如裸DNA。或者，在該方法中，組合物可以作為脂質(zhì)體制劑被施用。該組合物可以皮內(nèi)，通過吸入劑，等等給藥。
本發(fā)明還提供對哺乳動物免疫接種抗病原體感染的方法，該方法包括施用有效量的一種藥物組合物，該組合物含有編碼一種嵌合多肽的核酸，包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和包括來自病原體的抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域，或者包括所述核酸，載體，嵌合多肽或者其組合的DNA疫苗，其中施用組合物誘導(dǎo)對病原體的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供對哺乳動物免疫接種疫苗抗腫瘤抗原的方法，該方法包括施用有效量的一種藥物組合物，該組合物含有編碼一種嵌合多肽的核酸，包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和，包括腫瘤抗原的第二多肽結(jié)構(gòu)域，或者包括所述核酸，載體，嵌合多肽或者其組合的DNA疫苗，其中施用該組合物誘導(dǎo)對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供一種組合物制備用于對哺乳動物接種抗一種抗原的藥物制劑的用途，其中所述藥物制劑包括編碼一種嵌合多肽的核酸，包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，一種嵌合多肽，或者其組合，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；和，包括腫瘤抗原的第二多肽結(jié)構(gòu)域，和藥學(xué)可接受載體。
下面的附圖和說明書給出本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳細(xì)描述。從這些說明和附圖以及從權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征，目的和優(yōu)點將清晰可見。
這里引述的所有的公開物，專利，專利申請，GenBank序列和ATCC保藏號在表達(dá)上為了所有的目的引作參考。


圖1A是說明ELISPOT分析的結(jié)果的直方圖。應(yīng)用ELISPOT分析測定IFN-γ產(chǎn)生E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體的數(shù)目。點數(shù)值是各個接種組一式三份試驗SE的平均值。用E7-HSP70 DNA接種的小鼠產(chǎn)生最高的IFN-γ+點數(shù)值。給出的數(shù)據(jù)代表E7-特異性點-形成細(xì)胞(減去沒有E7 CTL肽存在下檢測到的點數(shù)值)。
圖1B是給出流式細(xì)胞儀分析結(jié)果的圖表。來自接種小鼠的脾細(xì)胞體外與E7肽(殘基49-57；RAHYNIVTF；SEQ ID NO5)一起培養(yǎng)過夜，并且對CD8+和胞內(nèi)IFN-γ染色。通過標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀分析用各種重組DNA疫苗免疫的小鼠中IFN-γ分泌CD8+T細(xì)胞前體的數(shù)目。用E7-HSP70 DNA接種的小鼠產(chǎn)生最高的IFN-γ+CD8+雙陽性T細(xì)胞。右上角給出3×105個脾細(xì)胞中CD8+IFN-γ+雙陽性T細(xì)胞數(shù)目。圖1A-B中給出的數(shù)據(jù)表明用E7-HSP70 DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠內(nèi)E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體的頻率。通過基因槍用空白質(zhì)粒(pcDNA3)，HSP70DNA(HSP)，E7 DNA(E7)，E7-HSP70 DNA(E7/HSP)或者與HSP70 DNA混合的E7 DNA(E7+HSP)免疫C57BL/6小鼠，或者不接受接種。對于接種的小鼠，給予2μgDNA/小鼠兩次。在最后的DNA接種之后10天，收集脾細(xì)胞。
圖2是用各種重組DNA疫苗接種小鼠的IFN-γ分泌E7-特異性CD4+細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的圖表。如圖1A-1B所示免疫C57BL/6小鼠。來自接種的小鼠的脾細(xì)胞在體外與E7肽(殘基30-67；DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRL；SEQ ID NO6)一起培養(yǎng)過夜，并且對CD4和胞內(nèi)IFN-γ染色。通過流式細(xì)胞儀分析IFN-γ分泌CD4+T細(xì)胞的數(shù)目。用E7-HSP70 DNA接種的小鼠產(chǎn)生與用野生型E7 DNA接種的小鼠可比較的CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。右上角給出了3×105個脾細(xì)胞中CD4+IFN-γ+雙陽性T細(xì)胞的數(shù)目。
圖3是說明用各種重組DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠中E7-特異性抗體應(yīng)答的直方圖。通過基因槍用對照質(zhì)粒(沒有插入物)，野生型HSP70，野生型E7，或者E7-HSP70 DNA免疫C57BL/6小鼠。接種之后14天從免疫的小鼠獲得血清樣品。使用系列稀釋的血清通過ELISA檢測E7-特異性抗體的存在。給出了1∶80稀釋度的結(jié)果，表明在450nmSE下平均吸收度(O.D.)。
圖4A和4B是說明用E7-HSP70 DNA接種保護小鼠抗TC-1腫瘤生長的線性圖。通過基因槍用空白質(zhì)粒(pcDNA3)，HSP70 DNA(HSP)，E7DNA(E7)，或E7-HSP70 DNA(E7/HSP)免疫C57BL/6小鼠。最后一次接種之后一周，對每只小鼠在右腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞攻擊小鼠。通過一周兩次觸診和檢查對小鼠監(jiān)測腫瘤生長的證據(jù)。在TC-1攻擊之后第60天，對每只小鼠在左腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞再次攻擊沒有腫瘤的小鼠。為了產(chǎn)生圖4A所示的數(shù)據(jù)，每一只小鼠接受2微克DNA疫苗。一周之后，用和第一次接種同樣的類型和量的DNA對小鼠再次接種。為了產(chǎn)生圖4B所示的數(shù)據(jù)，每一只小鼠只接受一次2微克DNA疫苗注射，沒有進(jìn)一步加強。
圖5A和5B是說明用E7-HSP70 DNA接種消滅預(yù)先存在的TC-1腫瘤細(xì)胞的線性圖。最初用2×104TC-1細(xì)胞皮下攻擊各個小鼠，接著通過基因槍用空白質(zhì)粒(pcDNA3)，HSP70 DNA(HSP)，E7 DNA(E7)，或E7-HSP70 DNA(E7/HSP)進(jìn)行DNA接種。通過一周兩次觸診和檢查對小鼠監(jiān)測腫瘤生長的證據(jù)。為了產(chǎn)生圖5A所示的數(shù)據(jù)，每一只小鼠在腫瘤攻擊之后3天和10天接受2微克DNA疫苗。對于圖5B，每一只小鼠只在腫瘤攻擊之后3天接受2微克DNA疫苗。沒有進(jìn)一步加強免疫。
圖6是說明E7-HSP70 DNA產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性要求HSP70 DNA序列與E7基因序列融合的線性圖。通過基因槍用E7-HSP70 DNA(E7/HSP)，或者與HSP70 DNA混合的E7 DNA(E7+HSP)免疫C57BL/6，或者不接受接種。對于接種的小鼠，只是給于一次2微克DNA/小鼠。接種之后1星期，對每只小鼠在右腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞攻擊小鼠。通過一周兩次觸診和檢查對小鼠監(jiān)測腫瘤生長的證據(jù)。
圖7是說明淋巴細(xì)胞亞群耗竭狀態(tài)對E7-HSP70 DNA疫苗效價的影響的線性圖。通過基因槍用2微克E7-HSP70 DNA免疫C57BL/6小鼠并且一周之后，用2微克E7-HSP70 DNA加強。最后接種之后兩周，在右腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞/小鼠攻擊小鼠。在腫瘤攻擊之前一周開始細(xì)胞耗竭并且在腫瘤攻擊之后持續(xù)40天。MAb GK1.5用于CD4耗竭，MAb2.43用于CD8耗竭，以及MAb PK136用于NK1.1耗竭。流式細(xì)胞儀分析表明耗竭了95％以上的合適的淋巴細(xì)胞亞型，而其它亞型的水平正常。通過一周兩次觸診和檢查對小鼠監(jiān)測腫瘤生長的證據(jù)。
圖8是GM-ETA(dII)-E7，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CSF，ETA(dII)，E7的構(gòu)建體的示意圖。
圖9是說明進(jìn)行以測定用GM-ETA(DII)-E7 DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠中的E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體的胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的流式細(xì)胞儀分析的圖表。通過基因槍用帶有GM，ETA(dII)，E7，GM-ETA(dII)，ETA(DII)-E7，GM E7或GM-ETA(DII)-E7基因插入物的質(zhì)粒DNA或者“空白”質(zhì)粒載體皮內(nèi)免疫C57BL/6小鼠，或者不接受接種。對于接種過的小鼠，給于兩次2微克DNA/小鼠。最后一次DNA接種之后10天，收集脾細(xì)胞。來自接種小鼠的脾細(xì)胞在體外與E7肽(殘基49-57；SEQID NO5)培養(yǎng)過夜并且對于CD8和胞內(nèi)IFN-γ染色。通過流式細(xì)胞儀分析用各種重組的DNA疫苗免疫的小鼠中IFN-γ分泌CD8+T細(xì)胞前體的數(shù)目。用GM-ETA(DII)-E7 DNA接種的小鼠產(chǎn)生最高的IFN-γ+CD8+雙陽性T細(xì)胞。
圖10是說明用各種重組的DNA疫苗免疫的小鼠中IFN-γ分泌E7-特異性CD4+細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的圖表。和對上面圖2描述的一樣免疫C57BL/6小鼠。來自接種過的小鼠的脾細(xì)胞在體外與E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO6)培養(yǎng)過夜并且對于CD4和胞內(nèi)IFN-γ染色。通過流式細(xì)胞儀分析IFN-γ分泌CD4+T細(xì)胞的數(shù)目。當(dāng)與用GM-E7 DNA接種的小鼠相比時，用GM-ETA(DII)-E7 DNA接種的小鼠產(chǎn)生可比較的CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。與用空白質(zhì)粒(pcDNA3)，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CS F，ETA(dII)，或E7 DNA免疫的小鼠相比，用GM-ETA(dII)-E7接種的小鼠產(chǎn)生更大數(shù)目的E7-特異性CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。
圖11是說明用GM-ETA(DII)-E7 DNA接種保護小鼠抗TC-1腫瘤生長的線性圖。通過基因槍用2微克/小鼠的空白質(zhì)粒(pcDNA3)，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CSF，ETA(dII)，E7 DNA，或GM-ETA(dII)-E7 DNA免疫C57BL/6小鼠。一周之后，用和第一次接種一樣的相同類型和量的DNA再次對小鼠接種。最后接種之后一周，對每只小鼠在右腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞攻擊小鼠。通過一周兩次觸診和檢查對小鼠監(jiān)測腫瘤生長的證據(jù)。在TC-1攻擊之后第60天，對沒有腫瘤的小鼠在左腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞/小鼠再次攻擊。
圖12是說明淋巴細(xì)胞亞群耗竭狀態(tài)對GM-ETAdII-E7 DNA疫苗效價的影響的線性圖。通過基因槍用2微克GM-ETAdII-E7 DNA免疫C57BL/6小鼠并且一周之后，用2微克GM-ETAdII-E7 DNA加強。最后一次接種之后兩周，在右腿皮下用5×104TC-1細(xì)胞/小鼠攻擊小鼠。在腫瘤攻擊之前一周開始細(xì)胞耗竭并且在腫瘤攻擊之后持續(xù)指定數(shù)量的天數(shù)。MAb GK1.5(Dialynas等，1983，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.) 1312445-2451)用于CD4耗竭，MAb 2.43(Sarmiento等，1980，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1252665-2672)用于CD8耗竭，以及MAb PK136(Koo等，1986，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1373742-3747)用于NK1.1耗竭。流式細(xì)胞儀分析表明耗竭了95％以上的合適的淋巴細(xì)胞亞型，而其它亞型的水平正常。通過一周兩次觸診和檢查對小鼠監(jiān)測腫瘤生長的證據(jù)。
圖13是E7 HSP70免疫原構(gòu)建體的氨基酸和核苷酸序列的圖。
圖14是GM ETA(dII)-E7免疫原構(gòu)建體的氨基酸和核苷酸序列的圖。該構(gòu)建體的GM-CSF部分，ETA(dII)，和E7部分用括號表示。
圖15是ETA(沒有信號序列)的氨基酸和核苷酸序列的圖。括號中是構(gòu)建免疫原構(gòu)建體中使用的殘基247-417(和相應(yīng)的核苷酸序列)。
圖16是說明全長結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)HSP70蛋白質(zhì)(SEQ ID NO9)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的圖。ATP酶結(jié)構(gòu)域(殘基1-356)用下劃線表示；底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SD；殘基357-516)用斜體字表示，而C一末端結(jié)構(gòu)域(CD；殘基517-625)用粗體字表示。
圖17是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中質(zhì)粒構(gòu)建體的示意圖。將所有的嵌合E7/熱激蛋白構(gòu)建體(E7-HSP70，E7-ATP. E7-SD，E7-CD，和E7)克隆到巨細(xì)胞病毒啟動子下游的表達(dá)載體的多個克隆位點。
圖18A是用包含編碼Hsp片段一抗原嵌合體(E7-HSP70，E7-ATP，E7-SD，E7-CD，和E7)的核酸構(gòu)建體的重組DNA疫苗免疫的小鼠中的IFN-γE7-特異性CD8+細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的圖。圖18B是說明IFN-γ產(chǎn)生E7-特異性CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)的直方圖。
圖19是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中質(zhì)粒構(gòu)建體的示意圖。
圖20A是SINrep5，SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70DNA構(gòu)建體的示意圖。圖20B是用和下面實施例6詳述中描述一樣的SP6 RNA聚合酶從這些DNA構(gòu)建體衍生的RNA轉(zhuǎn)錄物的示意圖。
各個附圖中類似參考標(biāo)記指示類似元件。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供編碼嵌合多肽的新的嵌合核酸，體外和體內(nèi)表達(dá)這些多肽的構(gòu)建體，分離的嵌合多肽，藥物組合物和制備和使用這些組合物的方法。這些組合物和方法特別用于刺激或者增強選擇的抗原的免疫原性，或者刺激或者增強對那種抗原的特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的核酸包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)序列的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的一個實施方案以這樣的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即在包括編碼熱激蛋白的羧基末端片段，例如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)熱激蛋白70(HSP70)(參見，例如，SEQ ID NO9)，或者Flt-3配體(參見，例如，SEQ ID NO25)，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)(SEQ ID NO1)，或者胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(參見，例如，假單胞桿菌ETA dIISEQ ID NO3)的第一結(jié)構(gòu)域；和編碼一種抗原，例如來自病原體或者腫瘤的抗原肽的第二結(jié)構(gòu)域的嵌合核酸DNA的存在下，增強嵌合核酸編碼的靶抗原，例如DNA疫苗的免疫原性。因此，本發(fā)明提供明顯增強DNA疫苗的效價，并且因此提高臨床功效的接種的組合物和方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合核酸編碼免疫原性組分(immunogenic composition)，所述免疫原性成分含有一種嵌合多肽，所述嵌合多肽包括包括熱激蛋白(HSP)，例如HSP70，的羧基末端結(jié)構(gòu)域(CD)片段的第一結(jié)構(gòu)域(由第一結(jié)構(gòu)域DNA編碼的)，和包括一種抗原，例如I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-限制的抗原，例如I類MHC-結(jié)合的表位的第二結(jié)構(gòu)域(由第二結(jié)構(gòu)域DNA編碼的)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)的羧基末端片段是長度至少10個氨基酸并且從天然存在的蛋白質(zhì)的羧基末端那一半衍生的多肽和肽。例如，HSP70的羧基末端片段是一種肽，其從HSP70的部分衍生的氨基酸序列跨越SEQ ID NO9的大約殘基312至大約殘基625；跨越那些殘基的編碼區(qū)的DNA編碼該肽。所述羧基末端結(jié)構(gòu)域(CD)片段也可以是具有SEQ ID NO9的大約殘基517至大約殘基625的氨基酸序列的肽。
例如，所述免疫原性組分可以含有一種嵌合多肽，所述嵌合多肽包括包括編碼包含SEQ ID NO9的殘基517至625的氨基酸序列的多肽的DNA的第一結(jié)構(gòu)域和(可操作地連接于)包含編碼I類MHC限制性的抗原的第二DNA的第二結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明包括乳頭瘤病毒E7-HSP70-CD融合多肽以及編碼該融合多肽的嵌合核酸(DNA)。任選地，所述組合物包括編碼一種多肽的DNA，所述多肽包含從HSP70的氨基末端片段衍生的殘基，例如SEQ ID NO9的殘基161-370。DNA成分，例如第一和第二(和任選地，第三)DNA可操作地連接的順序(即重組蛋白質(zhì)上結(jié)構(gòu)域的排列)可以改變而不影響免疫原性。例如，HSP-編碼(或者Flt-3配體-或者胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域-編碼)DNA序列位于靶抗原編碼序列的5′和3′端。在一個實施方案中，這些多肽-編碼核酸結(jié)構(gòu)域符合讀框(即，DNA是可操作地連接的)使得該DNA構(gòu)建體編碼重組多肽，其中抗原(例如，I類MHC限制性抗原)位于HSP-和Flt-3配體-和胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域-衍生的殘基的氨基末端。
如下面所討論的，抗原(例如I類MHC限制性抗原)可以從象病毒這樣的病原體產(chǎn)生，或者從癌組織，例如，腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)的多肽衍生。本發(fā)明的DNA疫苗可以包括表達(dá)盒，例如，包括編碼HSP羧基末端片段或者Flt-3配體或者胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的第一DNA和(可操作地連接于)編碼一種抗原(例如I類MHC限制性抗原)的第二DNA的表達(dá)或質(zhì)粒載體。本發(fā)明的治療方法包括通過對哺乳動物施用這里描述的免疫原組分誘導(dǎo)哺乳動物對一種抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的方法。
在另一個可供選擇的實施方案中，本發(fā)明的嵌合核酸或免疫原組分含有下面的成分(a)包括編碼與專門的(professional)抗原呈遞細(xì)胞(APC)結(jié)合的多肽，或者HSP的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體，或者假單孢桿菌屬外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的序列的第一DNA；(b)包括編碼胞質(zhì)轉(zhuǎn)運體(translocator)肽(例如包括ETA dII)的序列的第二DNA，和(c)包括編碼一種抗原，例如一種I類MHC限制性抗原的序列的第三DNA。所述第一，第二，和第三DNA可以可操作地連接。所謂＂可操作地連接＂指編碼一種多肽的DNA序列符合讀框地與編碼另一種多肽的另一種DNA連接產(chǎn)生重組的嵌合的，或者“融合，”蛋白質(zhì)?？刹僮鞯剡B接的DNA信息的翻譯產(chǎn)生嵌合多肽或者融合基因產(chǎn)物。本發(fā)明包括這樣的嵌合核酸和多肽，其中各個結(jié)構(gòu)域以所有可能的組合連接，即第一，第二，和第三DNA可操作地連接的順序是無關(guān)緊要的。
構(gòu)建體(例如表達(dá)盒，載體等)還可以含有調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列。多肽編碼序列和調(diào)控序列以這樣一種方式連接，使得允許當(dāng)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活子蛋白)與調(diào)控序列結(jié)合時的基因表達(dá)。
在一個實施方案中，所述免疫原成分的第一核酸結(jié)構(gòu)域編碼HSP，例如結(jié)核分枝桿菌熱激蛋白70(HSP70)(SEQ ID NO9)的片段。給定蛋白質(zhì)的“片段”是長度比參照多肽短的多肽。例如，所述多肽長度至少9或10個氨基酸，但是少于成熟的參照蛋白或多肽的殘基的總數(shù)。例如，結(jié)核分枝桿菌HSP70的片段分子量小于70kDa。HSP70的片段具有與天然存在的HSP70的氨基酸序列至少50％等同的氨基酸序列。HSP70片段的長度小于625個氨基酸。該片段可以具有參照蛋白的生物活性。例如，在一個實施方案中，該片段能夠結(jié)合專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，例如樹狀細(xì)胞(DC)，或者該片段能夠介導(dǎo)嵌合多肽(由免疫原成分的DNA所編碼)轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。在一個實施方案中，第一DNA或者第二DNA(或者兩者)編碼熱激蛋白或ETA(dII)的片段例如(例如，SEQ ID NO3)。
(免疫原性成分的)DNA的第二結(jié)構(gòu)域(或者第三結(jié)構(gòu)域，如果也存在胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的話)能編碼抗原表位，例如I類MHC-限制性抗原。在一個實施方案中，所述抗原來自病毒，例如人乳多空病毒，例如，宮頸癌-相關(guān)的人乳頭瘤病毒(HPV)。所述病毒抗原可以是來自HPV-16的E6或E7抗原的全部或部分。本發(fā)明的嵌合核酸能夠表達(dá)的其它病毒抗原包括牛病毒性腹瀉病毒E2抗原；巨細(xì)胞病毒的ppUL83或pp89；腦炎病毒SLE的prM/E；乙肝病毒的HBV表面抗原或者HBV核心抗原；HIV-1抗原，例如gp160；單純皰疹病毒的ICP27，gD2，糖蛋白B，或者單純皰疹病毒糖蛋白B。備選地，所述抗原可以是癌癥(例如腫瘤—相關(guān)的)抗原，例如突變體p53；與黑素瘤細(xì)胞相關(guān)的MAGE-1或者M(jìn)AGE-3，例如在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的癌癥-相關(guān)抗原。其它抗原包括瘧疾肽(NANP)40，HIV-1 p24，或者流感核蛋白。
編碼嵌合多肽的第一結(jié)構(gòu)域的DNA可以包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者其片段。在一個實施方案中，編碼的蛋白是包含二硫鍵，例如跨越SEQ ID NO1的Cys 51和Cys93的二硫鍵的功能性GM-CSF片段。GM-CSF的其它生物活性片段是包括SEQ IDNO1的殘基18-22，34-41，38-48，52-61，94-115，95-111的多肽。
備選地，編碼第一多肽結(jié)構(gòu)域的DNA可以包括Flt3配體(FL)(例如參見SEQ ID NO25)，CTLA-4，4-1BB，CD40配體，或者TNF受體序列(或者其APC-結(jié)合片段)或者APC-結(jié)合多肽序列。
編碼第二多肽結(jié)構(gòu)域的DNA能編碼轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域序列，例如假單胞桿菌外毒素A(ETA)的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域序列，例如ETA的II結(jié)構(gòu)域(dII)(例如，跨越SEQ ID NO3的大約253至大約364殘基)。轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域是誘導(dǎo)與其連接的蛋白質(zhì)或多肽轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠的多肽。例如，第二DNA能編碼來自白喉，梭狀芽孢桿菌(Botulinum，例如tetanus)，炭疽芽孢桿菌(炭疽)，耶爾森氏菌，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(霍亂)，或者百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)毒素。本發(fā)明不受任何特定機理的限制，免疫原成分中編碼轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的DNA的存在能夠通過從內(nèi)體/溶酶體區(qū)室向細(xì)胞溶膠的抗原轉(zhuǎn)運而增強該成分編碼的抗原的I類MHC呈遞。優(yōu)選地，編碼該毒素的基因的毒性結(jié)構(gòu)域被突變或缺失。
所述免疫原成分不需要包含如上所述的第一，第二和第三DNA。在一個可供選擇的實施方案中，編碼第三結(jié)構(gòu)域(需要其免疫性的靶抗原)的DNA可操作地連接于編碼HSP的羧基末端片段(參見例如，SEQ IDNO9)，F(xiàn)lt-3配體(參見例如，SEQ ID NO25)，或者假單胞桿菌外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)(參見SEQ ID NO3)，或者APC結(jié)合多肽(沒有編碼轉(zhuǎn)運體多肽的DNA存在)的DNA；在另一個實施方案中，所述嵌合核酸進(jìn)一步編碼編碼轉(zhuǎn)運體(例如，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運體)多肽的DNA。例如，本發(fā)明的嵌合核酸能夠編碼包含E7-ETA，E7-HSP70，E7-GM-CSF，或E7-FL(即，E7-Flt-3配體)的融合多肽。本發(fā)明的免疫原成分可以含有與編碼對其尋求免疫性的抗原的DNA可操作地連接的SEQ ID NO25 (Flt-3配體)的大約1至大約189殘基的編碼DNA。
本發(fā)明的嵌合核酸還能編碼含有E7-HSP70融合多肽，GM-ETA(dII)-E7融合多肽，或者ETA(dII)-E7(即，沒有GM成分)的免疫原成分。
本發(fā)明還提供了一種DNA疫苗。所述DNA疫苗組合物能夠含有一種質(zhì)?；蛘咂渌磉_(dá)載體，其包括(a)編碼熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者，一種與專門的抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的多肽的第一DNA，和(b)編碼一種抗原，例如I類MHC限制性抗原的第二DNA。所述疫苗可以包括包括編碼胞質(zhì)轉(zhuǎn)運體多肽的DNA的第三結(jié)構(gòu)域。以這樣一種方式將多肽結(jié)構(gòu)域編碼序列(DNA)克隆到表達(dá)(例如質(zhì)粒)載體中，使得第一，第二，和，如果合適，第三DNA是＂符合讀框＂的(可操作地連接)。當(dāng)在轉(zhuǎn)化了表達(dá)(質(zhì)粒)載體的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯時，該載體指導(dǎo)產(chǎn)生包括上述結(jié)構(gòu)域(例如APC-結(jié)合部分，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運體部分，和I類限制性抗原的表位)的嵌合多肽。
在一個可供選擇的實施方案中，分離本發(fā)明的嵌合核酸(DNA)(多核苷酸)，表達(dá)盒，和本發(fā)明的多肽。所謂＂分離的＂指，例如，沒有在生物體自然存在的基因組中位于感興趣的基因序列的旁側(cè)的基因的核酸分子。因此，該術(shù)語包括，例如，插入到，例如，載體中的重組DNA；插入到自主復(fù)制的質(zhì)粒和病毒中的重組DNA；或者插入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA；或者獨立于其它序列的作為獨立的分子存在的DNA(例如通過PCR或者限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA或cDNA片段)。還包括是編碼另外的多肽序列雜合基因的一部分的重組DNA。該術(shù)語不包括基因組DNA的大節(jié)段，例如，象粘粒克隆中存在的那些，其包含旁側(cè)連接一個或多個在自然存在的基因組中在其旁側(cè)自然連接的其它基因的給定DNA序列。也參見這里對“分離的”定義。
核酸分子(或者多核苷酸)包括RNA和DNA，包括cDNA，基因組DNA，和合成的(例如化學(xué)合成的)DNA。單鏈情況下，所述核酸分子可以是有義鏈或反義鏈。因此，該術(shù)語包括，例如，插入到載體中的重組DNA；插入到自主復(fù)制的質(zhì)粒和病毒中的重組DNA；或者在除了其天然位點之外的位點插入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA；或者獨立于其它序列地作為單獨的分子存在的重組DNA(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的或者限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA或cDNA片段)。還包括是編碼另外的多肽序列的雜合基因的一部分的重組DNA。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的是編碼免疫原成分(嵌合多肽，或者“融合蛋白”)的嵌合核酸(DNA)，包括表達(dá)盒中的編碼序列，載體，本發(fā)明的DNA疫苗，包含具有給定的參考序列(例如結(jié)核分枝桿菌HSP70的羧基末端部分(SEQ ID NO9)，F(xiàn)lt-3配體(SEQ ID NO25)，GM-CSF(SEQ ID NO1)，假單胞桿菌的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域ETA dII(SEQ ID NO3))的核苷酸序列的鏈，或者具有足夠高的序列相同性以便具有生物學(xué)等價的活性的鏈，或者，以高嚴(yán)謹(jǐn)性與具有參照序列的DNA鏈雜交的鏈，或者其片段。例如，本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸包括與參照序列具有至少50％序列同一性，并且編碼具有指定的生物活性的多肽的DNA，例如，假單胞桿菌ETA dII的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。其它實例包括編碼免疫原性成分的第一結(jié)構(gòu)域的第一DNA編碼的多肽的生物活性能結(jié)合到APC，第二DNA結(jié)構(gòu)域編碼的肽的生物活性可以是胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，第三DNA編碼的肽的生物活性能結(jié)合到I類MHC分子。所述DNA可以具有與參照序列的至少大約75％同一性，大約85％同一性，大約90％同一性，大約95％同一性，或者大約99％同一性，或者100％同一性。
為了計算序列同一性，應(yīng)用Lasergene軟件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)進(jìn)行核苷酸和氨基酸比較。使用的MegAlign模塊是Clustal V方法(Higgins等，1989，CABIOS 5(2)151-153)。使用的參數(shù)是缺口補償10，缺口長度補償10。
備選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)的是編碼在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有參照序列(上文提到的)，或者其互補序列的DNA鏈雜交并且編碼具有特定的生物活性的多肽的免疫原成分的嵌合核酸(DNA)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行雜交，例如Ausubel等描述的方法(近代分子生物學(xué)方法(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley & Sons，1989)。＂高嚴(yán)謹(jǐn)性＂指特征在于高溫和低鹽濃度的核酸雜交和洗滌條件，即，洗滌條件是65℃，鹽濃度是大約0.1 × SSC。＂低＂至＂中等＂嚴(yán)謹(jǐn)性指特征在于低溫和高鹽濃度的DNA雜交和洗滌條件，即，洗滌條件是低于65℃，鹽濃度是至少1.0×SSC。例如，高嚴(yán)謹(jǐn)性條件可以包括在下面的條件下的雜交大約42℃，和大約50％甲酰胺；第一次洗滌在大約65℃，大約2× SSC，和1％SDS的條件下；接著的第二次洗滌是在大約65℃和大約0.1％× SSC的條件下。通過下面的雜交檢測適合檢測與參照基因或者序列有大約50％序列同一性的DNA序列的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件大約42℃，不存在甲酰胺；第一次洗滌是在大約42℃，大約6× SSC，和1％SDS的條件下；第二次洗滌是在大約50℃，大約6× SSC，和大約1％SDS的條件下。
本發(fā)明包括通過對哺乳動物施用如上所述的編碼免疫原成分的嵌合核酸，或者嵌合多肽對哺乳動物誘導(dǎo)對抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的方法。在一個實施方案中，所述成分以裸DNA施用。也可以在增強靶細(xì)胞對DNA或多肽的吸收的活性劑的存在下施用所述成分(例如DNA，多肽，載體等)，例如磷脂制劑，例如脂質(zhì)體。
該方法用于對哺乳動物接種抗病原體感染。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合多肽(和編碼它們的嵌合核酸)包括來自所述病原體，例如病毒和細(xì)菌的抗原。該方法還用于對哺乳動物預(yù)防癌癥的發(fā)生或者治療已經(jīng)存在的癌癥。利用公知方法，例如基因篩選來鑒定有發(fā)生某些類型癌癥的危險的哺乳動物。通過施用其中(例如第三)DNA的抗原結(jié)構(gòu)域編碼癌癥(腫瘤)-相關(guān)抗原，例如與宮頸癌相關(guān)的HPV E7的成分治療有發(fā)生癌癥危險或者患有癌癥的患者(該癥狀被＂緩解＂)。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，當(dāng)體內(nèi)直接導(dǎo)入哺乳動物時，誘導(dǎo)編碼的多肽在動物體內(nèi)表達(dá)，并且接著又誘導(dǎo)對編碼的多肽特異性的CD8+免疫應(yīng)答。所述多核苷酸可以是這樣的一種核酸，其包括基本調(diào)控元件(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件，例如啟動子)，使得在導(dǎo)入活的脊椎動物細(xì)胞時，該細(xì)胞能產(chǎn)生由所述多核苷酸編碼的翻譯產(chǎn)物。例如，所述多核苷酸可以是編碼熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者其組合或者片段的多脫氧核糖核酸。
編碼期望對其有免疫應(yīng)答的抗原性多肽的嵌合核酸(DNA)能夠與轉(zhuǎn)錄啟動子可操作地連接。在一些情況下，該多核苷酸編碼的抗原正常情況下在那種動物中不存在；其只在病理癥狀下的該動物中存在(例如，與病毒相關(guān)的異源蛋白質(zhì))。在另外的情況下，所述抗原可以是自身多肽，例如，腫瘤-相關(guān)抗原，其在疾病狀態(tài)下或者其它狀態(tài)下被錯誤調(diào)節(jié)。所述嵌合核酸(例如DNA疫苗)編碼的多肽是體內(nèi)合成的(即，動物自身組織產(chǎn)生的)；細(xì)胞能夠?qū)⒈磉_(dá)的嵌合蛋白加工處理并且由MHC分子表達(dá)，例如，I類MHC多肽。
包括編碼該抗原的嵌合核酸的多核苷酸可以連接成用于體內(nèi)施用的合適的構(gòu)建體，例如，對于多核苷酸接種特異性地優(yōu)化的表達(dá)載體。所述嵌合多肽-編碼序列與調(diào)控元件可操作地連接，例如轉(zhuǎn)錄啟動子，增強子，免疫原表位，編碼免疫增強或者免疫調(diào)控基因的另外的編碼序列(例如順反子)，其可以具有其自身的調(diào)控元件(例如，啟動子，轉(zhuǎn)錄中止子)；所述構(gòu)建體還可以包括復(fù)制的細(xì)菌起點和/或抗生素抗性基因。所述載體還可以包含表達(dá)多順反子的mRNA的內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(IRES)。轉(zhuǎn)錄啟動子包括例如T7或SP6啟動子這樣的強有效的RNA聚合酶啟動子。
這里描述的多核苷酸和DNA疫苗激發(fā)抗編碼的抗原的保護性免疫性。例如，注射編碼抗原E7的DNA表達(dá)載體導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡或者降低腫瘤細(xì)胞生長。接種之后產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞的抗原特異性CTLs。
很多優(yōu)點與本發(fā)明的嵌合核酸和表達(dá)系統(tǒng)的體內(nèi)施用接種策略有關(guān)。很多已知的DNA疫苗的缺點在于它們有限的效價。與標(biāo)準(zhǔn)DNA疫苗相反，本發(fā)明的嵌合核酸(多核苷酸)和接種方法產(chǎn)生有效的抗原特異性免疫治療。本發(fā)明的多核苷酸和DNA疫苗能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，這種應(yīng)答比常規(guī)DNA疫苗更有效至少大約2-倍，至少大約10-倍，至少大約20-倍，至少大約30-倍，或者至少大約40-倍，所述常規(guī)DNA疫苗是例如不包含本發(fā)明嵌合核酸的那些，例如編碼一種嵌合多肽的序列，所述嵌合多肽包括包括編碼熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列(或者APC-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域)的第一多肽結(jié)構(gòu)域；和包括抗原多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
通過本領(lǐng)域公知的方法測定疫苗效價，例如，如本文所述，通過測定接種之后誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞前體或者通過測定接種之后病原體(例如病毒)或者腫瘤的荷重的減少。盡管本發(fā)明不受任何特殊作用機理的限制，DNA疫苗中編碼的多肽可以具有進(jìn)入I類MHC途徑并且激發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的潛能。在一個實施方案中，具體設(shè)計本發(fā)明的嵌合核酸(例如DNA疫苗)，以便指導(dǎo)免疫原通過編碼胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域(＂胞質(zhì)轉(zhuǎn)運體結(jié)構(gòu)域＂)進(jìn)入I類MHC抗原-加工處理途徑。作為結(jié)果，優(yōu)化細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的激發(fā)作用。
DNA疫苗的其它優(yōu)點包括大規(guī)模生產(chǎn)的安全性和簡單性。本發(fā)明的疫苗對于馴養(yǎng)動物或畜牧業(yè)動物以及對于人是安全而有用的。例如，裸質(zhì)粒DNA是安全的，具有低免疫原性，并且能反復(fù)施用。DNA疫苗容易以高純度大規(guī)模制備并且相對于蛋白質(zhì)和其它生物聚合物來說是高度穩(wěn)定的。參見例如美國專利Nos.5,580,859；5,589,466；5,910,488。
要導(dǎo)入到疫苗賦形劑中的可表達(dá)DNA或者轉(zhuǎn)錄的RNA的量可以根據(jù)使用的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動子的強度而不同。例如，免疫應(yīng)答的強度取決于蛋白質(zhì)表達(dá)水平和表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性。一般情況下，直接對機體組織，例如肌肉或真皮組織直接施用大約1ng-5mg，100ng-2.5mg DNA之間的，或者大約1微克—大約750微克DNA之間的，或者大約10微克—大約300微克的DNA之間的有效劑量范圍。靜脈內(nèi)施用(IV)DNA的一種劑量是大約該DNA分子的106-1022個拷貝。皮下注射(SC)，皮內(nèi)導(dǎo)入，通過皮膚壓印，和施用的其它方式例如腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，或者吸入法送遞也是合適的。例如，可以通過“biolistics”例如使用“基因槍”施用DNA?？梢砸韵嗤姆绞郊訌娊臃N。參見，例如美國專利Nos6,004,287；5,753,477；5,179,022。
也可以配制DNA疫苗作為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的一部分使用公知方法送遞，例如公開在Pan等，1995，癌癥研究(Cancer Res.)55(21)4776-4779和Pan等，1995，天然藥物(Nature Med.)1(5)471-7中的那些。用多核苷酸免疫原接種之后，通過施用相應(yīng)的多肽免疫原也可以加強免疫應(yīng)答。
所述嵌合核酸，載體或者其它多核苷酸可以是裸的，即，不結(jié)合以任何蛋白質(zhì)，佐劑或者影響受者免疫系統(tǒng)的其它活性劑。在生理可接受溶液例如無菌鹽水或者無菌緩沖鹽水中施用裸的DNA。
備選地，所述DNA可以結(jié)合以脂質(zhì)體，例如卵磷脂脂質(zhì)體或者作為DNA-脂質(zhì)體混合物。也可以使用有助于細(xì)胞吸收DNA的試劑(即，有利于轉(zhuǎn)染的試劑)，例如也可以使用鈣離子。用多核苷酸包衣的微轟擊粒子也用作施用疫苗的工具，例如，金顆粒。小顆粒脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合氣溶膠化合物也可以用來送遞本發(fā)明的核酸，參見，例如，美國專利No.6090407。
免疫原成分的功能元件本發(fā)明的核酸包括能被表達(dá)產(chǎn)生具有兩個或三個或多個功能結(jié)構(gòu)域的嵌合基因產(chǎn)物的鄰接的核酸序列包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者APC-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽結(jié)構(gòu)域；和包括抗原性多肽(例如，I類MHC限制性表位)的第二多肽結(jié)構(gòu)域。所述嵌合核酸進(jìn)一步包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域-編碼序列。編碼的基因產(chǎn)物產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。這種應(yīng)答比施用嵌合基因產(chǎn)物更有效并且比施用一種DNA疫苗更有效，所述DNA疫苗編碼一種抗原(例如，I類MHC限制性表位)，所述抗原沒有熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者APC-結(jié)合部分；或者，如在一個實施方案中的，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運部分。
賦予抗原特異性免疫應(yīng)答增強的HSP70結(jié)構(gòu)域根據(jù)下文實施例5的詳細(xì)描述，測定結(jié)核分枝桿菌HSP70的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。鑒定了至少三個功能結(jié)構(gòu)域ATP酶結(jié)構(gòu)域(包含SEQ ID NO9的殘基1-356)，底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SD；包含SEQ ID NO9的殘基357-516)和羧基末端結(jié)構(gòu)域(CD；包含SEQ ID NO9的殘基517-625)(圖16)。測定了該HSP70的每一個結(jié)構(gòu)域?qū)β鉊NA疫苗效價的貢獻(xiàn)。編碼各結(jié)構(gòu)域的DNA符合讀框地連接，即，可操作地連接，于編碼乳頭瘤病毒抗原E7的DNA。測定了E7-特異性CD8 T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
結(jié)果表明當(dāng)插入DNA疫苗構(gòu)建體中時，編碼HSP70的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD)的DNA提高該DNA疫苗對該疫苗編碼的靶抗原產(chǎn)生免疫性的效價。此外，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)е铝税LHSP70的DNA構(gòu)建體中的抗原特異性I類MHC限制性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答增強的大部分。
定義除非另有說明，這里使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義。如這里使用的，除非另有說明，下面的術(shù)語具有對它們描述的意義。
這里使用的術(shù)語＂抗原＂或者＂免疫原＂指包括一種肽，多肽或蛋白質(zhì)的一種化合物或組合物，其當(dāng)以合適的量(“免疫有效量”)施用(或者通過施用核酸，例如DNA疫苗而體內(nèi)表達(dá))時，其是＂抗原性＂或＂免疫原性＂的，即，能激發(fā)，加強或增強細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答(其也可以是免疫抑制的，例如，在誘導(dǎo)抑制的情況下)，不管是單獨的還是組合的或者連接或者融合另一種物質(zhì)(其可以一次施用或者幾次間隔施用)都是如此。
這里使用的術(shù)語＂表達(dá)盒＂指一種核苷酸序列，其能夠影響結(jié)構(gòu)基因(即蛋白質(zhì)編碼序列)在與該序列相容的宿主中的表達(dá)。表達(dá)盒至少包括與多肽編碼序列可操作地連接的啟動子；和，任選地，有其它序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號。也可以使用影響表達(dá)需要的或有幫助的另外的因子，例如，增強子。這里使用的＂可操作地連接＂指在DNA序列的上游連結(jié)啟動子使得該啟動子介導(dǎo)DNA序列的轉(zhuǎn)錄。因此，表達(dá)盒也包括質(zhì)粒，表達(dá)載體，重組病毒，任何形式的重組＂裸DNA＂載體等。＂載體＂包括能夠感染，轉(zhuǎn)染，瞬時或永久轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的核酸。要認(rèn)識到載體可以是裸核酸，或者與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)復(fù)合的核酸。所述載體任選地包括病毒或細(xì)菌核酸和/或蛋白質(zhì)，和/或膜(例如細(xì)胞膜，病毒脂質(zhì)被膜等)。載體包括，但不限于復(fù)制子(例如RNA復(fù)制子(參見下面的實施例6)，噬菌體)，DNA片段可以與其連接并且變得可復(fù)制。因此，載體包括，但不限于RNA，自主復(fù)制的環(huán)狀或線形DNA或RNA(例如質(zhì)粒，病毒等等，參見例如美國專利No.5,217,879)，并且包括表達(dá)和非表達(dá)質(zhì)粒兩者。當(dāng)重組微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物被描述為宿有＂表達(dá)載體＂，這包括染色體外環(huán)狀和線形DNA或已經(jīng)插入到宿主染色體中的DNA。宿主細(xì)胞保持載體，該載體或者作為自主結(jié)構(gòu)在有絲分裂期間細(xì)胞可以穩(wěn)定復(fù)制載體，或者載體被插入宿主基因組中。
術(shù)語＂連接＂或＂化學(xué)連接＂指兩個部分的任何化學(xué)鍵合，例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，ER侶伴多肽與抗原多肽化學(xué)連接。這樣的化學(xué)連接包括重組或體內(nèi)產(chǎn)生的融合蛋白的肽鍵合。
術(shù)語＂嵌合蛋白＂或＂融合蛋白＂指包括至少一個與第二肽或肽結(jié)構(gòu)域結(jié)合的多肽或肽結(jié)構(gòu)域的成分。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼融合蛋白(嵌合多肽)的分離的或重組的核酸分子，所述融合蛋白(嵌合多肽)包括至少兩個結(jié)構(gòu)域，包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。附加的結(jié)構(gòu)域可以包括多肽，肽，多糖等等。＂融合＂可以是通過肽鍵，化學(xué)連接，電荷相互作用(例如靜電吸引，例如鹽橋，H-鍵等)等產(chǎn)生的結(jié)合。如果多肽是重組的，＂融合蛋白＂可以從普通的信使翻譯來。備選地，可以通過任何化學(xué)或靜電方法連接結(jié)構(gòu)域成分。本發(fā)明的嵌合分子還可以包括附加的序列，例如，接頭，表位標(biāo)記，酶裂解識別序列，信號序列，分泌信號等等。備選地，可以簡單地將肽和載體連接以有利于嵌合多肽的操作或鑒定/定位。
術(shù)語＂抗原性＂或＂免疫原＂或＂免疫原性成分＂指一種化合物或成分，其包括不管是單獨的還是組合的或者與另一種物質(zhì)連接或融合都是＂免疫原性的＂，即能夠激發(fā)，加強或增強細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的肽，多肽或蛋白質(zhì)。免疫原成分可以是至少5個氨基酸的肽，長度10個氨基酸的肽，長度15個氨基酸的片段，長度20個氨基酸或者更長的片段。所述免疫原可以包括＂載體＂多肽和半抗原，例如，與另一種成分融合或連接(化學(xué)法或者其它方法)的融合蛋白或載體多肽。所述免疫原可以在免疫載體中重組表達(dá)，所述免疫載體可以是包括與啟動子可操作地連接的免疫原編碼序列的簡單地裸的DNA，例如，簡單表達(dá)盒。免疫原包括抗原決定簇，或者表位，抗體與之結(jié)合，或者當(dāng)與MHC分子的肽結(jié)合位點結(jié)合時，T淋巴細(xì)胞受體(TCRs)與之結(jié)合；這些表位一般3-10個氨基酸長。
這里使用的術(shù)語＂分離的＂，當(dāng)指一種分子或成分時，例如，本發(fā)明的嵌合核酸或多肽，指與至少一種其它化合物例如蛋白質(zhì)，其它核酸(例如RNA)，或者體內(nèi)或者其天然存在狀態(tài)下與之聯(lián)合的其它污染物分開的分子或成分。因此，當(dāng)其與任何其它成分分離時，認(rèn)為該成分是分離的，所謂其它成分是其“天然”情況下與之結(jié)合的或者因為和在細(xì)胞提取物中一樣，體外或體內(nèi)產(chǎn)生而關(guān)聯(lián)的成分，例如細(xì)胞膜。但是，分離的成分也可以是基本上純的。分離的成分可以是均一的并且可以是無水或有水溶液。例如，應(yīng)用分析化學(xué)技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或者高效液相色譜(HPLC)能測定純度和同質(zhì)性。因此，本發(fā)明的分離的成分不含有與它們的原位環(huán)境正常地相關(guān)的物質(zhì)。即使在蛋白質(zhì)被分離為同質(zhì)或者優(yōu)勢泳帶，也有痕量的與期望的成分共-純化的污染物。
包括HPV-16 E7多肽的短語＂HPV多肽＂描述了本領(lǐng)域公知的多肽；例如，關(guān)于HPV-16 E7，參見，例如，GenBank登記號No.AF125673(1999年6月1日)描述了完整的HPV-16基因組和HPV-16 E7蛋白質(zhì)。
術(shù)語＂多肽＂，＂蛋白質(zhì)＂和＂肽＂包括本發(fā)明的成分，其也包括結(jié)構(gòu)和功能基本上相應(yīng)于從中衍生出變體的多肽的＂類似物＂，或者＂保守變體＂和＂模擬物＂或者＂模擬肽＂，包括，例如，熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列。
術(shù)語＂藥物組合物＂指適合受試者藥物應(yīng)用的組合物，例如，作為疫苗。本發(fā)明的藥物組合物是含有藥學(xué)有效量的包括例如核酸或者載體或者本發(fā)明的細(xì)胞的成分和藥學(xué)可接受載體的制劑。
術(shù)語＂啟動子＂是一系列指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。如這里所使用的，啟動子包括接近轉(zhuǎn)錄起始位點的必需的核酸序列，例如在II型聚合酶啟動子情況下，是TATA元件。啟動子也任選地包括位于轉(zhuǎn)錄起始位點遠(yuǎn)至幾千個堿基對的遠(yuǎn)側(cè)增強子或抑制子元件。＂組成型＂啟動子在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下是活性的。＂可誘導(dǎo)的＂啟動子在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下是活性的。＂組織特異性＂啟動子在生物體的某些組織類型中是活性的，但是在該相同生物體的其它類型組織中沒有活性。術(shù)語＂可操作地連接＂指核酸表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動子，或者轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的列陣)和其中表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)相應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄的第二核酸序列之間的功能連接。
術(shù)語＂重組＂指合成的或者以其它方式體外操作的多核苷酸(例如＂重組多核苷酸＂)，指使用細(xì)胞內(nèi)或者其它生物系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生基因產(chǎn)物的重組多核苷酸的方法，或者指重組多核苷酸編碼的多肽(＂重組蛋白＂)。例如，這里描述的重組核酸和多肽可以用來實施本發(fā)明方法。＂重組方法＂也包括將具有來自不同來源的不同編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)域或啟動子序列的核酸連接到用于表達(dá)例如在用來實施本發(fā)明的載體中的可誘導(dǎo)或組成型表達(dá)多肽編碼序列的表達(dá)盒或表達(dá)載體中。
術(shù)語＂自主復(fù)制RNA復(fù)制子＂指以RNA病毒，例如，甲病毒基因組RNA(例如，新培斯病毒，Semliki Forest病毒，等)為基礎(chǔ)的構(gòu)建體，其已經(jīng)被基因工程處理可以表達(dá)異源RNA和蛋白質(zhì)。這些重組載體是自主復(fù)制的(即，它們是＂復(fù)制子＂)并且能夠作為裸RNA或DNA導(dǎo)入細(xì)胞，這一點在下文中將詳細(xì)描述。在一個實施方案中，自主復(fù)制RNA復(fù)制子包括新培斯病毒自主復(fù)制RNA載體S1Nrep5，其詳細(xì)描述于美國專利No.5,217,879。
術(shù)語＂全身施用＂指以導(dǎo)致將組合物或藥物導(dǎo)入循環(huán)系統(tǒng)的方式施用組合物或藥物，例如本發(fā)明的DNA疫苗或者這里描述的嵌合核酸和多肽。術(shù)語＂區(qū)域施用＂指對特定的解剖學(xué)空間例如腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，硬膜下或者對具體器官施用組合物或藥物等。例如，區(qū)域施用包括將用于對肝部位給藥的組合物或藥物施加給肝動脈中。術(shù)語＂局部給藥＂指對局限的，有限的解剖學(xué)空間施用組合物或藥物，例如腫瘤內(nèi)注射到腫瘤物質(zhì)中，皮下注射，肌內(nèi)注射等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員都明白局部施用或者區(qū)域施用都可以導(dǎo)致組合物或藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。
核酸的產(chǎn)生和操作如這里所述，為施用編碼融合蛋白的核酸提供本發(fā)明方法。可以體內(nèi)或體外合成重組融合蛋白。編碼這些成分的核酸可以是“裸DNA”形式或者它們可以被插入用于體內(nèi)或離體施用的質(zhì)粒，載體，重組病毒(例如＂復(fù)制子＂)等中?？梢灾苽洳⑶殷w外或體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的核酸和載體，可以利用制備和表達(dá)這些基因和載體的多種不同的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員要認(rèn)識到通過調(diào)節(jié)用來實施本發(fā)明的載體中的基因和核酸(例如啟動子)的表達(dá)或活性可以獲得期望的基因活性。對于增強或減弱基因表達(dá)或活性或組織特異性所描述的任何公知方法可以用于本發(fā)明。本發(fā)明可以結(jié)合本領(lǐng)域公知的在科技和專利文獻(xiàn)中充分描述的任何方法或方案加以實施。
一般技術(shù)可以從各種來源，一般是基因工程的，擴增的和/或重組表達(dá)的各種來源分離用于實施本發(fā)明的核酸序列，不管是RNA，cDNA，基因組DNA，載體，重組病毒或者其雜合體?？梢允褂萌魏沃亟M表達(dá)系統(tǒng)，除了細(xì)菌細(xì)胞之外，包括例如哺乳動物，酵母，昆蟲或者植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?；蛘?，可以通過公知的化學(xué)合成技術(shù)體外合成這些核酸，如描述于，例如，Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)，美國化學(xué)學(xué)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)105661；Belousov(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 253440-3444；Frenkel(1995)；自由基生物藥物(Free Radic.Biol.Med.)19373-380；Blommers(1994)生物化學(xué)(Biochemistry)337886-7896；Narang(1979)酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)6890；Brown(1979)酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)68109；Beaucage(1981)四面體快報(Tetra.Lett.)221859；美國專利No.4,458,066。然后，通過合成互補鏈并且在合適的條件下將鏈一起退火，或者通過使用DNA聚合酶用合適的引物加入互補鏈，可以獲得雙鏈DNA片段。
操作核酸的技術(shù)例如在序列中產(chǎn)生突變，亞克隆，標(biāo)記探針，測序，雜交等都詳細(xì)描述于科技和專利文獻(xiàn)中，參見，例如，Sambrook，編著，分子克隆實驗手冊(MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL)(第二版)，Vols.1-3，冷泉港實驗室，(1989)；當(dāng)代分子生物學(xué)方法(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，Ausubel，編著，John Wiley & Sons，Inc.，紐約(1997)；生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗技術(shù)與核酸探針雜交(LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGYHYBRIDIZATIONWITH NUCLEIC ACID PROBES)，第I部分.理論和核酸制備(Theoryand Nucleic Acid Preparation)，Tijssen，編著，Elsevier，N.Y.(1993)。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何一種一般方法可以分析和鑒定核酸，載體，殼體，多肽等。這些包括例如分析生物化學(xué)方法，例如NMR，分光光度法，放射照相法，電泳，毛細(xì)管電泳，高效液相色譜(HPLC)，薄層色譜(TLC)，和超擴散色譜，各種免疫學(xué)方法，例如液體或凝膠沉淀素反應(yīng)，免疫擴散，免疫電泳，放射免疫測試(RIAs)，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)，免疫熒光測定，Southern分析，Northern分析，點印跡分析，凝膠電泳(例如SDS-PAGE)，RT-PCR，定量PCR，其它核酸或靶物或信號擴增方法，放射標(biāo)記，閃爍計數(shù)，和親和層析。
核酸的擴增寡核苷酸引物可以用來擴增核酸產(chǎn)生用來實施本發(fā)明的融合蛋白編碼序列，用來監(jiān)測體內(nèi)施用之后疫苗的水平(例如質(zhì)粒或病毒的水平)，用來證實激活的CTL的存在和表型等等。本發(fā)明技術(shù)人員可以利用已知序列選擇和設(shè)計合適的寡核苷酸擴增引物，所述已知序列例如，編碼熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌屬外毒素A(ETAdII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)序列的那些。擴增方法也是本領(lǐng)域公知的，例如，聚合酶鏈反應(yīng)，PCR(PCR方法，方法指南和應(yīng)用(PCR PROTOCOLS，A GUIDE TO METHODSAND APPLICATIONS)，Innis，Academic Press出版，N.Y.(1990)和PCR策略(PCR STRATEGIES)(1995)，Innis，Academic Press出版，Inc.，N.Y.，連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction)(LCR)(參見例如，Wu(1989)基因組(Genomics)4560；Landegren(1988)科學(xué)(Science)2411077；Barringer(1990)基因(Gene)89117)；轉(zhuǎn)錄擴增(例如參見，Kwoh(1989)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 861173)；和自身保持序列復(fù)制(參見例如，Guatelli(1990)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 871874)；Qβ復(fù)制酶擴增(參見例如，Smith(1997)臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)351477-1491)，自動β復(fù)制酶擴增測定(參見例如，Burg(1996)分子細(xì)胞探針(Mol.Cell.Probes)10257-271)和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；也參見Berger(1987)酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)152307-316；Sambrook；Ausubel；美國專利Nos.4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)生物技術(shù)(Biotechnology)13563-564。
表達(dá)盒的克隆和構(gòu)建表達(dá)盒，包括質(zhì)粒，重組病毒(例如，RNA病毒，象下面描述的復(fù)制子)和編碼這里描述的融合蛋白的其它載體被用來體外和體內(nèi)表達(dá)這些多肽?？萍己蛯＠墨I(xiàn)中充分描述了通過各種常規(guī)技術(shù)表達(dá)重組核酸。參見例如，Roberts(1987)自然(Nature)328731；Schneider(1995)蛋白質(zhì)實驗純化(Protein Expr.Purif.) 643510；Sambrook，Tijssen或Ausubel。質(zhì)粒，載體等可以從天然來源分離，從象ATCC或GenBank庫這樣的來源獲得，或者通過合成或重組方法制備。
用來實施本發(fā)明的核酸可以在細(xì)胞(例如附加型表達(dá)系統(tǒng))中穩(wěn)定或瞬時表達(dá)?？梢圆迦脒x擇標(biāo)記對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞賦予穩(wěn)定表型。例如，選擇標(biāo)記可以標(biāo)記附加型保持和復(fù)制使得不要求整合到宿主基因組中。例如，標(biāo)記物可以標(biāo)記抗生素抗性(例如，氯霉素，卡那霉素，G418，博萊霉素，潮霉素)或者除草劑抗性(例如，氯磺隆和Basta)，使篩選用期望的DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(參見例如，Blondelet-Rouault(1997)基因(Gene)190315-317；Aubrecht(1997)藥物實驗治療雜志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)281992-997)。
體內(nèi)核酸施用在一個實施方案中，將本發(fā)明的嵌合核酸克隆到能體外，離體和/或體內(nèi)轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞(例如人或其它哺乳動物細(xì)胞)的表達(dá)盒(例如質(zhì)粒或者其它載體，病毒)中?？梢允褂萌魏畏椒ǎ缫灾|(zhì)或脂質(zhì)體為基礎(chǔ)的基因送遞(例如參見，Mannino(1988)生物技術(shù)(Bio Techniques)6682-691；美國專利No.5,279,833)，具有期望的異源序列作為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分的復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見例如，Miller(1990)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)104239；Kolberg(1992)J.NIH Res.443；Cornetta(1991)人體基因治療(Hum.Gene Ther.)2215)。也參見例如Zhang(1996)癌癥轉(zhuǎn)移研究(Cancer Metastasis Rev.) 15385-401；Anderson，科學(xué)(Science)(1992)256808-813；Nabel(1993)TIBTECH 11211-217；Mitani(1993)TIBTECH 11162-166；Mulligan(1993)科學(xué)(Science)，926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11167-175；Miller(1992)自然(Nature)357455-460。
表達(dá)盒也可以來自病毒基因組。可以使用的載體包括重組修飾的有包膜或者沒有包膜的DNA和RNA病毒，例如，來自桿狀病毒科(baculoviridiae)，細(xì)小病毒科(parvoviridiae)，picornoviridiae，皰疹病毒科(herpesveridiae)，痘病毒科(poxviridae)，腺病毒科(adenoviridiae)，細(xì)小核糖核酸病毒科(picornnaviridiae)或者甲病毒科(alphaviridae)。也可以使用利用每一個母體載體性能的有利優(yōu)點的嵌合載體(參見例如，F(xiàn)eng(1997)自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)15866-870)。可以通過重組DNA技術(shù)修飾這樣的病毒基因組來包括腫瘤抑制劑基因并且可以基因工程處理為復(fù)制缺陷，條件復(fù)制或者復(fù)制有效。所述載體可以是復(fù)制缺陷或條件復(fù)制的。載體可以來自腺病毒，腺—相關(guān)病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以包括以下面為基礎(chǔ)的那些鼠白血病病毒(MuLV)，長臂猿無尾猿白血病病毒(GaLV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，以及其組合。參見例如，Buchscher(1992)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)66(5)2731-2739；Johann(1992)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)66(5)1635-1640(1992)；Sommerfelt(1990)病毒學(xué)(Virol.)17658-59；Wilson(1989)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)632374-2378；Miller(1991)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)652220-2224。也可以使用以腺—相關(guān)病毒(AAV)為基礎(chǔ)的載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，例如，用于體外產(chǎn)生核酸和肽，和體內(nèi)和離體治療方法。參見，Okada(1996)基因治療(Gene Ther.)3957-964；West(1987)病毒學(xué)(Virology)16038-47；Carter(1989)美國專利No.4,797,368；Carter等WO 93/24641(1993)；Kotin(1994)人體基因治療(Human Gene Therapy)5793-801；Muzyczka(1994)臨床研究雜志(J.Clin.Invst.)941351，是關(guān)于對AAV載體的綜述。
使用自主復(fù)制RNA復(fù)制子體內(nèi)施用除了上述表達(dá)載體和重組病毒之外，也可以使用自主復(fù)制的RNA復(fù)制子來感染細(xì)胞或組織或整個生物體本發(fā)明融合蛋白—表達(dá)核酸。因此，本發(fā)明也包括經(jīng)基因工程處理使表達(dá)異源RNA和蛋白質(zhì)的RNA病毒，例如甲病毒基因組RNA(例如，新培斯病毒；Semliki Forest病毒；Venezuelan equine腦炎病毒等等)。當(dāng)異源編碼序列取代病毒結(jié)構(gòu)基因時，實現(xiàn)異源序列，例如本發(fā)明的融合蛋白的高水平表達(dá)。
這些重組RNA是自主復(fù)制的(即它們是＂復(fù)制子＂)并且可以作為裸RNA或DNA被導(dǎo)入細(xì)胞。但是，它們要求包裝反互補并且作為感染病毒體顆粒從細(xì)胞釋放出。缺陷輔助RNA包含復(fù)制所要求的順—作用序列以及驅(qū)動多肽-編碼的可讀框表達(dá)的RNA啟動子。在復(fù)制子和缺陷輔助RNA共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，從復(fù)制子RNA翻譯的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)使得復(fù)制和轉(zhuǎn)錄缺陷輔助RNA，產(chǎn)生病毒體結(jié)構(gòu)蛋白。參見例如，Bredenbeek(1993)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)676439-6446。
RNA復(fù)制子疫苗可以來自甲病毒載體，例如新培斯病毒(披蓋病毒科家族)(參見例如，Xiong(1989)科學(xué)(Science)2431188-1191)，SemlikiForest病毒(參見例如，Ying(1999)天然藥物(Nat.Med.)5823-827)或者Venezuelan equine腦炎病毒(參見例如，Pushko(1997)病毒學(xué)(Virology)239389-401)載體。這些疫苗是自主復(fù)制的和自主限制的，并且可以作為RNA或DNA施用，其然后被轉(zhuǎn)錄到被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的RNA復(fù)制子中或者體內(nèi)轉(zhuǎn)錄到RNA復(fù)制子中(參見例如，Berglund(1998)自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)16562-565)。自主復(fù)制RNA感染不同范圍的細(xì)胞類型并且使高水平表達(dá)感興趣的抗原(參見例如，Huang(1996)當(dāng)代生物技術(shù)論壇(Curr.Opin.Biotechnol.)7531-535)。另外，自主復(fù)制RNA最后引起被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解，因為病毒復(fù)制對于感染的宿主細(xì)胞是有毒性的(參見例如，F(xiàn)rolov(1996)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)701182-1190)。因此，這些載體不會引起與裸DNA疫苗整合到宿主基因組中相關(guān)的憂慮。這對于疫苗產(chǎn)生有致癌基因潛力的靶蛋白例如腺病毒E7蛋白特別重要。
在一個實施方案中，自主復(fù)制RNA復(fù)制子包括新培斯病毒自主復(fù)制RNA載體SINrepS，如詳細(xì)描述于例如Bredenbeek(1993)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)676439-6446；也參見，例如，Herrmann(1998)生物化學(xué)生物物理通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun)253524-531。
藥物組合物的配制和施用在本發(fā)明的各實施方案中，多肽，核酸，表達(dá)盒，細(xì)胞，和顆粒作為藥物成分以足以產(chǎn)生個體抗原特異性免疫應(yīng)答(例如CTL應(yīng)答)的量施加給個體。
用于核酸，肽和多肽的藥學(xué)可接受載體和制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且在科技和專利文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述，參見例如，最后一版的Remington′s制藥科學(xué)(Remington′s Pharmaceutical Science)，Maack出版公司，Easton，PA(＂Remington′s＂)；Banga；Putney(1998)自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)16153-157；Patton(1998)生物技術(shù)(Biotechniques)16141-143；Edwards(1997)科學(xué)(Science)2761868-1871；美國專利No.5780431；5770201)。
本發(fā)明方法中使用的核酸和多肽可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法單獨送遞或者作為藥物組合物送遞，例如全身，部位和局部；通過動脈內(nèi)，鞘內(nèi)(IT)，靜脈內(nèi)(IV)，腸胃外，胸膜腔內(nèi)，局部，口服或者局部施用，如皮下，氣管內(nèi)(例如通過氣霧劑)或者跨膜(例如口腔，膀胱，陰道，子宮，直腸，鼻粘膜)。送遞組合物的實際方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的或顯而易見的，并且詳細(xì)描述于科技和專利文獻(xiàn)中，參見例如，Remington′s。
根據(jù)施用的方法和途徑和頻率，是否施用其它藥物，個體應(yīng)答等，可以通過任何方式并且以任何單位劑量形式施用本發(fā)明的藥物組合物。典型核酸，肽和多肽藥物組合物的劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這樣的劑量一般自然提議并且根據(jù)各種因素調(diào)節(jié)，例如，最初的反應(yīng)(例如，產(chǎn)生的抗原特異性CTL量，腫瘤收縮等等)，具體的治療方案，患者健康和耐藥性。適合產(chǎn)生期望的反應(yīng)的藥物組合物的量定義為＂治療有效劑量＂。用于該應(yīng)用的劑量安排和有效量，即＂給藥法＂將取決于各種各樣的因素，包括，例如，通過免疫要治療或預(yù)防的疾病或癥狀，患者健康的一般狀態(tài)，患者身體狀況，年齡，藥物劑型和藥物組合物的濃度等等。給藥方案也要考慮藥物動力學(xué)，即，藥物組合物的吸收速度，生物利用度，代謝，清除率等等，參見例如Remington?？梢詰{經(jīng)驗確定劑量，例如，通過評價癥狀的減輕或改善，或者通過客觀標(biāo)準(zhǔn)，例如，測定抗原特異性CTL水平。如上所述以根據(jù)需要的劑量和頻率和患者的耐受性為基礎(chǔ)，可以一次施用或者多次施用。可以單獨地或者與其它治療性處理相結(jié)合，或者作為預(yù)防性免疫來施用本發(fā)明的藥物組合物。
試劑盒本發(fā)明提供含有如上所述實施本發(fā)明方法的本發(fā)明藥物組合物的試劑盒。在一個可供選擇的實施方案中，所述試劑盒可以含有本發(fā)明的重組和合成的嵌合多肽；或者，編碼它們的核酸，例如，以裸DNA(例如質(zhì)粒)，病毒(例如甲病毒-衍生的“復(fù)制子”，包括新培斯病毒復(fù)制子)等等的形式。試劑盒可以含有教導(dǎo)方法的說明材料，例如，施用用來實施本發(fā)明的組合物的方法，用本發(fā)明的核酸或多肽注射或感染細(xì)胞或患者或動物的方法，監(jiān)測得到的免疫應(yīng)答(例如CTL應(yīng)答)的方法，以及對個體對施用的成分的反應(yīng)的評價等等。
要明白這里描述的實施例和實施方案只是為了舉例說明的目的，對本領(lǐng)域技術(shù)人員將提示各種修飾或改變，并且包括在本申請和后面的權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)。
實施例提供下面的實施例舉例說明，但不限制要求保護的的本發(fā)明的范圍。
實施例1在體內(nèi)抗原基因與HSP70基因的連接對DNA疫苗效價的增強和對腫瘤的治療下面的實施例描述了證實本發(fā)明的成分和方法對于體內(nèi)增強抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答和治療腫瘤是有效的這樣的研究。
使用HPV-16 E7作為模型抗原，這里描述的數(shù)據(jù)指明含有編碼具有熱激蛋白，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運部分，和I類MHC表位形式的抗原的嵌合多肽的多核苷酸的DNA疫苗導(dǎo)致對該表位的特異性的有效免疫性。評價了鍵聯(lián)結(jié)核分枝桿菌熱激蛋白70(HSP70)對裸DNA疫苗產(chǎn)生的抗原特異性免疫性的效價的影響。
結(jié)核分枝桿菌HSP70大大增強了HPV-16 E7-表達(dá)DNA疫苗的效價。具有與HPV-16 E7融合的HSP70的DNA疫苗激發(fā)強的E7-特異性細(xì)胞免疫性(E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率至少增加30-倍)并且產(chǎn)生抗HPV-16 E7-表達(dá)鼠腫瘤的顯著的CD8+T細(xì)胞-依賴性預(yù)防和治療作用。
數(shù)據(jù)表明HSP70優(yōu)先增強E7 DNA疫苗的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。相反，HSP70連接沒有可檢測地增強CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。不能誘導(dǎo)通過流式細(xì)胞儀分析的可檢測的IFN-γ-表達(dá)CD4+T細(xì)胞和不能誘導(dǎo)E7-特異性抗體證實了這一點。編碼E7-HSP70融合基因的DNA疫苗將E7-特異性CD8+T細(xì)胞的頻率相對于含有野生型E7基因的疫苗(沒有HSP70基因序列存在下)提高了40-倍。更重要的是，對常規(guī)DNA疫苗(例如，編碼單一抗原的疫苗)加入HSP70基因序列將效果較差的疫苗轉(zhuǎn)化為具有顯著抗已發(fā)生的E7-表達(dá)腫瘤的效價的疫苗。令人驚奇地，E7-HSP70融合疫苗專一地瞄向CD8+T細(xì)胞；免疫作用和抗腫瘤作用完全不依賴CD4。這些結(jié)果表明HSP70與抗原基因的融合通過CD8依賴途徑大大增強了DNA疫苗的效價。
選擇人乳頭瘤病毒(HPV)-衍生的抗原，因為HPV，特別是HPV-16，與大多數(shù)宮頸癌相關(guān)。HPV致癌基因蛋白質(zhì)，E6和E7，在大多數(shù)包含HPV的宮頸癌中在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)和保持和共同表達(dá)中是重要的。瞄向E7和/或E6蛋白質(zhì)的疫苗或免疫治療能夠預(yù)防和治療HPV-相關(guān)的子宮頸惡性腫瘤。數(shù)據(jù)表明編碼抗原的多核苷酸，例如全長E7-編碼序列，連接到HSP-編碼序列提高DNA疫苗的效價。對包含野生型HPV-16 E7的DNA疫苗和包含與結(jié)核分枝桿菌HSP70融合的全長E7的DNA疫苗評價它們的免疫應(yīng)答產(chǎn)生和它們保護動物抗HPV-16 E7表達(dá)鼠腫瘤的能力。編碼E7的DNA與編碼HSP70的DNA的連接大大增加了E7-特異性CD8+T細(xì)胞的擴展和激活，完全忽略CD4臂。這種增強的CD8應(yīng)答導(dǎo)致抗已發(fā)生的腫瘤的有效的抗腫瘤免疫性。
利用下面的材料和方法產(chǎn)生下述數(shù)據(jù)。
質(zhì)粒DNA構(gòu)建體和制備編碼結(jié)核分枝桿菌HSP70的DNA片段是本領(lǐng)域公知的(GENBANK登記號No.Z95324 AL123456；核苷酸10633-12510編碼HSP70)。
表1HSP70的氨基酸序列MARAVGIDLGTTNSVVSVLEGGDPVWANSEGSRTTPSIVAFARNGEVLVGQPAKNQAVTNVDRTVRSVKRHMGSDWSIEIDGKKYTAPEISARILMKLKRDAEAYLGEDITDAVITTPAYFNDAQRQATKDAGQIAGLNVLRIVNEPTAAALAYGLDKGEKEQRILVFDLGGGTFDVSLLEIGEGVVEVRATSGDNHLGGDDWDQRVVDWLVDKFKGTSGIDLTKDKMAMQRLREAAEKAKIELSSSQSTSINLPYITVDADKNPLFLDEQLTRAEFQRITQDLLDRTRKPFQSVIADTGISVSEIDHVVLVGGSTRMPAVTDLVKELTGGKEPNKGVNPDEVVAVGAALQAGVLKGEVKDVLLLDVTPLSLGIETKGGVMTRLIERNTTIPTKRSETFTTADDNQPSVQIQVYQGERELAAHNKLLGSFELTGIPPAPRGIPQIEVTFDIDANGIVHVTAKDKGTGKENTIRIQEGSGLSKEDIDRMIDAEAHAEEDRKRREEADVRNQAETLVYQTEKFVKEQREAEGGSKVPEDTLNKVDAAVAEAKAALGGSDISAIKSAMEKLGQESQALGQAIYEAAQAASQATGAAHPGGEPGGAHPGSADDVVDAEVVDDGREAK(SEQ ID NO9)，GENBANK Z95324 AL123456；結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸10633-12510編碼/表2編碼HSP70的核苷酸序列atggctcg tgcggtcggg atcgacctcg ggaccaccaa ctccgtcgtc tcggttctgg aaggtggcgacccggtcgtc gtcgccaact ccgagggctc caggaccacc ccgtcaattg tcgcgttcgc ccgcaacggt gaggtgctggtcggccagcc cgccaagaac caggcagtga ccaacgtcga tcgcaccgtg cgctcggtca agcgacacat gggcagcgactggtccatag agattgacgg caagaaatac accgcgccgg agatcagcgc ccgcattctg atgaagctga agcgcgacgccgaggcctac ctcggtgagg acattaccga cgcggttatc acgacgcccg cctacttcaa tgacgcccag cgtcaggccaccaaggacgc cggccagatc gccggcctca acgtgctgcg gatcgtcaac gagccgaccg cggccgcgct ggcctacggcctcgacaagg gcgagaagga gcagcgaatc ctggtcttcg acttgggtgg tggcactttc gacgtttccc tgctggagatcggcgagggt gtggttgagg tccgtgccac ttcgggtgac aaccacctcg gcggcgacga ctgggaccag cgggtcgtcgattggctggt ggacaagttc aagggcacca gcggcatcga tctgaccaag gacaagatgg cgatgcagcg gctgcgggaagccgccgaga aggcaaagat cgagctgagt tcgagtcagt ccacctcgat caacctgccc tacatcaccg tcgacgccgacaagaacccg ttgttcttag acgagcagct gacccgcgcg gagttccaac ggatcactca ggacctgctg gaccgcactcgcaagccgtt ccagtcggtg atcgctgaca ccggcatttc ggtgtcggag atcgatcacg ttgtgctcgt gggtggttcgacccggatgc ccgcggtgac cgatctggtc aaggaactca ccggcggcaa ggaacccaac aagggcgtca accccgatgaggttgtcgcg gtgggagccg ctctgcaggc cggcgtcctc aagggcgagg tgaaagacgt tctgctgctt gatgttaccccgctgagcct gggtatcgag accaagggcg gggtgatgac caggctcatc gagcgcaaca ccacgatccc caccaagcggtcggagactt tcaccaccgc cgacgacaac caaccgtcgg tgcagatcca ggtctatcag ggggagcgtg agatcgccgcgcacaacaag ttgctcgggt ccttcgagct gaccggcatc ccgccggcgc cgcgggggat tccgcagatc gaggtcactttcgacatcga cgccaacggc attgtgcacg tcaccgccaa ggacaagggc accggcaagg agaacacgat ccgaatccaggaaggctcgg gcctgtccaa ggaagacatt gaccgcatga tcaaggacgc cgaagcgcac gccgaggaggatcgcaagcg tcgcgaggag gccgatgttc gtaatcaagc cgagacattg gtctaccaga cggagaagtt cgtcaaagaacagcgtgagg ccgagggtgg ttcgaaggta cctgaagaca cgctgaacaa ggttgatgcc gcggtggcgg aagcgaaggcggcacttggc ggatcggata tttcggccat caagtcggcg atggagaagc tgggccagga gtcgcaggct ctggggcaagcgatctacga agcagctcag gctgcgtcac aggccactgg cgctgcccac cccggcggcg agccgggcgg tgcccaccccggctcggctg atgacgttgt ggacgcggag gtggtcgacg acggccggga ggccaagtga(SEQ ID NO10)；GENBANK登記號No.Z95324 AL123456的核苷酸10633-12510。
為了產(chǎn)生HSP-表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3-HSP)，將HSP70-編碼DNA從pKS70亞克隆到巨細(xì)胞病毒啟動子下游pcDNA3.1(-)表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)的獨特BamHI和HindIII克隆位點中。為了產(chǎn)生HPV-16 E7-表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3-E7)，利用設(shè)計的引物通過PCR擴增E7 DNA，分別在擴增的片段的5′和3′端產(chǎn)生BamHI和HindIII限制性位點。然后將擴增的E7 DNA克隆到pcDNA3.1的獨特的BamHI和HindIII克隆位點。為了產(chǎn)生E7-HSP70嵌合體(pcDNA-E7-HSP70)，利用設(shè)計的引物通過PCR擴增E7 DNA，在擴增的片段的5′和3′端產(chǎn)生BamHI限制性位點。然后將E7 DNA亞克隆到pcDNA3-HSP的5′端。通過DNA測序證實這些構(gòu)建體的精確性。將攜帶HSP，E7或E7-HSP70基因插入物的質(zhì)粒DNA和＂空白＂質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到亞克隆有效的DH5(TM細(xì)胞；Life Technologies，USA)中。然后擴增DNA并且利用兩次CsCl純化進(jìn)行純化(BioServeBiotechnologies，Laurel，Maryland)。在每一次制備中利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的完整性以及不存在大腸埃希氏桿菌DNA或RNA。通過在260nm下測定光密度來測定DNA濃度。通過限制性酶消化和凝膠電泳證實存在插入的E7片段。reticulum和calreticulum多肽(和編碼它們的多核苷酸)是本發(fā)明免疫原組合物中HSP成分的有用的替代物。
表3HPV16 E7抗原的氨基酸序列MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO7)，GENBANK登記號No.AAD33353。
表4編碼HPV E7的核苷酸序列atgcatgga gatacaccta cattgcatga atatatgtta gatttgcaac cagagacaac tgatctctac tgttatgagcaaaaaatga cagctcagag gaggaggatg aaatagatgg tccagctgga caagcagaac cggacagagc ccattacaatattgtaacct tttgttgcaa gtgtgactct acgcttcggt tgtgcgtacaaagcacacac gtagacattc gtactttggaagacctgtta atgggcacac taggaattgt gtgccccatc tgttctcaga aaccataa(SEQ ID NO8)；GENBANK登記號No.AF125673的核苷酸562-858。
DNA接種根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，使用氦-驅(qū)動基因槍(Bio-Rad，Hercules，CA)進(jìn)行基因槍顆粒-介導(dǎo)的DNA接種。簡要地說，通過將25mg 1.6μm金微載體(Bio-rad，Hercules，CA)和100微升0.05M亞精胺(Sigma，St，Louis，MO)混合制備DNA包被的金顆粒。接著在渦旋混合的同時依次向該微載體加入質(zhì)粒DNA(50微克)和1.0M CaCl2(100微升)。使該混合物在室溫(RT)下沉淀10分鐘。然后將微載體/DNA懸浮物離心(10,000r.p.m.，5秒)并且在再次懸浮于3毫升聚乙烯吡咯烷酮(0.1mg/ml)(Bio-rad，Hercules，CA)的無水乙醇溶液中之前用新鮮無水乙醇洗滌3次。然后將溶液裝入管中使靜置4分鐘。小心去除乙醇并且通過旋轉(zhuǎn)管使微載體/DNA懸浮物均衡地接觸管的內(nèi)側(cè)表面。然后通入每分鐘0.4升的流動的氮氣干燥管。然后將包被有微載體/DNA的干燥的管切成0.5-英寸的筒，并且在4℃下保存在有蓋的干燥瓶中。作為結(jié)果，每一個筒含有1微克的質(zhì)粒DNA和0.5mg的金。將DNA包被的金顆粒(1微克DNA/粒)使用氦-驅(qū)動基因槍(Bio-rad，Hercules，CA)送遞到小鼠的修剪過的腹部區(qū)，基因槍的排放壓為400p.s.I。
ELISPOT測試應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的ELISPOT測試來檢測HPV-16 E7特異性CD8+T細(xì)胞。用50微升磷酸鹽緩沖鹽水中10微克/毫升大鼠抗小鼠IFN-γ抗體(克隆R4-6A2，Pharmingen，San Diego，CA)包被96-孔濾板(Millipore，Bedford，MA)。4℃下培養(yǎng)過夜之后，洗滌孔并且用含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基封閉。將來自各個接種小鼠組的新鮮分離的不同濃度的脾細(xì)胞，從1×106/孔開始，和15U/ml白細(xì)胞介素-2一起加給各孔。細(xì)胞在有或沒有1微克/毫升E7特異性H-2Db CTL表位(E7，殘基49-57；SEQ ID NO5)情況下在37℃下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)之后洗滌平板，然后將細(xì)胞與50微升PBS中的5微克/毫升生物素化的IFN-γ抗體(克隆XMG1.2，Pharmingen)在4℃下培養(yǎng)過夜。洗滌6次之后，加入50微升PBS中1.25微克/毫升抗生物素蛋白減性磷酸酶(Sigma，St.Louis，MO)，并且在室溫下培養(yǎng)2小時。洗滌之后，通過加入50微升BCIP/NBT溶液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)顯現(xiàn)斑點，并且在室溫下溫育1小時。使用解剖顯微鏡計數(shù)點數(shù)。
胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞儀分析來自天然的或者接種組小鼠的脾細(xì)胞或者與包含I類MHC表位的E7肽(殘基4957；SEQ ID NO5)或者與包含II類MHC肽的E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO6)一起溫育。測定其蛋白質(zhì)和多肽殘基代表I類MHC抗原表位的方法是本領(lǐng)域公知的。以2微克/毫升的濃度加入E7肽。為了檢測E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體和E7-特異性CD4+T輔助細(xì)胞應(yīng)答，分別使用CD8+CTL表位殘基49-57和殘基30-67。在從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞之前6小時加入GolgistopTM(Pharmigen，San Diego，CA)。然后細(xì)胞在FACSCAN緩沖液中洗滌一次并且用藻紅蛋白(PE)-綴合的單克隆大鼠抗-小鼠CD8或CD4抗體(Pharmingen，San Diego，CA)染色。使用Cytofix/Cytoperm TM(Pharmingen)試劑盒根據(jù)廠商說明對細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。FITC-綴合的抗-IFN-γ或者抗-IL-4抗體和免疫球蛋白同種型對照抗體(大鼠IgG1)都購自Pharmingen。在Becton-DickensonFACScanTM上使用CELLQuestTM軟件(Becton Dickson ImmunocytometrySystem，Mountain View，CA)進(jìn)行分析。
細(xì)胞因子的ELISA最后接種之后2星期收集脾細(xì)胞(4×106)并且與10微克/毫升的E7蛋白質(zhì)一起在總體積2毫升的補充有10％(vol/vol)胎牛血清，50單位/ml青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，2mM非基本氨基酸的RPMI 1640中在24-孔組織培養(yǎng)平板中培養(yǎng)72小時。收集上清夜并且使用ELISA試劑盒(Endogen)根據(jù)廠商說明測試IFN-γ和IL-4的存在。
抗-E7 ELISA通過標(biāo)準(zhǔn)的直接ELISA測定血清中的抗-HPV 16 E7抗體。用100微升10微克/毫升細(xì)菌產(chǎn)生的HPV-16 E7蛋白質(zhì)包被96微孔板并且在4℃下培養(yǎng)過夜。然后用含有20％胎牛血清的PBS將孔封閉。在免疫之后第14天從小鼠制備血清，用PBS系列稀釋，加給ELISA孔，并且在37℃下培養(yǎng)2小時。用含有0.05％Tween-20的PBS洗滌之后，室溫下該平板與1/2000稀釋度的過氧化物酶-綴合的兔抗小鼠IgG抗體(Zymed，San Francisco，CA)培養(yǎng)1小時。該平板洗滌6次，并且用TMB(Pierce，Rockford，IL)促生長，并且用1M H2SO4終止。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA讀數(shù)儀在450nm下對ELISA平板讀數(shù)。
鼠腫瘤細(xì)胞系應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)和保持鼠腫瘤細(xì)胞系TC-1。腫瘤細(xì)胞系的生長和小鼠中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的腫瘤的形成是本領(lǐng)域認(rèn)可的人類癌癥的模型。HPV-16 E6，E7和ras致癌基因被用來轉(zhuǎn)化原代C57BL/6小鼠肺上皮細(xì)胞。在補充有10％(vol/vol)胎牛血清，50單位/ml青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，2mM非基本氨基酸和0.4mg/ml G418的RPMI 1640中在37℃下在5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞。在腫瘤攻擊的這一天，通過胰蛋白酶作用收獲TC-1細(xì)胞，用1× Hanks緩沖鹽溶液洗滌兩次并且最后再次懸浮于設(shè)計為注射濃度的1× Hanks緩沖鹽溶液中。
小鼠從國家癌癥研究中心(the National Cancer Institute)(Frederick，Maryland)購得6至8周齡雄性C57BL/6小鼠。
體內(nèi)腫瘤保護通過基因槍用2微克的HSP DNA，E7 DNA，E7-HSP70 DNA，或者沒有插入物的空白質(zhì)粒對小鼠接種(每組5只)。一周之后，用和第一次接種相同的給藥法對小鼠加強免疫。另一組小鼠(每組5只)接種一次(沒有進(jìn)一步加強)。最后接種之后一周，用5×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞對小鼠右腿皮下攻擊，并且每周兩次監(jiān)測。
體內(nèi)腫瘤治療如上所述制備腫瘤細(xì)胞和DNA疫苗。用2×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞對小鼠右腿皮下攻擊。用TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊之后3天，通過基因槍對小鼠施用2微克的HSP DNA，E7 DNA，E7-HSP70 DNA，或者沒有插入物的空白質(zhì)粒。一周之后，用和第一次接種相同的給藥法對小鼠加強免疫。另一組小鼠(每組5只)接種一次，腫瘤攻擊之后沒有進(jìn)一步加強。每周兩次監(jiān)測。
體內(nèi)抗體耗竭利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行體內(nèi)抗體耗竭(depletion)。通過基因槍用2微克的E7-HSP70 DNA接種C57BL/6小鼠，一周之后加強免疫，并且用5×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊?？贵w耗竭在腫瘤攻擊之前一周就開始了。對于CD4耗竭，使用CD4-特異性單克隆抗體，例如，MAbGK1.5；對于CD8耗竭，使用CD8-特異性抗體，例如MAb 2.43，對于NK1.1耗竭，使用與NK細(xì)胞結(jié)合的抗體，例如，MAb PK136。流式細(xì)胞儀分析表明耗竭了95％以上的合適的淋巴細(xì)胞亞群，而其它亞群的水平正常。腫瘤攻擊之后第40天抗體耗竭終止。
用E7-HSP70融合DNA接種增強E7-特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答CD8+T淋巴細(xì)胞是抗腫瘤效應(yīng)子中最重要的成分。為了測定E7-HSP70 DNA疫苗產(chǎn)生的E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率，利用酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)測試和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。ELISPOT測試和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色都是用來測定單細(xì)胞水平的IFN-γ產(chǎn)生的敏感功能測試，它們因此被用來定量測定抗原-特異性CD8+T細(xì)胞。如圖1A所示，對來自E7HSP70 DNA接種小鼠的每106個脾細(xì)胞檢測對免疫顯性Db-限制性E7(49-57；SEQ ID NO5)肽特異性的435 IFN-γ斑點形成CD8+T細(xì)胞，并且與來自E7 DNA接種小鼠的僅14 E7(49-57)-特異性IFN-γ斑點-形成CD8+T細(xì)胞/106脾細(xì)胞相比較。減去從只有pcDNA-3載體產(chǎn)生的背景(3點/106脾細(xì)胞)，對于E7和E7-HSP70 DNA疫苗分別得到11和432E7(49-57)-特異性IFN-γ斑點-形成CD8+T細(xì)胞。類似地，利用對CD8和胞內(nèi)IFN-γ雙染色通過流式細(xì)胞儀分析也可以定量測定E7(49-57)-特異性CD8+T細(xì)胞前體的量。從該項測試得到的值(圖1B)與圖1A中給出的ELISPOT結(jié)果密切相關(guān)。如圖1B所示，通過流式細(xì)胞儀分析得知用E7-HSP70 DNA接種的小鼠產(chǎn)生最大數(shù)值的E7-特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞前體(大約726/106脾細(xì)胞)，而用E7 DNA接種的小鼠沒有給出高于載體接種的對照物的信號。這些數(shù)據(jù)表明編碼E7的I類MHC限制性表位的DNA可操作地連接于編碼HSP70的DNA或者其片段，導(dǎo)致E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率提高至少30-倍。
用E7-HSP70融合DNA接種不增強E7-特異性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為了測定E7-HSP70 DNA疫苗產(chǎn)生的E7-特異性CD4+T前體細(xì)胞和細(xì)胞因子分布，對來自免疫小鼠的脾細(xì)胞上的CD4表面標(biāo)記物和胞內(nèi)IFN-γ或IL-4進(jìn)行雙染色，接著進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。體外將來自免疫小鼠的脾細(xì)胞與E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO6)一起培養(yǎng)過夜并且對CD4和胞內(nèi)IFN-γ染色。E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO6)在HPV-16的E7可讀框蛋白質(zhì)中包含主要T輔助表位。利用流式細(xì)胞儀分析IFN-γ分泌CD4+T細(xì)胞百分比。如圖2所示，與單獨用野生型E7 DNA或載體接種的小鼠相比，用E7-HSP70 DNA接種的小鼠產(chǎn)生類似數(shù)量的CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。用與HSP70質(zhì)?；旌系腅7 DNA接種的小鼠產(chǎn)生稍高一些的CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞，但是在各接種組之間在CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞數(shù)目方面沒有統(tǒng)計學(xué)意義差異。
作為檢測E7-特異性CD4+T的CD4對胞內(nèi)IFN-γ染色的能力的陽性對照，對用表達(dá)Sig/E7/LAMP-1(其將E7靶向II類MHC隔室)的DNA疫苗接種的小鼠的分析，證明相對于用E7 DNA或?qū)φ召|(zhì)粒接種的小鼠來說，CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞增加3倍。也分析了用各種DNA疫苗接種的小鼠的IL-4分泌E7-特異性CD4+T細(xì)胞。在接受E7-HSP70 DNA，混合HSP70DNA的E7DNA，野生型E7 DNA，空白質(zhì)粒DNA，或者沒有接種的小鼠沒有鑒定明顯的CD4+IL-4+雙陽性細(xì)胞。利用MICK-2IL-4分泌細(xì)胞(Pharmingen，San Diego，CA)作為陽性對照來保證用于該項研究的胞質(zhì)內(nèi)IL-4染色的成功。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的含有編碼熱激蛋白的全部或部分的DNA的DNA疫苗誘導(dǎo)獨立于CD4+免疫應(yīng)答的對該疫苗編碼的表位的CD8+免疫應(yīng)答。
用E7-HSP70融合DNA接種不產(chǎn)生E7-特異性抗體最后接種之后2周通過直接酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)測定接種的小鼠的血清中抗-HPV 16E7抗體的量。所有的接種小鼠組的小鼠血清中沒有測定到抗-E7抗體(Fig.3)。使用商售抗-E7單克隆抗體(Zymed，San Francisco，CA)和來自用包含Sig/E7/LAMP-1嵌合體的疫苗接種的血清作為陽性對照來保證抗-E7 ELISA成功地用于該項研究。該結(jié)果與完全不存在E7 DNA或E7-HSP70 DNA疫苗的明顯的E7特異性CD4刺激相符合。
用E7-HSP70融合DNA接種增強抗腫瘤生長的保護作用為了測定用E7-HSP70 DNA構(gòu)建體接種是否保護小鼠抗E7-表達(dá)腫瘤，使用不同劑量的DNA疫苗進(jìn)行兩次體內(nèi)腫瘤保護實驗。關(guān)于第一次實驗，通過基因槍用2微克裸DNA/小鼠對小鼠接種并且在一周之后用相同劑量加強。關(guān)于第二次實驗，通過基因槍用2微克裸DNA/小鼠對小鼠接種，沒有進(jìn)一步加強免疫。最后接種之后天用5×104TC-1/小鼠在右腿皮下對小鼠攻擊。對于接受加強接種的小鼠，接受E7-HSP70 DNA接種的那些小鼠100％在TC-1攻擊之后60天沒有腫瘤，而只有40％接受E7DNA(不存在HSP-編碼DNA)接種的小鼠沒有腫瘤。相反，腫瘤攻擊之后15天之內(nèi)，所有的沒有接種的小鼠和接受空白質(zhì)?；騂SP DNA的小鼠出現(xiàn)腫瘤生長(圖4A)。關(guān)于接受一次接種沒有加強的小鼠，100％的接受E7-HSP70 DNA接種的小鼠在TC-1攻擊之后60天保持沒有腫瘤，而所有的沒有接種的小鼠和接受空白質(zhì)粒，HSP70 DNA或E7 DNA的小鼠在腫瘤攻擊之后15天內(nèi)發(fā)生腫瘤生長(圖4B)。
為了測定E7-HSP70 DNA產(chǎn)生的抗腫瘤作用是否持久，用5×104TC-1/小鼠在左腿皮下對沒有腫瘤的動物再次攻擊。在腫瘤攻擊之后多達(dá)30天沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(圖4A-B)。總之，這些結(jié)果表明與編碼HSP多肽DNA可操作地連接的編碼I類MHC限制性抗原表位的DNA構(gòu)建體，例如，E7-HSP70融合DNA，顯著增強抗表達(dá)I類限制性表位的腫瘤，例如TC-1腫瘤的生長的抗腫瘤免疫性。即使當(dāng)在更嚴(yán)格條件下(沒有施用加強疫苗)試驗時也發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤作用。E7-HSP70 DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性是持久的。
用E7-HSP70融合DNA治療性接種治愈發(fā)生的E7-表達(dá)腫瘤小鼠為了試驗DNA疫苗在根除確診的TC-1腫瘤中的效力，使用不同劑量的DNA疫苗進(jìn)行體內(nèi)腫瘤治療實驗。首先以2×104細(xì)胞/小鼠的劑量將TC-1細(xì)胞皮下注入右腿。三天之后，通過基因槍皮內(nèi)用2微克的對照質(zhì)粒DNA，HSP70 DNA，野生型E7DNA，或E7-HSP70 DNA治療每一只小鼠。關(guān)于第一次實驗，引發(fā)之后7天，用相同疫苗劑量對小鼠加強免疫。關(guān)于第二次實驗，接觸抗原之后沒有對小鼠進(jìn)一步加強免疫。如圖5A所示，對于接受加強的DNA接種的小鼠，80％的接受E7-HSP70DNA接種的小鼠消除了TC-1腫瘤，而100％沒有接種的小鼠和接受空白質(zhì)粒，HSP DNA或E7 DNA的小鼠在腫瘤攻擊之后20天內(nèi)出現(xiàn)腫瘤生長。關(guān)于接受一次接種沒有加強的小鼠，60％的接受E7-HSP70 DNA接種的小鼠在TC-1攻擊之后70天保持沒有腫瘤，而所有的沒有接種的小鼠和接受空白質(zhì)粒，HSP70 DNA或E7 DNA的小鼠在腫瘤攻擊之后20天內(nèi)發(fā)生腫瘤生長(圖5B)?？傊?，這些結(jié)果表明用野生型E7 DNA接種(不存在編碼HSP多肽的DNA)不能消除小鼠預(yù)先接種的E7-表達(dá)腫瘤，而用與編碼HSP多肽的DNA可操作地連接的編碼E7的DNA，例如，E7-HSP70 DNA，根除了已發(fā)生的E7-表達(dá)腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明E7-HSP70DNA顯著增強抗腫瘤免疫性，而與常規(guī)DNA疫苗(即沒有編碼HSP多肽的DNA)產(chǎn)生的免疫性水平相比，DNA疫苗構(gòu)建體中編碼HSP多肽的DNA的存在增強了該DNA疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性。
產(chǎn)生抗腫瘤免疫性要求編碼抗原性表位的DNA與HSP70-編碼序列融合為了測定抗腫瘤免疫性是否要求E7與HSP70的融合，將E7-HSP70DNA與混合有HSP70 DNA的E7-DNA相比較，并且測定產(chǎn)生抗腫瘤免疫性的能力。為了保證對相同的細(xì)胞送遞E7 DNA和HSP70 DNA，在彈丸制備之前將E7 DNA與HSP70 DNA混合。因此，一粒彈丸會含有E7 DNA和HSP70 DNA。如上所述進(jìn)行免疫學(xué)測試和腫瘤保護實驗(沒有加強接種)。數(shù)據(jù)表明只有E7-HSP70 DNA增強E7-特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。HSP70 DNA與E7 DNA混合不增強CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。關(guān)于腫瘤保護實驗，所有的接種E7-HSP70 DNA的小鼠在腫瘤攻擊之后60天保持沒有腫瘤。相反，所有的沒有接種或者接種與HSP70 DNA混合的E7 DNA的小鼠在腫瘤攻擊之后15天之內(nèi)發(fā)生腫瘤生長(圖6)。E7 DNA與HSP70 DNA的融合對于產(chǎn)生抗腫瘤免疫性是必需的。這些結(jié)果表明編碼I類MHC限制性抗原表位的DNA必須與編碼APC-結(jié)合表位的DNA和/或編碼胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽的DNA可操作地連接。
是CD8+T細(xì)胞而不是CD4+T細(xì)胞或者NK細(xì)胞對于由具有與HSP70融合的E7的DNA疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤作用是必需的為了測定對排斥E7-陽性腫瘤細(xì)胞是重要的淋巴細(xì)胞亞型，進(jìn)行體內(nèi)抗體耗竭實驗?？贵w耗竭在腫瘤攻擊之前一周開始并且在腫瘤攻擊之后第40天終止。如圖7所示，所有的原初小鼠和所有的耗竭CD8+T細(xì)胞的小鼠在腫瘤攻擊之后14天內(nèi)長出腫瘤。相反，所有的沒有耗竭的小鼠和所有的耗竭CD4+T細(xì)胞或者NK1.1細(xì)胞的小鼠在腫瘤攻擊之后50天保持沒有腫瘤。這些結(jié)果表明DNA疫苗以CD4-非依賴方式激活CD8+T細(xì)胞，并且這些CD8+T細(xì)胞對于E7-HSP70 DNA疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性是必需的。
HSP在刺激CD8+T細(xì)胞中的作用盡管本發(fā)明不受任何特殊機理的限制，本發(fā)明的嵌合核酸和DNA疫苗的HSP70結(jié)構(gòu)域可以作為抗原的“陪伴分子”而起作用，例如，其可以是陪伴分子以便移動抗原多肽到合適的細(xì)胞類型來優(yōu)化CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。彈道DNA遞送直接印入DNA到皮膚前體。E7-HSP70 DNA-轉(zhuǎn)染的樹狀細(xì)胞(DCs)表達(dá)HSP70。HSP70是胞質(zhì)HSP，其在蛋白質(zhì)折疊，運送和降解中起者多種作用。其涉及I類MHC限制性抗原處理。因此，DNA疫苗編碼的HSP融合產(chǎn)物可以更有效地靶向蛋白酶體處理。
CD8+T細(xì)胞可以是基因槍-介導(dǎo)的E7-HPS70 DNA接種中的關(guān)鍵成員。這里描述的數(shù)據(jù)表明CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫性的效應(yīng)子期中需要。相反，耗竭CD4+或者NK1.1+細(xì)胞不降低E7-HSP70 DNA產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性。該發(fā)現(xiàn)與使用蛋白質(zhì)-基礎(chǔ)的HSP疫苗的方法的結(jié)果相反，后者證明在使用來自腫瘤細(xì)胞的gp96制劑的抗腫瘤免疫性的效應(yīng)子期中需要CD4+和CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
將HSP-相關(guān)的肽導(dǎo)入MHC-1抗原呈遞途徑中涉及專門的APC對HSP復(fù)合體的吸收。只有激活的B細(xì)胞和單核細(xì)胞可以吸收HSP70，而激活的T細(xì)胞可以不轉(zhuǎn)運HSP70。盡管受體-介導(dǎo)的HSP吸收對于HSP/肽復(fù)合體蛋白質(zhì)疫苗是重要的，但是其不大可能在基因槍介導(dǎo)的E7-HSP70 DNA疫苗中起作用。DNA疫苗編碼的重組E7-HSP70融合基因通過基因槍被直接送給DCs，繞過了對受體介導(dǎo)的胞吞作用的需要。也可以發(fā)生APC的交叉引發(fā)，因為可能從其它細(xì)胞類型例如角質(zhì)細(xì)胞(也可以通過基因槍接種轉(zhuǎn)染)釋放E7-HSP70，并且然后通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入DCs。
對E7與HSP70融合的要求提示E7變得更具免疫原性，可能因為HSP70 T細(xì)胞表位的加入。用HSP70 DNA接種擴大了個體中可能存在的HSP70-反應(yīng)性T細(xì)胞的集合(由于先前接觸病原體)。這些HSP70-反應(yīng)性T細(xì)胞可能產(chǎn)生與偶聯(lián)的肽反應(yīng)的強的輔助作用；這可能是這樣的機理，即通過ELISPOT測試和通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色在用E7-HSP70融合基因接種的小鼠中觀察檢測到該機理導(dǎo)致E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率提高，但是在用混合有HSP70質(zhì)粒的E7質(zhì)粒接種的小鼠則沒有發(fā)現(xiàn)。
HSP可以通過不依賴于抗原的機理體內(nèi)和體外直接激活T細(xì)胞。不存在抗原肽的情況下，HSP能夠誘導(dǎo)抗原特異性CTL克隆的TNF-α和IFN-γ的分泌。人HSP-60能夠作為天然免疫系統(tǒng)的危險信號而起作用，并且能夠誘導(dǎo)T輔助1(TH1)促炎癥應(yīng)答。但是，單獨接種HSP70DNA或者接種混合有HSP70質(zhì)粒的E7質(zhì)粒的小鼠沒有觀察到E7-特異性CD4+T細(xì)胞數(shù)目的顯著增加。DNA疫苗的HSP成分刺激的γδT細(xì)胞也可以參與E7-HSP70 DNA疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤作用。
盡管E7-HSP70通過增強的I類MHC呈遞產(chǎn)生有效的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，將抗原靶向于II類MHC呈遞途徑的其它構(gòu)建體可以提供增強的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答?？梢怨餐┯弥苯釉鰪奍類MHC和II類MHC限制性途徑的疫苗的給藥。例如，其中第二DNA編碼用于增強E7的II類MHC呈遞途徑的LAMP-1內(nèi)體/溶酶體靶向信號的DNA構(gòu)建體，例如嵌合Sig/E7/LAMP-1 DNA疫苗能夠和本發(fā)明的核酸和疫苗共同施用來刺激抗原-特異性CD4+T細(xì)胞。這里描述的與II類MHC-靶向疫苗，例如Sig/E7/LAMP-1聯(lián)合的E7-HSP70疫苗可以以協(xié)同方式激活免疫系統(tǒng)的多個臂，導(dǎo)致顯著增強的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和有效的抗腫瘤作用。
這些結(jié)果證明呈彈道施用的DNA疫苗的形式的本發(fā)明舉例的嵌合核酸(編碼HSP70和HPV-16 E7融合蛋白的DNA融合構(gòu)建體)能夠產(chǎn)生比單獨的編碼抗原E7的DNA疫苗更強的E7-特異性CD8+T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗HPV-16 E7-表達(dá)鼠腫瘤的抗腫瘤作用。因此，這些結(jié)果證明HSP70序列(和，如這里所述的，羧基-末端HSP結(jié)構(gòu)域的融合體)與抗原基因(或者其片段)的融合大大提高了DNA疫苗的效價。該策略被用來預(yù)防和治療疾病，例如，傳染性疾病，和腫瘤和癌癥體系，特別是帶有已知的腫瘤-特異性抗原的那些。
實施例2通過編碼GM-CSF的DNA序列和假單孢桿菌外毒素A的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域與抗原基因的連接提高DNA疫苗效價下面的實施例描述了本發(fā)明的成分和方法有效用于體內(nèi)增強抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答和治療腫瘤的研究。
構(gòu)建了編碼免疫原“融合蛋白”成分的嵌合核酸，其中編碼GM-CSF(或者其片段)的DNA(可操作地連接)于抗原-編碼序列的結(jié)構(gòu)域。盡管本發(fā)明不受任何特殊機理的限制，得到的融合蛋白可以已經(jīng)增強了其中包含的抗原對表達(dá)GM-CSF受體，例如專門的APC及其前體的靶向性。編碼ETA多肽的DNA的存在，例如假單孢桿菌外毒素A 的II結(jié)構(gòu)域(ETA(dII)(SEQ ID NO3)的存在，可以介導(dǎo)抗原自內(nèi)體/溶酶體區(qū)室到胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運來增強I類MHC呈遞。
通過將編碼GM-CSF和ETA(dII)的DNA序列與模型抗原E7的基因融合來制備DNA嵌合體(GM-ETA(dII)-E7)。使用本領(lǐng)域公認(rèn)的人癌癥的小鼠模型來評價該構(gòu)建體激發(fā)的免疫原性和抗腫瘤活性。通過肌內(nèi)或皮內(nèi)注射使用GM-ETA(dII)-E7嵌合體DNA疫苗對小鼠免疫增強E7-特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗E7-表達(dá)鼠腫瘤細(xì)胞系(TC-1)的有效抗腫瘤保護和治療。在編碼其它構(gòu)建體，特別是GM-E7，ETA(dII)-E7，或GM-ETA(dII)的DNA疫苗中沒有發(fā)現(xiàn)這種顯著的抗腫瘤作用。這里描述的DNA接種策略用于針對癌癥和病原體微生物的感染的抗原特異性免疫治療。
改進(jìn)外源抗原的I類MHC呈遞作用是提高DNA疫苗效價的策略，這一點可以用假單孢桿菌外毒素A的H結(jié)構(gòu)域(ETA(dII))檢驗ETA是阻斷蛋白質(zhì)合成的來自銅綠假單孢桿菌屬(Pseudomonasaeruginosa)細(xì)菌的毒素。II結(jié)構(gòu)域，或者ETA(dII)，使得從內(nèi)體/溶酶體區(qū)室轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)，這導(dǎo)致外源抗原I類MHC呈遞作用的增強。因為I結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)LDL-結(jié)合，并且III結(jié)構(gòu)域具有與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的毒性能力，這些不期望的ETA的部分被替代或者缺失。使用DNA嵌合體(GM-ETA(dII)-E7)產(chǎn)生下述數(shù)據(jù)。HPV-16 E7被用作模型抗原，因為其是HPV-相關(guān)惡性腫瘤中廣泛表達(dá)和充分表征的臨床相關(guān)致癌基因蛋白質(zhì)。GM-CSF DNA可以插入到各種APC中，誘導(dǎo)樹狀細(xì)胞(DC)成熟的增強。通過與抗原連接，GM-CSF也可以增強抗原對表達(dá)GM-CSF受體(GM-CSF-R)，例如專門的APCs和它們的前體的靶向性。以DNA形式連接抗原的ETA(dII)也可以將抗原從內(nèi)體/溶酶體區(qū)室轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)，導(dǎo)致I類MHC增強的呈遞作用。用根據(jù)GM-ETA(dII)-E7實施例涉及的嵌合DNA構(gòu)建體接種提供激活I(lǐng)類和II類MHC限制途徑所需的效力，導(dǎo)致增強的E7-特異性免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用。
使用下面的材料和方法產(chǎn)生下述數(shù)據(jù)。
DNA構(gòu)建體和制備使用5′端引物，5′-GGGGAGATCTGGATGTGGCTGCAGAATTTA-3′(SEQ ID NO11)和3′端引物(EcoRI)，5′-GGGAGAATTCTTTTGGACTGGTTTTTTGCAT-3′(SEQ ID NO12)通過PCR獲得編碼鼠GM CSF的DNA片段。使用從GM-CSF-轉(zhuǎn)導(dǎo)的B-16黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA作為PCR的模板。
表5鼠GM-CSF的氨基酸序列MWLQNLLFLGIVVYSLSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPVQK(SEQ ID NO1)；(SEQ ID NO1)；GENBANK登記號No.X02333。
表6鼠GM-CSF的cDNA序列g(shù)agctcagca agcgctctcc cccaattccc ttagccaaag tggacgccac cgaacagaca 61gacctaggct aagaggtttg atgtctctgg ctacccgact ttgaaaattt tccgcaaagg 121aaggcctttt gactacaatggcccacgaga gaaaggctaa ggtcctgagg aggatgtggc 181tgcagaattt acttttcctg ggcattgtgg tctacagcct ctcagcaccc acccgctcac 241ccatcactgt cacccggcct tggaagcatg tagaggccat caaagaagcc ctgaacctcc 301tggatgacat gcctgtcaca ttgaatgaag aggtagaagt cgtctctaac gagttctcct 361tcaagaagct aacatgtgtg cagacccgcc tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca 421atttcaccaa actcaagggc gccttgaaca tgacagccag ctactaccag acatactgcc 481ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac aagttaccac ctatgcggat ttcatagaca 541gccttaaaac ctttctgact gatatcccct ttgaatgcaa aaaaccagtc caaaaatgag 601gaagcccagg ccagctctga atccagcttc tcagactgct gcttttgtgc ctgcgtaatg 661agccaggaac tcggaatttc tgccttaaag ggaccaagag atgtggcaca gccacagttg 721
gagggcagta tagccctctg aaacgctga ctcagcttgg acagcggcaa gacaaacgag 781agatattttc tactgatagg gaccattata tttatttata tatttatatt ttttaaatat 841ttatttattt atttatttaa ttttgcaact ctatttattg agaatgtctt accagataat 901aaattattaa aacttt (SEQ ID NO2)；(SEQ ID NO2)；GENBANK登記號No.X05906；＂atg＂起始位點下有下劃線。
接著將擴增的產(chǎn)物亞克隆到pSP73載體(Promega)的BgIII和EcoRI位點產(chǎn)生pSP73-GM。利用相同的策略使用人GM-CSF序列(GENBANK登記號M11220)制備DNA構(gòu)建體。或者，第一DNA編碼Flt-3配體(FL)，CTLA-4，4-1BB，CD40配體，或者TNF受體的全部或者APC-結(jié)合片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列和核苷酸序列。測定給定的多肽或蛋白質(zhì)片段是否結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(APC)(例如巨噬細(xì)胞或DC)也是本領(lǐng)域公知的。例如，用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記多肽(以及已知不結(jié)合APC的對照多肽)并且與APC溫育。洗滌細(xì)胞之后，APC之上或之中標(biāo)記物的檢測(與對照物相比較)表明該多肽具有APC結(jié)合結(jié)構(gòu)域或序列。
用5′端引物，5′-GGGAGAATTCTCGCCTGTCACTTTCCCGAG-3′(SEQ ID NO13)和3′端引物，5□-GGAAGGATCCAGTTCTGCGTGCCGCGGG-3’(SEQ ID NO14)應(yīng)用PCR產(chǎn)生包含ETA的II結(jié)構(gòu)域的DNA片段。
表7ETA的氨基酸序列MHLIPHWIPLVASLGLLAGGSSASAAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQTQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO3)；GENBANK登記號No.K01397 M23348；殘基1-25＝信號肽；成熟肽起點下劃線＂A＂；轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域跨越殘基247-417。
表8編碼ETA的cDNActgcagctgg tcaggccgtt tccgcaacgc ttgaagtcct ggccgatata ccggcagggc 61cagccatcgt tcgacgaata aagccacctc agccatgatg ccctttccat ccccagcgga 121accccgacat ggacgccaaa gccctgctcc tcggcagcct ctgcctggcc gccccattcg 181ccgacgcggc gacgctcgac aatgctctct ccgcctgcct cgccgcccgg ctcggtgcac 241cgcacacggc ggagggccag ttgcacctgc cactcaccct tgaggcccgg cgctccaccg 301gcgaatgcgg ctgtacctcg gcgctggtgc gatatcggct gctggccagg ggcgccagcg 361ccgacagcct cgtgcttcaa gagggctgct cgatagtcgc caggacacgc cgcgcacgct 421gaccctggcg gcggacgccg gcttggcgag cggccgcgaa ctggtcgtca ccctgggttg 481tcaggcgcct gactgacagg ccgggctgcc accaccaggc cgagatggac gccctgcatg 541tatcctccga tcggcaagcc tcccgttcgc acattcacca ctctgcaatc cagttcataa 601atcccataaa agccctcttc cgctccccgc cagcctcccc gcatcccgca ccctagacgc 661cccgccgctc tccgccggct cgcccgacaa gaaaaaccaa ccgctcgatc agcctcatcc 721ttcacccatc acaggagcca tcgcgatgca cctgataccc cattggatcc ccctggtcgc 781cagcctcggc ctgctcgccg gcggctcgtc cgcgtccgcc gccgaggaag ccttcgacct 841ctggaacgaa tgcgccaaag cctgcgtgct cgacctcaag gacggcgtgc gttccagccg 901catgagcgtc gacccggcca tcgccgacac caacggccag ggcgtgctgc actactccat 961ggtcctggag ggcggcaacg acgcgctcaa gctggccatc gacaacgccc tcagcatcac 1021
agcgacggc ctgaccatcc gcctcgaagg cggcgtcgag ccgaacaagc cggtgcgcta 1081cagctacacg cgccaggcgc gcggcagttg gtcgctgaac tggctggtac cgatcggcca 1141gagaagccc tcgaacatca aggtgttcat ccacgaactg aacgccggca accagctcag 1201ccacatgtcg ccgatctaca ccatcgagatgggcgacgag ttgctggcga agctggcgcg 1261cgatgccacc ttcttcgtca gggcgcacga gagcaacgag atgcagccga cgctcgccat 1321cagccatgcc ggggtcagcg tggtcatggc ccagacccag ccgcgccggg aaaagcgctg 1381agcgaatgg gccagcggca aggtgttgtg cctgctcgac ccgctggacg gggtctacaa 1441ctacctcgcc cagcaacgct gcaacctcga cgatacctgg gaaggcaaga tctaccgggt 1501gctcgccggc aacccggcga agcatgacct ggacatcaaa cccacggtca tcagtcatcg 1561cctgcacttt cccgagggcg gcagcctggc cgcgctgacc gcgcaccagg cttgccacct 1621gccgctggag actttcaccc gtcatcgcca gccgcgcggc tgggaacaac tggagcagtg 1681cggctatccg gtgcagcggc tggtcgccct ctacctggcg gcgcggctgt cgtggaacca 1741ggtcgaccag gtgatccgca acgccctggc cagccccggc agcggcggcg acctgggcga 1801gcgatccgc gagcagccgg agcaggcccg tctggccctg accctggccg ccgccgagag 1861cgagcgcttc gtccggcagg gcaccggcaa cgacgaggcc ggcgcggcca acgccgacgt 1921gtgagcctg acctgcccgg tcgccgccgg tgaatgcgcg ggcccggcgg acagcggcga 1981cgccctgctg gagcgcaact atcccactgg cgcggagttc ctcggcgacg gcggcgacgt 2041cagcttcagc acccgcggca cgcagaactg gacggtggag cggctgctcc aggcgcaccg 2101caactggag gagcgcggct atgtgttcgt cggctaccac ggcaccttcc tcgaagcggc 2161gcaaagcatc gtcttcggcg gggtgcgcgc gcgcagccag gacctcgacg cgatctggcg 2221cggtttctat atcgccggcg atccggcgct ggcctacggctacgcccagg accaggaacc 2281cgacgcacgc ggccggatcc gcaacggtgc cctgctgcgg gtctatgtgc cgcgctcgag 2341ctgccgggc ttctaccgca ccagcctgac cctggccgcg ccggaggcgg cgggcgaggt 2401cgaacggctg atcggccatc cgctgccgct gcgcctggac gccatcaccg gccccgagga 2461gaaggcggg cgcctggaga ccattctcgg ctggccgctg gccgagcgca ccgtggtgat 2521tccctcggcg atccccaccg acccgcgcaa cgtcggcggc gacctcgacc cgtccagcat 2581cccgacaag gaacaggcga tcagcgccct gccggactac gccagccagc ccggcaaacc 2641gccgcgcgag gacctgaagt aactgccgcg accggccggc tcccttcgca ggagccggcc 2701tctcggggc ctggccatac atcaggtttt cctgatgcca gcccaatcga atatgaattc(SEQ ID NO4)；GENBANK登記號No.K01397 M23348。
接著將擴增產(chǎn)物亞克隆到pSP73-GM的EcoRI和BamHI位點產(chǎn)生pSP73-GM-ETA(dII)。用5′端引物，5′-GGGAGGATCCTCATGCATGGAGATACACCT-3′(SEQ ID NO15)和3′端引物，5′-GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG-3′(SEQ ID NO16)通過PCR合成包含HPV-16 E7的DNA片段。使用質(zhì)粒pCMVneoBamHI-E7作為PCR反應(yīng)的模板。將擴增的產(chǎn)物進(jìn)一步克隆到pSP73-GM-ETA(dII)的BamHI和HindIII位點產(chǎn)生pSP73-GM-ETA(dII)-E7。通過DNA測序證實GM-ETA(dII)-E7的序列。通過BglII和HindII限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7獲得pcDNA3.1-GM-ETA(dII)-E7并且將分離的GM-ETA(dII)-E7片段克隆到巨細(xì)胞病毒啟動子下游pcDNA3.1(-)表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)的獨特的BamHI和HindIII克隆位點。通過BglII和BamHI限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7產(chǎn)生pcDNA3.1-GM-ETA(dII)并且將分離的GM-ETA(dII)片段克隆到pcDNA3.1(-)的獨特BamHI克隆位點。通過用EcoRI和HindIII限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7獲得pcDNA3.1-ETA(dII)-E7并且將分離的ETA(dII)-E7片段克隆到pcDNA3.1(-)的獨特EcoRI和HindIII克隆位點。通過BglII和BamHI限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7產(chǎn)生pcDNA3.1-GM并且將分離的GM-CSF片段克隆到pcDNA3.1(-)的獨特BamHI克隆位點。通過用EcoRI和BamHI限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7獲得pcDNA3.1-ETA(dII)并且將分離的ETA(dII)片段克隆到pcDNA3.1(-)的獨特EcoRI和BamHI克隆位點。通過用BamHI和HindIII限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7獲得pcDNA3.1-E7并且將分離的E7片段克隆到pcDNA3.1(-)的獨特BamHI和HindIII克隆位點。為了產(chǎn)生pcDNA3.1-GM-E7，使用5′端引物，5′-CCCAGATCTAATCATGCATG-3′(SEQ ID NO17)和3′端引物，5′-GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG-3′
(SEQ ID NO18)通過PCR合成合成E7片段。用BglII和HindIII消化擴增的E7產(chǎn)物并且進(jìn)一步克隆到pSP73-GM的BamHI和HindIII位點。通過BglII和HindIII消化，從pSP73-GM-E7分離GM-E7片段并且克隆到pcDNA3.1(-)的BamHI和HindII位點。
通過DNA測序證明這些構(gòu)建體的精確性。將攜帶GM，ETA(dII)，E7，GM-ETA(dII)，ETA(DII)-E7，GM-E7或GM-ETA(DII)-E7基因插入物的質(zhì)粒DNA和＂空白＂質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到亞克隆有效DH5(TM細(xì)胞(LifeTechnologies，USA)中。然后擴增DNA并且用雙CsCl純化(BioServeBiotechnologies，Laurel，Maryland)。在各個制備中利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查質(zhì)粒DNA的整合性和不存在大腸埃希氏桿菌DNA或RNA。通過在260nm下測定光密度測定DNA濃度。通過限制酶消化和凝膠電泳證實插入的E7片段的存在。
DNA接種使用氦-驅(qū)動基因槍(Bio-Rad，Hercules，CA)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法并且如上所述進(jìn)行基因槍顆粒-介導(dǎo)的DNA接種。
胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞儀分析來自原初的或者接種組小鼠的脾細(xì)胞或者與包含I類MHC表位的E7肽(殘基49-57；SEQ ID NO5)或者與包含II類MHC肽的E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO6)一起溫育。以2微克/毫升的濃度加入E7肽20小時。為了檢測E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體和E7-特異性CD4+T輔助細(xì)胞應(yīng)答，分別使用CD8+CTL表位殘基49-57和殘基30-67。在從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞之前6小時加入Golgistop(Pharmigen，San Diego，CA)。然后細(xì)胞在FACSCAN緩沖液中洗滌一次并且用藻紅蛋白(PE)-綴合的單克隆大鼠抗-小鼠CD8或CD4抗體(Pharmingen，San Diego，CA)染色。使用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)試劑盒根據(jù)廠商說明對細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。FITC-綴合的抗-IFN-γ或者抗-IL-4抗體和免疫球蛋白同種型對照抗體(大鼠IgG1)都購自Pharmingen。在Becton-DickensonFACScan上使用CELLQuest軟件(Becton Dickson ImmunocytometrySystem，Mountain View，CA)進(jìn)行分析。
小鼠和鼠腫瘤細(xì)胞
上面實施例1描述了小鼠和腫瘤細(xì)胞例如TC-1細(xì)胞的制備和保持。
體內(nèi)腫瘤保護關(guān)于腫瘤保護實驗，通過基因槍用2微克的攜帶GM，ETA(dII)，E7，GM-ETA(dII)，ETA(DII)-E7，GM-E7或GM-ETA(DII)-E7基因插入物的質(zhì)粒DNA和空白質(zhì)粒載體對小鼠接種(每組5只)。一周之后，用和第一次接種相同的給藥法對小鼠加強免疫。另一組小鼠(每組5只)接種一次(沒有進(jìn)一步加強)。最后接種之后一周，用5×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞對小鼠右腿皮下攻擊，并且每周兩次監(jiān)測。
體內(nèi)抗體耗竭體內(nèi)抗體耗竭的方法如上所述。簡要地說，通過基因槍用2微克的MG-ETADII-E7 DNA接種C57BL/6小鼠，一周之后加強免疫，并且用5×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊?？贵w耗竭在腫瘤攻擊之前一周就開始了。對于CD4耗竭，使用MAb GK1.5；對于CD8耗竭，使用MAb 2.43，對于NK1.1耗竭，使用MAb PK136。流式細(xì)胞儀分析表明耗竭了95％以上的合適的淋巴細(xì)胞亞群，而其它亞群的水平正常。腫瘤攻擊之后第40天耗竭終止。
GM-ETA(dII)-E7融合DNA疫苗的產(chǎn)生和表征圖8中證明GM-ETA(dII)-E7，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CSF，ETA(dII)和E7的構(gòu)建體的示意圖。
用GM-ETA(dII)-E7融合DNA接種增強E7-特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答CD8+T淋巴細(xì)胞是抗腫瘤效應(yīng)子中最重要的成分。為了測定GM-ETA(dII)-E7DNA疫苗產(chǎn)生的E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率，利用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。利用對CD8和胞內(nèi)IFN-γ雙染色通過流式細(xì)胞儀分析定量測定E7(49-57)-特異性CD8+T細(xì)胞前體。從該項測試得到的值與ELISPOT結(jié)果密切相關(guān)。如圖9所示，通過流式細(xì)胞儀分析得知用GM-ETA(dII)-E7DNA接種的小鼠產(chǎn)生最大數(shù)值的E7-特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞前體，而用E7，GM-CSF，ETA(dII)，GM-ETA(dII)，GM-E7或ETA-E7DNA接種的小鼠沒有給出高于載體接種的對照物的信號。
用GM-ETA(dII)-E7融合DNA接種也增強E7-特異性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為了測定GM-ETA(dII)-E7 DNA疫苗產(chǎn)生的E7-特異性CD4+T前體細(xì)胞和細(xì)胞因子分布，對來自免疫小鼠的脾細(xì)胞上的CD4表面標(biāo)記物和胞內(nèi)IFN-γ進(jìn)行雙染色，接著進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。體外將來自免疫小鼠的脾細(xì)胞與E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO7)一起培養(yǎng)過夜并且對CD4和胞內(nèi)IFN-γ染色。E7肽(殘基30-67；SEQ ID NO7)在HPV-16的E7可讀框蛋白質(zhì)中包含主要T輔助表位。測定蛋白質(zhì)或肽的多肽序列內(nèi)T輔助細(xì)胞表位的方法是本領(lǐng)域公知的。
利用流式細(xì)胞儀分析IFN-γ分泌CD4+T細(xì)胞百分比。如圖10所示，與用E7 DNA，GM-CSF，ETA(dII)，GM-ETA(dII)，ETA-E7 DNA或單獨載體接種的小鼠相比，用GM-ETA(dII)-E7 DNA接種的小鼠產(chǎn)生更大數(shù)量的CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。用GM-ETA(dII)-E7 DNA接種的小鼠產(chǎn)生類似水平的E7-特異性CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。這些結(jié)果證明在接種的小鼠中GM-CSF在增強IFN-γ分泌E7-特異性CD4+T細(xì)胞中起著重要作用。這些結(jié)果還證明包含與編碼靶抗原的DNA可操作地連接的GM-CSF-編碼序列的DNA疫苗比只包含抗原-編碼序列的那些更有效。
用GM-ETA(dII)-E7融合DNA接種增強小鼠抗TC-1腫瘤生長的保護作用為了測定用GM-ETA(dII)-E7 DNA構(gòu)建體接種是否保護小鼠抗E7-表達(dá)腫瘤，使用各種DNA疫苗進(jìn)行體內(nèi)腫瘤保護實驗。通過基因槍用2微克裸DNA/小鼠對小鼠接種并且在一周之后用相同劑量加強。最后接種之后7天用5×104TC-1/小鼠在右腿皮下對小鼠攻擊。接受GM-ETA(dII)-E7 DNA接種的那些小鼠100％在TC-1攻擊之后30天保持沒有腫瘤，而所有的沒有接種的小鼠和接受E7 GM-CSF，ETA(dII)，GM-ETA(dII)，GM-E7，ETA-E7 DNA或空白質(zhì)粒的小鼠在腫瘤攻擊之后15天內(nèi)發(fā)生腫瘤生長(圖11)。為了測定GM-ETA(dII)-E7DNA產(chǎn)生的抗腫瘤作用是否持久，用5×104TC-1/小鼠在左腿皮下對沒有腫瘤的動物再次攻擊。在腫瘤攻擊之后達(dá)30天沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤生長。這些結(jié)果表明GM-ETA(dII)-E7融合DNA顯著增強抗TC-1腫瘤的生長的抗腫瘤免疫性，并且GM-ETA(dII)-E7DNA產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性是持久的。
CD8+T細(xì)胞對于GM-ETA(dII)-E7DNA疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤作用是必需的為了測定對排斥E7-陽性腫瘤細(xì)胞是重要的淋巴細(xì)胞亞型，進(jìn)行體內(nèi)抗體耗竭實驗。抗體耗竭在腫瘤攻擊之前一周開始并且在腫瘤攻擊之后圖12所示的天數(shù)終止。如圖12所示，所有的原初狀態(tài)小鼠和所有的耗竭CD8+T細(xì)胞的小鼠在腫瘤攻擊之后14天內(nèi)長出腫瘤。相反，所有的沒有耗竭的小鼠和所有的耗竭CD4+T細(xì)胞或者NK1.1細(xì)胞的小鼠在腫瘤攻擊之后數(shù)天保持沒有腫瘤。這些結(jié)果表明CD8+T細(xì)胞對于GM-ETA(dII)-E7DNA疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤免疫性是必需的。
這里描述的數(shù)據(jù)證明編碼攜帶APC-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和抗原性表位的本發(fā)明的嵌合核酸，DNA構(gòu)建體，誘導(dǎo)對編碼的抗原性表位特異性的有效免疫應(yīng)答。結(jié)果表明，在小鼠腫瘤中，嵌合體中GM-CSF(GM)基因，ETA(dII)基因，和HPV-16 E7基因的融合產(chǎn)生增強的E7-特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗HPV-16 E7-表達(dá)鼠腫瘤的抗腫瘤作用。
通過肌內(nèi)或皮內(nèi)注射使用GM-ETA(dII)-E7嵌合體對小鼠接種能介導(dǎo)E7-特異性免疫應(yīng)答和抗E7-表達(dá)鼠腫瘤細(xì)胞系(TC-1)的有效抗腫瘤保護作用和治療。而在編碼其它構(gòu)建體，特別是GM-E7，ETA(dII)-E7，或GM-ETA(dII)DNA疫苗中沒有發(fā)現(xiàn)這種顯著的抗腫瘤作用。此外，與接受其它構(gòu)建體的小鼠相比，對接受GM-ETA(dII)-E7的小鼠發(fā)現(xiàn)更大的CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，這些結(jié)果表明GM-ETA(dII)-E7嵌合DNA代表對于選擇的抗原，例如癌癥免疫治療中的癌抗原，或者，抗病原體的抗原的增強細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的新的策略，用于治療或預(yù)防與那種病原體相關(guān)的病癥。結(jié)果還證明該疫苗的成分在產(chǎn)生有效的E7-特異性免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用中是重要的。
結(jié)果表明GM-CSF基因是GM-ETA(dII)-E7融合蛋白中的重要成分，這一點由GM-ETA(dII)-E7和ETA(dII)-E7 DNA構(gòu)建體的比較證明。ETA(dII)-E7構(gòu)建體沒有GM-ETA(dII)-E7的GM-CSF成分，這可以導(dǎo)致沒有增強的E7-特異性CD8+或CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用。
GM-CSF誘導(dǎo)粒細(xì)胞和APC的產(chǎn)生并且作為樹狀細(xì)胞(DCs)的免疫刺激信號起作用。此外，GM-CSF靶向?qū)ｉT的APCs并且促進(jìn)它們的分化，因為APCs具有GM-CSF受體。盡管本發(fā)明不局限于任何特殊機理，GM-ETA(dII)-E7融合蛋白由于存在GM-CSF結(jié)構(gòu)域而可以誘導(dǎo)MHC和DCs和其它APCs上的共同刺激分子表達(dá)中的變化，導(dǎo)致在ETA(dII)-E7中沒有發(fā)現(xiàn)的增強的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)表明樹狀細(xì)胞上GM-CSF結(jié)構(gòu)域的免疫增強作用是GM-ETA(dII)-E7融合蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用的關(guān)鍵成分。
盡管本發(fā)明不局限于任何特殊機理，本發(fā)明的抗原-特異性免疫治療方法可以靶向DC的表面分子，其使得抗原直接進(jìn)入DC進(jìn)行加工和呈遞?？梢杂米髅庖咴煞值腁PC-結(jié)合組分的其它多肽包括Flt-3配體(FL)，CD40配體，TNFα，和41BB。編碼這樣的多肽的DNA被用作本發(fā)明的免疫原成分或DNA疫苗的第一DNA組分。Flt3配體(Flt3-1或FL)可以體內(nèi)增強樹狀細(xì)胞的功能和量。Flt3(fms-樣酪氨酸激酶3)是本領(lǐng)域公知的鼠酪氨酸激酶受體，并且Flt3已經(jīng)被用來鑒定和接著克隆相應(yīng)的配體，F(xiàn)lt3-L(Hannum等，1994，自然(Nature).368643-648；Maraskovsky等，實驗藥物雜志(J.of Experimental Med.)，(1996)1841953-1962；199638)。CD40配體(CD154)也是有用的；它可以由于其對DC上的作用而提高疫苗效價。TNF-α代表提高疫苗效價的另一種策略；TNF-α可以促進(jìn)DC遷移到淋巴樣組織并且分化并且發(fā)育朗氏細(xì)胞。提高疫苗效價的另一種策略是使用4-1BBL，結(jié)合4-1BB(CD137)的腫瘤壞死因子家族的細(xì)胞因子。DC上4-1BBL表達(dá)之后與4-1BB相互作用提供了引發(fā)增殖的T細(xì)胞的第二共同刺激信號，其獨立于通過CD28受體的信號傳導(dǎo)。這些提高疫苗效價的策略以類似于GM-ETA(dII)-E7中GM-CSF的方式使用DC表面分子，使得抗原靶向DC并且接著誘導(dǎo)DC分化并且增強抗原加工和呈遞。
白喉，梭狀芽孢桿菌屬，Botulinum(tetanus)，芽孢桿菌屬，耶爾森氏菌屬，霍亂弧菌(霍亂)，或者百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)毒素代表可以具有治療應(yīng)用的來自細(xì)菌的分子。這樣的分子可以以類似于本發(fā)明DNA疫苗編碼的融合多肽中ETA結(jié)構(gòu)域的方式發(fā)揮功能。這些結(jié)構(gòu)域可以引起通過抗原從內(nèi)體/溶酶體區(qū)室轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運作用增強I類MHC呈遞作用(特別是如果編碼該毒素的基因的毒性結(jié)構(gòu)域被突變或缺失的話)。
下面測定一種給定的多肽或蛋白質(zhì)片段是否具有胞質(zhì)轉(zhuǎn)運活性，并且因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)作為本發(fā)明融合蛋白中的一個結(jié)構(gòu)域。炭疽毒素致死因子(LF)已經(jīng)被證明將外來蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到真核生物細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中，類似白喉毒素的機理。耶爾森氏菌屬(Yersiniae)細(xì)胞毒素YopE和YopH用作轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域并且用于抗原跨越宿主細(xì)胞膜進(jìn)入巨噬細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的內(nèi)在化作用。百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)腺苷酸毒素(CyaA)通過細(xì)胞膜直接轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，因此增強I類MHC抗原操作。因此，本發(fā)明的融合蛋白和疫苗(例如，GM-ETA(dII)-E7融合蛋白中ETA(dII)結(jié)構(gòu)域)利用的疫苗效價增強策略可能類似于這些細(xì)菌毒素的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的生物機理。這些結(jié)構(gòu)域可以使抗原從內(nèi)體/溶酶體區(qū)室逃脫到胞質(zhì)溶膠中，導(dǎo)致I類MHC呈遞作用的增強。
實施例3通過連接編碼假單孢桿菌屬外毒素A的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的DNA到抗原基因?qū)NA疫苗效價的增強下面的實施例描述證明本發(fā)明的成分和方法對于體內(nèi)增強抗原-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答和治療腫瘤是有效的這樣的研究。
本發(fā)明不受任何特殊機理的限制，編碼包括ETA結(jié)構(gòu)域和HPV-16E7抗原的融合蛋白的DNA疫苗可以導(dǎo)致與沒有編碼ETA的序列的疫苗相比，E7分布給更大數(shù)目的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，特別是對于通過基因槍皮內(nèi)施用的核酸。多肽結(jié)構(gòu)域ETA(dII)可以釋放蛋白質(zhì)給其它細(xì)胞吸收。
免疫測試表明用與ETA(dII)融合的E7接種導(dǎo)致E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率增加30-倍，沒有顯著的E7-特異性CD4或抗體增強。體外研究表明轉(zhuǎn)染ETA(dII)-E7 DNA的細(xì)胞以比轉(zhuǎn)染野生型E7 DNA的細(xì)胞更有效的方式通過I類MHC途徑呈遞E7抗原。此外，ETA融合蛋白脈沖的來自骨髓的樹狀細(xì)胞以比野生型E7蛋白質(zhì)脈沖的樹狀細(xì)胞更有效的方式通過I類MHC途徑呈遞E7抗原。令人吃驚地增強CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性導(dǎo)致有效的皮下腫瘤保護和肺轉(zhuǎn)移的治療。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的成分和方法通過增加表達(dá)的抗原的擴散而提高抗原特異性DNA疫苗效價。例如，施用編碼ETA-抗原融合蛋白或嵌合體的DNA疫苗，可以加強胞內(nèi)擴散該融合蛋白中表達(dá)的抗原(相對編碼包括抗原但是缺少ETA結(jié)構(gòu)域的多肽的類似DNA疫苗而言)。
實施例4抗原編碼序列與FL(Flt-3配體)序列的連接提高DNA疫苗效價下面的實施例描述證明本發(fā)明的成分和方法對于體內(nèi)增強抗原-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答和治療腫瘤是有效的這樣的研究。
Flt-3配體(FL)在專門的抗原呈遞細(xì)胞，特別是樹狀細(xì)胞的產(chǎn)生中是重要的細(xì)胞因子。盡管本發(fā)明不受任何特殊機理的限制，其中Flt-3配體結(jié)構(gòu)域連接期望對其有免疫性的抗原的重組分子(包括FL和抗原的融合蛋白)可以使抗原靶向APC，例如樹狀細(xì)胞。
使用HPV-16 E7作為抗原，評價Flt3-配體(FL)-抗原構(gòu)建體(圖19)對裸DNA疫苗產(chǎn)生的抗原特異性免疫性的效力的影響。SEQ ID NO25的殘基1-189是FL-衍生的，殘基190-287是E7-衍生的(SEQ ID NO25的288位點中的＂Z＂表示一個終止)。通過基因槍皮內(nèi)施用編碼FL-E7融合多肽的DNA構(gòu)建體。發(fā)現(xiàn)相對于在沒有FL-編碼序列存在下包含野生型E7基因的疫苗來說，包含嵌合FL/E7融合基因的疫苗大大提高E7-特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。
體外研究表明轉(zhuǎn)染FL/E7 DNA的細(xì)胞以比轉(zhuǎn)染野生型E7 DNA的細(xì)胞更有效的方式通過I類MHC途徑呈遞E7抗原。此外，F(xiàn)L/E7融合蛋白脈沖的來自骨髓的樹狀細(xì)胞以比野生型E7蛋白質(zhì)脈沖的樹狀細(xì)胞更有效的方式通過I類MHC途徑呈遞E7抗原。更重要的是，該融合將效力很小的疫苗轉(zhuǎn)化為具有顯著的抗已發(fā)生的E7-表達(dá)轉(zhuǎn)移腫瘤的效力的疫苗。另人感興趣的是，F(xiàn)L/E7融合疫苗主要靶向CD8+T細(xì)胞并且抗腫瘤作用完全是CD4-獨立的。這些數(shù)據(jù)表明Flt3-配體DNA與抗原-編碼序列的融合通過CD8-依賴途徑提高DNA疫苗的效價。
實施例5賦予抗原-特異性免疫應(yīng)答的增強的HSP70的結(jié)構(gòu)域下面的實施例描述證明本發(fā)明的嵌合核酸對于體內(nèi)增強抗原-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答和治療腫瘤是有效的這樣的研究，所述本發(fā)明嵌合核酸編碼包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段的第一多肽結(jié)構(gòu)域的嵌合多肽。
測定結(jié)核分枝桿菌HSP70的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。鑒定了至少三個功能結(jié)構(gòu)域ATP酶結(jié)構(gòu)域(包含SEQ ID NO9的殘基1-356)，底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SD；包含SEQ ID NO9的殘基357-516)和羧基末端結(jié)構(gòu)域(CD；包含SEQ ID NO9的殘基517-625)(圖16)。測定了該HSP70的每一個結(jié)構(gòu)域?qū)β鉊NA疫苗效價的貢獻(xiàn)。編碼各結(jié)構(gòu)域的DNA符合讀框地連接，即，可操作地連接，于編碼乳頭瘤病毒抗原E7的DNA。測定了E7-特異性CD8T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
利用標(biāo)準(zhǔn)基因槍DNA遞送方法皮內(nèi)用包含下面基因的DNA疫苗對C57BL/6小鼠接種(i)HSP70基因；(ii)野生型HPV-16 E7基因；(iii)與HSP70(E7-ATP)的ATP酶結(jié)構(gòu)域融合的HPV-16 E7基因；(iv)與HSP70(E7-SD)的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SD)融合的HPV-16 E7基因；或者(v)與HSP70(E7-CD)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD)融合的IIPV-16 E7。將所有的嵌合E7/熱激蛋白構(gòu)建體克隆到巨細(xì)胞病毒啟動子下游pcDNA3.1(-)表達(dá)載體的多個克隆位點(圖17)。通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色使用E7-特異性I類MHC肽(RAHYNIVTF；SEQ ID NO7的氨基酸49-57)分析體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答來評價E7-特異性CD8+T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫性。
圖18A是說明E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率的代表性FASCAN。來自接種小鼠的脾細(xì)胞體外與E7肽(SEQ ID NO7的氨基酸49-57)培養(yǎng)過夜，并且對CD8+表達(dá)和胞內(nèi)IFN-γ染色。利用流式細(xì)胞儀分析用各種DNA構(gòu)建體(E7-HSP70，E7-ATP，E7-SD，E7-CD，或單獨的E7)免疫的小鼠的IFN-γ篩選CD8+T細(xì)胞前體的數(shù)目。用E7-HSP70 DNA接種的小鼠產(chǎn)生最高數(shù)目的E7-特異性CD8+前體。E7-CD產(chǎn)生第二高數(shù)量的E7-特異性CD8+前體，可與單獨的E7-HSP70相比較(并且大于E7-SD，E7-ATP，和野生型E7)。
圖18B說明IFN-γ-產(chǎn)生E7-特異性CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)目。通過流式細(xì)胞儀測定在存在(實心直方圖)和不存在(空心直方圖)E7抗原肽(SEQ ID NO7的殘基49-57)的存在下細(xì)胞的數(shù)目。數(shù)據(jù)表示為CD8+IFN-γ+細(xì)胞/3×105脾細(xì)胞的平均值+SEM。結(jié)果表明當(dāng)插入到DNA疫苗構(gòu)建體中時，編碼HSP70的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的DNA提高該DNA疫苗產(chǎn)生對該疫苗編碼的靶抗原的免疫性的效力。此外，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)包含全長HSP70的DNA疫苗中的抗原特異性I類MHC限制性CD8+T細(xì)胞免疫增強的大部分。
例如，用融合全長HSP70的E7接種導(dǎo)致E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率提高30-倍(每3×105個脾細(xì)胞大約365)(圖18A-B)。用融合HSP70的ATP結(jié)構(gòu)域的E7接種導(dǎo)致E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體頻率稍微提高(每3×105個脾細(xì)胞大約58)。類似地，用融合HSP70的SD結(jié)構(gòu)域的E7接種產(chǎn)生每3×105個脾細(xì)胞大約85個E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體。相反，用融合HSP70的CD結(jié)構(gòu)域的E7接種產(chǎn)生每3×105個脾細(xì)胞大約296個E7-特異性CD8+T細(xì)胞前體，這個量類似于用融合到全長HSP70的E7接種的小鼠獲得的量。這些結(jié)果表明HSP70的CD結(jié)構(gòu)域在DNA疫苗中帶來大部分增強的抗原特異性I類MHC限制性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
這些數(shù)據(jù)證明編碼抗原性肽(例如HPV-16 E7)和全長HSP70或HSP70的CD結(jié)構(gòu)域的融合體的DNA(沒有編碼HSP70的其它部分的DNA)大大增強了對該抗原的抗原特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。在缺少據(jù)認(rèn)為在刺激CTL應(yīng)答中重要的ATP酶結(jié)構(gòu)域中的更多的N-末端序列(SEQ ID NO9的殘基161-370)的構(gòu)建體中觀察到免疫應(yīng)答的增強。數(shù)據(jù)表明即使不存在其它HSP序列，包含編碼HSP的CD結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體的DNA疫苗也增強對該DNA疫苗編碼的靶抗原的抗原-特異性I類MHC限制性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實施例6施用表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的自主復(fù)制RNA病毒增強抗原特異性細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的產(chǎn)生在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠表達(dá)本發(fā)明的嵌合蛋白的自主復(fù)制RNA復(fù)制子，該嵌合蛋白是包括包括熱激蛋白的第一多肽結(jié)構(gòu)域和包括至少一種抗原肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。下面的實施例描述證明使用本發(fā)明的方法，這些構(gòu)建體對于體內(nèi)增強抗原-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答是有效的這樣的研究。作為模型系統(tǒng)，在新培斯病毒自主復(fù)制RNA載體，SINrep5中體內(nèi)表達(dá)包括HPV-16 E7和結(jié)核分枝桿菌HSP70的融合蛋白。測定該載體產(chǎn)生的抗原特異性免疫性的效力。這些結(jié)果還證明在新培斯病毒自主復(fù)制RNA載體中體內(nèi)表達(dá)的包括熱激蛋白多肽和抗原肽的融合蛋白對于體內(nèi)增強抗原-特異性CTL應(yīng)答是有效的。
這些實驗證明包含E7/HSP70融合基因的RNA復(fù)制子疫苗在接種的小鼠中產(chǎn)生顯著高于包含野生型E7基因的疫苗的E7-特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。此外，體外研究證明來自E7/HSP70 RNA復(fù)制子轉(zhuǎn)染的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞的E7抗原可以被骨髓衍生的樹狀細(xì)胞吸收，并且通過I類MHC途徑比野生型E7 RNA復(fù)制子轉(zhuǎn)染的編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞更有效地呈遞。更重要的是，HSP70與E7的融合將效力小的疫苗轉(zhuǎn)化為具有顯著抗E7-表達(dá)腫瘤的效價的疫苗。這種抗腫瘤作用依賴NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。這些結(jié)果表明HSP70與抗原基因的結(jié)合大大提高了自主復(fù)制RNA疫苗的效價。這些結(jié)果證明E7和HSP70連接的新培斯RNA疫苗大大提高了E7-特異性CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的擴展作用和活性，完全回避CD4臂并且獲得抗E7表達(dá)腫瘤的有效抗腫瘤免疫性。
進(jìn)一步研究了新培斯RNA疫苗促進(jìn)抗腫瘤作用的機理。發(fā)現(xiàn)新培斯E7/HSP70RNA疫苗能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡并且促進(jìn)樹狀細(xì)胞吞噬這些細(xì)胞，大大提高了E7-特異性CD8+T細(xì)胞的擴展作用和活性。這種增強的CD8應(yīng)答導(dǎo)致抗E7-表達(dá)腫瘤細(xì)胞系的有效抗腫瘤免疫性。
選擇HPV-16E7作為疫苗開發(fā)的模型疫苗，因為如上文討論的，HPV，特別是HPV-16，與大多數(shù)宮頸癌相關(guān)。
質(zhì)粒DNA構(gòu)建體和制備根據(jù)上文Chen(2000)所述制備載體pcDNA3-HSP70，pcDNA3-E7和pcDNA3-E7/HSP70。例如Bredenbeek(1993)病毒學(xué)雜志(J.Virol)676439-6446描述過新培斯病毒RNA復(fù)制子載體，SINrep5。通過分別用XbaI和PmeI限制酶酶切pcDNA3-HSP70，pcDNA3-E7和pcDNA3-E7/HSP70通過分離編碼結(jié)核分枝桿菌HSP70，HPV-16E7和嵌合的E7/HSP70制備載體SINrep5-HSP70，SINrep5-E7和SINrep5-E7/HSP70。使用凝膠分離消化的產(chǎn)物。這些分離的DNA片段進(jìn)一步克隆到SINrep5載體中的相應(yīng)的XabI和PmlI位點產(chǎn)生SINrepS-HSP70，SINrep5-E7，和SINrepS-E7/HSP70構(gòu)建體。DNA測序證明這些構(gòu)建體的精確性。
體外RNA制備應(yīng)用Mandl(1998)自然藥物(Nature Med)41438-1440描述的方法進(jìn)行從SINrp5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70和SINrep5產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。使用SpeI將DNA模板線性化用于從SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70和SINrep5合成RNA復(fù)制子。體外轉(zhuǎn)錄RNA疫苗并且根據(jù)vendor′指南使用SP6RNA聚合酶和來自標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)的封端類似物封端。合成之后，通過用DNA酶I消化去除DNA。使用變性甲醛瓊脂糖凝膠(參見例如，Mandl(1998)上文)對合成的RNA定量測定和分析。將純化的RNA分為等份用于對動物接種并且用于轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞系。通過利用電穿孔將RNA轉(zhuǎn)染到BHK21細(xì)胞中來評價轉(zhuǎn)錄物的蛋白質(zhì)表達(dá)。
細(xì)胞系從ATCC(Rockville，MD)獲得小倉鼠腎細(xì)胞(BHK21)并且在補充有5％FBS，10％胰蛋白朊磷酸肉湯，2mM谷氨酰胺和抗生素的Glasgow MEM中培養(yǎng)。細(xì)胞保持在37℃濕潤的5％CO2大氣下并且每2天傳代。根據(jù)Lin(1996)癌癥研究(Cancer Res.)5621-26所述進(jìn)行TC-1細(xì)胞的制備和保持。在腫瘤攻擊的這一天，通過受胰蛋白酶作用收獲TC-1細(xì)胞，用1× Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)洗滌兩次，最后再次懸浮于1× HBSS至設(shè)計的用于注射的濃度。
用于SINrep5 RNA疫苗的E7蛋白質(zhì)表達(dá)的ELISA通過間接ELISA方法測定E7蛋白質(zhì)自SINrep5-E7和SINrep5-E7/HSP70 RNA的表達(dá)。使用來自SIN5rep E7或-E7/HSP70轉(zhuǎn)染的BHK21的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物測定E7蛋白質(zhì)的量。簡要地說，根據(jù)Liljestrom(1991)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)654107-4113所述通過電穿孔分別用4微克的SINrep5，SINrep5-E7，SINrep5-HSP70或SINrep5-E7/HSP70 RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染千萬個BHK21細(xì)胞。電穿孔之后16-20小時收集轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞。用終體積100微升的各種SINrep5RNA轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞溶胞產(chǎn)物包被96-微孔板，并且在4℃下培養(yǎng)過夜。用細(xì)菌產(chǎn)生的HPV-16 E7蛋白質(zhì)作為陽性對照。然后用含有20％胎牛血清的PBS封閉孔。向ELISA孔加入稀釋的抗-E7Ab(Zymed，San Francisco，CA)，并且在37℃下培養(yǎng)2小時。用含有0.05％Tween-20的PBS洗滌之后，室溫下該平板與1/2000稀釋度的過氧化物酶-綴合的兔抗小鼠IgG抗體(Zymed，San Francisco，CA)培養(yǎng)1小時。洗滌該平板，并且用TMB(Pierce，Rockford，IL)促生長，并且用1M H2SO4終止。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA讀數(shù)儀在450nm下對ELISA平板讀數(shù)。用含有0.05％Tween-20的PBS洗滌之后，室溫下該平板與1/2000稀釋度的過氧化物酶-綴合的兔抗小鼠IgG抗體(Zymed，San Francisco，CA)培養(yǎng)1小時。該平板洗滌6次，并且用1-Step Turbo TMB-ELISA(Pierce，Rockford，IL)促生長，并且用1M H2SO4終止。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA讀數(shù)儀在450nm下對ELISA平板讀數(shù)。然后通過與標(biāo)準(zhǔn)化E7蛋白質(zhì)比較計算和測定細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的E7蛋白質(zhì)的量小鼠從國家癌癥研究中心(the National Cancer Institute)(Frederick，Maryland)購得6至8周齡雌性C57BL/6小鼠，并且保持在Johns Hopkins醫(yī)院(Baltimore，MD)的腫瘤學(xué)動物中心。根據(jù)現(xiàn)有方法并且根據(jù)對正確使用和護理實驗動物的的說明進(jìn)行所有的動物程序。
RNA接種如上所述利用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所有的SINrep5 RNA疫苗。通過在260nm下測定光密度測定DNA濃度。利用變性凝膠電泳進(jìn)一步檢查RNA轉(zhuǎn)錄物的整合性和量。用10微克各種SINrep5 RNA在右后褪對小鼠肌內(nèi)接種，SINrep5-E7/HSP70除外，其以0.1，1和10微克的量施用。
E7抗體的ELISA根據(jù)Wu(1995)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9211671-1165所述，通過直接ELISA測定血清中的抗-HPV 16 E7抗體。用100微升5微克/毫升細(xì)菌產(chǎn)生的HPV-16 E7蛋白質(zhì)包被96微孔板并且在4℃下培養(yǎng)過夜。然后用含有20％胎牛血清的PBS將孔封閉。在免疫之后第14天從小鼠制備血清，用PBS系列稀釋，加給ELISA孔，并且在37℃下培養(yǎng)2小時。用含有0.05％Tween-20的PBS洗滌之后，室溫下該平板與1/2000稀釋度的過氧化物酶-綴合的兔抗小鼠IgG抗體(Zymed，San Francisco，CA)培養(yǎng)1小時。洗滌該平板，并且用1-Step Turbo TMB-ELISA(Pierce，Rockford，IL)促生長，并且用1M H2SO4終止。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA讀數(shù)儀在450nm下對ELISA平板讀數(shù)。
INF-γ的酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)接種之后2星期收集脾細(xì)胞，并且與包含I類MHC表位的E7肽(aa49-57)(參見例如Feltkamp(1993)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)232242-2249)或者包含II類MHC表位的E7肽(aa30-67)(參見例如Tindle(1991)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)885887-5891)一起在總體積2毫升的補充有10％(vol/vol)胎牛血清，50單位/ml青霉素和鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，2mM非基本氨基酸的RPMI 1640中在24-孔組織培養(yǎng)平板中培養(yǎng)6天。收集上清夜并且使用ELISA試劑盒(Endogen，Woburn，MA)根據(jù)廠商說明測試IFN-γ的存在。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)測試根據(jù)Corr(1999)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1634721-4727所述96孔圓底平板中進(jìn)行CTL測試。通過乳酸鹽脫氫酶(LDH)的定量測定來測定細(xì)胞溶解(參見例如Corr(1999)上文)。RNA接種之后周收集脾細(xì)胞，并且與E7肽(aa49-57)一起在總體積2毫升的補充有10％(vol/vol)胎牛血清，50單位/ml青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，2mM非基本氨基酸的RPMI 1640中在24-孔組織培養(yǎng)平板中培養(yǎng)6天作為效應(yīng)子細(xì)胞。TC-1腫瘤細(xì)胞用作靶細(xì)胞。TC-1細(xì)胞與各種效應(yīng)子/靶物(E/T)之比的脾細(xì)胞混合。在37℃下溫育5小時之后，收集50微升培養(yǎng)基，根據(jù)CytoTox測試試劑盒(Promega，Madison，WI)根據(jù)生產(chǎn)商說明，來評價培養(yǎng)基中LDH的量。從下面的等式計算溶胞百分比100 ×(A-B)/(C-D)，其中A實驗-效應(yīng)子信號值的讀數(shù)，B是效應(yīng)子自發(fā)背景信號值，C是來自靶細(xì)胞的最大信號值，D是靶自發(fā)背景信號值。
胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞儀分析來自自然狀態(tài)的或者接種組小鼠的脾細(xì)胞與包含II類MHC肽的E7肽(aa30-67)一起溫育(Tindle(1999)上文)用于測定E7-特異性CD4+T輔助細(xì)胞前體。以10微克/毫升的濃度加入E7肽20小時。在從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞之前6小時加入GolgistopTM(Pharmigen，San Diego，CA)。然后細(xì)胞在FACSCANTM緩沖液中洗滌一次并且用藻紅蛋白(PE)-綴合的單克隆大鼠抗-小鼠CD4抗體(Pharmingen，San Diego，CA)染色。使用Cytofix/CytopermTM試劑盒(Pharmingen)根據(jù)廠商說明對細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。FITC-綴合的抗-IFN-γ和免疫球蛋白同種型對照抗體(大鼠IgG1)都購自Pharmingen。在Becton-Dickenson FACScanTM上使用CELLQuestTM軟件(Becton Dickson Immunocytometry System，Mountain View，CA)進(jìn)行分析。
體內(nèi)腫瘤保護實驗關(guān)于腫瘤保護實驗，用不同劑量的SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70，和空白SINrep5 RNA疫苗肌內(nèi)(IM)對小鼠免疫(每組5只)。免疫14天之后，用1×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞在尾靜脈對小鼠靜脈內(nèi)注射。三星期之后，對小鼠實施安死術(shù)。通過不知情方式的實驗計數(shù)評價并且每一只小鼠的肺重量和肺小結(jié)數(shù)目。
體內(nèi)抗體耗竭實驗先前例如Lin(1996)上文；Wu(1995)實驗藥物雜志(J.Exp.Med.)1821415-1421描述了體內(nèi)抗體耗竭的方法。簡要地說，用1微克的自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70 RNA對小鼠肌內(nèi)接種，并且用1×104細(xì)胞/小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞通過尾靜脈注射攻擊?？贵w耗竭在腫瘤攻擊之前一周就開始了。對于CD4耗竭，使用MAb GK1.5(Dialynas(1983)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1312445)；對于CD8耗竭，使用MAb2.43(Sarmiento(1 980)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1252665)，對于NK1.1耗竭，使用MAb PK136(Koo(1986)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1373742)。流式細(xì)胞儀分析表明耗竭了95％以上的合適的淋巴細(xì)胞亞群，而具有正常水平的其它亞群。腫瘤攻擊之后第2 1天耗竭終止。
細(xì)胞表面標(biāo)記物染色和流式細(xì)胞儀分析根據(jù)Ji(1999)人體基因治療(Human Gene Therapy)102727-2740所述，用細(xì)胞表面標(biāo)記物染色立即對來自自然狀態(tài)的或者接種組小鼠的脾細(xì)胞染色。細(xì)胞在FACSCANTM緩沖液中洗滌一次并且用PE-綴合的單克隆大鼠抗-小鼠NK1.1抗體和FITC-綴合的單克隆大鼠抗-小鼠CD3抗體(Pharmingen，SanDiego，CA)染色。NK細(xì)胞集落用抗NK1.1抗體染色而不用抗CD3抗體染色。利用流式細(xì)胞儀分析用各種自身復(fù)制RNA疫苗免疫的小鼠NK細(xì)胞的百分比。
來自骨髓的樹狀細(xì)胞(DCs)的產(chǎn)生和培養(yǎng)根據(jù)Lu(2000)實驗藥物雜志(J.Exp.Med.)191541-550所述，在GM-CSF存在下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞產(chǎn)生DCs。簡要地說，從小鼠的脛骨收集骨髓。將紅細(xì)胞溶解，并且使殘留的細(xì)胞通過尼龍篩去除小的骨碎屑。收集細(xì)胞并且將1×106細(xì)胞/毫升置于24-孔板上在補充有5％FCS，2mM-巰基乙醇，1％非基本氨基酸，100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素(Life Technologies，Rockville，MD)，和100U/ml GM-CSF(PharMingen，San Diego，CA)的RMPI 1640中培養(yǎng)。每2天置換三分之二的培養(yǎng)基，在第7天收集沒有附著的細(xì)胞。通過對DC標(biāo)記物的流式細(xì)胞儀分析(FACS)表征收集的細(xì)胞。
E7-特異性CD8+T細(xì)胞系的產(chǎn)生通過腹膜內(nèi)注射Sig/E7/LAMP-1疫苗免疫雌性C57BL/6(H-2b)小鼠產(chǎn)生E7-特異性CD8+細(xì)胞系。在第8天收集脾細(xì)胞。關(guān)于開始體外刺激，用濃度為20U/ml的IL-2和1μM E7肽(氨基酸49-57)對脾細(xì)胞脈沖6天。通過將(2ml/孔)的1×106包含E7特異性CTLs的脾細(xì)胞與3×106照射過的脾細(xì)胞混合并且用濃度為20U/ml的IL-2和1μM E7肽(氨基酸49-57)脈沖，在24-孔板中進(jìn)行E7-特異性CTL細(xì)胞系增殖。該程序每6天重復(fù)一次。通過CTL測試表征E7 CTL細(xì)胞系的特異性。進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析來證明CD8標(biāo)記物的表達(dá)。
體外細(xì)胞死亡分析如上文所述，用4微克的SINrep5，SINrep5-E7，SINrep5-HSP70或SINrep5-E7/HSP70 RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染千萬個BHK21細(xì)胞。使用天然BHK21細(xì)胞或沒有SINrep5RNA的電穿孔的BHK21細(xì)胞作為對照物。每24小時收集BHK21細(xì)胞并且評價，直到72小時。使用膜聯(lián)蛋白V編程性細(xì)胞死亡檢測試劑盒(PharMingen，San Diego，CA)根據(jù)生產(chǎn)商說明，并且接著進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，分析編程性細(xì)胞死亡和壞死BHK21細(xì)胞百分比。
使用編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞脈沖的DC作為靶細(xì)胞的CTL測試?yán)妙愃朴贏lbert(1998)自然(Nature)39286-89；Albert(1998)實驗藥物雜志(J.Exp.Med.)1881359-1368所述的方法進(jìn)行使用編程性細(xì)胞死亡細(xì)胞脈沖的DC作為靶細(xì)胞的CTL測試；有一些修改。簡要地說，使用4微克的各種自主復(fù)制SINrep5 RNA通過電穿孔轉(zhuǎn)染千萬個BHK21細(xì)胞。電穿孔之后16-20小時收集BHK21細(xì)胞。根據(jù)ELISA測定，用SINrep5-E7，或SINrep5-E7/HSP70 RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞中表達(dá)的E7蛋白質(zhì)水平類似。然后在37℃下3×105轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞與1×105個骨髓衍生的DCs共同培養(yǎng)48小時。然后將這些制備的DCs用作靶細(xì)胞，并且Db-限制性E7-特異性CD8+T細(xì)胞用作效應(yīng)子細(xì)胞。用以各種比例(1∶1，3∶1，9∶1，和27∶1)混合的最終體積是200升的效應(yīng)子細(xì)胞和靶細(xì)胞(1×104/孔)進(jìn)行CTL測試。37℃下溫育5小時之后，收集50微升培養(yǎng)基評價培養(yǎng)基中LDH的量，如上所述。與沒有轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞共同溫育的DC，單獨的轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞，單獨的沒有處理的DCs，和單獨的CD8+T細(xì)胞系用作陰性對照。
自主復(fù)制RNA構(gòu)建體的構(gòu)建和表征如上所述進(jìn)行質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的產(chǎn)生的下面的自主復(fù)制SINrep5 RNA構(gòu)建體的制備。SINrep5載體包含編碼新陪斯病毒RNA復(fù)制酶的基因和SP6啟動子(參見例如，Bredenbeek(1993)上文)。圖20A給出了SINrep5，SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5 E7/HSP70 DNA構(gòu)建體的示意圖。另外，圖20B給出了使用SP6 RNA聚合酶從這些DNA構(gòu)建體衍生的RNA轉(zhuǎn)錄物的示意圖。甲基化M7G＂帽＂位于mRNA的5′端，接著是負(fù)責(zé)自主復(fù)制的序列(復(fù)制酶)，感興趣的基因(即I類MHC肽表位，E7，HSP70，E7/HSP70，等等)，和聚腺苷酸化尾部(AAAA)。進(jìn)行ELISA證明各種自主復(fù)制RNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞對E7蛋白質(zhì)的表達(dá)。SINrep5-E7和SINrep5-E7/HSP70表達(dá)類似量的E7蛋白質(zhì)。
用自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70 RNA接種增強E7-特異性細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答CD8+T淋巴細(xì)胞是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性最重要的效應(yīng)子。為了測定SINrepS-E7/HSP70 RNA疫苗產(chǎn)生的E7-特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的量，利用CTL測試。通過肌內(nèi)注射用各種SINrep5自主復(fù)制RNA疫苗免疫小鼠。14天之后收集脾細(xì)胞和血清樣品。為了進(jìn)行細(xì)胞毒性測定，將來自各種自主復(fù)制SINrep5RNA疫苗的脾細(xì)胞與包含I類MHC表位的E7肽(aa 49-57)一起培6天作為效應(yīng)子細(xì)胞。TC-1腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。TC-1細(xì)胞與脾細(xì)胞以各種E/T(效應(yīng)子/靶物之比)混合。通過定量測定LDH測定細(xì)胞溶解。這里所示的CTL測試是進(jìn)行的兩個實驗中的一個代表。
與其它RNA疫苗相比，自主復(fù)制RNA E7/HSP70疫苗產(chǎn)生大得多的特異性裂解百分比(*P＜0.001，單向(one-way)ANOVA)。與其它SINrep5 RNA疫苗接種的小鼠相比，自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70產(chǎn)生大得多的特異性裂解百分比(*P＜0.001，單向ANOVA)。發(fā)現(xiàn)SINrep5-E7/HSP70 RNA產(chǎn)生特異性裂解的能力大約是自主復(fù)制SINrep5-E7 RNA的4倍(32.7％對8.8％，E/T之比45/1，P＜0.001)。
用自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70 RNA接種增強E7-特異性CD8+T細(xì)胞分泌高水平的INF-γ為了測定自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70 RNA產(chǎn)生E7-特異性CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答的程度，利用ELISA檢測培養(yǎng)的脾細(xì)胞的上清液中的INF-γ的濃度。14天之后收集脾細(xì)胞和血清樣品。將來自各種自主復(fù)制RNA疫苗的脾細(xì)胞與包含I類MHC表位的E7肽(aa 49-57)(或者沒有任何肽)一起體外培養(yǎng)6天。作為陰性對照，也進(jìn)行沒有肽的ELISA。收集培養(yǎng)基中的上清液利用ELISA檢測INF-γ的濃度。
與其它RNA疫苗相比，用E7肽(aa 49-57)刺激的自主復(fù)制E7/HSP70RNA組的脾細(xì)胞分泌最大濃度的INF-γ(P＜0.001，單向ANOVA)。這些也結(jié)果表明HSP70與E7的融合顯著增強INF-γ-分泌E7-特異性CD8+T細(xì)胞活性。因此，E7的I類MHC表位可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞。注釋與其它RNA疫苗相比，用E7肽(aa 49-57)刺激的自主復(fù)制E7/HSP70 RNA組的脾細(xì)胞分泌最大濃度的INF-γ(*P＜0.001，單向ANOVA)。
用自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70 RNA接種不產(chǎn)生顯著的E7-特異性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為了測定這些RNA疫苗產(chǎn)生的E7-特異性CD4+T前體細(xì)胞和細(xì)胞因子分布，對來自免疫小鼠的脾細(xì)胞上的CD4表面標(biāo)記物和胞內(nèi)IFN-γ進(jìn)行雙染色，接著進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。體外將脾細(xì)胞與E7肽(aa30-67)一起培養(yǎng)過夜并且對CD4和胞內(nèi)IFN-γ染色。E7肽(aa30-67)在HPV-16的E7可讀框蛋白質(zhì)中包含主要T輔助表位(參見例如Tindle(1991)上文)。利用流式細(xì)胞儀分析IFN-γ分泌CD4+T細(xì)胞百分比。
與用SINrep5-E7 RNA(15/3×105脾細(xì)胞對12/3×105脾細(xì)胞，p＞0.05)或者其它RNA組接種的小鼠相比，用SINrep5-E7/HSP70 RNA接種的小鼠組產(chǎn)生類似數(shù)目的CD4+IFN-γ+雙陽性細(xì)胞。對天然狀態(tài)小鼠和用空白質(zhì)粒，E7，HSP70，或E7/HSP70 RNA接種的小鼠之間利用流式細(xì)胞儀沒有發(fā)現(xiàn)E7-特異性CD4+IFN-γ+細(xì)胞數(shù)目的顯著差異。使用來自Sig/E7/LAMP-1 DNA接種小鼠(Ji(1999)上文)的脾細(xì)胞作為陽性對照用于胞內(nèi)IFN-γ染色用于該項研究。
接種之后2周利用各種稀釋度(1∶100，1∶500，1∶1000)的直接酶聯(lián)免疫測試(ELISA)測定接種小鼠血清中抗-HPV 16 E7抗體的量。與其它RNA疫苗構(gòu)建體產(chǎn)生的相比，SINrep5-E7/HSP70在接種小鼠血清中不產(chǎn)生更高滴度的E7-特異性抗體。
用自主復(fù)制SINrep5-E7/HSP70 RNA接種保護小鼠抗TC-1腫瘤的生長為了測定用自主復(fù)制SINrepS-E7/HSP70 RNA接種是否保護小鼠抗E7-表達(dá)腫瘤，使用不同劑量的SINrep5-E7/HSP70RNA在右后腿肌內(nèi)施用進(jìn)行體內(nèi)腫瘤保護實驗。類似地，用10微克自主復(fù)制SINrep5，SINrep5-HSP70，和SINrep5-E7 RNA接種小鼠。也對小鼠注射包括0.1微克，1微克和10微克地不同劑量的自主復(fù)制SINrep5，SINrep5-HSP70 RNA。接種之后一周，通過以2×104細(xì)胞/小鼠的劑量靜脈內(nèi)尾靜脈注射用TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊小鼠。每周兩次監(jiān)測小鼠并且腫瘤攻擊之后21天殺死小鼠。腫瘤攻擊之后21天評價肺小結(jié)。用空白SINrep5(10微克)，SINrep5-HSP70(10微克)，SINrep5-E7(10微克)，和SINrep5-E7/HSP70 RNA(0.1微克，1微克，和10微克)接種之后35天對肺切片。肺病灶平均數(shù)用作各種RNA疫苗在控制HPV-16 E7-表達(dá)腫瘤生長中的效力的量度。
用自主復(fù)制E7/HSP70 RNA疫苗(0.1微克，1微克，和10微克)接種的小鼠的平均肺小結(jié)(nodule)數(shù)與用其它RNA疫苗接種的小鼠相比小得多(P＜0.001，單向ANOVA)。這些結(jié)果證明自主復(fù)制RNA SINrep5-E7/HSP70疫苗即使在0.1微克這樣低的劑量下也保護小鼠不受靜脈內(nèi)腫瘤攻擊，而用來自10微克沒有插入物的SINrep5，10微克SINrep5-E7，或10微克SINrepS-HSP70的RNA接種的小鼠在TC-1腫瘤攻擊之后長出數(shù)個肺小結(jié)。
CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞對于用SINrep5-E7/HSP70 RNA疫苗接種產(chǎn)生的抗腫瘤作用是重要的為了測定對抗E7-表達(dá)腫瘤細(xì)胞的保護作用是重要的淋巴細(xì)胞的類型，進(jìn)行體內(nèi)抗體耗竭實驗(CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的)(來自用自主復(fù)制RNA疫苗免疫的小鼠的脾細(xì)胞的NK細(xì)胞百分比高于沒有免疫的，并且各種自主復(fù)制RNA疫苗之間的NK細(xì)胞百分比沒有顯著差異)。在腫瘤攻擊之前一周開始抗體耗竭并且在腫瘤攻擊之后第21天終止。
耗竭CD8+T細(xì)胞和NK1.1細(xì)胞的小鼠的平均肺小結(jié)數(shù)顯著高于沒有耗竭組的那些。此外，NK1.1細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致比CD8+耗竭小鼠更高的腫瘤肺小結(jié)的平均數(shù)。
比較中，CD4+T細(xì)胞耗竭小鼠的平均肺小結(jié)數(shù)類似于沒有耗竭小鼠的結(jié)果，表明CD4+T細(xì)胞在產(chǎn)生該作用中不是關(guān)鍵的。這些結(jié)果表明CD8+T細(xì)胞對于SINrep5-E7/HSP70 RNA疫苗產(chǎn)生的抗原特異性抗腫瘤免疫性是必需的，而NK細(xì)胞，盡管不局限于E7/HSP70 RNA疫苗，也起著重要作用。
還研究了NK細(xì)胞作用是否限于E7/HSP70疫苗或者其是否是使用的載體的結(jié)果。對CD3(-)，NK1.1(+)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析表明相對于原初小鼠來說，在所有的構(gòu)建體(E7/HSP70，E7，HSP70，和對照質(zhì)粒)中它們的存在大大增加，表明NK細(xì)胞是不局限于E7/HSP70疫苗的抗腫瘤作用的重要的效應(yīng)子。
自主復(fù)制RNA疫苗誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡通過電穿孔將體外從各種質(zhì)粒SINrep5 RNA疫苗轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染到BHK21細(xì)胞中。將沒有RNA的電穿孔BHK 21細(xì)胞和沒有處理的BHK21細(xì)胞用作對照物。通過膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠染色接著流式細(xì)胞儀分析測定編程性細(xì)胞死亡和壞死BHK21細(xì)胞百分比。
當(dāng)用SINrep5 RNA疫苗轉(zhuǎn)染時，24小時至72小時之后，編程性細(xì)胞死亡的BHK21細(xì)胞的百分比表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)減少(代表性的是SIN5-E7/HSP70 70.3±3.6％，24hr，49.3±4.2％，48hr，18.0±3.1％，72hr，P＜0.001，單向ANOVA)。與另外兩個對照組相比，用SINrep5 RNA疫苗轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞在24，48和72小時之后產(chǎn)生更高的百分比。發(fā)現(xiàn)各種SINrep5 RNA疫苗的編程性細(xì)胞死亡百分比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
用SINrep5-E7/HSP70 RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞脈沖的樹狀細(xì)胞中E7通過I類MHC途徑的呈遞增強體內(nèi)增強的E7-特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的可能的機理是通過攝取來自表達(dá)各種E7構(gòu)建體的編程性細(xì)胞死亡體(apoptotic bodies)E7通過I類MHC途徑的呈遞作用，也稱之為“交叉引發(fā)(cross-priming)”。進(jìn)行交叉引發(fā)實驗來表征來自各種自主復(fù)制RNA轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡體脈沖的樹狀細(xì)胞中E7的I類MHC呈遞。如先前所述，已經(jīng)證明BHK21細(xì)胞具有穩(wěn)定的高轉(zhuǎn)染效率，并且用不同的E7-包含自主復(fù)制RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有類似的E7表達(dá)。轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞與來自骨髓的DC一起培養(yǎng)。DCs被用作靶細(xì)胞，而E7-特異性CD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)子細(xì)胞。使用各種E/T之比進(jìn)行CTL測試。
與和用SINrep5-E7 RNA轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞共同培養(yǎng)的DC相比，和用SINrepS E7/HSP70RNA轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞共同培養(yǎng)的DC靶細(xì)胞產(chǎn)生顯著更高的特異性裂解百分比(P＜0.001)。這些結(jié)果提示用包含E7/HSP70融合蛋白的編程性細(xì)胞死亡體脈沖的樹狀細(xì)胞通過I類MHC途徑呈遞E7抗原比用包含野生型E7蛋白質(zhì)的編程性細(xì)胞死亡體脈沖的樹狀細(xì)胞更有效。因此，HSP70與E7的融合增強E7-特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答；并且，盡管本發(fā)明不局限于任何特殊機理，這種增強可能是通過＂交叉引發(fā)＂。
已經(jīng)描述了本發(fā)明的一些實施方案。但是，要明白不脫離本發(fā)明的精神和范圍可以進(jìn)行各種改進(jìn)。因此，其它實施方案在下面的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種編碼嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括第一多肽結(jié)構(gòu)域，包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)，或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，和第二多肽結(jié)構(gòu)域，包括抗原性多肽。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述編碼第一多肽結(jié)構(gòu)域的核酸是在編碼第二多肽結(jié)構(gòu)域的核酸的5’端。
3.權(quán)利要求1的核酸，其中所述編碼第二多肽結(jié)構(gòu)域的核酸是在編碼第一多肽結(jié)構(gòu)域的核酸的5’端。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段具有陪伴分子活性。
5.權(quán)利要求1的核酸，其中所述熱激蛋白(HSP)包括熱激蛋白70(HSP70)。
6.權(quán)利要求1的核酸，其中所述熱激蛋白70(HSP70)來自結(jié)核分枝桿菌。
7.權(quán)利要求1的核酸，其中所述熱激蛋白(HSP)包括SEQ ID NO9的殘基312-625給出的序列。
8.權(quán)利要求1的核酸，其中所述熱激蛋白(HSP)包括SEQ ID NO9的大約殘基517至大約殘基625給出的序列。
9.權(quán)利要求1的核酸，其中所述Flt-3配體多肽包括SEQ ID NO25的大約殘基1至大約殘基189給出的序列。
10. 權(quán)利要求1的核酸，其中所述假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)包括SEQ ID NO3的大約殘基247至大約殘基417給出的序列。
11.權(quán)利要求1的核酸，其中所述假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)包括SEQ ID NO3的大約殘基253至大約殘基364給出的序列。
12.權(quán)利要求1的核酸，其中所述GM-CSF序列是包含二硫鍵的GM-CSF片段。
13.權(quán)利要求1的核酸，其中所述GM-CSF片段包括SEQ ID NO1的大約殘基18至大約殘基22，或者大約殘基34至大約殘基41，或者大約殘基38至大約殘基48，或者大約殘基52至大約殘基61，或者大約殘基94至大約殘基115，或者大約殘基95至大約殘基111給出的序列。
14.權(quán)利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽包括I類MHC-結(jié)合肽表位。
15.權(quán)利要求14的核酸，其中所述I類MHC-結(jié)合肽表位長度在大約8個氨基酸殘基和大約11個氨基酸殘基之間。
16.權(quán)利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽來自病毒。
17.權(quán)利要求16的核酸，其中所述病毒是人乳多空病毒。
18.權(quán)利要求16的核酸，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒(HPV)。
19.權(quán)利要求18的核酸，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒-16(HPV-16)。
20.權(quán)利要求18的核酸，其中所述抗原性多肽包括人乳頭瘤病毒E6多肽或人乳頭瘤病毒E7多肽。
21.權(quán)利要求16的核酸，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
22.權(quán)利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽是腫瘤-特異性的或者腫瘤-相關(guān)的多肽。
23.權(quán)利要求22的核酸，其中所述腫瘤-特異性的或者腫瘤-相關(guān)的多肽包括在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原。
24.權(quán)利要求22的核酸，其中所述腫瘤-特異性的或者腫瘤-相關(guān)的多肽是突變體p53，MAGE-1或MAGE-3。
25.權(quán)利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽來自病原體。
26.權(quán)利要求25的核酸，其中所述病原體是瘧疾，HIV-1，牛病毒性腹瀉病毒，巨細(xì)胞病毒，腦炎病毒，肝炎病毒，單純皰疹病毒或者流感病毒。
27.權(quán)利要求1的核酸，其中所述嵌合多肽進(jìn)一步包括第三多肽結(jié)構(gòu)域，其包括胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域。
28.權(quán)利要求27的核酸，其中所述胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域包括假單胞桿菌屬外毒素A(ETA)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。
29.權(quán)利要求28的核酸，其中所述假單胞桿菌屬外毒素A(ETA)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO3的大約殘基253至大約殘基364給出的序列。
30.權(quán)利要求27的核酸，其中所述胞質(zhì)轉(zhuǎn)運多肽結(jié)構(gòu)域包括來自白喉，梭狀芽孢桿菌屬，Botulinum，芽孢桿菌屬，耶爾森氏菌屬，霍亂弧菌，或者百日咳博德特氏桿菌的毒素的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。
31.權(quán)利要求27的核酸，其中所述編碼第三多肽結(jié)構(gòu)域的核酸位于編碼第一或第二結(jié)構(gòu)域的核酸的5’端，或者位于編碼第一或第二結(jié)構(gòu)域的核酸之間，或者位于編碼第一或第二結(jié)構(gòu)域的核酸的3’端。
32.權(quán)利要求1的核酸，進(jìn)一步包括調(diào)控核酸序列。
33.權(quán)利要求32的核酸，其中所述調(diào)控核酸序列包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
34.一種包括編碼一種嵌合多肽的核酸的表達(dá)盒，所述嵌合多肽包括一種包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和一種包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
35.權(quán)利要求34的表達(dá)盒，包括表達(dá)載體或質(zhì)粒。
36.權(quán)利要求34的表達(dá)盒，包括自主復(fù)制RNA復(fù)制子。
37.權(quán)利要求36的表達(dá)盒，其中所述自主復(fù)制RNA復(fù)制子包括新培斯病毒自主復(fù)制RNA載體。
38.權(quán)利要求37的表達(dá)盒，其中所述自主復(fù)制RNA復(fù)制子包括新培斯病毒自主復(fù)制RNA載體SINrep5。
39.一種包括編碼一種嵌合多肽的核酸的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述嵌合多肽包括一種包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和一種包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
40.一種嵌合多肽，包括一種包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的(ETA dII)第一多肽結(jié)構(gòu)域，和，一種包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
41.權(quán)利要求40的嵌合多肽，其中所述第一多肽結(jié)構(gòu)域與第二多肽結(jié)構(gòu)域非共價連接。
42.權(quán)利要求40的嵌合多肽，其中所述第一多肽結(jié)構(gòu)域與第二多肽結(jié)構(gòu)域共價連接。
43.權(quán)利要求42的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽是重組多肽。
44.一種含有下面成分的藥物組合物編碼嵌合多肽的核酸，包括編碼嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域；和，藥學(xué)可接受賦形劑。
45.權(quán)利要求44的組合物，其中用組合物用磷脂配制成脂質(zhì)體。
46.一種含有下面成分的DNA疫苗編碼嵌合多肽的核酸，包括編碼嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域；和，藥學(xué)可接受賦形劑。
47.一種包含編碼嵌合多肽的核酸或者包括編碼嵌合多肽的核酸的載體的顆粒，其中嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
48.權(quán)利要求47的顆粒，其中所述顆粒包括適合顆粒轟擊的材料。
49.權(quán)利要求48的顆粒，其中所述材料包括金。
50.一種誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用有效量的包括下面成分的一種組合物編碼嵌合多肽的核酸，包括編碼嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域，或者一種包括所述核酸，所述載體，所述嵌合多肽或者其組合的DNA疫苗，其中施用有效量的組合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述編碼所述嵌合多肽的核酸或者載體作為裸DNA被施用。
53.權(quán)利要求52的方法，其中通過基因槍或等價物施用所述裸DNA。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述組合物作為脂質(zhì)體制劑被施用。
55.權(quán)利要求50的方法，其中皮內(nèi)施用所述組合物。
56.一種對哺乳動物接種抗病原體感染的方法，該方法包括施用有效量的一種組合物，所述組合物含有編碼嵌合多肽的核酸，包括編碼嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括來自病原體的抗原多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域，或者一種包括所述核酸，所述載體，所述嵌合多肽或者其組合的DNA疫苗，其中施用有效量的組合物誘導(dǎo)對該病原體的免疫應(yīng)答。
57.一種對哺乳動物接種抗腫瘤抗原的方法，該方法包括施用有效量的一種組合物，所述組合物含有編碼嵌合多肽的核酸，包括編碼嵌合多肽的核酸的載體，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括腫瘤抗原的第二多肽結(jié)構(gòu)域，或者一種包括所述核酸，所述載體，所述嵌合多肽或者其組合的DNA疫苗，其中施用有效量的組合物誘導(dǎo)對該腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。
58.一種成分用于制備用于對哺乳動物接種抗一種抗原的藥物制劑的用途，其中所述藥物制劑含有編碼一種嵌合多肽的核酸，包括編碼一種嵌合多肽的核酸的載體，嵌合多肽，或者它們的組合，其中所述嵌合多肽包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或假單孢桿菌屬外毒素A的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(ETA dII)；和，包括腫瘤抗原的第二多肽結(jié)構(gòu)域，和藥學(xué)可接受賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供新的編碼嵌合多肽的嵌合核酸，體外和體內(nèi)表達(dá)這些多肽的構(gòu)建體，分離的嵌合多肽，藥物組合物和制備和使用這些組合物的方法。這些組合物和方法特別有用于刺激或增強選擇的抗原的免疫原性或者刺激或增強對該抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的核酸包括包括熱激蛋白(HSP)的羧基末端片段，F(xiàn)lt－3配體(FL)，假單孢桿菌外毒素A(ETA dII)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，或者粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞—集落刺激因子(GM－CSF)序列的第一多肽結(jié)構(gòu)域，和包括抗原性多肽的第二多肽結(jié)構(gòu)域。
文檔編號A61K47/24GK1411512SQ00817456
公開日2003年4月16日 申請日期2000年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月20日
發(fā)明者吳澤柱, 黃建富 申請人:約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院