專利名稱：人mcp－1的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1的抗體和該抗體在治療涉及單核細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移和活化的疾病和紊亂，如炎癥中的用途。
公開的日本專利申請(qǐng)JP 05276986(Sumitomo Electric Co.)描述了人MCP-1的嚙齒類動(dòng)物單克隆抗體的制備，該抗體可用于確定MCP-1和治療及診斷涉及巨嗜細(xì)胞浸潤(rùn)的疾病。公開的日本專利申請(qǐng)JP 09067399(Mitsui Toatsu)描述了從EBV轉(zhuǎn)化的人外周血細(xì)胞進(jìn)行的人MCP-1的人單克隆抗體的制備，該抗體可以用于治療炎癥。公開的日本專利申請(qǐng)JP11060502(Teijin)描述了MCP-1抑制劑，尤其是人抗MCP-1抗體在治療大腦梗塞中的用途。
目前我們已制備了人MCP-1的改良抗體，該抗體可以用于治療涉及單核細(xì)胞和T細(xì)胞遷移和活化的疾病和紊亂。
因此，本發(fā)明提供包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的MCP-1結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含至少一個(gè)順次含有高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu；以及其直接等價(jià)物。
因此，本發(fā)明還提供包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的MCP-1結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含至少一個(gè)順次含有高變區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro；以及其直接等價(jià)物。
第一方面，本發(fā)明提供單結(jié)構(gòu)域的MCP-1結(jié)合分子，該分子中包括含有以上定義的重鏈可變區(qū)(VH)的分離的免疫球蛋白重鏈。
第二方面，本發(fā)明還提供包含重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的MCP-1結(jié)合分子及其直接等價(jià)物，其中所述MCP-1結(jié)合分子含有至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含a)順次含有高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu，和b)順次含有高變區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
除非另行指明，否則本文中所有的多肽鏈均以具有起始于N末端并終止于C末端的氨基酸序列來描述。
當(dāng)抗原結(jié)合位點(diǎn)包含VH和VL域時(shí)，這些域可以定位在相同的多肽分子上，或者優(yōu)選地，每個(gè)域可以定位在不同的鏈上，即VH域是免疫球蛋白重鏈或其片段的一部分，而VL是免疫球蛋白輕鏈或其片段的一部分。
“MCP-1結(jié)合分子”是指能夠與單獨(dú)的或連接其它分子的MCP-1抗原結(jié)合的任何分子。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(定性測(cè)定)可以反映結(jié)合反應(yīng)，包括例如參照陰性對(duì)照試驗(yàn)(其中使用具有無關(guān)特異性但優(yōu)選具有相同的同種型的抗體)用于確定對(duì)MCP-1和其受體(即趨化因子受體(CCR)-2，如CCR2B)結(jié)合的抑制作用的生物測(cè)定方法，或任何類型的結(jié)合試驗(yàn)。有利的是，可以在例如BIAcore試驗(yàn)中證實(shí)本發(fā)明的MCP-1結(jié)合分子與MCP-1的結(jié)合。
抗原結(jié)合分子的實(shí)例包括B細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的抗體以及嵌合的、CDR嫁接的或人的抗體，或其任何片段如F(ab’)2和Fab片段，以及單鏈或單結(jié)構(gòu)域抗體。
單鏈抗體由抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成，這些可變區(qū)通過常常由10至30個(gè)氨基酸，優(yōu)選15至25個(gè)氨基酸組成的肽接頭共價(jià)結(jié)合在一起。因此，該結(jié)構(gòu)不包括重鏈和輕鏈的恒定部分，而且小的間隔肽的抗原性被認(rèn)為應(yīng)比整個(gè)恒定部分的抗原性小?！扒逗峡贵w”是指這樣的抗體，其中重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)或兩者來源于人，而重鏈和輕鏈的可變區(qū)均是非人(如鼠)來源的或來源人但來自不同人的抗體?！癈DR嫁接的抗體”是指這樣的抗體，其中高變區(qū)(CDR)來自供體抗體，如非人(如鼠源)抗體或不同人的抗體，而免疫球蛋白的所有的或基本上所有的其它部分，例如恒定區(qū)和可變區(qū)的高度保守部分(即構(gòu)架區(qū))均來自受體抗體，如人源抗體。然而，CDR嫁接的抗體可以在構(gòu)架區(qū)中，例如在與高變區(qū)相鄰的構(gòu)架區(qū)部分含有少許供體序列的氨基酸?！叭丝贵w”是指這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)均來源于人，或與來源于人的序列基本上一致，但不一定來自相同抗體，這樣的抗體包括其中鼠源的免疫球蛋白可變部分和恒定部分的基因已被其人來源的對(duì)等物替代的小鼠所產(chǎn)生的抗體，見例如EP 0546073 B1，USP 5545806，USP 5569825，USP 5625126，USP 5633425，USP 5661016，USP 5770429，EP 0 438474 B1和EP 0 463151 B1中一般術(shù)語的描述。
尤其優(yōu)選的本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子是人抗體，尤其是AAV293，AAV294和ABN912抗體，描述于下文的實(shí)施例中。(AAV293抗體是人IgG3/κ抗體，而ABN912是人IgG4/κ抗體，但兩者在其它方面基本一致。AAV294抗體是人IgG1/κ抗體，其可變區(qū)與AAV293可變區(qū)相比除了在VH的FR1、CDR2和FR3以及VL的CDR1’和FR3’中有單氨基酸改變外，兩者是一致的，描述在下文實(shí)施例中。)因此，在優(yōu)選的嵌合抗體中，重鏈和輕鏈的可變區(qū)均來源于人，例如Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2中顯示的ABN912抗體的可變區(qū)。恒定區(qū)優(yōu)選也包含適宜的人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，參見例如“具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列”，Kabat，E.A.等，US Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institute of Health。
可以使高變區(qū)與任何類型的構(gòu)架區(qū)連接，但優(yōu)選構(gòu)架區(qū)來源于人。適宜的構(gòu)架區(qū)描述在Kabat E.A.等，同上。優(yōu)選的重鏈構(gòu)架是人的重鏈構(gòu)架，例如Seq.Id.No.1中顯示的ABN912抗體的重鏈構(gòu)架。它由FR1、FR2、FR3和FR4區(qū)順次組成。以相似方式，Seq.Id.No.2顯示了順次由FR1’、FR2’、FR3’和FR4’區(qū)組成的優(yōu)選的ABN912輕鏈構(gòu)架。可以使用另外的構(gòu)架區(qū)，優(yōu)選人構(gòu)架區(qū)來代替Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2中顯示的那些，例如參見Kabat等，同上。構(gòu)架區(qū)，尤其是與高變區(qū)相鄰的構(gòu)架部分的少許氨基酸殘基可以不同于相應(yīng)定義的構(gòu)架區(qū)中的那些，以便例如影響結(jié)合性質(zhì)。
因此，本發(fā)明還提供包含至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的MCP-1結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含具有與Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并終止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第一域或上述第一域和具有與Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并終止于第109位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第二域。
針對(duì)天然存在于所有人體中的蛋白質(zhì)的單克隆抗體典型地是在非人系統(tǒng)如小鼠中產(chǎn)生的。這直接導(dǎo)致，當(dāng)將雜交瘤產(chǎn)生的異種抗體施用于人時(shí)引起主要由異種免疫球蛋白的恒定區(qū)介導(dǎo)的不良免疫應(yīng)答。由于不能長(zhǎng)期施用這類抗體，因此這顯然限制了這類抗體的用途。因此，尤其優(yōu)選施用在用于人后不可能引起實(shí)質(zhì)性同種異型應(yīng)答的單鏈的、單結(jié)構(gòu)域的、嵌合的、CDR嫁接的抗體，或特別是人抗體。
鑒于前述，更優(yōu)選的本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子選自如下人抗MCP-1抗體和其直接等價(jià)物，其中所述人抗MCP-1抗體包含至少a)包含(i)順次含有高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的可變區(qū)和(ii)人重鏈的恒定部分或其片段的免疫球蛋白重鏈或其片段；所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu，和b)包含(i)含有CDR3’高變區(qū)及任選地還含有CDR1’、CDR2’高變區(qū)的可變區(qū)和(ii)人輕鏈的恒定部分或其片段的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
或者，本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子可以選自包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的單鏈結(jié)合分子和其直接等價(jià)物，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含a)順次含有高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的第一域，所述高變區(qū)具有Seq.Id.No.1所示氨基酸序列，b)含有高變區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’的第二域，所述高變區(qū)具有Seq.Id.No.2所示氨基酸序列，和c)與所述第一域的N末端及所述第二域的C末端或者與所述第一域的C末端及所述第二域的N末端結(jié)合的肽接頭。
正如熟知的，氨基酸序列中的微小變化，如缺失、插入或替代一個(gè)、幾個(gè)或甚至多個(gè)氨基酸可以導(dǎo)致具有實(shí)質(zhì)上相同性質(zhì)的原蛋白質(zhì)的等位形式。
因此，術(shù)語“其直接等價(jià)物”是指任何如下單結(jié)構(gòu)域的MCP-1結(jié)合分子(分子X)，(i)其中高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3作為整體與Seq.Id.No.1所示高變區(qū)至少80％同源、優(yōu)選至少90％同源、更優(yōu)選至少95％同源，且(ii)其能夠和參考分子基本上以相同的程度抑制MCP-1與其受體的結(jié)合，所述參考分子具有和分子X相同的構(gòu)架區(qū)但具有和Seq.Id.No.1所示相同的高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3；或指每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有至少兩個(gè)域的任何如下MCP-1結(jié)合分子(分子X’)，(i)其中高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’作為整體與Seq.Id.No.1和2所示高變區(qū)至少80％同源、優(yōu)選至少90％同源、更優(yōu)選至少95％同源，且(ii)其能夠和參考分子基本上以相同的程度抑制MCP-1與其受體的結(jié)合，所述參考分子具有和分子X’相同的構(gòu)架區(qū)和恒定部分但具有和Seq.Id.No.1和2所示相同的高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’。
在本發(fā)明說明書中，如果兩個(gè)氨基酸序列在最佳比對(duì)時(shí)在同樣的位置上具有至少80％相同的氨基酸殘基(氨基酸序列中的缺口或插入被計(jì)為不相同的殘基)，則它們相互有至少80％同源性。
對(duì)MCP-1與其受體結(jié)合的抑制可以方便地在多種試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，這些試驗(yàn)包括下文中描述的那些試驗(yàn)。術(shù)語“以相同的程度”是指在上述一個(gè)試驗(yàn)中參考分子和等價(jià)分子在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上表現(xiàn)出基本上相似的MCP-1結(jié)合抑制曲線。例如，當(dāng)按上述進(jìn)行測(cè)定時(shí)，對(duì)MCP-1和其受體(CCR2B)結(jié)合的抑制，典型地本發(fā)明的MCP-1結(jié)合分子具有的IC50S在相應(yīng)參考分子的IC50的+/-×5范圍內(nèi)，優(yōu)選與之基本相同。
例如，所用試驗(yàn)可以是通過膜結(jié)合MCP-1受體(CCR2B)和本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子進(jìn)行的MCP-1結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，該試驗(yàn)可以使用例如下文實(shí)施例中所述的SPA技術(shù)進(jìn)行。
最優(yōu)選地，人MCP-1抗體包含至少a)一條含有如下可變區(qū)和人重鏈恒定部分的重鏈，所述可變區(qū)具有與Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸終止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列；和b)一條含有如下可變區(qū)和人輕鏈恒定部分的輕鏈，所述可變區(qū)具有與Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸終止于第109位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列。
人重鏈恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或ε型，優(yōu)選γ型，更優(yōu)選γ4型，而人輕鏈恒定部分可以是κ或λ型(其包括λ1、λ2和λ3亞型)但優(yōu)選κ型。所有這些恒定部分的氨基酸序列均可參見Kabat等，同上。
本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子可以通過重組DNA技術(shù)制備。鑒于此，必須構(gòu)建編碼該結(jié)合分子的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、將其置于適當(dāng)?shù)目刂菩蛄兄虏⑥D(zhuǎn)移至適宜的宿主生物中用于表達(dá)。
因此，在非常一般的意義上本發(fā)明提供(i)編碼本發(fā)明的單結(jié)構(gòu)域的MCP-1結(jié)合分子、本發(fā)明的單鏈MCP-1結(jié)合分子、本發(fā)明的MCP-1結(jié)合分子或其重鏈或輕鏈或片段的DNA分子，和(ii)本發(fā)明DNA分子在通過重組方式制備本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子中的用途。
本領(lǐng)域現(xiàn)狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)本文提供的信息，即高變區(qū)的氨基酸序列和編碼它們的DNA序列，合成本發(fā)明DNA分子。構(gòu)建可變區(qū)基因的方法描述在例如EPA 239 400中，并可以簡(jiǎn)單地總結(jié)如下克隆編碼具有任何特異性的MAb的可變區(qū)的基因。確定編碼構(gòu)架區(qū)和高變區(qū)的DNA區(qū)段，并將編碼高變區(qū)的DNA區(qū)段從中除去以便編碼構(gòu)架區(qū)的DNA區(qū)段與接點(diǎn)處的適宜限制性位點(diǎn)融合在一起。可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法誘變DNA分子的方式在適當(dāng)?shù)奈恢卯a(chǎn)生這些限制性位點(diǎn)。根據(jù)Seq.Id.No.1或2所示序列通過DNA合成制備合成的雙鏈CDR盒。使這些盒具有粘性末端，以便可以將它們連接在構(gòu)架的接點(diǎn)處。
而且，為了獲得編碼本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子的DNA構(gòu)建體，并不需要從生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞系獲取mRNA。因此，對(duì)于在僅有關(guān)于抗體基因的核苷酸序列的書面信息時(shí)如何通過重組DNA技術(shù)制備抗體，PCT申請(qǐng)WO90/07861給出了完全的教導(dǎo)。該方法包括合成大量的寡核苷酸、通過PCR方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、和將它們拼接成期望的DNA序列。
包含適宜啟動(dòng)子或編碼重鏈和輕鏈恒定部分的基因的表達(dá)載體可通過公共渠道獲得。因此，一旦制備了本發(fā)明的DNA分子，就可以方便地將其轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。編碼單鏈抗體的DNA分子也可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法，如WO 88/1649中的描述來制備。
鑒于上面的描述，對(duì)于本申請(qǐng)來講，不必為滿足說明書充分公開的要求而進(jìn)行雜交瘤或細(xì)胞系的保藏。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如下描述的用于制備MCP-1結(jié)合分子的第一和第二DNA構(gòu)建體第一DNA構(gòu)建體編碼重鏈或其片段并包含a)編碼交替地包含高變區(qū)和構(gòu)架區(qū)的可變區(qū)的第一部分，所述高變區(qū)順次是氨基酸序列顯示在Seq.Id.No.1中的CDR1、CDR2和CDR3；該第一部分起始于編碼可變區(qū)的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼可變區(qū)的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，和b)編碼重鏈恒定部分或其片段的第二部分，其起始于編碼重鏈恒定部分的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼該恒定部分或其片段的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，之后接終止密碼子。
優(yōu)選地，該第一部分編碼具有與Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并終止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的可變區(qū)。更優(yōu)選，該第一部分具有Seq.Id.No.1所示起始于第1位核苷酸并終止于第366位核苷酸的核苷酸序列。而且優(yōu)選地，該第二部分編碼人重鏈的恒定部分，更優(yōu)選人γ4鏈的恒定部分。該第二部分可以是基因組來源的DNA片段(包含內(nèi)含子)或cDNA片段(無內(nèi)含子)。
第二DNA構(gòu)建體編碼輕鏈或其片段并包含a)編碼交替地包含高變區(qū)和構(gòu)架區(qū)的可變區(qū)的第一部分；所述高變區(qū)是氨基酸序列顯示在Seq.Id.No.2中的CDR1’、CDR2’和CDR3’；該第一部分起始于編碼可變區(qū)的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼可變區(qū)的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，和b)編碼輕鏈恒定部分或其片段的第二部分，其起始于編碼輕鏈恒定部分的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼該恒定部分或其片段的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，之后接終止密碼子。
優(yōu)選地，該第一部分編碼具有與Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并終止于第109位氨基酸的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列的可變區(qū)。更優(yōu)選，該第一部分具有Seq.Id.No.2所示起始于第1位核苷酸并終止于第327位核苷酸的核苷酸序列。而且優(yōu)選地，該第二部分編碼人輕鏈的恒定部分，更優(yōu)選人κ鏈的恒定部分。
本發(fā)明還包括這樣的MCP-1結(jié)合分子，在該分子中一個(gè)或多個(gè)，典型地僅少許CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’或CDR3’殘基與Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2所示殘基相比發(fā)生了改變；例如可以通過突變，如定點(diǎn)誘變相應(yīng)的DNA序列來實(shí)現(xiàn)此改變。本發(fā)明包括編碼此改變的MCP-1結(jié)合分子的DNA序列。本發(fā)明還包括這樣的結(jié)合分子，該分子中一個(gè)或多個(gè)，典型地僅少許構(gòu)架區(qū)殘基與Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2所示殘基相比發(fā)生了改變。
在第一和第二DNA構(gòu)建體中，第一和第二部分可以通過內(nèi)含子分隔開，并且可以方便地將增強(qiáng)子放置在第一和第二部分之間的內(nèi)含子中。該增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄但不翻譯，其存在可以幫助轉(zhuǎn)錄的有效進(jìn)行。在特定實(shí)施方案中，第一和第二DNA構(gòu)建體包含有利地來源于人的重鏈基因的增強(qiáng)子。
將各DNA構(gòu)建體置于適宜的表達(dá)控制序列的控制下，尤其是適宜的啟動(dòng)子的控制下。任何類型的啟動(dòng)子均可以使用，只要它適合DNA構(gòu)建體將要轉(zhuǎn)移至其中進(jìn)行表達(dá)的宿主生物即可。然而，如果表達(dá)發(fā)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，則尤其優(yōu)選使用免疫球蛋白基因的啟動(dòng)子。
可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中制備期望的抗體。適宜的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法得到，所述方法包括將置于適宜的控制序列之下的第一和第二DNA構(gòu)建體顯微注射至卵中、將如此制備的卵轉(zhuǎn)移至適宜的假孕雌性個(gè)體中并選擇表達(dá)期望抗體的后代。
當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中制備抗體鏈時(shí)，必須首先將這些DNA構(gòu)建體插入一個(gè)單一表達(dá)載體中，或插入兩個(gè)分離的但相容的表達(dá)載體中，后一種可能性是優(yōu)選的。
因此，本發(fā)明還提供能夠在原核或真核細(xì)胞系中復(fù)制并包含至少一個(gè)上述DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體。
然后將含有DNA構(gòu)建體的各表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至適宜的宿主生物中。當(dāng)DNA構(gòu)建體被分別地插在兩個(gè)表達(dá)載體上時(shí)，可以將它們單獨(dú)地轉(zhuǎn)移，即每個(gè)細(xì)胞一種類型的載體，或共轉(zhuǎn)移，此后一種可能性是優(yōu)選的。適宜的宿主生物可以是細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，后者是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是淋巴來源的，例如骨髓瘤、雜交瘤或正常的永生化B細(xì)胞，它有利地不表達(dá)任何內(nèi)源性抗體重鏈或輕鏈，如SP2/0細(xì)胞系。
為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)選將MCP-1結(jié)合分子的編碼序列整合在宿主細(xì)胞DNA中允許或利于該MCP-1結(jié)合分子高水平表達(dá)的座位上。可以基于表達(dá)的MCP-1結(jié)合分子的水平，鑒定和選擇其中MCP-1結(jié)合分子的編碼序列整合在此類有利的座位上的細(xì)胞。任何適宜的選擇標(biāo)記均可以用于制備含有MCP-1結(jié)合分子編碼序列的宿主細(xì)胞；例如，可以使用dhfr基因/氨甲蝶呤或等價(jià)選擇系統(tǒng)。用于本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子表達(dá)的系統(tǒng)包括基于GS的擴(kuò)增/選擇系統(tǒng)，如EP 0256055 B，EP 0323997 B和歐洲專利申請(qǐng)89303964.4中描述的那些。
在本發(fā)明的再一方面，提供制備MCP-1結(jié)合分子的方法，包括(i)培養(yǎng)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的生物和(ii)從培養(yǎng)物中回收MCP-1結(jié)合分子。
最優(yōu)選地，本發(fā)明MCP-1結(jié)合分子是人抗體，如AAV293、AAV294或ABN912抗體，而且其可以通過培養(yǎng)相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞系制備，或優(yōu)選從含有編碼該人抗體的DNA(包括經(jīng)改變而使抗體同種型或其它抗體功能或性質(zhì)發(fā)生變化的DNA)的重組細(xì)胞系中制備。
根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)AAV294及更特別地AAV293和ABN912抗體與重組人伊奧他新-1(eotaxin-1)有交叉反應(yīng)。這樣，這些抗體可以有利地與伊奧他新-1及MCP-1相互作用，并可以用于抑制伊奧他新-1和其受體的結(jié)合，以及抑制MCP-1和其受體的結(jié)合。過敏性疾病和病癥，包括過敏性和炎性呼吸道疾病，如哮喘涉及到伊奧他新分泌。對(duì)MCP-1和伊奧他新，例如人MCP-1和人伊奧他新具有結(jié)合特異性的抗體，尤其是嵌合和CDR嫁接的抗體且特別是人抗體，以及這些抗體在治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病中的用途均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，再一方面，本發(fā)明包括與伊奧他新有交叉反應(yīng)的MCP-1的抗體。
有利地，本發(fā)明此方面的抗體是能夠抑制MCP-1和其受體的結(jié)合并能夠抑制伊奧他新和其受體的結(jié)合的抗體。
其它方面，本發(fā)明包括i)可與伊奧他新-1發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新-1與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體在治療MCP-1或伊奧他新-1介導(dǎo)的疾病或病癥中的用途；ii)給患者治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，所述方法包括給患者施用有效量的可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體；iii)含有可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP抗體、以及可藥用賦形劑、稀釋劑或載體的藥物組合物；和iv)可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體在制備用于治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物中用途。
在這些其它方面中，所述MCP-1抗體優(yōu)選與伊奧他新-1發(fā)生交叉反應(yīng)，而所述伊奧他新介導(dǎo)的疾病優(yōu)選是伊奧他新-1介導(dǎo)的疾病。
為了本說明書的目的，如果一個(gè)抗體與AAV294、AAV293或ABN912抗體相比能夠基本上以相同的程度抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合，則該抗體“能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合”，其中“以相同程度”具有以上定義的含義。
在本說明書中，術(shù)語“MCP-1介導(dǎo)的疾病”和“伊奧他新介導(dǎo)的疾病”包括MCP-1或伊奧他新，尤其是伊奧他新-1在其中對(duì)疾病或病況(包括疾病或病況的引起、發(fā)展、進(jìn)程、持續(xù)或病理)直接地或間接地起作用的所有疾病和病況。
在本說明書中，術(shù)語“治療”是指預(yù)防性或防止性治療以及治愈性或疾病改善性治療，包括對(duì)易于感染疾病或被懷疑已感染疾病的患者、以及患病的或已被診斷患有疾病或病況的患者的治療，并包括對(duì)臨床復(fù)發(fā)的抑制。
AAV293和ABN912抗體對(duì)MCP-1的結(jié)合親和力比以前報(bào)道的抗MCP-1抗體，如抗人MCP-1抗體對(duì)MCP-1的結(jié)合親和力高。因此，ABN912與MCP-1結(jié)合的解離平衡常數(shù)KD小于約50pM，例如約43pM。此高結(jié)合親和力使得ABN912尤其適用于治療性應(yīng)用。
因此，再一方面，本發(fā)明提供與MCP-1結(jié)合的KD為約50pM或更少的抗MCP-1抗體。如上面就與伊奧他新有交叉反應(yīng)的抗MCP-1抗體描述的用途、方法和組合物一樣，本發(fā)明此方面也包括涉及這些高親和抗體的用途、方法和組合物。
而且，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)ABN912抗體和包括MCP-1第24位的精氨酸殘基的MCP-1抗原性表位結(jié)合。因此，有利地，ABN912抗體能夠直接干擾MCP-1和其受體(CCR2B)的結(jié)合；對(duì)于MCP-1和CCR2B的結(jié)合而言，Arg24是MCP-1的一個(gè)重要?dú)埢?。此外，ABN912的結(jié)合位點(diǎn)包括MCP-1的Arg18和Lys49殘基。
因此，再一方面，本發(fā)明包括與含有MCP-1第24位的精氨酸殘基的MCP-1抗原性表位結(jié)合的抗MCP-1抗體。優(yōu)選地，該抗原性表位還包括MCP-1的第18位精氨酸殘基和第49位賴氨酸殘基。類似地，本發(fā)明此方面包括如同上面就可與伊奧他新交叉反應(yīng)的抗MCP-1抗體描述的用途、方法和組合物。
上述MCP-1結(jié)合分子，尤其是根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的MCP-1結(jié)合分子；可與伊奧他新交叉反應(yīng)的抗MCP-1抗體，尤其是能夠抑制MCP-1和伊奧他新與它們的受體結(jié)合的抗體；對(duì)于與MCP-1的結(jié)合而言具有約50pM或更少的KD的抗MCP-1抗體；和可與包括MCP-1第24位精氨基酸殘基的MCP-1抗原性表位結(jié)合的抗體在下文中均稱作“本發(fā)明的抗體”。
優(yōu)選地，本發(fā)明抗體是根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的MCP-1結(jié)合分子。有利地，本發(fā)明抗體是人抗體，最優(yōu)選ABN912抗體或其直接等價(jià)物。
本發(fā)明抗體可以抑制MCP-1對(duì)其靶細(xì)胞的作用，因此適用于治療MCP-1介導(dǎo)的疾病和病癥。本發(fā)明抗體的這些和其它藥理學(xué)活性可以在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法，例如下述方法中得以證實(shí)1.對(duì)MCP-1與CCR2B表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抑制MCP-1實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和效應(yīng)子功能的先決條件是MCP-1與受體CCR2B的相互作用。閃爍親近測(cè)定法(SPA)技術(shù)被用于證實(shí)本發(fā)明抗體可抑制MCP-1和表達(dá)所述受體的細(xì)胞膜的結(jié)合。
將表達(dá)CCR2B的CHO細(xì)胞的細(xì)胞膜與一組濃度的靶抗體(例如10-14M至10-8M)一起孵育，使用麥胚凝集素小珠通過SPA測(cè)量(125-I)-MCP-1的殘留結(jié)合。當(dāng)在此試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，本發(fā)明抗體典型地具有約0.1至約10nM，特別是約0.5nM(如461±206pM)的IC50S。
2.對(duì)MCP-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制本發(fā)明抗體抑制MCP-1引起的生理學(xué)作用的潛力通過在有和無抗體的情況下測(cè)量MCP-1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員來確定。
使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)CCR2B的CHO細(xì)胞系和THP-1細(xì)胞通過熒光染色和FACS分析測(cè)量鈣應(yīng)答，見下文實(shí)施例中的描述。當(dāng)在此試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，本發(fā)明抗體典型地具有約0.05至約10nM，特別是約0.5nM(例如，390±20pM)IC50S。
本發(fā)明抗體有利地與伊奧他新，尤其是伊奧他新-1發(fā)生交叉反應(yīng)，因此可以有利地抑制伊奧他新對(duì)其靶細(xì)胞的作用，并由此還適用于治療伊奧他新介導(dǎo)的疾病和病癥。本發(fā)明抗體和伊奧他新的交叉反應(yīng)性可以使用光生物傳感技術(shù)，如BIAcore(Karlsson等，J.Immunol.Meth.1991；145229-240)來測(cè)定。
正如上述試驗(yàn)中指出的，本發(fā)明抗體可以有力地阻斷MCP-1的作用，并優(yōu)選與exotaxin發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明抗體具有如下藥物用途本發(fā)明抗體可以用于預(yù)防和治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病或病況。MCP-1在白細(xì)胞運(yùn)輸，尤其是單核細(xì)胞向炎癥部位的遷移中有重要作用，因此本發(fā)明抗體可以用于抑制單核細(xì)胞遷移，例如以治療炎癥、過敏反應(yīng)和過敏性疾病、自身免疫病、移植排斥、涉及白細(xì)胞浸潤(rùn)的癌癥、狹窄或再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。
可以用本發(fā)明抗體治療的疾病或病況包括炎癥或過敏性疾病，包括呼吸道過敏性疾病如哮喘、過敏性鼻炎、COPD、超敏性肺病、超敏性肺炎、間質(zhì)性肺病(ILD)(例如特發(fā)性肺纖維化、或與自身免疫病如RA、SLE等有關(guān)的ILD)；過敏反應(yīng)或超敏反應(yīng)，藥物過敏(例如對(duì)青霉素或頭孢菌素)和昆蟲叮咬過敏；炎癥性腸病，如局限性回腸病和潰瘍性結(jié)腸炎；脊椎關(guān)節(jié)病、硬皮?。汇y屑病和炎性皮膚病，如皮炎、濕疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、蕁麻疹；脈管炎；自身免疫病，尤其是病因包括炎性成分在內(nèi)的自身免疫病，如關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)炎)和風(fēng)濕性疾病，包括涉及骨喪失、炎性疼痛、超敏反應(yīng)(包括呼吸道超敏反應(yīng)和皮膚超敏反應(yīng))和過敏的炎癥和風(fēng)濕性疾病?？梢詰?yīng)用本發(fā)明抗體的具體自身免疫病包括自身免疫性血液病(包括如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血和特發(fā)性血小板減少)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性軟骨病、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮膚癬菌病、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無力、銀屑病、斯-約綜合征、特發(fā)性口炎性腹瀉、自身免疫性炎癥性腸病(包括例如潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸病和腸易激惹綜合征)、自身免疫性甲狀腺炎、貝赫切特病、內(nèi)分泌性眼病、格雷夫斯病、肉樣瘤病、多發(fā)性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、眼色素層炎(前和后色素層炎)、干燥性角結(jié)膜炎和春季性角結(jié)膜炎、間質(zhì)性肺纖維化、和腎小球性腎炎(伴有或不伴有腎病綜合征，例如包括特發(fā)性腎病綜合征或微小病變腎病)；移植排斥(例如移植中，包括心臟、肺、心肺聯(lián)合、肝臟、腎臟、胰臟、皮膚或角膜移植中)，包括同種異體移植排斥或異種移植排斥或移植物抗宿主疾病，和與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的器官移植；動(dòng)脈粥樣硬化；
伴有皮膚或器官的白細(xì)胞浸潤(rùn)的癌癥；脈管系統(tǒng)，尤其是動(dòng)脈，如冠狀動(dòng)脈的狹窄或再狹窄，包括由對(duì)脈管的干涉以及新血管內(nèi)膜(neointimal)增生導(dǎo)致的狹窄或再狹窄；和涉及炎性反應(yīng)的其它疾病或病況，包括再灌注損傷、血癌、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性(例如敗血癥性休克或內(nèi)毒素性休克)、多發(fā)性肌炎、皮肌炎和肉芽腫性疾病，包括肉樣瘤病。
對(duì)于治療骨和軟骨代謝疾病，包括骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和其它炎癥性關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及一般性骨喪失，包括老化相關(guān)的骨喪失，尤其是牙周病，本發(fā)明抗體尤其有用。
對(duì)于上述適應(yīng)癥，當(dāng)然，適當(dāng)?shù)膭┝繉㈦S例如待施用的具體的本發(fā)明抗體、宿主、給藥模式和所治療疾病的性質(zhì)及嚴(yán)重性而改變。然而，在預(yù)防應(yīng)用中，一般，在每千克體重約0.05mg至約10mg、更通常在每千克體重約0.1mg至約5mg的劑量下，顯示出可獲得滿意的結(jié)果。對(duì)于預(yù)防性應(yīng)用，給藥頻率正常為約每周一次至不超過約每3個(gè)月一次，更通常是約每2周一次至不超過約每10周1次，例如每4或8周一次。本發(fā)明抗體可以方便地通過腸胃外、靜脈內(nèi)(例如進(jìn)入肘前或其它外周靜脈內(nèi))、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。例如，預(yù)防性治療典型地包括每月一次至每2至3個(gè)月一次，或頻率更低地施用本發(fā)明抗體。
本發(fā)明藥物組合物可以按常規(guī)方式制備。優(yōu)選提供凍干形式的本發(fā)明組合物。對(duì)于直接給藥，可以將其溶解在適宜的含水載體，如注射用無菌水或無菌緩沖生理鹽水中。如果期望配制成大體積溶液用于灌注，更確切地用于快速注射給藥時(shí)，則有利的是在配制時(shí)將人血清白蛋白或患者自身的肝素化血液加入此鹽水中。存在過量的此類生理惰性蛋白質(zhì)可以防止由于灌注溶液使用的容器和管子的壁的吸附而引起的抗體丟失。如果使用白蛋白，則適宜的濃度為0.5至4.5％重量鹽溶液。
在如下實(shí)施例中參照附圖僅通過舉例說明的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述

圖1A-顯示來自經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的恒河猴的各種穿刺活檢組織的嗜酸性過氧化物酶(eosinophilperoxidase，EPO)活性的柱形圖；B-顯示這些活檢組織的髓過氧化物酶(MPO)活性的類似柱形圖；圖2-顯示來自ABN912和CGP44290(對(duì)照抗體)處理前和后的4只恒河猴的組織學(xué)樣品的嗜酸性染色的照片；圖3-顯示在各種處理方案中人皮膚移植物中的Th細(xì)胞遷移(％)的柱形圖；和圖4-顯示ABN912突變體與MCP-1結(jié)合的相對(duì)結(jié)合親和力的柱形圖。
實(shí)施例我們用構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠(表達(dá)人IgG/κ的所有組成成份而非鼠免疫球的所有組成成份)(Fishwild等，1996，Nat Biotechnol.，第14卷，第845-851頁(yè))制備抗人MCP-1的抗體。通過標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)使這些小鼠的B細(xì)胞永生化，并得到分泌人IgG3/κ抗體AAV293的鼠雜交瘤細(xì)胞。
實(shí)施例1小鼠的免疫和雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生免疫用包含在完全弗氏佐劑中的重組人MCP-1(R&D Systems，Minneapolis，MN，美國(guó))，以每只小鼠100μg蛋白的劑量，在第0天和第14天(腹膜內(nèi))及第26天(靜脈內(nèi))免疫四只Medarex小鼠(小鼠號(hào)16194-16197，Medarex公司.Annadale，NJ，美國(guó))。在第41天，沒有一只小鼠顯示出有能探測(cè)到的血清抗體。在第49天和65天，用包含在不完全弗氏佐劑中的rhMCP-1，劑量是100μg蛋白每只小鼠，皮下對(duì)小鼠進(jìn)行進(jìn)一步的免疫。
當(dāng)在第106天進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在其中一只小鼠(小鼠號(hào)16194)的血清中探測(cè)到相當(dāng)可觀的抗MCP-1抗體效價(jià)。在融合之前，這只小鼠再接受7次加強(qiáng)免疫在第106天(腹膜內(nèi))、119天(皮下)和135天(腹膜內(nèi))用100μg蛋白(于鹽水中)每只小鼠的劑量來免疫，在融合前的第4天(x2-靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))和第3天及第2天(均為腹膜內(nèi))用25μg蛋白(于鹽水中)每只小鼠的劑量進(jìn)行免疫。
融合及雜交瘤的篩選在融合當(dāng)天，用CO2吸入法處死小鼠16194，用PEG 4000通過常規(guī)方法使全部脾臟細(xì)胞(4.8×107個(gè))與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系PAI-O細(xì)胞(5×107個(gè))融合。在含有一層小鼠腹膜細(xì)胞(Balb/c小鼠)飼養(yǎng)層的720個(gè)孔中接種融合細(xì)胞(1ml/孔)，所述孔中有補(bǔ)加了HAT的RPMI 1640培養(yǎng)基、10％熱滅活的胎牛血清、5×10-5Mβ-巰基乙醇、50μg/ml慶大霉素。每4天更換一次培養(yǎng)基，在14天后，將HAT培養(yǎng)基換成HT培養(yǎng)基，即，把氨基蝶呤去除。在接種的最初720個(gè)孔中，461個(gè)孔(64％)呈雜交瘤生長(zhǎng)陽性。收集上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(ELISA)篩選MCP-1反應(yīng)性單克隆抗體。鑒定出7個(gè)IgG亞型的單克隆抗體。用4×96孔微量滴定板，按每個(gè)孔0.5個(gè)細(xì)胞/100μl接種進(jìn)行克隆。在8天后用顯微鏡來檢測(cè)這些克隆，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基100μl，并在第二天用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)上清液。選出具有最高反應(yīng)性的雜交瘤，克隆149，用于進(jìn)一步克隆及表征?；谝蕾噐hMCP-1的鈣動(dòng)員實(shí)驗(yàn)中雜交瘤亞克隆的IgG3/κ單克隆抗體產(chǎn)物AAV293的抑制活性，篩選出雜交瘤亞克隆149-12。
重鏈及輕鏈的純化和部分氨基酸序列氨基酸測(cè)序用SDS-PAGE分離已經(jīng)純化的抗體AAV293的輕鏈和重鏈，并用Edman降解法測(cè)出氨基端的氨基酸。從克隆的雜交瘤細(xì)胞中得到mRNA，進(jìn)而得到cDNA，用PCR擴(kuò)增此cDNA得到編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行全測(cè)序。在以下的Seq.Id No.1和Seq Id No.2中給出了重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基端氨基酸序列及相應(yīng)的DNA序列，其中粗體顯示了CDR。Seq.Id no.130 60GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTCGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu10 2090 120TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGT TGG GTC CGC CAG GCTSer Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala30 40150 180CCA GGG AAA GGG CTG GAG TGG CTG GCC Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 5060210 240 CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAT TCA CTG TAT Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr70 80270 300CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TTC TGT GCG AGG Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 90 100330 360 TGG GGC CGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val110 120TCT TCASer SerSeq.Id no.230 60GCC ATC CAG TTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ATCAla Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile10 20 90 120CTC ATC TGC TGG TAT CAG CAG AAA CCALeu Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro30 40150 180GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGG GTC CCA TCAGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser50 60210240AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG CCA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCTArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro70 80270 300GAA GAT TTT GCA ACT TAT TTC TGT CTC ACT TTC GGC GGAGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Thr Phe Gly Gly90100GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA ACTGly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr用上述的方法還得到另一個(gè)抗MCP-1單克隆抗體，IgGl/κ單克隆抗體產(chǎn)物，AAV294。這種抗體與MCP-1的結(jié)合親和力大約比AAV293抗體的親和力的1/3還弱，并且發(fā)現(xiàn)，除了如下替代外，該抗體的VH和VL的氨基酸序列與AAV293抗體的VH和VL的序列相同，這些替代是在VH，AAV294在第24位用Val替代Ala，在第60位用Phe替代Tyr，在第74位用Ser替代Asn，而在VL，AAV294在第30位用Tyr替代Ser，在第69位用Thr替代Pro。
重鏈和輕鏈表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR擴(kuò)增克隆的VL和VH的編碼序列，通過適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)將它們插入到盒式載體中，這種載體提供了免疫球蛋白啟動(dòng)子、來自RFT2抗體的前導(dǎo)序列(Heinrich等.(1989)J.Immunol.第143卷，第3589-97頁(yè))、J片段的一部分和剪接供體位點(diǎn)。將含有完整VL區(qū)、啟動(dòng)子和分泌前導(dǎo)序列的輕鏈盒轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中，所述載體含有人的Ck基因、免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子以及用于氨甲蝶呤選擇的修飾過的鼠源dhfr cDNA。
相應(yīng)地，重鏈盒轉(zhuǎn)移到含有人IgG4基因、免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子和新霉素抗性選擇基因的表達(dá)載體中。
在表達(dá)載體中，重鏈和輕鏈的構(gòu)型都與基因組中重排的免疫球蛋白基因的構(gòu)型類似，這種構(gòu)型據(jù)認(rèn)為對(duì)于高水平表達(dá)是至關(guān)重要的。
為了制備抗體，將以上的載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞系，例如SP2/0細(xì)胞系。含有載體序列的細(xì)胞可以通過氨甲喋呤進(jìn)行篩選，培養(yǎng)篩選出的細(xì)胞系，用以表達(dá)ABN912抗體(人IgG4/κ抗人MCP-1抗體)。
對(duì)分別載有NVP-ABN912的重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體進(jìn)行線性化，通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入Sp2/0細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含有胎牛血清(FCS)的非選擇性RPMI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20小時(shí)，然后以1.4mg/ml使用G41848-72小時(shí)。使轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞庫(kù)適應(yīng)沒有FCS但含有通常使用的添加劑(丙酮酸鹽、谷氨酰胺、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素)的RPMI培養(yǎng)基。用200nM氨甲喋呤和1μM氨甲喋呤進(jìn)行兩步擴(kuò)增后，分離出高產(chǎn)者克隆。用輔助的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(additional spinner exprimant)，通過在T175培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)4-5個(gè)月，評(píng)價(jià)克隆和亞克隆的產(chǎn)量穩(wěn)定性。對(duì)于高產(chǎn)者克隆，從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到生物反應(yīng)器培養(yǎng)。得到幾個(gè)對(duì)ABN912的生產(chǎn)有用的高產(chǎn)者細(xì)胞系。在過度生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中得到的累積產(chǎn)物的最大量是504mg/l。
實(shí)施例2生物化學(xué)和生物學(xué)數(shù)據(jù)在體外人單克隆抗體ABN912結(jié)合人MCP-1并抑制其作用。該單克隆抗體與重組人MCP-1的結(jié)合通過兩種獨(dú)立的生物化學(xué)方法來進(jìn)一步表征，即Biacore分析和閃爍親近測(cè)定法(SPA)分析。用BIAcore評(píng)價(jià)ABN912抗體對(duì)其它CC趨化因子或非人MCP-1的特異性，用閃爍親近測(cè)定法展示ABN912對(duì)MCP-1與表達(dá)CCR2B的細(xì)胞的結(jié)合的抑制。在表達(dá)CCR2B的細(xì)胞中通過Ca2+動(dòng)員實(shí)驗(yàn)展示ABN912對(duì)重組和天然產(chǎn)生的MCP-1的生物學(xué)活性。而用MCP-1誘導(dǎo)的趨化性分析試驗(yàn)展示ABN912對(duì)其天然靶細(xì)胞(外周血單核細(xì)胞，hPBMC)的活性。2.1 BIAcore分析用BIAcore分析測(cè)定出重組人MCP-1與固定化ABN912結(jié)合的結(jié)合與解離速率常數(shù)，并得出KD值。把ABN912固定在傳感芯片表面，通過表面等離子體共振(Surface plasmon resonance)測(cè)量出它與重組MCP-1的結(jié)合(BIACORE 2000儀器手冊(cè)，1999年三月(AC版本)；httpwww.biacore.com)。得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。
ABN912與重組人MCP-1的結(jié)合有很高的親和力。2.2趨化因子選擇性和物種特異性情況為了確定MCP-1與ABN912相互作用的特異性，我們用BIAcore評(píng)價(jià)了一系列非人MCP-1和CC-趨化因子與ABN912相互作用的潛力。2.2.1與非靈長(zhǎng)類MCP-1的相互作用我們?cè)u(píng)價(jià)了一系列MCP-1與ABN912抗體的結(jié)合，這些MCP-1來自實(shí)驗(yàn)室常用的物種。這個(gè)測(cè)定的作法是把5nM趨化因子溶液注射入預(yù)先加載有ABN912的BIAcore流過池(flowcell)中。8分鐘后測(cè)定對(duì)于每種被調(diào)查的趨化因子而言發(fā)生結(jié)合的趨化因子數(shù)量。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于下表中，表示為與重組人MCP-1(100％)相比每種趨化因子的結(jié)合百分?jǐn)?shù)。
ABN912對(duì)人MCP-1是特異的，并且與任何其它被測(cè)物種的MCP-1沒有交叉反應(yīng)。2.2.2與重組趨化因子的相互作用為了測(cè)定ABN912與其它CC-趨化因子的交叉反應(yīng)性情況，我們用上述方法評(píng)價(jià)它們與抗體的結(jié)合潛力。每種趨化因子與重組人源MCP-1相比的結(jié)合百分?jǐn)?shù)如下表所示。
ABN912對(duì)人MCP-1是特異的，不與MCP-2、MCP-3、MCP-4、LEC、RANTES、MIP-lα和MIP-1β發(fā)生交叉反應(yīng)，但與人伊奧他新，即人伊奧他新-1，有顯著的交叉反應(yīng)。并且發(fā)現(xiàn)AAV294與伊奧他新也有顯著的交叉反應(yīng)。2.3對(duì)MCP-1與CCR2B表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合的抑制作用用SPA(閃爍親近測(cè)定法)技術(shù)顯示ABN912抗體可以阻止MCP-1與表達(dá)CCR2B受體的細(xì)胞膜結(jié)合。把表達(dá)CCR2B的CHO細(xì)胞(CHO#84-見下)的細(xì)胞膜與一系列濃度的ABN912(10-14M至10-8M)一起孵育，用麥胚凝集素珠通過閃爍親近測(cè)定法測(cè)定放射性(125-I)MCP-1的殘留結(jié)合。來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均IC50[M]是(461±206)×10-12。ABN912阻止MCP-1與表達(dá)CCR2B受體的細(xì)胞膜結(jié)合。2.4對(duì)MCP-1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用MCP-1誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的早期事件是胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)員，這可以利用熒光染料來測(cè)定。
對(duì)鈣應(yīng)答的測(cè)定是通過利用細(xì)胞系CHO#84來實(shí)現(xiàn)的，該CHO細(xì)胞系是一個(gè)經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而表達(dá)趨化因子受體CCR2B的細(xì)胞系。將CHO#84細(xì)胞培養(yǎng)在沒有RNA酶和DNA酶的MEMα培養(yǎng)基中進(jìn)行，其中所述培養(yǎng)基含有g(shù)lutamax-1并補(bǔ)充有10％透析的胎牛血清、200U/ml青霉素/鏈霉素和作為選擇劑的80nM氨甲蝶呤。在細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)至密集但未達(dá)到匯合之前，用PBS洗細(xì)胞并且通過與胰蛋白酶-EDTA短時(shí)間孵育(最多1分鐘)剝離細(xì)胞。
在RPMI中洗一次CHO#84細(xì)胞，在250g下離心7分鐘，在含有0.04％pluronic acid、1.0μM fura red和0.3μM fluo-3的Hepes緩沖液0.5％BSA中重懸，達(dá)到3.5×106個(gè)細(xì)胞/毫升。在暗處室溫下用這些熒光鈣探測(cè)加載細(xì)胞，此過程持續(xù)1小時(shí)且其間不時(shí)地輕輕攪拌(6-8次)。然后在Hepes緩沖液0.5％BSA中離心兩次，收獲細(xì)胞，沉淀在Hepes緩沖液0.5％BSA中重懸，達(dá)到1.5-2×106個(gè)細(xì)胞/毫升。細(xì)胞至此即可用于刺激和鈣測(cè)定，并于使用前在室溫下暗處保存。
抗體和趨化因子(MCP-1，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國(guó))均配制成20倍濃度的溶液，在加入細(xì)胞之前，把這兩種溶液在室溫下混合在一起5-8分鐘。用流式細(xì)胞儀(FACS，Becton Dickinson)相對(duì)時(shí)間測(cè)定綠色和紅色熒光的值。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞樣本，為了獲得基線值，首先對(duì)預(yù)先加載了熒光Ca-針的細(xì)胞中的熒光進(jìn)行為期15秒的記錄。暫時(shí)中斷數(shù)據(jù)的獲取，通過加入小體積的刺激物(10倍濃度的趨化因子，其中有或者沒有抗體)刺激細(xì)胞，然后恢復(fù)熒光測(cè)定。全部熒光測(cè)定持續(xù)51秒。
所用Ca2+指示劑在結(jié)合鈣時(shí)表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度的相反遷移；fura red熒光下降而fluo-3熒光上升。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)紅色熒光和綠色熒光進(jìn)行紀(jì)錄，算出綠色熒光和紅色熒光的比率，并對(duì)時(shí)間作圖?！盎€比率”和“刺激比率”分別定義為僅在刺激前獲得的比率的平均值和刺激后獲得的最大比率的平均值。我們用刺激指數(shù)(S.I.)來定量應(yīng)答強(qiáng)度，刺激指數(shù)是指“刺激比率”除以“基線比率”的值。把有抗體時(shí)獲得的刺激指數(shù)表示成只有溶劑時(shí)獲得的刺激指數(shù)的百分?jǐn)?shù)。溶解在溶劑S1中的抗體Al的抑制作用(％)通過下式計(jì)算100-[S.I.Al×100]/S.I.s1]
對(duì)ABN912和前體抗體AAV293及商購(gòu)得到的無關(guān)抗MCP-1鼠源抗體(R&D Systems)的抑制作用進(jìn)行比較。而且由于用于產(chǎn)生AAV293的免疫原是來自大腸桿菌的未糖基化的重組人MCP-1，故還使用來自TNFα刺激的HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的MCP-1上清液來刺激CHO#84細(xì)胞，并按上述測(cè)量ABN912對(duì)Ca2+動(dòng)員的拮抗作用。所獲結(jié)果見下表。
ABN912特異地抑制CHO#84細(xì)胞中由MCP-1誘導(dǎo)的Ca2+動(dòng)員，且對(duì)來自大腸桿菌的和來自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的MCP-1具有相似效果。2.5對(duì)MCP-1誘導(dǎo)的趨化性的抑制作用用基于Boyden室的趨化性分析方法測(cè)定ABN912抑制MCP-1對(duì)人外周血單核細(xì)胞(hPBMC)的趨化作用的能力。由LymphoprepTM制備HPBMC，并將2×106個(gè)單核細(xì)胞/毫升用作輸入量。按指定的摩爾比將ABN912或無關(guān)抗體(陰性對(duì)照)加入Boyden室的底部和頂部區(qū)室中。在底部區(qū)室中用5.7nM重組人MCP-1或1nM fMIPL(陰性對(duì)照)誘導(dǎo)趨化性。在室溫下，允許細(xì)胞從頂部區(qū)室向底部區(qū)室遷移90分鐘。通過染色和計(jì)數(shù)測(cè)定出發(fā)生遷移的細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABN912以劑量依賴性方式抑制MCP-1誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞的趨化性。ABN912對(duì)MCP-1誘導(dǎo)的趨化性的作用是特異的，無關(guān)抗體無此作用，并且ABN912對(duì)fMIFL誘導(dǎo)的趨化性也無此作用。2.6對(duì)恒河猴中白細(xì)胞遷移的抑制作用這個(gè)機(jī)制性模型用于測(cè)試當(dāng)給恒河猴靜脈內(nèi)快速注射NVP-ABN912時(shí)，MCP-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞向恒河猴皮膚的遷移能否被NVP-ABN912所抑制。
為了增加白細(xì)胞數(shù)目以及致敏內(nèi)皮細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)最佳的白細(xì)胞募集，對(duì)成年雄性恒河猴進(jìn)行為期13天(每天兩次，靜脈內(nèi))、劑量為30μg/kg的IL-3注射。在第13天，麻醉猴子，在右側(cè)胸部和腹部皮內(nèi)注射MCP-1(10μg)，一式三份。四小時(shí)后，再次麻醉猴子，并從MCP-1注射點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行穿刺活檢。然后，用NVP-ABN912或者同種型匹配的直接抗人癌胚抗原的人源化陰性對(duì)照抗體(CGP44290)對(duì)猴子進(jìn)行靜脈內(nèi)快速注射以達(dá)到5mg/kg的劑量。最后，在左側(cè)胸部和腹部皮內(nèi)再次注射MCP-1(10μg)，一式三份。這些注射位點(diǎn)與先前的注射位點(diǎn)是對(duì)稱位點(diǎn)關(guān)系。四小時(shí)后，麻醉猴子，從MCP-1注射點(diǎn)進(jìn)行穿刺活檢。然后，將所有的穿刺活檢物切成兩半，一半凍在液氮中留作酶分析。另一半保留在福爾馬林里留作以后的組織學(xué)分析。對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的酶分析分別是測(cè)其嗜酸性過氧化物酶(EPO)活性和髓過氧化物酶(MPO)活性。對(duì)每只猴子都要做進(jìn)行PBS注射和不進(jìn)行注射以刺激細(xì)胞浸潤(rùn)的平行對(duì)照。每個(gè)對(duì)照都沒發(fā)現(xiàn)顯著的抗體介導(dǎo)效應(yīng)。
分別用NVP-ABN912和CGP44290(IgG4，同種型匹配的陰性對(duì)照)處理之前和之后在MCP-1注射位點(diǎn)的酶促活性顯示為平均值±SD。對(duì)于每種條件，每只猴子身上均使用多個(gè)注射位點(diǎn)(3)。在圖1.A-嗜酸性粒細(xì)胞遷移和圖1.B-嗜中性粒細(xì)胞遷移中，顯示了來自兩個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的聯(lián)合數(shù)據(jù)。
用抗體處理之前(MCP-1未處理，100％)和之后，穿刺活檢組織中的標(biāo)化EPO(A)或MPO(B)活性表示為平均值±SD。
當(dāng)用10μgMCP-1在恒河猴皮膚中誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移時(shí)，與抗體處理前的白細(xì)胞遷移相比，在有NVP-ABN912時(shí)觀察到85.5％嗜酸性粒細(xì)胞和81.4％嗜中性粒細(xì)胞的遷移受到抑制。在應(yīng)用CGP44290時(shí)，對(duì)這兩種細(xì)胞而言僅測(cè)定到大約20％的抑制作用?？紤]到單獨(dú)的PBS注射導(dǎo)致與用10μgMCP-1時(shí)所觀察到的應(yīng)答相比13.0％(嗜酸性粒細(xì)胞)和22.7％(嗜中性粒細(xì)胞)的募集，因此NVP-ABN912的施用把白細(xì)胞遷移數(shù)目減少到用PBS刺激時(shí)所觀察到的背景水平。
在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，在NVP-ABN912與對(duì)照抗體之間觀察到的差異是極顯著差異(p＜0.01)，考慮到此作用的大小，這似乎也具有生物學(xué)上的相關(guān)性。在圖2中顯示了嗜酸性粒細(xì)胞遷移的典型組織學(xué)。
本說明書展示了對(duì)于四只猴子(2279，2280，2281和2282)來自于MCP-1誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的穿刺活檢組織的組織學(xué)。
(A)，(B)，(E)，(F)各是在抗體處理前猴子2279，2280，2281和2282的嗜酸性粒細(xì)胞染色。
(C)，(D)，(G)，(H)各是在抗體處理后猴子2279，2280，2281和2282的嗜酸性粒細(xì)胞染色。
猴子2279和2280是用同種型匹配的陰性對(duì)照抗體CGP44290(5mg/kg)處理的，猴子2281和2282是用NVP-ABN912(5mg/kg)處理的。
嗜酸性粒細(xì)胞染成紅色(在黑白色圖中顯示為暗點(diǎn))，在(G)和(H)區(qū)用箭頭示出在這兩只NVP-ABN912處理的猴子中存在的少數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞。
用CGP44290處理時(shí)，沒有觀察到處理前后有差異；然而用NVP-ABN912處理猴子時(shí)，觀察到嗜酸性粒細(xì)胞的遷移幾乎完全被抑制。2.7對(duì)SCID-hu小鼠中T細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用這個(gè)機(jī)制性模型用于測(cè)試MCP-1誘導(dǎo)的Th細(xì)胞向SCID-hu小鼠皮膚的浸潤(rùn)能否被腹膜內(nèi)注射的NVP-ABN912所抑制。
把兩小片成人皮膚(SCID-hu皮膚)移植到SCID小鼠上。在移植后的5-6周對(duì)移植物的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，然后選擇成功移植的小鼠(通常＞85％)用于體內(nèi)遷移實(shí)驗(yàn)。對(duì)于趨化因子誘導(dǎo)的遷移，用標(biāo)準(zhǔn)密度梯度分離的方法從白細(xì)胞層樣品中分離出PBMC并且將其過繼轉(zhuǎn)移(腹膜內(nèi)1×108個(gè)細(xì)胞/小鼠，500μl體積)到先前移植(5-8周)了兩塊人皮膚(在背部上方的左側(cè)和右側(cè))的SCID-hu皮膚小鼠中。在第0天完成細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)第1、2、4和6天，把MCP-1(R&D Systems，Minneapolis，MN)和PBS經(jīng)皮內(nèi)途徑施用到人移植物中。對(duì)照小鼠(CGP44290處理)在右側(cè)皮膚移植物中接受500ngMCP-1，在左側(cè)皮膚移植物中接受等體積(30μ1)PBS。NVP-ABN912處理的小鼠在其左右兩側(cè)皮膚移植物中均注入500ngMCP-1。在第0天(細(xì)胞轉(zhuǎn)移前5小時(shí))和實(shí)驗(yàn)第2天和第5天，腹膜內(nèi)(100μg/小鼠，4mg/kg，500μl體積)施用NVP-ABN912和同種型對(duì)照CGP44290。在第8天，處死所有小鼠并收集人皮膚移植物，用于進(jìn)一步分析。
用DAKO Medimachine，按照制造商的說明書制備每塊人皮膚移植物的單細(xì)胞懸液。用偶聯(lián)有FITC和PE的人抗-CD3和抗-CD4單克隆抗體(mAb)對(duì)這些細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，并用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson，San Jose，CA)進(jìn)行分析。圖3顯示了結(jié)果。CPG44290處理組(3只小鼠，n＝3)中有3.73±1.03％注入的人Th細(xì)胞浸潤(rùn)皮膚移植物，與之相比，在相應(yīng)的ABN912處理組(5只小鼠，n＝10)中為0.73±0.15％。
在用PBS誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的小鼠中，0.34±0.17％的Th細(xì)胞浸潤(rùn)人皮膚移植物(3只小鼠，n＝3)。
作方差單向分析的統(tǒng)計(jì)分析，然后進(jìn)行Dunnett′s多重比較檢驗(yàn)posthoc。相對(duì)于CGP44290處理的動(dòng)物，用ABN912處理的動(dòng)物中Th細(xì)胞浸潤(rùn)的降低是非常顯著的(p＜0.01，**)。2.8對(duì)人MCP-1上的ABN912結(jié)合表位及作用方式的特征通過X-射線晶體學(xué)測(cè)定MCP-1和NVP-ABN912的Fab片段的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。
用蛋白酶解法從整個(gè)抗體上得到NVP-ABN912的Fab片段，用蛋白質(zhì)A層析及隨后用大小排阻層析對(duì)Fab片段進(jìn)行純化。
用蛋白質(zhì)G層析及大小排阻層析純化Fab與重組人MCP-1的復(fù)合體，并通過超濾濃縮至50mM Tris-HCI(pH8.0)，0.1M NaCl中的26mg/ml。在懸浮液滴(20％(w/v)PEG 4,000、10％(v/v)異丙醇、0.1M Na HepespH7.5)中通過氣相擴(kuò)散技術(shù)在室溫下生長(zhǎng)晶體。這些晶體在空間群P212121中，晶胞尺寸a＝63.90、b＝86.08、c＝321.64，每個(gè)不對(duì)稱晶胞中有三個(gè)復(fù)合體。在收集數(shù)據(jù)前，將一個(gè)晶體在17％(w/v)PEG 4,000、8.5％(v/v)異丙醇、15％甘油、85mM Na Hepes pH7.5中浸泡約3分鐘。然后，將晶體放置在尼龍CryoLoop中，并在120K氮流中直接冷凍。在EuropeanSyncrotron Radiation Facility的SNBL光束(λ＝0.90)下，用MAR345圖像信號(hào)板系統(tǒng)測(cè)量衍射數(shù)據(jù)。在20.0到2.33分辨率收集到總共242，617次觀察(89.3％完整性)，相當(dāng)于68，948次獨(dú)特反射(Rsym＝0.050)。用3D6單克隆抗體的Fab片段(RCSB entry 1DFB；He等，1992)和人MCP-1(RCSB entry 1DOL；Lubkowski等，1997)的X射線結(jié)構(gòu)作為初始模型，通過分子替換法測(cè)定晶體結(jié)構(gòu)。用CNX程序通過扭轉(zhuǎn)角動(dòng)力學(xué)和能量最低原理改進(jìn)所述結(jié)構(gòu)，對(duì)在20到2.33之間的所有反射，達(dá)到最終的R-因子為0.224(Rfree＝0.261)。最終模型包括ABN912的L1到L214和H1到H222以及人MCP-1的第10到71位殘基。這個(gè)模型有良好的幾何形狀，鍵長(zhǎng)的rms偏差為0.006而鍵角的rms偏差為1.36°。
NVP-ABN912 Fab/人MCP-1復(fù)合體顯示出一個(gè)大的結(jié)合表面(1,5902的結(jié)合隱蔽表面)，涉及許多疏水和極性相互作用以及幾個(gè)關(guān)鍵性的靜電相互作用。與抗原的主要接觸是由NVP-ABN912的長(zhǎng)H-CDR3環(huán)介導(dǎo)的，這個(gè)環(huán)折疊在抗原結(jié)合位點(diǎn)的中心上并大部分被包埋在復(fù)合體中。人MCP-1上的結(jié)合表位包含氨基酸殘基Asn 14，Thr 16，Asn 17，Arg 18，Lys 19，Ile 20，Ser 21，Gln 23，Arg 24，Lys 49，Glu 50，Ile 51和Cys 52。Arg18，Arg 24和Lys 49參與了與抗體殘基Glu L55，Asp H99和Glu H101的靜電相互作用，并參與了與Tyr L94，Trp H33，Asn H50，Gln H53，Asp H99和Tyr H108的氫鍵相互作用。另外，MCP-1的Arg 18和Arg 24的胍基部分分別與Trp H33和Tyr H32的芳環(huán)發(fā)生π堆積。NVP-ABN912與抗原的Tyr 13，Gln 17，Ser 21，Lys 19，Arg 24和Glu 50的其它相互作用由包埋在蛋白質(zhì)接觸面中的8個(gè)水分子介導(dǎo)。既然MCP-1的Tyr 13和Arg 24參與和CCR2B趨化因子受體的結(jié)合(Hemmerich等，1999，Biochemistry，第38卷；第13013-13025頁(yè))，這樣看起來，NVP-ABN912與拮抗物直接競(jìng)爭(zhēng)與受體結(jié)合。2.9通過定點(diǎn)誘變對(duì)MCP-1上的ABN912表位作圖為了確定對(duì)于NVP-ABN912的識(shí)別而言MCP-1上的功能性重要?dú)埢?，進(jìn)行丙氨酸掃描誘變研究(Cunningham，B.C.和Wells，J.A.(1989)Science第244卷，第1081-1085頁(yè))。首先，為了確認(rèn)表面暴露殘基，用WebLab Viewer軟件對(duì)MCP-1的三維結(jié)構(gòu)(Handel，T.M.和Domaille，P.J.(1996)Biochemistry第35卷，第6569-6584頁(yè)；Lubkowski，J.，Bujacz，G.，Boqué，L.，Domaille，P.J.，Handel，T.M.和Wlodawer，A.(1997)NatureStruct.Biol.第4卷，第64-69頁(yè))進(jìn)行目測(cè)檢查。用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Papworth，C.，Bauer，J.C.，Braman，J.和Wright，D.A.(1996)Strategies 9(3)，3-4)對(duì)有潛在可能與ABN912相互作用的全部39個(gè)殘基單個(gè)地突變?yōu)楸彼峄蛸嚢彼?D3K，A48K)。首先通過用兩微克載有獲得的MCP-1突變序列的表達(dá)質(zhì)粒和Geneporter轉(zhuǎn)染試劑(Gene TherapySystems)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在HEK.EBNA細(xì)胞中表達(dá)該突變基因。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3天，收集上清液，離心5分鐘，用親和層析進(jìn)行純化。以純化的MCP-1為標(biāo)準(zhǔn)，用蛋白分析法(Biorad)測(cè)定突變型MCP-1的濃度。典型地，從3ml培養(yǎng)物中獲得40μg純化的人MCP-1或突變型MCP-1。
用BIAcore儀器(BIAcore)通過表面等離子體共振測(cè)定NVP-ABN912與MCP-1以及突變型MCP-1的親和力。首先，活化儀器的傳感芯片表面并注射30μg/ml抗-Fcγ溶液以便與芯片共價(jià)結(jié)合。通過注射5μg/ml溶液，使NVP-ABN912抗體聚集在抗-Fcγ修飾的表面上。稀釋MCP-1或突變型MCP-1，使終濃度為0.75到4nM，注射稀釋物以使之與傳感芯片表面固定的NVP-ABN912結(jié)合。隨后有5分鐘的結(jié)合和解離，在此期間記錄表面等離子體共振信號(hào)。然后用BIAevaluation 3.0軟件(儀器安裝的軟件部分；手冊(cè)Cat.No.BR 1002-29；7-97版)來分析系列滴定物。結(jié)果見于圖4，圖中顯示NVP-ABN912與MCP-1以及突變型MCP-1的結(jié)合。
根據(jù)上述確定出的MCP-1上供NVP-ABN912識(shí)別的主要決定簇是殘基T16，R18，R24和K49。T16，R18和R24突變成丙氨酸可以導(dǎo)致完全不能與NVP-ABN912結(jié)合；而K49突變成丙氨酸導(dǎo)致親和力下降為原來的1/133。
權(quán)利要求
1.MCP-1結(jié)合分子和其直接等價(jià)物，其中所述MCP-1結(jié)合分子包括含有至少一個(gè)順次包含高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu。
2.MCP-1結(jié)合分子和其直接等價(jià)物，其中所述MCP-1結(jié)合分子包括含有至少一個(gè)順次包含高變區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
3.包含重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的MCP-1結(jié)合分子及其直接等價(jià)物，其中所述MCP-1結(jié)合分子含有至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含a)順次含有高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu，和b)順次含有高變區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的MCP-1結(jié)合分子，其是人抗體。
5.包含至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的MCP-1結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)包含具有與Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并終止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第一域或上述第一域和具有與Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并終止于第109位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第二域。
6.編碼重鏈或其片段的第一DNA構(gòu)建體，其包含a)編碼交替地包含高變區(qū)和構(gòu)架區(qū)的可變區(qū)的第一部分，所述高變區(qū)順次是氨基酸序列顯示在Seq.Id.No.1中的CDR1、CDR2和CDR3；該第一部分起始于編碼可變區(qū)的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼可變區(qū)的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，和b)編碼重鏈恒定部分或其片段的第二部分，其起始于編碼重鏈恒定部分的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼該恒定部分或其片段的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，之后接終止密碼子。
7.編碼輕鏈或其片段的第二DNA構(gòu)建體，其包含a)編碼交替地包含高變區(qū)和構(gòu)架區(qū)的可變區(qū)的第一部分；所述高變區(qū)是氨基酸序列顯示在Seq.Id.No.2中的CDR1’、CDR2’和CDR3’；該第一部分起始于編碼可變區(qū)的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼可變區(qū)的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，和b)編碼輕鏈恒定部分或其片段的第二部分，其起始于編碼輕鏈恒定部分的第一個(gè)氨基酸的密碼子并終止于編碼該恒定部分或其片段的最后一個(gè)氨基酸的密碼子，之后接終止密碼子。
8.能夠在原核或真核細(xì)胞系中復(fù)制的表達(dá)載體，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體。
9.制備MCP-1結(jié)合分子的方法，其包括(i)培養(yǎng)用根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的生物和(ii)從該培養(yǎng)物中回收MCP-1結(jié)合分子。
10.與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)的抗MCP-1抗體。
11.i)可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體在治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病或病癥中的用途；ii)給患者治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，所述方法包括給患者施用有效量的可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體；iii)含有可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體、以及可藥用賦形劑、稀釋劑或載體的藥物組合物；和iv)可與伊奧他新發(fā)生交叉反應(yīng)且能夠抑制MCP-1和伊奧他新與其受體結(jié)合的抗MCP-1抗體在制備用于治療MCP-1或伊奧他新介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物中的用途。
12.MCP-1的抗體，對(duì)于和MCP-1的結(jié)合而言其具有約50pM或更小的KD。
13.MCP-1的抗體，其與包括MCP-1第24位精氨酸殘基的MCP-1抗原性表位結(jié)合。
14.尤其是參考實(shí)施例實(shí)質(zhì)上如前文所述的所有新化合物、工藝、方法和用途。
全文摘要
本發(fā)明提供包含至少一個(gè)含有序列如本文中定義的高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(V
文檔編號(hào)A61P11/00GK1443199SQ01812065
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者P·希斯坦德, H·霍夫施泰特爾, T·G·佩恩, R·烏費(fèi)爾, F·E·迪帕多瓦 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司