專利名稱：Hcv e1e2疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及疫苗組合物。具體的，本發(fā)明涉及含有E1E2抗原、亞微米水包油乳劑和/或CpG寡核苷酸的HCV E1E2組合物。
本發(fā)明背景丙肝病毒(HCV)是引起腸胃外非甲、非乙型肝炎(NANBH)的主要原因。病毒存在于0.4到2.0％的血液供體中。慢性肝炎在約50％感染中發(fā)展，其中約20％感染個(gè)體發(fā)生了肝硬化，肝硬化有時(shí)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌。因此，研究和控制該病具有醫(yī)學(xué)重要性。
HCV首先由Houghton等作為NANBH起因鑒定并確定特征。由于獲得序列的方法已知，HCV的病毒基因序列已知。參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 89/04669；WO 90/11089和WO 90/14436。HCV有9.5kb的正義、單鏈RNA基因組且是黃病毒家族的成員。在系統(tǒng)發(fā)生分析的基礎(chǔ)上鑒定了至少六個(gè)不同但相關(guān)HCV基因型(Simmonds等，J.Gen.Virol.(1993)742391-2399)。病毒編碼具有超過3000個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)多蛋白(Choo等，Sciencel.(1989)244359-362；Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)882451-2455；Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)881711-1715)。多蛋白共翻譯和翻譯后加工成結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
特別地，如

圖1所示，一些蛋白質(zhì)由HCV基因組編碼。HCV多蛋白裂解產(chǎn)物的順序和名稱如下NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。多蛋白最初的裂解由宿主蛋白酶催化，蛋白酶釋放三種結(jié)構(gòu)蛋白以及含病毒酶的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白是N-末端核殼蛋白(命名為“核心”)和兩種包膜糖蛋白“E1”(也稱為E)及“E2”(也稱為E2/NS1)。NS區(qū)域命名為NS2、NS3、NS4和NS5。NS2是具蛋白水解活性的整合膜蛋白，它與NS3結(jié)合并裂解NS2-NS3 sissle鍵，從而產(chǎn)生NS3 N-末端并釋放包括絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶的大多蛋白。NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。在這些反應(yīng)中，NS3釋放NS3輔因子(NS4a)、兩種蛋白質(zhì)(NS4b和NS5a)和RNA-依賴的RNA聚合酶(NS5b)。多蛋白成熟的完成通過NS3絲氨酸蛋白酶催化的在NS3-NS4a連接處的自身催化裂解來起始。
E1檢測(cè)為32-35kDa種類并轉(zhuǎn)變成單個(gè)約18kDa的內(nèi)H-敏感帶。相反，E2在免疫沉淀中表現(xiàn)出復(fù)雜模式，這與產(chǎn)生多種類型一致(Spaete等，Virol.(1992)188819-830；Selby等，J.Virol.(1996)705177-5182；Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Tomei等，J.Virol.(1993)674017-4026)。HCV包膜糖蛋白E1和E2形成共免疫沉淀的穩(wěn)定復(fù)合體(Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Lanford等，Virology.(1993)197225-235；Ralston等，J.Virol.(1993)676753-6761)。
當(dāng)E1和E2穩(wěn)定表達(dá)或在短暫牛痘病毒系統(tǒng)中時(shí)，它們維持在細(xì)胞內(nèi)且缺乏復(fù)雜碳水化合物(Spaete等，Virology.(1992)188819-830；Ralston等，J.Virol.(1993)676753-6761)。由于E1和E2蛋白在這些表達(dá)系統(tǒng)中一般是膜結(jié)合，產(chǎn)生分泌形式以促進(jìn)蛋白質(zhì)純化。參見例如美國(guó)專利號(hào)6,121,020。此外，描述了在海拉細(xì)胞中胞內(nèi)生成E1E2。參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 98/50556。
HCV E1和E2糖蛋白備受矚目，因?yàn)樵陟`長(zhǎng)類動(dòng)物的研究中顯示它們可抗病毒襲擊。(Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1994)911294-1298)。然而，需要有效的含有這些抗原的疫苗組合物以防止HCV感染。
疫苗組合物通常包括免疫佐劑以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。例如，完整弗氏佐劑(CFA)是有力的免疫刺激劑，它在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上與許多抗原成功使用。CFA包括三種成分礦物油、乳化劑和死分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。水溶抗原溶液與這些成分混合以產(chǎn)生油中水乳劑。盡管作為佐劑有效，CFA引起嚴(yán)重副作用，包括疼痛、膿腫形成和發(fā)熱，這主要是由于存在分枝桿菌成分。因此，CFA不用于人和牲畜疫苗。
胞壁酰二肽(MDP)是分枝桿菌細(xì)胞壁復(fù)合體的最小單位，復(fù)合體產(chǎn)生CFA觀察到的佐劑活性。參見例如Ellouz等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1974)591317。產(chǎn)生的一些MDP合成類似物表現(xiàn)出寬廣范圍的佐劑潛力和副作用。這些類似物的綜述參見Chedid等，Prog.Allergy(1978)2563。MDP的代表類似物包括MDP的蘇氨酰衍生物(Byars等，Vaccine(1987)5223)、MDP的n-丁基衍生物(Chedid等，Infect.Immun.35417)和胞壁酰三肽的親脂衍生物(Gisler等，微生物產(chǎn)物和相關(guān)合成化合物的免疫調(diào)節(jié)(Immunomodulations of Microbial Products and Related SyntheticCompounds)(1981)Y.Yamamura和S.Kotani編，Excerpta Medica，Amsterdam，第167頁)。
一種MDP親脂衍生物是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanine-2-(1’-2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-huydroxyphosphoryloxy)-ethylamine)(MTP-PE)。此胞壁酰三肽包括磷脂尾部，可使分子疏水部分與脂類環(huán)境聯(lián)合而胞壁酰肽部分與水環(huán)境相聯(lián)。因此，MTP-PE本身能作為乳化劑來產(chǎn)生穩(wěn)定的水包油乳劑。MTP-PE被用于名為MTP-PE-LO(低油)的乳劑，該乳劑含有4％鯊烯的0.008％土溫80(Tween 80TM)，以便以有效結(jié)果傳遞單純皰疹病毒gD抗原(Sanchez-Pescador等，J.Immunol.(1988)1411720-1727)，盡管其物理穩(wěn)定性很差。近來，一種安全、高免疫原性的亞微米水包油乳劑MF59包含4-5％w/v鯊烯、0.5％w/v土溫80TM、0.5％Span85TM和任選的不同量MTP-PE，它發(fā)展用于疫苗組合物。參見例如Ott等，“MF59-設(shè)計(jì)和評(píng)估用于人疫苗的安全和潛在佐劑”(MF59-Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines)，疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法(Vaccine DesignTheSubunit and Adjuvant Approach)(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)Plenum Press，New York，1995，277-296頁，Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1994)911294-1298和Houghton等，病毒性肝炎和肝臟疾病(Viral Hepatitis and Liver Disease)(1997)，第656頁，描述了使用HCVE1/E2復(fù)合體和包括MTP-PE的亞微米水包油乳劑。
細(xì)菌DNA包括在體外對(duì)外周血單核細(xì)胞有免疫刺激效果的未甲基化的CpG二核苷酸。Krieg等，J.Clin.Immunol.(1995)15284-292。CpG寡核苷酸用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。參見例如美國(guó)專利號(hào)6,207,646；6,214,806；6,218,371和6,406,705。
盡管使用這些佐劑，常規(guī)疫苗通常不能提供抗靶病原體的適當(dāng)保護(hù)。因此，對(duì)于有效抗HCV的疫苗組合物有持續(xù)需要，疫苗組合物包括安全和非毒性佐劑。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基礎(chǔ)在一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)上，使用HCV E1E2抗原結(jié)合亞微米水包油乳劑和含免疫刺激核酸序列(ISS)的寡核苷酸如CpY、CpR和未甲基化CpG基序(后面有鳥苷并由磷酸鍵相連的胞嘧啶)，提供的抗體滴度顯著高于沒有這些佐劑所觀察到的。另外，本文佐劑可與ISS單獨(dú)使用而沒有亞微米水包油乳劑，或與缺乏MTP-PE的亞微米水包油乳劑單獨(dú)使用而沒有ISS。使用這種組合提供安全和有效方法來提高HCV E1E2抗原的免疫原性。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)的組合物包括HCV E1E2抗原和缺乏MTP-PE的亞微米水包油乳劑，其中亞微米水包油乳劑能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。組合物可進(jìn)一步包括ISS如含未甲基化CpG基序的寡核苷酸(“CpG寡核苷酸”)，當(dāng)ISS存在時(shí)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)的方法在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答，包括給試驗(yàn)品施用治療有效量HCV E1E2抗原和缺乏MTP-PE的亞微米水包油乳劑，其中亞微米水包油乳劑能提高對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。試驗(yàn)品也可施用一個(gè)或更多ISS如一種或多種含未甲基化CpG基序的寡核苷酸，其中ISS能增強(qiáng)對(duì)HCVE1E2抗原的免疫應(yīng)答。亞微米水包油乳劑可作為抗原存在于相同組合物中或在單獨(dú)組合物中施用。此外，如果存在ISS，它可存在于與抗原和/或亞微米水包油乳劑相同的組合物中，或在不同組合物中。
在更多的實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)的方法產(chǎn)生的組合物包括缺乏MTP-PE的亞微米水包油乳劑與HCV E1E2抗原結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括ISS如含未甲基化CpG基序的寡核苷酸，寡核苷酸能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答，ISS與E1E2抗原和亞微米水包油乳劑結(jié)合。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)的組合物包括HCV E1E2抗原和ISS如能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原免疫應(yīng)答的CpG寡核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)的方法在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答，包括給試驗(yàn)品施用治療有效量HCV E1E2抗原和ISS如CpG寡核苷酸，其中ISS能提高對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。ISS可作為抗原存在于相同組合物中或在單獨(dú)組合物中施用。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)的方法產(chǎn)生的組合物包括ISS如CpG寡核苷酸與HCV E1E2抗原結(jié)合，其中ISS能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。
上面任何實(shí)施方案中的CpG分子可有公式5’-X1X2CG X3X4，其中X1和X2是選自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的序列，X3和X4選自TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA和TpG，其中“p”表示磷酸鍵。在一些實(shí)施方案中，CpG寡核苷酸包括序列側(cè)翼有一些其它核苷的GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
在另外的實(shí)施方案中，用于本組合物的CpG寡核苷酸有序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)或序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQID NO5)。
在一些實(shí)施方案中，亞微米水包油乳劑包括(1)可代謝的油，其中油的量為總體積的0.5％到20％(2)乳化劑，其中乳化劑為0.01％到2.5％重量(w/v)，其中油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米，其中亞微米水包油乳劑能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。
在其它實(shí)施方案中，亞微米水包油乳劑如上所述且缺乏任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物以及任何胞壁酰肽。
在另外的實(shí)施方案中，乳化劑包括聚氧乙烯山梨聚糖單、二或三酯和/或山梨聚糖單、二或三酯。
在一些實(shí)施方案中，油的量為總體積的1％到12％，如1％到4％，乳化劑為0.01％到1％重量(w/v)如0.01％到0.05％重量(w/v)。
在其它本文所述的實(shí)施方案中，亞微米水包油乳劑包括4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v土溫80TM(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)、和/或0.25-1.0％Span85TM(山梨聚糖三油酸酯)，以及任選的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
在另外實(shí)施方案中，亞微米水包油乳劑實(shí)質(zhì)上由(1)5％體積的鯊烯；(2)一種或多種乳化劑組成，所述乳化劑選自土溫80TM(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)和Span85TM(山梨聚糖三油酸酯)，其中乳化劑存在總量為1％重量(w/v)；鯊烯和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米，其中組合物缺乏任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物以及任何胞壁酰肽，此外水包油乳劑能增強(qiáng)對(duì)HCV抗原的免疫應(yīng)答。
在其它實(shí)施方案中，一種或多種乳化劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，且聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯存在總量為1％重量(w/v)。
在一些它實(shí)施方案中，組合物缺乏胞壁酰肽。
參考下列詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面是顯然的。
附圖詳述圖1是HCV基因組的圖示，描述了HCV多蛋白的不同區(qū)域。
圖2A-C(SEQ ID NOS3和4)顯示了核苷和相應(yīng)的HCV-1 E1/E2/p7區(qū)域的氨基酸序列。圖中所示數(shù)字是相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白。顯示了E1、E2和p7區(qū)域。
圖3是質(zhì)粒pMHE1E2-809的圖，質(zhì)粒編碼用于本發(fā)明使用的代表E1E2蛋白E1E2809。
圖4顯示來自小鼠的E1E2809EIA抗體滴度，如實(shí)施例所述，小鼠用E1E2809加CpG；E1E2809加MF59；E1E2809加CpG和MF59；E1E2809加4XMF59免疫。圓圈表示各個(gè)小鼠的血清抗體滴度。方框顯示一組十只小鼠的幾何平均抗體滴度(GMT)。誤差柱(error bar)是用于統(tǒng)計(jì)上顯著差異的比較缺口，差異由單向方差分析確定。
發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐使用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的化學(xué)、生化、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分說明。參見例如基礎(chǔ)病毒學(xué)(Fundamental Virology)，第二版，I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology)，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)(ProteinsStructures and Molecular Properities)(W.H.Freeman和Company，1993)；A.L.Lehninger，生物化學(xué)(Biochemistry)(WorthPublishers，Inc.，當(dāng)添加入)；Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningA Laboratory Manual)(第2版，1989)；酶學(xué)中的方法(Methods InEnzymology)(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)。
必須指出，如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用，除非另有明顯說明單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如提及“一種抗原”包括兩種或更多抗原的混合物等。
在文中使用下列氨基酸縮寫丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H) 異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L) 賴氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P) 絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T) 色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y) 纈氨酸Val(V)I.定義在本發(fā)明描述中，適用下列術(shù)語且定義如下所示。
術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物且不限于產(chǎn)物的最小長(zhǎng)度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等包括在定義內(nèi)。全長(zhǎng)蛋白質(zhì)和其片段包含在定義內(nèi)。術(shù)語也包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。此外，為了本發(fā)明，“多肽”所指蛋白質(zhì)包括對(duì)天然序列的修飾如缺失、添加和置換(一般是保守性質(zhì))，只要蛋白質(zhì)保持所需活性。這些修飾可以是設(shè)計(jì)的如通過定點(diǎn)突變，或者可以是偶然的如通過生成蛋白質(zhì)的宿主的突變或由于PCR擴(kuò)增的誤差。
“E1多肽”指來自HCV E1區(qū)域的分子。成熟HCV-1的E1區(qū)域起始于多蛋白的約氨基酸192且持續(xù)到約氨基酸383，數(shù)字是相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白。(參見圖1和2A-2C。圖2A-2C的氨基酸192-383對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4的氨基酸位置20-211)。在約173到約191的氨基酸(SEQ ID NO4的氨基酸1-19)作為E1的信號(hào)序列。因此，“E1多肽”指前體E1蛋白包括信號(hào)序列或缺乏此序列的成熟E1多肽，或者甚至指有異源信號(hào)序列的E1多肽。E1多肽包括出現(xiàn)在約氨基酸位置360-383的C-末端膜錨序列(參見出版于1996年2月15日的國(guó)際公開號(hào)WO96/04301)。一種本文定義的E1多肽可或可不包括C-末端膜錨序列或其部分。
“E2多肽”指來自HCV E2區(qū)域的分子。成熟HCV-1的E2區(qū)域起始于約氨基酸383-385，數(shù)字是相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白。(參見圖1和2A-2C。圖2A-2C的氨基酸383-385對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4的氨基酸位置211-213)。信號(hào)肽起始于多蛋白的約氨基酸364。因此，“E2多肽”指前體E2蛋白包括信號(hào)序列或缺乏此序列的成熟E2多肽，或者甚至指有異源信號(hào)序列的E2多肽。E2多肽包括出現(xiàn)在約氨基酸位置715-730的C-末端膜錨序列并可延伸直到約氨基酸殘基746(參見lin等，J.Virol.(1994)685063-5073)。一種本文定義的E2多肽可或可不包括C-末端膜錨序列或其部分。此外，E2多肽也可包括所有或部分直接毗鄰E2C-末端的p7區(qū)域。如圖1和圖2A-2C所示，p7區(qū)域發(fā)現(xiàn)于位置747-809，數(shù)字相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白(SEQ ID NO4的氨基酸位置575-637)。另外，已知存在多種HCV E2(Spaete等，Virol.(1992)188819-830；Selby等，J.Virol.(1996)705177-5182；Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Tomei等，J.Virol.(1993)674017-4026)。因此，為了本發(fā)明目的，術(shù)語“E2”包含任何這些種類E2，包括但不限于缺失1-20個(gè)或更多來自E2 N-末端氨基酸的種類，如缺失1、2、3、4、5....10...15、16、17、18、19...等個(gè)氨基酸。這些E2種類包括起始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的種類。
來自HCV-1的代表E1和E2區(qū)域顯示于圖2A-2C和SEQ ID NO4。為了本發(fā)明目的，E1和E2區(qū)域關(guān)于多蛋白的氨基酸數(shù)字定義，多蛋白由HCV-1基因組編碼，起始甲硫氨酸指定為位置1。參見例如Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)882451-245。然而，應(yīng)該指出本文所用術(shù)語“E1多肽”或“E2多肽”不限于HCV-1序列。在此方面，其它HCV分離物中的對(duì)應(yīng)E1或E2區(qū)域可通過排列來自分離物的序列來確定，排列形式使序列產(chǎn)生最大排列。這可由任何一些計(jì)算機(jī)軟件包進(jìn)行，如ALIGN 1.0，來自弗吉尼亞大學(xué)生化系(AttnDr.William R.Pearson)。參見Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1988)852444-2448。
此外，本文所定義“E1多肽”或“E2多肽”不限于有圖中所述精確序列的多肽。確實(shí)，HCV基因組在體內(nèi)處于恒定流出狀態(tài)并包含一些在分離物間表現(xiàn)出相對(duì)高程度可變性的可變結(jié)構(gòu)域。一些保守和可變區(qū)域在這些菌株中已知，一般來自這些區(qū)域抗原表位的氨基酸序列有高程度的序列同源性，如超過30％的氨基酸序列同源性，當(dāng)排列兩種序列時(shí)，超過40％、超過60％甚至超過80-90％的同源性優(yōu)選。顯然術(shù)語包含來自任何不同HCV菌株和分離物的E1和E2多肽，包括有任何6種HCV基因型的分離物，HCV基因型描述于Simmonds等，J.Gen.Virol.(1993)742391-2399(如菌株1、2、3、4等)以及新鑒定的分離物和這些分離物亞類如HCV1a、HCV1b等。
因此，例如術(shù)語“E1”或“E2”多肽指來自任何不同HCV菌株的天然E1或E2序列以及下面進(jìn)一步定義的類似物、突變蛋白和免疫原性片段。許多這些菌株的完整基因型已知。參見例如美國(guó)專利號(hào)6,150,087和GenBank編號(hào)AJ238800和AJ238799。
此外，術(shù)語“E1多肽”和“E2多肽”所包含蛋白質(zhì)包括對(duì)天然序列的修飾如內(nèi)部缺失、添加和置換(一般是保守性質(zhì))。這些修飾可以是設(shè)計(jì)的如通過定點(diǎn)突變，或者可以是偶然的如通過天然產(chǎn)生的突變事件。只要修飾的E1和E2多肽發(fā)揮功能用于它們想要的目的，所有這些修飾包括在本發(fā)明中。因此，例如如果E1和/或E2多肽待用于疫苗組合物，修飾必須不損失免疫活性(即引起體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力)。
如上所述，“E1E2”復(fù)合體所指蛋白質(zhì)包含至少一種E1多肽和至少一種E2多肽。這種復(fù)合體也可包括所有或部分直接毗鄰E2 C-末端的p7區(qū)域。如圖1和圖2A-2C所示，p7區(qū)域發(fā)現(xiàn)于位置747-809，數(shù)字相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白(SEQ IDNO4的氨基酸位置575-637)。本文定義為“E1E2809”的代表E1E2復(fù)合體包括p7蛋白。
E1E2復(fù)合體中E1和E2相聯(lián)模式是非實(shí)質(zhì)的。E1和E2多肽可通過非共價(jià)相互作用如靜電力或通過共價(jià)鍵來聯(lián)合。例如，本應(yīng)用的E1E2多肽可以融合蛋白形式，融合蛋白包括上面定義的免疫原性E1多肽和免疫原性E2多肽。融合可從編碼E1E2嵌合體的多核苷酸中表達(dá)。另外，E1E2復(fù)合體可僅通過混合單獨(dú)產(chǎn)生的E1和E2蛋白來自發(fā)形成。類似的，當(dāng)共表達(dá)和分泌入介質(zhì)時(shí)，E1和E2蛋白可自發(fā)形成復(fù)合體。因此，術(shù)語包括自發(fā)來自于純化E1和/或E2的E1E2復(fù)合體(也稱為聚集體)。這種聚集體可包括一個(gè)或更多E1單體，E1單體與一個(gè)或更多E2單體相聯(lián)。E1和E2單體存在數(shù)量不需相同，只要存在至少一個(gè)E1單體和一個(gè)E2單體。檢測(cè)E1E2復(fù)合體的存在可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白檢測(cè)技術(shù)來確定，如聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫學(xué)技術(shù)如免疫沉淀。
術(shù)語“類似物”和“突變蛋白”指所涉及分子的生物學(xué)上活性衍生物或這些衍生物保持所需活性的片段，如本文所述試驗(yàn)中的免疫反應(yīng)性。一般，術(shù)語“類似物”所指化合物有天然多肽序列和結(jié)構(gòu)，相對(duì)天然分子具有一個(gè)或更多氨基酸添加、置換(通常是保守性質(zhì))和/或缺失，只要修飾不破壞免疫原活性。術(shù)語“突變蛋白”所指肽有一個(gè)或更多肽模擬物(“類肽”)，如描述于國(guó)際公開號(hào)WO 91/04282。優(yōu)選的是，類似物或突變蛋白有至少與天然分子相同的免疫活性。產(chǎn)生多肽類似物和突變蛋白的方法在本領(lǐng)域已知并在下面進(jìn)一步描述。
尤其優(yōu)選的類似物包括保守性質(zhì)的置換，即置換發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中。具體是，氨基酸一般獲得自四個(gè)家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷極性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳族氨基酸。例如，有理由預(yù)測(cè)用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)取代亮氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、絲氨酸取代蘇氨酸或者結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸相似保守取代氨基酸對(duì)于生物活性沒有主要作用。例如，感興趣的多肽可包括多至5-10個(gè)保守或非保守氨基酸置換，或甚至到約15-25或50個(gè)保守或非保守氨基酸置換，或任何5-50間的整數(shù)，只要分子所需功能保持完整。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過參考本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle圖可確定能忍受變化的感興趣區(qū)域。
“片段”所指多肽僅由部分完整全長(zhǎng)多肽序列和結(jié)構(gòu)組成。片段可包括C-末端缺失和N-末端缺失和/或天然多肽的內(nèi)部缺失。具體HCV蛋白的“免疫原性片段”一般包括至少約5-10個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，至少約15-25個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基優(yōu)選，至少約20-50個(gè)或更多全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基最優(yōu)選，如果所討論片段保持引起本文所述免疫應(yīng)答的能力，免疫原性片段定義抗原表位或5個(gè)氨基酸和全長(zhǎng)序列間的任何整數(shù)。為描述已知HCV E1和E2免疫片段，參見例如Chien等，國(guó)際公開號(hào)WO 93/00365。
本文所用術(shù)語“抗原表位”所指序列有至少約3-5個(gè)氨基酸，約5到10或15個(gè)優(yōu)選，不超過約500個(gè)氨基酸(或任何其間的整數(shù))，抗原表位定義自身序列或部分更大的序列。在其施用的試驗(yàn)品中引起免疫應(yīng)答。通常，抗原表位結(jié)合在對(duì)這種序列反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體。對(duì)于片段長(zhǎng)度沒有嚴(yán)格上限，可包括幾乎蛋白序列全長(zhǎng)或者甚至含兩個(gè)或更多來自HCV多蛋白抗原表位的融合蛋白。用于試驗(yàn)本發(fā)明的抗原表位不限于有親代蛋白質(zhì)部分確切序列的多肽，多肽獲得自親代蛋白質(zhì)。病毒基因組處于恒定流出狀態(tài)且保持一些在分離物間表現(xiàn)出高程度可變性的可變結(jié)構(gòu)域。因此，術(shù)語“抗原表位”包括與天然序列相同的序列以及對(duì)天然序列的修飾，如缺失、添加和置換(一般是保守性質(zhì))。
特定多肽區(qū)域包括的抗原表位可用本領(lǐng)域熟知的任何數(shù)量抗原表位作圖技術(shù)鑒定。參見例如抗原表位作圖操作(Epitope Mapping Protocols)，分子生物學(xué)中的方法(Methods in Molecular Biology)，第66卷(Glenn E. Morris編，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如確定線性抗原表位可通過如在固體支持物上同時(shí)合成大數(shù)量肽和蛋白分子部分相應(yīng)肽，且當(dāng)肽仍附于支持物時(shí)使肽與抗體反應(yīng)。這些技術(shù)在本領(lǐng)域已知并描述于如美國(guó)專利號(hào)4,708,871；Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA813998-4002；Geysen等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82178-182；Geysen等，(1986)Molec.Immunol.23709-715。使用這些技術(shù)，鑒定了一些HCV抗原表位。參見例如Chien等，病毒性肝炎和肝臟疾病(1994)320-324頁和下面。類似的，構(gòu)象抗原表位通過確定空間構(gòu)象氨基酸來鑒定如通過x-射線結(jié)晶學(xué)和2維核磁共振。參見例如抗原表位作圖操作，同上。蛋白的抗原區(qū)域也可用標(biāo)準(zhǔn)抗原性和親水性圖來鑒定，如用來自O(shè)xfordMolecular Group的Omiga 1.0版本軟件程序計(jì)算。此計(jì)算機(jī)程序使用Hopp/Woods法，Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)783824-3828確定抗原性分布和Kyte-Doolittle技術(shù)，Kyte等，J.Mpl.Biol.(1982)157105-132用于親水性圖。
如本文所用，術(shù)語“構(gòu)象抗原表位”指全長(zhǎng)蛋白部分或其類似物或突變蛋白，具有氨基酸序列天然的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列編碼全長(zhǎng)天然蛋白中的抗原表位。天然結(jié)構(gòu)特征包括但不限于糖基化和三維結(jié)構(gòu)。確定序列的抗原表位長(zhǎng)度可進(jìn)行多種變化，因?yàn)檫@些抗原表位被認(rèn)為由抗原三維形狀來形成(如折疊)。因此，確定抗原表位的氨基酸數(shù)量可以相對(duì)少但廣泛分布在分子長(zhǎng)度中(或在二聚物等的情況中甚至在不同分子上)，通過折疊產(chǎn)生正確抗原表位構(gòu)象。確定抗原表位的殘基間抗原部分對(duì)于抗原表位的構(gòu)象結(jié)構(gòu)不關(guān)鍵。例如如果維持對(duì)抗原表位構(gòu)象關(guān)鍵的序列(如參與二硫鍵、糖基化位點(diǎn)等的半胱氨酸)，缺失或置換這些間插序列也許不影響構(gòu)象抗原表位。
構(gòu)象抗原位用上述方法鑒定。此外，在特定多肽中確定構(gòu)象抗原表位的存在或缺失可通過用抗體(多克隆血清或單克隆構(gòu)象抗原表位)篩選感興趣抗原并比較其反應(yīng)性和僅保持線性抗原表位的抗原變性形式(如果有)。在這種多克隆抗體篩選中，有利的是首先用變性抗原吸收多克隆血清并觀察它受否保持感興趣抗原的抗體。獲得自E1和E2區(qū)域的構(gòu)象抗原表位描述于如國(guó)際公開號(hào)WO 94/01778。
對(duì)HCV抗原或組合物的“免疫應(yīng)答”是指試驗(yàn)品中對(duì)感興趣組合物中存在分子的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)展。為了本發(fā)明目的，“體液免疫應(yīng)答”指抗體分子調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答，“細(xì)胞免疫應(yīng)答”由T-淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞調(diào)節(jié)。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要方面包括細(xì)胞溶解T細(xì)胞(“CTLs”)的抗原-特異反應(yīng)。CTLs對(duì)肽抗原有特異性，抗原與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼的蛋白質(zhì)相聯(lián)并在細(xì)胞表面表達(dá)。CTLs有助于誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的胞內(nèi)破壞或感染這些微生物的細(xì)胞裂解。細(xì)胞免疫的另一方面包括輔助T細(xì)胞的抗原-特異反應(yīng)。輔助T細(xì)胞作用于協(xié)助刺激功能和集中非特異效應(yīng)細(xì)胞的活性，效應(yīng)細(xì)胞抗的細(xì)胞表面展現(xiàn)出與MHC分子相關(guān)肽抗原?！凹?xì)胞免疫應(yīng)答”也指細(xì)胞因子、趨化因子和其它這種分子的產(chǎn)生，其它分子由活化的T細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞生成，包括那些來自于CD4+和CD8+T細(xì)胞。引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物或疫苗可用于通過在細(xì)胞表面與MHC分子相聯(lián)的抗原呈遞使脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品敏感。細(xì)胞-調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答針對(duì)表面呈遞抗原的細(xì)胞或附近。此外，可產(chǎn)生抗原-特異T-淋巴細(xì)胞以在未來保護(hù)免疫宿主。具體抗原刺激細(xì)胞-調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力可通過一些試驗(yàn)確定，如淋巴增生(淋巴細(xì)胞活化)試驗(yàn)、CTL細(xì)胞毒型細(xì)胞試驗(yàn)或分析敏化試驗(yàn)品中特異于抗原的T-淋巴細(xì)胞。這些試驗(yàn)在本領(lǐng)域熟知，參見例如Erickson等，J.Immunol.(1993)1514189-4199；Doe等Eur.J.Immunol.(1994)242369-2376。
因此，本文所用免疫應(yīng)答可刺激CTL產(chǎn)生和/或輔助T細(xì)胞產(chǎn)生或活化。感興趣抗原也可引起抗體-調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)，包括例如中和結(jié)合(NOB)抗體。確定NOB抗體反應(yīng)存在的技術(shù)描述于如Rosa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)931759。因此，免疫應(yīng)答可包括一種或多種下列效果B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的生成；和/或抑制T細(xì)胞和/或γδT細(xì)胞的活化，這些細(xì)胞特異于感興趣組合物或疫苗中存在的一種或幾種抗原。這些反應(yīng)可用于中和傳染性和/或調(diào)解抗體-補(bǔ)體或抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC)以提供宿主癥狀的保護(hù)或緩和。這些反應(yīng)可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定和中和試驗(yàn)確定。
如本文所用，“免疫刺激核苷序列”或“ISS”是指包括至少一個(gè)免疫刺激寡核苷酸(ISS-ODN)部分的多核苷酸。ISS部分是單或雙鏈DNA或RNA寡核苷酸，有至少六個(gè)核苷堿基，可包括修飾的寡核苷酸或修飾核苷的序列或由修飾的寡核苷酸或修飾核苷的序列組成。ISS部分包括或側(cè)翼有CG-包含核苷序列或p(IC)核苷序列，序列可以是回文。半胱氨酸可以是甲基化或未甲基化的。用于本發(fā)明的具體的ISS分子的例子包括下面進(jìn)一步討論的CpG分子以及CpY和CpR分子等。
HCV E1E2組和物的成分，如亞微米水包油乳劑或CpG寡核苷酸，可增強(qiáng)對(duì)組合物中存在的HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答，組合物引起免疫應(yīng)答的能力大于相同量未傳遞其它成分的抗原。確定這種提高的免疫原性可通過施用有和沒有其它成分的抗原組合物，用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)比較抗兩者的抗體滴度，如本領(lǐng)域熟知的放射性免疫測(cè)定和ELISAs。
“重組”蛋白是保持所需活性并由本文所述重組DNA技術(shù)制備的蛋白質(zhì)。通常，，感興趣的基因被克隆并隨后表達(dá)在轉(zhuǎn)化生物體中。宿主生物體表達(dá)外源基因以在表達(dá)條件下生成蛋白質(zhì)。
當(dāng)提及多肽時(shí)，“分離”指所示分子與全生物體分開和分離，分子發(fā)現(xiàn)于自然中或在顯著缺乏其它相同類型生物大分子情況中存在。關(guān)于多核苷酸的術(shù)語“分離”是指核酸分子，缺乏全部或部分天然與它正常相聯(lián)的序列；或是天然存在的序列，但有與之相聯(lián)的異源序列；或者是與染色體分離的分子。
“相同抗原決定簇”指來自不同HCV亞類或菌株的抗原決定簇，如HCV菌株1、2、3等，由于序列變化抗原決定簇不需相同但出現(xiàn)在所討論HCV序列中的相同位置。一般，當(dāng)比對(duì)兩種序列時(shí)，相同抗原決定簇的氨基酸序列有高度的序列同源性，如超過30％的氨基酸序列同源性，通常超過40％，如超過60％，甚至超過80-90％的同源性。
“同源性”指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分間的百分比同一性。兩個(gè)DNA或兩個(gè)多肽序列彼此“顯著同源”，序列表現(xiàn)出至少約50％的確定長(zhǎng)度分子的序列同一性，至少約75％優(yōu)選，至少約80-85％更優(yōu)選，至少約90％優(yōu)選，至少約95-98％最優(yōu)選。如本文所用，顯著同源也指表現(xiàn)出與具體DNA或多肽序列完全同一性的序列。
一般，“同一性”分別指對(duì)應(yīng)于兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確核苷-核苷或氨基酸-氨基酸。百分比同一性可通過直接比較兩個(gè)分子間序列信息來確定，通過比對(duì)序列、計(jì)算兩個(gè)比對(duì)序列間配對(duì)的確切數(shù)字、除以較短序列長(zhǎng)度并將結(jié)果乘以100。計(jì)算機(jī)程序可用于協(xié)助分析，如ALIGN，Dayhoff，M.O.，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)集(Atlas of Protein Sequence and Structure)M.O.Dayhoff編，5Suppl.3353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC，它改變了Smith和Waterman的局部同源性算法，Advances inAppl.Math.2482-489，1981用于肽分析。確定核苷序列同一性的程序存在于Wisconsin序列分析包，第8版(來自Genetics Computer Group，Madison，WI)例如BESTFIT、FASTA、GAP程序，它們也依賴于Smith和Waterman算法。這些程序使用廠商建議和上述Wisconsin序列分析包中所述缺省參數(shù)。例如涉及序列的具體核苷序列的百分比同一性可用Smith和Waterman同源性算法確定，采用六個(gè)核苷位置的缺省記錄表和缺口罰分(gap penalty)。
另一種在本發(fā)明中確定百分比同一性的方法是使用MPSRCH程序包，其版權(quán)屬于愛丁堡大學(xué)，由John F.Collins和Shane.S.Sturrok開發(fā)，InteliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分銷。Smith和Waterman算法可用于此程序包，其中在記錄表中使用了缺省參數(shù)(例如，缺口罰分為12，缺口延伸罰分為1，缺口為6)。從數(shù)據(jù)中產(chǎn)生的“匹配”值反映了“序列同一性”。其它計(jì)算序列間百分比同一性或類似性的適當(dāng)程序一般在本領(lǐng)域中已知，例如其它對(duì)比程序有采用缺省參數(shù)的BLAST。例如，可用采用以下缺省參數(shù)的BLASTN和BLASTP遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；濾器(filter)＝無；鏈＝兩者；截止＝60；期望值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述(dexcription)＝50個(gè)序列；排序＝高分；數(shù)據(jù)庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序的詳細(xì)描述可在以下因特網(wǎng)地址中找到http://www/ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外，同源性可通過在同源區(qū)域間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下雜交多核苷酸來確定，接著用單鏈-特異核酸酶消化并確定消化片段大小。顯著同源的DNA序列可在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中鑒定，在例如此具體系統(tǒng)定義的嚴(yán)格條件下。定義適當(dāng)雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。參見例如Sambrook等，同上；DNA克隆(DNA cloning)，同上；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)，同上。
II.完成本發(fā)明的模式詳細(xì)描述本發(fā)明前，要理解的是由于制劑或參數(shù)會(huì)變化，本發(fā)明不限于具體制劑或過程參數(shù)。也要理解的是本文所用術(shù)語僅用于描述本發(fā)明具體實(shí)施方案，并不想要限制。
盡管與本文所述類似或相同的一些組合物和方法可用于本發(fā)明實(shí)踐，本文描述了優(yōu)選材料和方法。
如上所指出，本發(fā)明基礎(chǔ)在一個(gè)發(fā)現(xiàn)上，HCV E1E2抗原結(jié)合缺乏MTP-PE的亞微米水包油乳劑以及亞微米水包油乳劑和免疫刺激核酸分子如CpG寡核苷酸，提供的組合物引起的抗體滴度顯著高于沒有這些佐劑所觀察到的。E1E2多肽引起的HCV-特異抗體提供用于發(fā)展HCV疫苗的體外和體內(nèi)模式系統(tǒng)，具體用于鑒定與強(qiáng)抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗體滴度產(chǎn)生相關(guān)的HCV E1、E2和HCV E1E2多肽抗原表位，和/或抗HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答。E1E2多肽也可用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗HCV的免疫應(yīng)答，具體是用于治療或預(yù)防目的的抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗體反應(yīng)和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。
為進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面提供關(guān)于E1E2多肽的更詳細(xì)討論用于試驗(yàn)組合物以及產(chǎn)生亞微米水包油乳劑、免疫刺激核酸分子和包括上述部分的組合物。
E1E2多肽如上所說明，用于本發(fā)明的E1E2復(fù)合體包括E1和E2多肽，與非共價(jià)或共價(jià)相互作用相聯(lián)。丙肝病毒基因組通常包含單個(gè)約9,600核苷的可讀框，可讀框轉(zhuǎn)錄成多蛋白。裂解HCV多蛋白以產(chǎn)生一些不同產(chǎn)物，順序?yàn)镹H2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH(見圖1)。HCV E1多蛋白是糖蛋白且從約氨基酸192延伸到氨基酸383(數(shù)字相對(duì)于HCV-1多蛋白)。參見例如Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)882451-2455。約173到約191的氨基酸代表E1的信號(hào)序列。HCV E2多蛋白也是糖蛋白且從約氨基酸383延伸到氨基酸746。E2的信號(hào)肽起始于約多蛋白的氨基酸364。因此，本文所用術(shù)語“全長(zhǎng)”E1或“非平截”E1所指多蛋白包括至少HCV多蛋白的氨基酸192-383(數(shù)字相對(duì)于HCV-1)。關(guān)于E2，本文所用術(shù)語“全長(zhǎng)”或“非平截”所指多蛋白包括至少HCV多蛋白的氨基酸383或384到氨基酸746(數(shù)字相對(duì)于HCV-1)。此揭示中顯然的是用于本發(fā)明的E2多蛋白可包括來自p7區(qū)域的其它氨基酸如氨基酸747-809。
如上說明，E2作為多個(gè)種類存在(Spaete等，Virol.(1992)188819-830；Selby等，J.Virol.(1996)70∶5177-5182；Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Tomei等，J.Virol.(1993)674017-4026)且剪短和蛋白水解可發(fā)生在E1和E2多肽的N-和C-末端。因此，本文所用E2多肽可包括至少HCV多蛋白氨基酸405-661，如400、401、402...到661，例如383或384-661、383或384-715、383或384-746、383或384到-749或者383或384-809、或者383或384到661-809間任意C-末端，數(shù)字相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1。類似的，本文所用E1多肽優(yōu)選可包括HCV多蛋白氨基酸192-326、192-330、192-333、192-360、192-363、192-383、或192到326-383間任意C-末端。
E1 E2復(fù)合體也可由含抗原表位的免疫原性片段E1和E2組成。例如，E1多肽片段可包括從E1多肽約5個(gè)氨基酸到近全長(zhǎng)分子，如6、10、25、50、75、100、125、150、175、185個(gè)或更多氨基酸或所示數(shù)字間任何整數(shù)。E1和E2多肽可來自相同或不同HCV菌株。
例如，抗原表位獲得自如E2的超變量區(qū)域例如跨越氨基酸384-410或390-410的區(qū)域，抗原表位可包括在E2多肽中。結(jié)合到E2序列中的具體有效E2抗原表位包括獲得自此區(qū)域的契合序列，如契合序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn，代表HCV類型1基因組氨基酸390-410的契合序列。其它E1和E2抗原表位已知并描述于如Chien等，國(guó)際公開號(hào)WO 93/00365。
此外，復(fù)合體的E1和E2多肽可缺乏所有或部分跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域。膜錨序列功能是使多肽聯(lián)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。一般，這些多肽能分泌入培養(yǎng)基，其中表達(dá)蛋白質(zhì)的生物體被培養(yǎng)。然而，如國(guó)際公開號(hào)WO 98/50556所述，這些多肽也可胞內(nèi)回收。分泌到培養(yǎng)基用一些檢測(cè)技術(shù)確定，如聚丙烯酰胺凝膠電泳等、免疫學(xué)技術(shù)如免疫沉淀試驗(yàn)，描述于如出版于1996年2月15日的國(guó)際公開號(hào)WO 96/04301。關(guān)于E1，一般終止于氨基酸位置370和更高(以HCV-1 E1數(shù)字為基礎(chǔ))的多肽由ER保持并因此不分泌入培養(yǎng)基。關(guān)于E2，終止于氨基酸位置731和更高(也以HCV-1 E2序列數(shù)字為基礎(chǔ))的多肽由ER保持并因此不分泌。(參見例如出版于1996年2月15日的國(guó)際公開號(hào)WO 96/04301)。應(yīng)該指出這些氨基酸位置不是絕對(duì)的且可一定程度變化。因此，本發(fā)明預(yù)期使用保持跨膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的E1和E2多肽以及缺乏所有或部分跨膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，包括終止于約氨基酸369和更低的E1多肽和終止于約氨基酸730和更低的E1多肽，它們?yōu)楸景l(fā)明獲得。此外，C-末端平截可延伸穿過跨膜結(jié)構(gòu)域到N-末端。因此，例如發(fā)生在位置低于如360的E1平截和發(fā)生在位置低于如715的E2平截也可包括在本發(fā)明中。必要的是平截E1和E2多肽保持功能用于所需目的。然而，具體優(yōu)選的平截E1構(gòu)建不延伸超過氨基酸300。最優(yōu)選的在位置360終止。優(yōu)選的平截E2構(gòu)建是不延伸超過氨基酸位置715的C-末端平截。具體優(yōu)選的E2平截在任意氨基酸715-730后截短，如725。如果使用平截分子，優(yōu)選使用都截短的E1和E2分子。
E1和E2多肽和它們的復(fù)合體也可存在作為脫唾液酸糖蛋白。這些脫唾液酸糖蛋白由本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，如用阻斷末端糖基化的細(xì)胞。當(dāng)這些蛋白質(zhì)在這類細(xì)胞中表達(dá)并由GNA凝集素親和層析分離時(shí)，E1和E2蛋白自發(fā)聚集。產(chǎn)生這些E1E2聚集體的詳細(xì)方法描述于如美國(guó)專利號(hào)6,074,852。
此外，E1E2復(fù)合體可存在作為分子的異源混合物，這是由于上述的剪短和蛋白水解。因此，含E1E2復(fù)合體的組合物可包括多種E1E2，如終止于氨基酸746的E1E2(E1E2746)、終止于氨基酸809的E1E2(E1E2809)、或任意上述其它不同E1和E2分子如N-末端從1-20個(gè)氨基酸平截的E2分子，如起始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的E2種類。
E1E2復(fù)合體可重組產(chǎn)生，作為融合蛋白或通過如用編碼感興趣E1和E2多肽的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染可反式或順式完成，即使用不同載體或使用攜帶E1和E2基因的單個(gè)載體。如果用單個(gè)載體完成，兩個(gè)基因可由一組控制元件推動(dòng)，或者另外基因可存在于載體單獨(dú)表達(dá)盒中，由單獨(dú)制元件推動(dòng)。表達(dá)后，E1和E2蛋白自發(fā)相聯(lián)。另外，復(fù)合體可通過將分別產(chǎn)生的單獨(dú)蛋白質(zhì)混合一起來形成，以純化或半純化形式，或者甚至通過混合培養(yǎng)基，在其中表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞被培養(yǎng)。最后，本發(fā)明E1E2復(fù)合體可表達(dá)作為融合蛋白，其中E1的所需部分融合到E2的所需部分。
從分泌到培養(yǎng)基的全長(zhǎng)、平截的E1和E2蛋白以及胞內(nèi)生成的平截蛋白中產(chǎn)生E1E2復(fù)合體的方法在本領(lǐng)域中已知。例如，這種復(fù)合體可重組產(chǎn)生，描述于美國(guó)專利號(hào)6,121,020；Ralston等，J.Virol.(1993)67∶6753-6761，Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Lanford等，Virology.(1993)197225-235。
因此，用于本發(fā)明的編碼HCV E1和E2多肽的多核苷酸可用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)產(chǎn)生。例如，編碼上述分子的多核苷酸序列可用重組方法獲得，如通過從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選cDNA和基因組文庫或通過從已知包括相同載體中獲得基因。此外，所需基因可用本領(lǐng)域所述技術(shù)直接從病毒核酸分子中分離，如在Houghton等，美國(guó)專利號(hào)5,350,671中。感興趣基因也可合成產(chǎn)生，而不是克隆。分子可用具體序列的適當(dāng)密碼子設(shè)計(jì)。完整序列隨后從用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸中集合并裝配成完整編碼序列。參見例如Edge(1981)Nature.292756；Nambair等，(1984)Science.2231299；Jay等，(1984)J.Biol.Chem.2596311。
因此，具體核苷序列可從含所需序列的載體獲得或者用多種本領(lǐng)域已知寡核苷酸合成技術(shù)完全或部分合成，如在適當(dāng)處用定點(diǎn)突變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。參見例如Sambrook，同上。具體是，一種獲得編碼所需序列的核苷序列方法是通過退火常規(guī)產(chǎn)生的重疊合成寡核苷酸互補(bǔ)對(duì)、自動(dòng)化多核苷酸合成儀、接著用適當(dāng)DNA連接酶連接和通過PCR擴(kuò)增連接核苷序列。參見例如Jayaraman等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.884084-4088。另外，寡核苷酸定向合成(Jones等(1986)Nature.5475-82)、寡核苷酸定向突變預(yù)存在核苷區(qū)域(Riechmann等(1988)Nature332323-327和Verhoeyen等(1988)Science2391534-1536)和用T4 DNA聚合酶酶填充缺口寡核苷酸(Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8610029-10033)可用于提供的分子改變或增強(qiáng)抗原-結(jié)合能力和免疫原性。
一旦制備或分離了編碼序列，這種序列可克隆到任何適當(dāng)載體或復(fù)制子中。許多克隆載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，選擇適當(dāng)克隆載體是一種選擇。適當(dāng)載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體或病毒，當(dāng)與合適控制元件相聯(lián)時(shí)它們能復(fù)制。
編碼序列隨后置于適當(dāng)控制元件的控制下，取決于用于表達(dá)的系統(tǒng)。因此，編碼序列可置于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))和任選的操縱子控制下，從而感興趣DNA序列由合適轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列可或可不包含信號(hào)肽或前導(dǎo)序列，它們后來在翻譯后加工中被宿主去除。參見例如美國(guó)專利號(hào)4,431,739；4,425,4374,338,397。
除了控制序列，需要加入調(diào)節(jié)序列來調(diào)控相對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的序列表達(dá)。調(diào)節(jié)序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例子包括那些引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激來打開或關(guān)閉，包括存在調(diào)節(jié)化合物。其它種類調(diào)節(jié)元件也可存在于載體中。例如，本文可使用增強(qiáng)子元件以增加構(gòu)建表達(dá)水平。例子包括SV40早期基因增強(qiáng)子(Dijkema等(1985)EMBO J..4761)、獲得自勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.796777)和獲得自人CMV的元件(Boshart等(1985)Cell.41521)，如包括在CMV內(nèi)含子A序列中的元件(美國(guó)專利號(hào)5,688,688)。表達(dá)盒可進(jìn)一步包括在適當(dāng)宿主細(xì)胞中用于自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或更多選擇標(biāo)記、一個(gè)或更多限制性位點(diǎn)、高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的潛力。
構(gòu)建表達(dá)載體，從而具體編碼序列位于有合適調(diào)節(jié)序列的載體中，編碼序列相對(duì)控制序列的位置和方向使編碼序列在控制序列“控制”下轉(zhuǎn)錄(即在控制序列結(jié)合DNA分子的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列)。編碼感興趣分子的序列修飾對(duì)于獲得此目標(biāo)是需要的。例如，在一些情況中，必須修飾序列使它能以合適方向附于控制序列；即維持閱讀框?？刂菩蛄泻推渌{(diào)節(jié)序列可在插入載體前連接到編碼序列。另外，編碼序列可直接克隆到含控制序列和適當(dāng)限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體中。
如上所說明，產(chǎn)生感興趣多肽的突變體或類似物也是需要的。用于試驗(yàn)組合物的HCV多肽突變體或類似物可通過缺失部分編碼感興趣多肽的序列、插入序列和/或置換一個(gè)或更多序列內(nèi)核苷來制備。修飾核苷序列的技術(shù)如定點(diǎn)突變等對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。參見例如Sambrook等，同上；Kunkel T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1985)82448；Geisselsoder等(1987)BioTechniques5786；Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100468；Dalbie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.796409。
分子可在多種系統(tǒng)中表達(dá)，包括昆蟲、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)，這些都在本領(lǐng)域中熟知。
例如，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并描述于如Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒和其它形式從Invitrogen，San Diego CA購買(“MaxBac”試劑盒)。類似的，細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)領(lǐng)域熟知并描述于如Sambrook等，同上。酵母表達(dá)系統(tǒng)也在本領(lǐng)領(lǐng)域中已知并描述于如酵母遺傳工程(Yeast Genetic Engineering)(Barr等編)Butterwoths，London。
一些用于上述系統(tǒng)的合適宿主細(xì)胞也已知。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在本領(lǐng)領(lǐng)域中已知并包括來自American Type Culture Collection(ATCC)的無限增殖細(xì)胞系，例如但不限于中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、倉鼠幼兒腎細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人胚胎腎細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛腎(“MDBK”)細(xì)胞以及其它。類似的，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌宿主如大腸桿菌(E.Coli)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、鏈球菌屬(Steptococcus spp.)可用于本表達(dá)構(gòu)建。本發(fā)明中有用的酵母宿主包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、麥芽糖念珠菌(Candida maltosa)、多形類漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、脆弱克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrowialioplytica。用于桿狀病毒表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)、家蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。
包括感興趣核苷序列的核酸分子可使用多種本領(lǐng)域熟知的基因傳遞技術(shù)來穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中或維持在適當(dāng)宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定游離元件上。參見例如美國(guó)專利號(hào)5,399,346。
取決于所選表達(dá)系統(tǒng)和宿主，分子通過轉(zhuǎn)化上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在表達(dá)蛋白的條件下生長(zhǎng)來產(chǎn)生。表達(dá)蛋白隨后從宿主細(xì)胞分離并純化。如果表達(dá)系統(tǒng)分泌蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，產(chǎn)物可從培養(yǎng)基中直接純化。如果不分泌，蛋白質(zhì)可從細(xì)胞裂解物中分離。合適生長(zhǎng)條件和回收方法的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。
組合物一旦產(chǎn)生，E1E2抗原可在疫苗組合物中提供，如預(yù)防(即防止感染)或治療(治療感染后的HCV)疫苗。疫苗可包括一個(gè)或更多E1E2復(fù)合體的混合物如獲得自超過一個(gè)病毒分離物的E1E2復(fù)合體，以及其它HCV抗原。此外如上所說明，由于剪短和蛋白水解E1E2復(fù)合體可作為分子的異源混合物存在。因此含E1E2復(fù)合體的組合物可包括多種E1E2，如終止于氨基酸746的E1E2(E1E2746)、終止于氨基酸809的E1E2(E1E2809)、或任意上述其它不同E1和E2分子如N-末端從1-20個(gè)氨基酸平截的E2分子，如起始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的E2種類。
疫苗可與其它抗原和免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合施用，例如免疫球蛋白、細(xì)胞因子和趨化因子，包括但不限于細(xì)胞因子如IL-2、修飾的IL-2(cys125→ser125)、GM-CSF、IL-12、γ干擾素、IP-10、MIP1β、FLP-3、病毒唑和RANTEs。
疫苗一般包括一個(gè)或更多“藥學(xué)上可接受賦形劑或載體”如水、鹽水、甘油、乙醇等。此外，輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這些載體中。
載體任選存在，它是一種分子，本身不誘導(dǎo)對(duì)接受組合物個(gè)體有害的抗體產(chǎn)生。適當(dāng)載體一般是大、緩慢代謝的大分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂類聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)和失活病毒顆粒。這種載體對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的。此外，HCV多肽可結(jié)合到細(xì)菌類毒素，如來自白喉、破傷風(fēng)、霍亂等的類毒素。
如上所說明，亞微米水包油乳劑和/或ISS如CpG寡核苷酸(下面進(jìn)一步描述)可存在于相同組合物中以提高免疫應(yīng)答?？纱嬖谄渌魟?，例如但不限于(1)鋁鹽類(明礬)，如氫氧化鋁、正磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton，MT)，含2％鯊烯、0.2％土溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，成分來自單磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，MPL+CWS(DetoxTM)優(yōu)選；(3)皂角苷佐劑如QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)可使用或由此產(chǎn)生的顆粒如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合體)，ISCOMs可缺乏其它去垢劑(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO00/07621)；(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，如白介素，例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 99/44636)，如γ干擾素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的去毒突變體如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、具體是LT-K63(其中賴氨酸在位置63置換野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸在位置72置換野生型氨基酸)、CT-S109(其中絲氨酸在位置109置換野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中賴氨酸在位置9置換野生型氨基酸且甘氨酸在位置129置換野生型氨基)(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 93/13202和WO 92/19265)；(7)單磷酰脂A(MPL)或3-O-脫酰MPL(3dMPL)(參見例如GB2220221；EPA 0689454)，任選地大量缺少明礬(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 00/56358)；(8)3dMPL與如QS21和/或水包油乳劑的組合物(參見例如EPA 0835318；EPA0735898；EPA 0761231)；(9)聚氧乙烯或聚氧乙烯酯(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO99/52549)；(10)皂角苷和免疫刺激寡核苷酸，如CpG寡核苷酸(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 00/62800)；(11)免疫刺激物和金屬鹽類顆粒(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO00/23105)；(12)皂角苷和水包油乳劑(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO 99/11241)；(13)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任選的+固醇)(參見例如國(guó)際公開號(hào)WO98/57659)；(14)其它作為免疫刺激劑提高組合物有效性的物質(zhì)。
胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰(thr-MDP)、N-乙酰-非胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰(nor-MDP)、-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
通常，疫苗組合物制備為可注射物，作為脂溶液或懸浮液；適于溶液或懸浮液中的固體形式，也可制備注射前的脂類載體。
疫苗包括治療有效量的E1E2復(fù)合體和所需任何其它上述成分。“治療有效量”指在施用個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的E1E2蛋白量，保護(hù)性免疫應(yīng)答優(yōu)選。這種反應(yīng)一般導(dǎo)致試驗(yàn)品對(duì)疫苗分泌、細(xì)胞和/或抗體-調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的發(fā)展。通常，這種反應(yīng)包括但不限于一種或多種下列效果；產(chǎn)生來自任意免疫種類的抗體，如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴細(xì)胞增生；提供活化、生長(zhǎng)和分化信號(hào)給免疫細(xì)胞；輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或γδT細(xì)胞群的擴(kuò)展。
一旦制成，疫苗常規(guī)是腸胃外施用，如通過注射，皮下或肌肉內(nèi)。適于其它施用模式的另外制劑包括口頭和肺部制劑、栓劑和經(jīng)皮膚應(yīng)用。劑量治療可以是單劑量安排或多劑量安排。優(yōu)選的是，有效量足夠治療或防止疾病癥狀。必需精確量的不同取決于治療試驗(yàn)品；待治療個(gè)體的年齡和總體狀況；個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力；所需保護(hù)的程度；治療情況的嚴(yán)重性；具體選擇的E1E2多肽和其施用模式。合適有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。相對(duì)寬范圍的“治療有效量”可用本領(lǐng)域已知體外和體內(nèi)模式通過途徑嘗試確定。下面例子中所用E1E2多肽量提供總體指導(dǎo)，可用于最優(yōu)化抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗體的誘發(fā)。
具體是，E1E2復(fù)合體優(yōu)選肌肉內(nèi)注射到大哺乳動(dòng)物中，例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物如狒狒、黑猩猩或人，劑量為約0.1μg到約5.0mg每劑量或所列范圍內(nèi)的任何量，如.5μg到約1.0mg、1μg到約500μg、2.5μg到約250μg、4μg到約200μg，如4、5、6、7、8、9、10...20...30...40...50...60...70...80...90...100等μg每劑量。E1E2多肽可施用給未感染HCV的哺乳動(dòng)物或HCV-感染的哺乳動(dòng)物。
施用E1E2多肽可引起哺乳動(dòng)物中抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗體滴度維持至少1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)。也可施用E1E2多肽以提供記憶反應(yīng)。如果獲得這種反應(yīng)，抗體滴度可隨著時(shí)間下降，然而暴露于HCV病毒或免疫原導(dǎo)致抗體迅速誘導(dǎo)，如僅在幾天內(nèi)。任選的是，抗體滴度可在哺乳動(dòng)物中維持，這是通過在初步注射后2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、1年或更多提供一個(gè)或更多E1E2多肽的強(qiáng)化注射。
優(yōu)選的是，E1E2多肽引起的抗體滴度為至少10、100、150、175、200、300、400、500、750、1,000、1,500、2,000、3,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000(幾何平均滴度)或更高，或所列滴度內(nèi)的任何數(shù)字，這是用標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定來確定，如描述于下面例子中的免疫測(cè)定。參見例如Chien等，Lancet(1993)342933；和Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011。
亞微米水包油乳劑如上所說明，亞微米水包油乳劑也可在傳遞E1E2抗原前、同時(shí)或之后施用給脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品。本文所用亞微米水包油乳劑包括非毒性、可代謝的油和商業(yè)乳化劑。非毒性、可代謝的油的例子包括但不限于植物油、魚油、動(dòng)物油或合成制備油。魚油如鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油優(yōu)選，發(fā)現(xiàn)于鯊魚肝油的鯊烯2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四烷己烯(tetracosahexaene)尤其優(yōu)選。油成分存在量從約0.5％到約20％體積，至約15％的量?jī)?yōu)選，從約1％到約12％的量更優(yōu)選，從約1％到約4％的量最優(yōu)選。
佐劑的水溶部分可以是緩沖鹽水或無攙雜的水。由于組合物用于腸胃外施用，優(yōu)選構(gòu)成最終的溶液從而漲度即同滲重摩本質(zhì)與正常生理流體相同以防止由于組合物和生理流體間不同離子濃度導(dǎo)致施用后膨脹或迅速吸收組合物。如果使用鹽水而不是水，優(yōu)選緩沖鹽水以維持與正常生理?xiàng)l件相容的pH。同樣在一些情況中，必須維持pH在具體水平以確保一些組合物成分的穩(wěn)定性。因此，組合物的pH一般是pH6-8且pH可用任何生理上可接受緩沖液維持，如磷酸、醋酸、tris、重碳酸鹽或碳酸鹽緩沖液等。水溶劑的量一般是使組合物達(dá)到所需最終體積必需的量。
適用于水包油制劑的乳化劑沒有限制包括以山梨聚糖為基礎(chǔ)的非離子表面活性劑如山梨聚糖單、二或三酯，例如以SpanTM或ArlacelTM名字購買的如SpanTM85(山梨聚糖三油酸酯)；商品名為土溫TM的聚氧乙烯山梨聚糖單、二或三酯，如土溫80TM(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)；名為MyrjTM的聚氧乙烯脂肪酸；獲得自月桂醇、乙醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪酸酯；如名為BrijTM；等。這些物質(zhì)可從一些商業(yè)源獲得，包括Sigma，St.Lousis，MO和ICI America’s Inc.，Wilmington，DE。這些乳化劑可單獨(dú)或組合使用。乳化劑通常存在量從0.02％到約2.5％重量(w/v)，0.05％到約1％優(yōu)選且0.01％到約0.5％更優(yōu)選。存在量一般約為20-30％所用油重量。
乳劑可包含其它免疫刺激劑，如胞壁酰肽，包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰(thr-MDP)、N-乙酰-非胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰(nor-MDP)、-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。免疫刺激細(xì)菌細(xì)胞壁成分如單磷酰脂A(MPL)、海藻糖dimycolate(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)也可存在。另外，乳劑可以沒有這些試劑，如沒有MTP-PE。本發(fā)明的亞微米水包油乳劑也可沒有任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。為描述本發(fā)明所用多種適當(dāng)亞微米水包油乳劑制劑以及免疫刺激劑，蠶繭例如國(guó)際公開號(hào)WO 90/14837；Remington制藥科學(xué)和實(shí)踐(TheScience and Practice of Pharmacy)，第19版(1995)；Van Nest等“用于與重組亞基疫苗使用的高級(jí)佐劑制劑”(Advanced adjuvant formulations foruse withrecombinat subunit vaccine)，疫苗92，新疫苗的現(xiàn)代方法(Vaccines 92，ModernApproaches to New Vaccines)(Brown等編)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，57-62頁(1992)；Ott等，“MF59-設(shè)計(jì)和評(píng)估用于人疫苗的安全和潛在佐劑”，疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)Plenum Press，New York(1995)277-296頁，和美國(guó)專利號(hào)6,299,884。
為產(chǎn)生亞微米顆粒即直徑小于1微米且在納米大小范圍中的顆粒，可使用一些技術(shù)。例如，可使用高剪切力原理操作的商業(yè)乳化器，在高壓下使流體通過小孔。商業(yè)乳化器例子包括但不限于110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)、Gaulin 30CD型(Gaulin，Inc.，Everett，MA)和Rainnie Minilab 8.30H型(MicroAutomizer Food and Diary，Inc.，Hudson，WI)。單獨(dú)乳化器使用的適當(dāng)壓力由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，當(dāng)使用110Y型微流化器時(shí)，在5000到30,000psi操作產(chǎn)生直徑約100到750nm的油滴。
油滴大小改變可通過變化去垢劑和油的比例(比例增加使小滴尺寸減小)、操作壓力(操作壓力增加使小滴尺寸減小)、溫度(溫度增加使小滴尺寸減小)和加入兩性免疫刺激劑(加入這些試劑使小滴尺寸減小)。實(shí)際小滴尺寸的改變隨著具體去垢劑、油和免疫刺激劑(如果有)和所選具體操作條件。小滴尺寸可使用校準(zhǔn)儀器檢驗(yàn)，如Coulter公司生產(chǎn)的商業(yè)亞微米顆粒分析器(N4MD型)，參數(shù)可用上述指南改變直到幾乎所有小滴直徑小于1微米，直徑小于0.8微米優(yōu)選，直徑小于0.5微米最優(yōu)選。幾乎所有是指至少約80％(數(shù)量)，至少約90％優(yōu)選，至少約95％更優(yōu)選，至少約98％最優(yōu)選。顆粒大小分布是典型高斯分布，從而平均直徑小于所列限制。
本文所用的具體優(yōu)選亞微米水包油乳劑是鯊烯/水乳劑，任選包含不同量的MTP-PE，如亞微米水包油乳劑含4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v土溫80TM(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)和/或0.25-1.0％Span85TM(山梨聚糖三油酸酯)和任選的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，例如稱為“MF59”的亞微米水包油乳劑(國(guó)際公開號(hào)WO90/14837；美國(guó)專利號(hào)6,299,884；和Ott等，“MF59-設(shè)計(jì)和評(píng)估用于人疫苗的安全和潛在佐劑”，疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)Plenum Press，New York(1995)277-296頁)。MF59包含4-5％w/v鯊烯、0.25-0.5％w/v土溫80TM、0.5％w/vSpan85TM和任選的不同量MTP-PE，用微流化器如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)制成亞微米顆粒。例如MTP-PE存在量可以是約0-500μg/劑量，0-250μg/劑量更優(yōu)選，0-100μg/劑量最優(yōu)選。如本文所用，術(shù)語“MF59-0”指上面缺乏MTP-PE的亞微米水包油乳劑，術(shù)語MF59-MTP指含MTP-PE的制劑。例如，“MF59-100”包含100μgMTP-PE每劑量等。另一種本文所用亞微米水包油乳劑MF69包含4.3％w/v鯊烯、0.25％w/v土溫80TM、0.75％w/vSpan85TM和任選的MTP-PE。又一種亞微米水包油乳劑是MF75，也稱為SAF，包含10％w/v鯊烯、0.4％土溫80TM、5％多聚醇-阻斷聚合物L(fēng)121和thr-MDP，同樣微流化成亞微米乳劑。MF75-MTP指包括MTP的MF75制劑，如來自100-400μg MTP-PE每劑量。
亞微米水包油乳劑、制造組合物中有用的相同和免疫刺激劑如胞壁酰的方法詳細(xì)描述于國(guó)際公開號(hào)WO 90/14837。
一旦制成亞微米水包油乳劑，如果使用ISS，它可在傳送抗原和ISS之前、同時(shí)或之后施用給脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品。如果抗原免疫前施用，佐劑制劑可早在用感興趣抗原免疫前5-10天施用，免疫前3-5天優(yōu)選且免疫前1-3或2天最優(yōu)選。如果分開施用，亞微米水包油制劑可傳送到抗原組合物相同傳遞位置或不同傳遞位置。
如果需要同時(shí)傳送，亞微米水包油制劑可用抗原組合物包括。一般，抗原和亞微米水包油乳劑可通過簡(jiǎn)單混合、攪拌或搖動(dòng)來結(jié)合。其它技術(shù)如將兩種成分混合物迅速穿過開口(如hydrodermic針)也可用于提供疫苗組合物。
如果結(jié)合，組合物的不同成分可以大范圍比例存在。例如，抗原和乳劑成分一般使用1∶50到50∶1的體積比例，1∶10到10∶1優(yōu)選，從約1∶5到3∶1更優(yōu)選，約1∶1最優(yōu)選。然而，其它比例對(duì)于特殊目的更合適，如當(dāng)具體抗原具有低免疫原性時(shí)，需要相對(duì)更高量的抗原成分。
免疫刺激核酸分子(ISS)以前報(bào)導(dǎo)細(xì)菌DNA刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答。參見例如Krieg等，Nautre(1995)374546-549。此免疫刺激能力來自高頻率的免疫刺激核酸分子(ISS)，如細(xì)菌DNA中存在的未甲基化CpG二核苷酸。含未甲基化CpG基序的寡核苷酸顯示誘導(dǎo)B細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的活化，如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。參見例如美國(guó)專利號(hào)6,207,646。
本發(fā)明使用來自ISS的佐劑。本發(fā)明的ISS包括的寡核苷酸可以是部分較大核苷構(gòu)建如質(zhì)?；蚣?xì)菌DNA。寡核苷酸可以是線性或環(huán)狀，或可包含線性和環(huán)狀片段。寡核苷酸可包括修飾，例如但不限于YOH或5’OH基團(tuán)修飾、核苷堿基修飾、糖成分修飾和磷酸基團(tuán)修飾。ISS可包括核糖核苷酸(包含核糖作為唯一或主要糖成分)、脫氧核糖核苷酸(包含去氧核糖作為主要糖成分)。修飾的糖或糖類似物也可結(jié)合在寡核苷酸中?？墒褂玫奶遣糠掷影ê颂恰⑷パ鹾颂?、戊糖、去氧戊糖、已糖、去氧已糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖和糖類似物環(huán)戊基。糖可以吡喃或呋喃形式。磷衍生物(或修飾的磷酸基團(tuán))可使用并可以是一磷酸、二磷酸、三磷酸、烷基磷酸、鏈烷磷酸、硫代磷酸等。結(jié)合到ISS寡核苷酸堿基的核酸堿基可以是天然產(chǎn)生的嘌呤和嘧啶堿基，即尿嘧啶或胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤以及這些堿基的天然發(fā)生或合成修飾。此外，存在大量非天然核苷，它們包括不同雜環(huán)堿基和不同糖部分(和糖類似物)并對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
結(jié)構(gòu)上，ISS的底部寡核苷酸是CG-包含核苷序列或p(IC)核苷序列，可以是回文序列。胞嘧啶可以是甲基化或未甲基化。用于本發(fā)明的具體ISS分子例子包括本領(lǐng)域已知的CpG、CpY和CpR分子等。
優(yōu)選ISS獲得自CpG分子家族、包括CpG基序的CpG二核苷酸和合成寡核苷酸(參見例如Krieg等，Nautre(1995)374546-549和Davis等J.Immunol(1998)160870-876)，如揭示于美國(guó)專利號(hào)6,207,646的任何不同免疫刺激CpG寡核苷酸。這些CpG寡核苷酸一般包括至少8到約100個(gè)核苷，8到40個(gè)核苷優(yōu)選，15-35個(gè)核苷更優(yōu)選，15-25個(gè)核苷和這些值之間任意數(shù)量核苷優(yōu)選。例如，包括共有CpG基序的寡核苷酸由公式5’-X1CG X2-3’表示，其中X1是A、G或T，X2是C或T。其它有用CpG分子包括由公式5’-X1X2CG X3X4表示的，其中X1和X2是序列如GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT、TpG，X3和X4是如TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA或TpG，其中“p”表示磷酸鍵。優(yōu)選的是，寡核苷酸不包括在5’-和/或3’末端或附近的GCG序列。另外，CpG優(yōu)選以兩個(gè)嘌呤(優(yōu)選GpA二核苷酸)或一個(gè)嘌呤和一個(gè)嘧啶(優(yōu)選GpT)在其5’-末端側(cè)翼，以兩個(gè)嘧啶在其3’-末端，優(yōu)選TpT或TpC二核苷酸。因此，優(yōu)選分子包括序列包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT，這些序列側(cè)翼有一些其它核苷，如1-20個(gè)或更多核苷酸，2到10個(gè)核苷優(yōu)選且3到5個(gè)核苷或這些所列范圍間任何整數(shù)更優(yōu)選。中央核心區(qū)域外的核苷似乎非?？梢宰兓?。
此外，本文所用CpG寡核苷酸可以是雙或單鏈。雙鏈分子體內(nèi)更穩(wěn)定而單鏈分子表現(xiàn)出提高的免疫活性。另外，磷酸骨架可被修飾以提高CpG分子的免疫刺激活性，如硫代磷酸-修飾。如美國(guó)專利號(hào)6,207,646所述，有硫代磷酸骨架的CpG分子優(yōu)選活化B細(xì)胞，有磷酸二酯骨架的CpG分子優(yōu)選活化單核(巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞)和NK細(xì)胞。
用于本組合物的示范CpG寡核苷酸包括的分子有序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)和5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQID NO5)。
可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)試驗(yàn)ISS分子刺激免疫應(yīng)答的能力。例如分子刺激體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力用上述免疫測(cè)定確定。此外，抗原和亞微米水包油組合物可有或沒有ISS施用以確定免疫應(yīng)答是否增強(qiáng)。
如上所說明，ISS可在傳送抗原和/或亞微米水包油乳劑之前、同時(shí)或之后施用。如果在抗原和/或亞微米水包油乳劑免疫前施用，ISS可早在免疫前5-10天施用，免疫前3-5天優(yōu)選且免疫前1-3或2天最優(yōu)選。如果分開施用，ISS可傳送到抗原組合物相同傳遞位置或不同傳遞位置。如果需要同時(shí)傳送，ISS可用抗原組合物包括。
一般，使用約5μg到5000μg ISS，更常用5μg到約1000的ISS每劑量，5μg到約500μg優(yōu)選，或從1到約100μg，優(yōu)選約5到約50μg，優(yōu)選5到約30或這些范圍內(nèi)的任何量，它們可在本方法中使用。
III.實(shí)驗(yàn)下面例子是完成本發(fā)明的具體實(shí)施方案。提供例子僅用于描述目的，不想在任何方面限制本發(fā)明范圍。
努力保證所用數(shù)字的準(zhǔn)確性(如量、溫度等)，但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
實(shí)施例1HCV E1E2的產(chǎn)生用于本發(fā)明疫苗組合物的HCV E1E2復(fù)合體制備為下列融合蛋白。特別地，哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pMH-E1E2-809(圖3)編碼E1E2融合蛋白，所述融合蛋白包括HCV-1的氨基酸192-809(參見Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)882451-2455)。E1E2809分子的序列示于本文圖2A-2C。
中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞用于表達(dá)來自pMH-E1E2-809的HCV E1E2序列。具體是，使用CHO DG44細(xì)胞。Uraub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1980)774216-4220描述的這些細(xì)胞獲得自CHO K-1細(xì)胞并通過dhfr基因中雙重缺失而缺乏二氫葉酸還原酶(dhfr)。
DG44細(xì)胞用pMH-E1E2-809轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)在選擇性培養(yǎng)即中，從而僅表達(dá)dhfr基因的細(xì)胞可生長(zhǎng)(Sambrook等，同上)。分離的CHO克隆挑入(約800個(gè)克隆)96孔板的各個(gè)孔中。從原始96孔板進(jìn)行影印來完成表達(dá)實(shí)驗(yàn)。影印板生長(zhǎng)至細(xì)胞形成匯合的單層。細(xì)胞固定到板壁并用冷甲醇滲透?？笶1E2的單克隆抗體3D5C3和抗E2的單克隆抗體3E51用于探測(cè)固定細(xì)胞。加入抗小鼠HRP綴合物后，接著加入底物，確定了最高表達(dá)的細(xì)胞系。然后將最高表達(dá)的細(xì)胞系擴(kuò)大到24孔聚合板(24-well cluster plate)。重復(fù)表達(dá)試驗(yàn)并再次將最高表達(dá)細(xì)胞系擴(kuò)張到最大體積的孔。這樣重復(fù)直到最高表達(dá)細(xì)胞系從6孔板擴(kuò)張到組織培養(yǎng)燒瓶。這時(shí)有足夠量的細(xì)胞來精確計(jì)數(shù)和收集細(xì)胞，進(jìn)行定量表達(dá)試驗(yàn)。在細(xì)胞裂解物上進(jìn)行ELISA(Spaete等，Virol.(1992)188819-830)以確定高表達(dá)子。
實(shí)施例2HCV E1E2的純化表達(dá)后，裂解CHO細(xì)胞并通過GNA-凝集素親和層析(GNA步驟)純化生成的E1E2809，接著進(jìn)行羥磷灰石(HAP)柱層析(HAP步驟)、DV50膜過濾(DV50步驟)、SP瓊脂糖HP柱層析(SP步驟)、Q膜過濾(Q步驟)和G25瓊脂糖柱層析(G25步驟)。完成各加工步驟后，產(chǎn)物收集用0.2μ過濾并保存于2-8℃或通過下次純化步驟直接加工。完成純化過程后，抗原用0.2μ過濾并保存于-60℃或更低直到過濾用于制劑。
具體是，裂解細(xì)胞，兩體積冷裂解緩沖液(1％Triton X-100于100mM Tris，pH8，和1mM EDTA)加入2-8℃的CHO細(xì)胞?；旌衔镆?000rpm在2-8℃離心45分鐘以去除碎片。收集上清并通過Sartorias 0.65μm Sartopure預(yù)濾器(Sartorius)和之后的Sartorias 0.65mm Sartofine預(yù)濾器來過濾，接著通過Sartorias 0.45μmSartobran過濾器和0.2μm Sartobran過濾器。過濾裂解物在裝入GNA柱前保存在冰上。
GNA瓊脂糖柱(1885ml，200×600，Vector Labs，Burlingame，CA)用八個(gè)柱體積的平衡緩沖液(25mM NaPO4，1.0M NaCl，12％Triton X-100，pH6.8)預(yù)平衡。裂解物以31.4ml/min(6cm/hr)加入柱過夜。柱用4床體積平衡緩沖液洗，隨后再次用5床體積10mM NaPO4，80mM NaCl，0.1％Triton X-100，pH6.8洗。產(chǎn)物用1M甲基α-D-吡喃甘露糖苷(MMP)，10mM NaPO4，80mM NaCl，0.1％Triton X-100，pH6.8洗提。收集約1體積的洗脫峰，0.2μm過濾并在或低于-60℃保存用于HAP層析。
HAP層析在室溫進(jìn)行。1200ml(100×150mm)I型陶瓷羥磷灰石柱(BioRad)用一個(gè)柱體積的0.4M NaPO4，pH6.8調(diào)節(jié)，隨后用不小于10個(gè)柱體積的10mM NaPO4，80mM NaCl，0.1％Triton X-100，pH6.8平衡。四組GNA洗提收集在不超過30℃的循環(huán)水浴中融化，0.2μm過濾并以131ml/min(100cm/hr)裝入平衡柱。裝載后HAP平衡緩沖液加入柱作為追蹤緩沖液(chase buffer)。當(dāng)UV上升到基線上時(shí)收集通過流量。當(dāng)產(chǎn)物收集體積到達(dá)一體積裝載體積加75％柱體積時(shí)，停止產(chǎn)物收集。HAP通過流量收集進(jìn)一步通過DV50病毒還原過濾來加工。
DV50過濾在室溫進(jìn)行。制備DV50裝載是通過兩倍稀釋HAP收集和0.15％TritonX-100，1mM EDTA，pH5.3調(diào)節(jié)。稀釋和調(diào)節(jié)通過加入稀釋緩沖液-1(3mM檸檬酸，2mM EDTA，0.2％Triton X-100)完成以調(diào)整產(chǎn)物收集的pH到5.3，接著加入稀釋緩沖液-2(2mM EDTA，0.2％Triton X-100，pH5.3)以使終體積達(dá)到2倍原始HAP收集體積。
稀釋和調(diào)節(jié)的HAP聚集物(DV50裝載)通過10英寸，Pall Ultipor VF DV50膜柱體(Pall)過濾。用過濾柱體收集過濾物(filter housing)，用水預(yù)濕，123℃高壓滅菌60分鐘消毒，使用前緩慢排氣。過濾器隨后用SP平衡緩沖液(10mM檸檬酸鈉，1mM EDTA，0.15％ Triton X-100，pH5.3)預(yù)濕，在不超過45psi的壓力加入DV50裝載前排出。DV50裝載接著用約800ml/min的流速在約30psi的轉(zhuǎn)膜壓力應(yīng)用。收集濾液并過夜保存在2-8℃并用于SP步驟。
SP層析在室溫進(jìn)行。88ml(50×45mm)SP瓊脂糖HP柱層析(Pharmacia，Peapack，NJ)用15個(gè)柱體積的平衡緩沖液(10mM檸檬酸，1mM EDTA，0.15％ Triton X-100，pH5.3)平衡。DV50過濾物加入柱。柱首先用5個(gè)柱體積的平衡緩沖液洗，接著用20個(gè)柱體積的洗滌緩沖液，洗滌緩沖液含10mM檸檬酸，15mM NaCl，1mM EDTA，0.1％土溫-80TM，pH6.0。產(chǎn)物用10mM檸檬酸，180mM NaCl，1mM EDTA，0.1％土溫-80TM，pH6.0從柱洗提。收集完整的280nm吸收峰作為產(chǎn)物收集。產(chǎn)物收集過夜保存在2-8℃并用于Q-膜過濾步驟。
Q-膜過濾步驟在室溫進(jìn)行。兩個(gè)消毒的Sartorious Q100X圓盤膜串聯(lián)相連。膜用不少于300ml的Q平衡緩沖液(10mM檸檬酸，180mM NaCl，1mM EDTA，0.1％土溫-80TM，pH6.0)平衡。完整SP洗提收集以30-100ml/min流速通過平衡的Q膜過濾，接著用40ml的Q平衡緩沖液沖洗。收集過濾物和沖洗物并結(jié)合作為產(chǎn)物收集且用于G25步驟。
G25步驟在室溫進(jìn)行。1115ml(100×142mm)Pharmacia交聯(lián)葡聚糖G-25柱(Pharmacia，Peapack，NJ)用不少于5個(gè)柱體積的制劑緩沖液(10mM檸檬酸，270mMNaCl，1mM EDTA，0.1％土溫-80TM，pH6.0)平衡。Q過濾收集加入柱并收集柱通過流量，0.22μm過濾(Millipore)并凍存于-60℃或更地直到使用。
實(shí)施例3小鼠中HCV E1E2疫苗組合物的免疫原性上述產(chǎn)生和純化的HCV E1E2809的免疫原性如下確定，HCV E1E2809與亞微米水包油乳劑和/或CpG寡核苷酸結(jié)合。
此研究中所用制劑概括于表1。一種亞微米水包油乳劑MF59如前所述生成，它包含4-5％w/v鯊烯、0.5％w/v土溫80TM、0.5％Span85TM。參見國(guó)際公開號(hào)WO90/14837；美國(guó)專利號(hào)6,299,884；和Ott等，“MF59-設(shè)計(jì)和評(píng)估用于人疫苗的安全和潛在佐劑”，疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)Plenum Press，New York(1995)277-296頁。對(duì)于組4和9，使用4倍量的MF59。此研究中所用MF59是MF59-O，不含任何MTP-PE。
組1、3、6和8所用制劑也包括25μg的活性CpG分子每劑量。所用活性CpG分子序列是5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)。
組5所用制劑包括25μg的失活CpG分子每劑量。所用失活CpG分子序列是5’-TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3’(SEQ ID NO2)。
組1-4所用制劑包括2.8μg每劑量的HCV E1E2809抗原，如上所述生成。
組5-9所用制劑包括2.0μg每劑量的HCV E2715，如美國(guó)專利號(hào)6,12,020所述，HCV E2715是CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的一種平截E2蛋白。
6周年齡的Balb/C小鼠分成9組(每組10只小鼠)并肌肉內(nèi)施用50μl的疫苗組合物和表l所列成分。動(dòng)物在初次注射后30和90天強(qiáng)化。最后一次注射后14天收集血清且通過酶免疫測(cè)定確定抗E1E2和抗E2抗體滴度。參見Chien等，Lancet(1993)342933。
結(jié)果示于表1和圖4?？梢奌CV E1E2免疫小鼠用CpG結(jié)合MF59作為佐劑，產(chǎn)生的E1E2抗體水平顯著高于(P＜0.05)單獨(dú)使用MF59或單獨(dú)使用4x MF59作為佐劑的E1E2免疫小鼠。單獨(dú)CpG產(chǎn)生的抗體水平高于單獨(dú)用MF59的抗體水平，盡管不顯著高于。相反，使用MF59和/或CpG的E2715免疫小鼠產(chǎn)生非常低的抗體水平，少于50％的小鼠響應(yīng)。這令人驚訝，因?yàn)榍懊嬗肊2715的實(shí)驗(yàn)在小鼠中產(chǎn)生高抗體水平，所有試驗(yàn)小鼠響應(yīng)。
表1.HCV E1E2809和E2715的免疫原性，它們使用CpG和/或MF59作為佐劑。括號(hào)中的數(shù)字表示產(chǎn)生抗體的動(dòng)物數(shù)量相對(duì)免疫動(dòng)物的數(shù)量。

實(shí)施例4黑猩猩中HCV E1E2疫苗組合物的免疫原性上述產(chǎn)生和純化的HCV E1E2809的免疫原性如下確定，HCV E1E2809與亞微米水包油乳劑和/或CpG寡核苷酸結(jié)合。
此研究中所用制劑概括于表2。MF59和E1E2809描述如上。所用CpG分子的序列是5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO5)。
黑猩猩分成2組(每組5只動(dòng)物)并肌肉內(nèi)施用疫苗組合物和表1所列成分。具體是，一組動(dòng)物用20μg E1E2809和MF59在0、1和6個(gè)月免疫。第二組動(dòng)物也用20μg E1E2809和MF59以及500μgCpG在0、1和6個(gè)月免疫。
最后一次免疫后14天獲得血清樣品且通過酶免疫測(cè)定確定抗E2抗體滴度。具體是E1 E2抗原覆蓋在聚苯乙烯微量滴定板上且結(jié)合抗體用HRP-綴合抗人抗體來檢測(cè)，接著用四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯底物發(fā)展。
如表2可見，HCV E1E2免疫黑猩猩用CpG結(jié)合MF59作為佐劑，產(chǎn)生的E1E2抗體水平顯著高于(P＜0.05)單獨(dú)使用MF59的E1E2免疫小鼠。
表2.使用CpG和MF59作為佐劑的HCV E1E2809的免疫原性。

因此，描述了新HCV疫苗組合物和使用相同的方法。根據(jù)前述，盡管一定程度描述了試驗(yàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，要理解可不離開本發(fā)明精神和范圍作出不同變化，范圍由所附權(quán)利要求書定義。
序列表<110>希龍公司(CHIRON CORPORATION)<120>HCV E1E2疫苗組合物<130>2302-17206.40<140>
<141>
<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述CpG寡核苷酸<400>1tccatgacgt tcctgacgtt 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述失活CpG分子<400>2tccaggactt ctctcaggtt 20<210>3<211>1914<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述HCV-1 E1/E2/p7區(qū)域<220>
<221>CDS<222>(1)..(1914)<400>3tct ttc tct atc ttc ctt ctg gcc ctg ctc tct tgc ttg act gtg ccc48Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro1 5 10 15gct tcg gcc tac caa gtg cgc aac tcc acg ggg ctc tac cac gtc acc96Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr20 25 30aat gat tgc cct aac tcg agt att gtg tac gag gcg gcc gat gcc atc144Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile
35 40 45ctg cac act ccg ggg tgc gtc cct tgc gtt cgc gag ggc aac gcc tcg192Leu His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser50 55 60agg tgt tgg gtg gcg atg acc cct acg gtg gcc acc agg gat ggc aaa240Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys65 70 75 80ctc ccc gcg acg cag ctt cga cgt cac atc gat ctg ctt gtc ggg agc288Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser85 90 95gcc acc ctc tgt tcg gcc ctc tac gtg ggg gac ctg tgc ggg tct gtc336Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val100 105 110ttt ctt gtc ggc caa ctg ttt acc ttc tct ccc agg cgc cac tgg acg384Phe Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr115 120 125acg caa ggt tgc aat tgc tct atc tat ccc ggc cat ata acg ggt cac432Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His130 135 140cgc atg gca tgg gat atg atg atg aac tgg tcc cct acg acg gcg ttg480Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu145 150 155 160gta atg gct cag ctg ctc cgg atc cca caa gcc atc ttg gac atg atc528Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile165 170 175gct ggt gct cac tgg gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg576Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met180 185 190gtg ggg aac tgg gcg aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc624Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly195 200 205gtc gac gcg gaa acc cac gtc acc ggg gga agt gcc ggc cac act gtg672Val Asp Ala Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His Thr Val210 215 220tct gga ttt gtt agc ctc ctc gca cca ggc gcc aag cag aac gtc cag720Ser Gly Phe Val Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val Gln225 230 235 240ctg atc aac acc aac ggc agt tgg cac ctc aat agc acg gcc ctg aac768Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Leu Asn Ser Thr Ala Leu Asn245 250 255tgc aat gat agc ctc aac acc ggc tgg ttg gca ggg ctt ttc tat cac816Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His260 265 270cac aag ttc aac tct tca ggc tgt cct gag agg cta gcc agc tgc cga864His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg275 280 285ccc ctt acc gat ttt gac cag ggc tgg ggc cct atc agt tat gcc aac912
Pro Leu Thr Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn290 295 300gga agc ggc ccc gac cag cgc ccc tac tgc tgg cac tac ccc cca aaa960Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys305 310 315 320cct tgc ggt att gtg ccc gcg aag agt gtg tgt ggt ccg gta tat tgc1008Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys325 330 335ttc act ccc agc ccc gtg gtg gtg gga acg acc gac agg tcg ggc gcg1056Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala340 345 350ccc acc tac agc tgg ggt gaa aat gat acg gac gtc ttc gtc ctt aac1104Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn355 360 365aat acc agg cca ccg ctg ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac1152Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn370 375 380tca act gga ttc acc aaa gtg tgc gga gcg cct cct tgt gtc atc gga1200Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly385 390 395 400ggg gcg ggc aac aac acc ctg cac tgc ccc act gat tgc ttc cgc aag1248Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys405 410 415cat ccg gac gcc aca tac tct cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg atc aca1296His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr420 425 430ccc agg tgc ctg gtc gac tac ccg tat agg ctt tgg cat tat cct tgt1344Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys435 440 445acc atc aac tac act ata ttt aaa atc agg atg tac gtg gga ggg gtc1392Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val450 455 460gag cac agg ctg gaa gct gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaa cgt tgc1440Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys465 470 475 480gat ctg gaa gat agg gac agg tcc gag ctc agc ccg tta ctg ctg acc1488Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr485 490 495act aca cag tgg cag gtc ctc ccg tgt tcc ttc aca acc ctg cca gcc1536Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala500 505 510ttg tcc acc ggc ctc atc cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag1584Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln515 520 525tac ttg tac ggg gtg ggg tca agc atc gcg tcc tgg gcc att aag tgg1632Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp530 535 540
gag tac gtc gtc ctc ctg ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc gtc tgc1680Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys545 550 555 560tcc tgc ttg tgg atg atg cta ctc ata tcc caa gcg gaa gcg gct ttg1728Ser Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu565 570 575gag aac ctc gta ata ctt aat gca gca tcc ctg gcc ggg acg cac ggt1776Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly580 585 590ctt gta tcc ttc ctc gtg ttc ttc tgc ttt gca tgg tat ctg aag ggt1824Leu Val Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly595 600 605aag tgg gtg ccc gga gcg gtc tac acc ttc tac ggg atg tgg cct ctc1872Lys Trp Val Pro Gly Ala Val Tyr Thr Phe Tyr Gly Met Trp Pro Leu610 615 620ctc ctg ctc ctg ttg gcg ttg ccc cag cgg gcg tac gcg taa1914Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala625 630 635<210>4<211>637<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述HCV-1 E1/E2/p7區(qū)域的氨基酸<400>4Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro1 5 10 15Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr20 25 30Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile35 40 45Leu His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser50 55 60Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys65 70 75 80Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser85 90 95Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val100 105 110Phe Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr115 120 125Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His130 135 140Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu
145 150 155 160Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile165 170 175Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met180 185 190Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly195 200 205Val Asp Ala Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His Thr Val210 215 220Ser Gly Phe Val Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val Gln225 230 235 240Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Leu Asn Ser Thr Ala Leu Asn245 250 255Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His260 265 270His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg275 280 285Pro Leu Thr Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn290 295 300Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys305 310 315 320Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys325 330 335Phe Thr Pro Ser Pro Val Val VaL Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala340 345 350Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn355 360 365Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn370 375 380Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly385 390 395 400Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys405 410 415His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr420 425 430Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys435 440 445Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val450 455 460Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys465 470 475 480Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr
485 490 495Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala500 505 510Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln515 520 525Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp530 535 540Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys545 550 555 560Ser Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu565 570 575Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly580 585 590Leu Val Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly595 600 605Lys Trp Val Pro Gly Ala Val Tyr Thr Phe Tyr Gly Met Trp Pro Leu610 615 620Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala625 630 635<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述CpG寡核苷酸<400>5tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 2權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含丙肝病毒(HCV)E1E2抗原和缺乏N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述HCV E1E2抗原包括與圖2A-2C的192-809位所示氨基酸連續(xù)序列有至少80％同一性的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述HCV E1E2抗原包含圖2A-2C中192-809位所示的氨基酸連續(xù)序列。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物進(jìn)一步包含免疫刺激核酸序列(ISS)。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述ISS是CpG寡核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-X1X2CG X3X4，其中X1和X2是選自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的序列，X3和X4選自TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA和TpG，其中p表示磷酸鍵。
7.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO5)。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑包括(1)可代謝的油，其中油的量為總體積的0.5％到20％；(2)乳化劑，其中乳化劑存在量為0.01％到2.5％重量(w/v)，其中油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述油的量為總體積的1％到12％且乳化劑存在量為0.01％到1％重量(w/v)。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述乳化劑包括聚氧乙烯山梨聚糖單、二或三酯和/或山梨聚糖單、二或三酯。
13.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑包括4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和/或0.25-1.0％山梨聚糖三油酸酯。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑實(shí)質(zhì)上由5％體積的鯊烯；和一種或多種乳化劑組成，所述乳化劑選自聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，其中所述乳化劑存在總量為1％重量(w/v)。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種乳化劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，且聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯存在總量為1％重量(w/v)。
16.一種組合物，所述組合物包含丙肝病毒(HCV)E1E2抗原和免疫刺激核酸序列(ISS)的組合物，其特征在于，所述ISS能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述ISS是CpG寡核苷酸。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述HCV E1E2抗原包括與圖2A-2C的192-809位所示氨基酸連續(xù)序列有至少80％同一性的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述HCV E1E2抗原包含圖2A-2C中192-809位所示的氨基酸連續(xù)序列。
20.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-X1X2CGX3X4，其中X1和X2是選自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的序列，X3和X4選自TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA和TpG，其中p表示磷酸鍵。
21.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)。
23.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO5)。
24.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括(a)丙肝病毒(HCV)E1E2抗原，所述抗原包括與圖2A-2C的192-809位所示氨基酸連續(xù)序列有至少80％同一性的氨基酸序列；(b)能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原免疫應(yīng)答的亞微米水包油乳劑，其中所述亞微米水包油乳劑包括(i)可代謝的油，其中油的量為總體積的1％到12％和(ii)乳化劑，其中乳化劑存在量為0.01％到1％重量(w/v)，并包括聚氧乙烯山梨聚糖單、二或三酯和/或山梨聚糖單、二或三酯，油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米；(c)CpG寡核苷酸，其中所述CpG寡核苷酸包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述HCV E1E2抗原包含圖2A-2C中192-809位所示的氨基酸連續(xù)序列。
26.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)。
27.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO5)。
28.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑包括4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯，和/或0.25-1.0％山梨聚糖三油酸酯，以及任選的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
29.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述亞微米水包油乳劑實(shí)質(zhì)上由5％體積的鯊烯；和一種或多種乳化劑組成，所述乳化劑選自聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，其中所述乳化劑存在總量為1％重量(w/v)。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種乳化劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，且聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯存在總量為1％重量(w/v)。
31.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括(a)包含圖2A-2C中192-809位所示的氨基酸序列的丙肝病毒(HCV)E1E2抗原；(b)能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原免疫應(yīng)答的亞微米水包油乳劑，其中所述亞微米水包油乳劑包括4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯，和/或0.25-1.0％山梨聚糖三油酸酯，以及任選的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，其中油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米；(c)CpG寡核苷酸，其中所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)或序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO5)。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其中，所述HCV E1E2抗原由圖2A-2C中192-809位所示的氨基酸序列組成。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中，所述亞微米水包油乳劑實(shí)質(zhì)上由(i)5％體積的鯊烯；和(ii)一種或多種乳化劑組成，所述乳化劑選自聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，其中所述乳化劑存在總量為1％重量(w/v)。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中，所述一種或多種乳化劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯，且聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和山梨聚糖三油酸酯存在總量為1％重量(w/v)。
35.如權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)所述的組合物在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。
36.一種在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述方法包括給試驗(yàn)品施用治療有效量的丙肝病毒(HCV)E1E2抗原和缺乏N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑，其中所述亞微米水包油乳劑能提高對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。
37.一種在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述方法包括給試驗(yàn)品施用治療有效量的丙肝病毒(HCV)E1E2抗原和免疫刺激核酸分子(ISS)，其中所述ISS能提高對(duì)HCV E1E2抗原的免疫應(yīng)答。
38.一種在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述方法包括給試驗(yàn)品施用治療有效量的組合物，所述組合物包括(a)丙肝病毒(HCV)E1E2抗原，所述抗原包括與圖2A-2C中192-809位所示氨基酸連續(xù)序列有至少80％的同一性的氨基酸序列；(b)能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原免疫應(yīng)答的亞微米水包油乳劑，其中所述亞微米水包油乳劑包括(i)可代謝的油，其中油的量為總體積的1％到12％，和(ii)乳化劑，其中乳化劑存在量為0.01％到1％重量(w/v)，并包括聚氧乙烯山梨聚糖單、二或三酯和/或山梨聚糖單、二或三酯，其中所述油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米；(c)CpG寡核苷酸，其中所述CpG寡核苷酸包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
39.一種在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述方法包括給試驗(yàn)品施用治療有效量的組合物，所述組合物包括(a)包含圖2A-2C中192-809位所示的氨基酸序列的丙肝病毒(HCV)E1E2抗原；(b)能增強(qiáng)對(duì)HCV E1E2抗原免疫應(yīng)答的亞微米水包油乳劑，其中所述亞微米水包油乳劑包括4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯和/或0.25-1.0％山梨聚糖三油酸酯，以及任選的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，其中所述油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，幾乎所有乳劑的油滴直徑為約100nm到小于1微米；(c)CpG寡核苷酸，其中，所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO1)或序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO5)。
40.一種制造組合物的方法，其特征在于，所述方法包括將亞微米水包油乳劑與丙肝病毒(HCV)E1E2抗原結(jié)合，所述亞微米水包油乳劑缺乏N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括將免疫刺激核酸序列(ISS)與E1E2抗原和亞微米水包油乳劑結(jié)合。
42.一種制造組合物的方法，其特征在于，所述方法包括將免疫刺激核酸序列(ISS)與丙肝病毒(HCV)E1E2抗原結(jié)合。
全文摘要
描述了包含E1E2抗原、亞微米水包油乳劑和/或免疫刺激核酸序列的HCV E1E2組合物。所述組合物可用于在脊椎動(dòng)物試驗(yàn)品中刺激免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)A61K47/00GK1636015SQ02812819
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者M·豪頓, S·R·蔻蒂斯, D·歐哈根, Y·－L·方 申請(qǐng)人:希龍公司