專利名稱：血管緊張肽-載體偶聯(lián)物及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。
相關(guān)技術(shù)哺乳動物的動脈血壓主要由被稱為腎素-血管緊張肽-系統(tǒng)(RAS)的生物化學(xué)級聯(lián)控制。在動脈血壓下降后，腎臟腎小球旁器的上皮樣細(xì)胞釋放腎素，啟動該系統(tǒng)。腎素酶切由肝臟分泌到血清中的血管緊張肽原(氨基酸序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Asn)。這種酶切導(dǎo)致形成十肽血管緊張肽I(ATI，氨基酸序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)。存在于肺內(nèi)皮中的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)在數(shù)秒鐘內(nèi)酶切ATI的兩個C端氨基酸，產(chǎn)生血管緊張肽II(氨基酸序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)。血管緊張肽I在體內(nèi)存在時間極短，沒有或僅有輕微的血管收縮活性，而血管緊張肽II對循環(huán)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)具有強烈的影響。RAS激活的血管緊張肽II水平升高引起血管收縮、鹽和水的腎潴留，二者均可升高動脈壓(高血壓)，可導(dǎo)致心血管損傷。高血壓的可能的臨床表現(xiàn)有中風(fēng)、梗塞、充血性心力衰竭、腎衰竭或視網(wǎng)膜出血。
根據(jù)美國疾病控制預(yù)防中心(CDC)報告，充血性心力衰竭是老年人中的一種主要慢性病，在美國每年大約致260,000人死亡。1995年，醫(yī)療保險為心力衰竭支付了34億美元。盡管已經(jīng)有治療高血壓的藥物，但是在治療的高血壓患者中只有約半數(shù)得到控制。這部分是由于患者不配合或者所用藥物無效。
當(dāng)前對高血壓的治療包括利用有機小分子干預(yù)RAS系統(tǒng)。主要靶標(biāo)是腎素、ACE和血管緊張肽II受體。ACE抑制劑包括賴諾普利(lisinopril)、卡托普利(captopril)和依那普利(enalapril)，然而，這些藥物尚未完全成功。首先，它們似乎不能完全阻斷ACE的活性，其次，ACE產(chǎn)生其它生物活性肽(包括緩激肽)也受到影響，這是不希望的。這些藥物能引起副作用，如干咳和初次給藥低血壓作用，伴有眩暈并可能昏厥。血管緊張肽II受體拮抗劑包括洛沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)和依貝沙坦(isbesaftan)，它們特異作用于AT1血管緊張肽受體，因此阻斷血管緊張肽II的主要血管收縮效果，并能較好地被耐受但不影響血管緊張肽激素的其它作用。然而，血管緊張肽II受體拮抗劑以及ACE抑制劑需要定期服用，通常是長期的，例如占成人壽命的大半部分，這至少部分解釋了較差的患者順應(yīng)性。因此，確實需要有效、良好耐受并且具有高患者順應(yīng)性的高血壓治療方法。
治療或預(yù)防與激素活性有關(guān)的疾病的一種可能的方法是通過免疫治療中和患者體內(nèi)激素的作用，即免疫患者抗激素或與激素產(chǎn)生有關(guān)的酶，使得該激素的活性被特異性抗激素或抗酶抗體中和，或者使其水平降低。這類抗體可以在被動免疫中外源性施用，或者可以使用基于激素或相關(guān)酶的免疫原通過主動免疫在原位產(chǎn)生。
為了控制高血壓而對RAS成分接種的可行性已經(jīng)在動物模型中得到證實(綜述見Michel，Am.Heart J.117756(1989))?？鼓I素的接種可有效降低血壓，然而，動物罹患自身免疫性腎炎(Michel等人，Circulation 811899(1990)；Lo等人，Hypertension 1680(1990))。對同源ACE主動免疫的資料非常有限。一篇報告描述了兔的接種，但是50只動物中只有1只產(chǎn)生可檢測的抗-ACE抗體(Soffer，F(xiàn)ed.Proc.422735(1983))。抗ACE免疫血清的被動轉(zhuǎn)移能夠降低兔的血壓，但是導(dǎo)致伴肺水腫的免疫過敏反應(yīng)，這可能是因為ACE在肺中以膜結(jié)合形式表達(dá)(Cadwell，F(xiàn)EBS Lett.6382(1976))。還沒有關(guān)于對血管緊張肽原的主動免疫的報告，但是有幾項研究探索了對血管緊張肽I和血管緊張肽II接種的可行性。有兩項研究報告了接種動物的血壓效應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)自身免疫(Christlieb，J.Clin.Invest.481506(1969)；Gardiner，Br.J.Pharmacol.1291178(2000))。然而，大多數(shù)用血管緊張肽進(jìn)行接種的研究結(jié)果是陰性的，這可能是因為誘導(dǎo)的抗血管緊張肽滴度太低，或者產(chǎn)生的抗體的特異性并非最佳。只針對血管緊張肽II的疫苗對RAS的作用可能不同于誘導(dǎo)抗血管緊張肽II、抗血管緊張肽I和(也可能)抗前體血管緊張肽原抗體的疫苗。
WO 98/5 8952描述了利用一種偶聯(lián)物進(jìn)行的治療，該偶聯(lián)物含有與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)的血管緊張肽I，如果與佐劑(如氫氧化鋁)一起使用，在大鼠中可誘導(dǎo)產(chǎn)生血管緊張肽特異性抗體。佐劑通常是有毒的，或者至少是刺激性的。允許用于人的佐劑迄今為止只有無機鹽(氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣)和病毒顆粒。最常用于人的佐劑是氫氧化鋁(明礬)。盡管認(rèn)為它是安全的，但是它在體內(nèi)長期存留，形成積淀。這種積淀形成的后果還不清楚，因此在未來的疫苗中，應(yīng)當(dāng)在不喪失其免疫原性的條件下盡量避免使用明礬。
因此，本領(lǐng)域仍然需要研制甚至在不使用佐劑時仍能誘導(dǎo)高抗體滴度的偶聯(lián)物。
發(fā)明簡述如今，我們已經(jīng)研制了用于誘導(dǎo)血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II(此處通稱為“血管緊張肽”)特異性抗體的強免疫原，它們甚至在不使用佐劑的情況下也是有效的，使得在體內(nèi)產(chǎn)生特異性針對一種或多種血管緊張肽(如血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II)的抗體。這些免疫原由與病毒樣顆粒(VLP)結(jié)合的血管緊張肽部分組成。產(chǎn)生高免疫原性的重復(fù)抗原陣列，甚至在不使用佐劑的情況下也能夠刺激抗體形成。根據(jù)所使用的血管緊張肽部分的氨基酸序列，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高抗體滴度，而且能夠針對血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的N端或C端特異性誘導(dǎo)。這使得能夠特異性靶向于僅僅一種血管緊張肽或其組合。因此本發(fā)明的免疫原能夠在免疫治療方法中使用，用來治療與RAS產(chǎn)生的血管緊張肽II水平升高有關(guān)的疾病。
不局限于任何特定的運行或機制理論，本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑(conjugate)能夠誘導(dǎo)可與一種以上的血管緊張肽形式結(jié)合，從而同時阻斷所有相關(guān)種類血管緊張肽的抗體。此外，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可能是血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的C端特異性的。在這些條件下，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體將阻斷腎素或ACE分別對血管緊張肽原或血管緊張肽I的激活。不過，與ACE或腎素不同的蛋白酶，如內(nèi)肽酶和氨肽酶，能夠從N端降解血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II，從而阻止與抗體結(jié)合的完整血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的積累。
因此，本發(fā)明提供如下免疫原其包含一種或多種血管緊張肽或肽部分或其衍生物，它們與一種或多種核心顆粒、優(yōu)選地與一種或多種病毒樣顆粒(VLP)結(jié)合，形成具有有序、重復(fù)陣列結(jié)構(gòu)的偶聯(lián)物。包含第一附著位點的核心顆粒和包含第二附著位點的血管緊張肽或其衍生物通過該第一和第二附著位點連接，形成有序、重復(fù)的陣列。第一與第二位點之間的相互作用可能是直接的，或者可能涉及至少一種其它分子，例如接頭。
在一個實施方案中，第一附著位點在核心顆粒中天然存在。此外，也可通過化學(xué)偶聯(lián)或重組技術(shù)添加第一附著位點。優(yōu)選的第一附著位點包括氨基、羧基或巰基。包含第一附著位點的優(yōu)選氨基酸選自賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸和組氨酸。特別優(yōu)選的是賴氨酸殘基。
血管緊張肽或其衍生物上適宜的第二附著位點有胺、酰胺、羧基和巰基。已經(jīng)研制了多種化合物，它們通過與核心顆粒蛋白質(zhì)分子的反應(yīng)性基團(tuán)形成共價鍵，使得肽/蛋白質(zhì)能夠交聯(lián)或者蛋白質(zhì)與衍生化分子能夠偶聯(lián)。
本發(fā)明的包含第一附著位點的核心顆粒包括適于形成有序、重復(fù)陣列的任何顆粒。在一些實施方案中，這類核心顆粒包括病毒樣顆粒(VLP)、噬菌體、噬菌體病毒樣顆粒、菌毛等。在某些實施方案中，包括HBcAg VLP、噬菌體VLP和I型菌毛。本發(fā)明也提供仍然能夠形成有序、重復(fù)結(jié)構(gòu)的核心顆粒的變體形式。變體形式包括核心顆粒的重組及天然形式和突變形式。在某些實施方案中，核心顆粒的突變形式包括第一附著位點的類型或所述位點的數(shù)量與親本不同的形式。核心顆粒上賴氨酸殘基數(shù)量的改變是特別優(yōu)選的。
在某些實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物包含與病毒樣顆粒(VLP)化學(xué)偶聯(lián)的血管緊張肽部分。這樣產(chǎn)生高免疫原性的重復(fù)抗原陣列，它甚至在不使用佐劑的情況下也能夠刺激抗體形成。根據(jù)所使用的血管緊張肽部分的氨基酸序列，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高抗體滴度，而且能夠針對血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的N端或C端特異性誘導(dǎo)。這使得能夠特異性靶向于僅僅一種血管緊張肽或其組合。因此本發(fā)明的免疫原能夠在免疫治療方法中使用，用來治療與RAS產(chǎn)生的血管緊張肽II水平升高有關(guān)的疾病。
本發(fā)明提供包含一種核心顆粒和一種或多種血管緊張肽或血管緊張肽部分的偶聯(lián)物，它適合用來誘發(fā)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明這類偶聯(lián)物和一種或多種其它成分(如一種或多種賦形劑或載體，適當(dāng)?shù)匾环N或多種藥物可接受的賦形劑或載體)的制劑。本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑包括疫苗偶聯(lián)物或制劑，它們含有或不含其它藥物可接受賦形劑或佐劑。例如，本發(fā)明還提供包含免疫有效量的一種或多種本發(fā)明偶聯(lián)物以及藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的疫苗制劑。在另一個實施方案中，疫苗還包含至少一種佐劑，如明礬或弗氏不完全佐劑。本發(fā)明還提供免疫和/或治療動物(優(yōu)選的是哺乳動物，如人)的方法，包括對動物施用免疫有效量的本發(fā)明的偶聯(lián)物或疫苗，從而誘發(fā)針對該偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答。動物可以用本發(fā)明的偶聯(lián)物或制劑通過本領(lǐng)域周知的任何給藥途徑適當(dāng)免疫，包括但不限于皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮膚、經(jīng)粘膜、口服或直接進(jìn)入淋巴結(jié)。鼻內(nèi)免疫是一種特別合適的途徑；這種給藥途經(jīng)不僅能夠產(chǎn)生包括IgA的高抗體滴度(如實施例所述)，而且由于避免了引起疼痛的免疫過程(例如肌肉內(nèi)免疫)，更易于被患者接受，從而改善順應(yīng)性。
本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑誘發(fā)免疫應(yīng)答，包括抗體的產(chǎn)生。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)抗一種或多種血管緊張肽或血管緊張肽部分的抗體的方法。本發(fā)明的這些抗體可用于RAS相關(guān)疾病的治療或預(yù)防，以及血管緊張肽或血管緊張肽部分的檢測，例如與動物組織或循環(huán)中存在的一種或多種RAS成分有關(guān)的疾病的診斷方法。
在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明可用于RAS相關(guān)疾病的預(yù)防或治療，包括但不限于中風(fēng)、梗塞、充血性心力衰竭、腎衰竭、視網(wǎng)膜出血等。用本發(fā)明的偶聯(lián)物或制劑免疫產(chǎn)生針對一種或多種血管緊張肽或血管緊張肽部分的免疫應(yīng)答，致使免疫分子，特別是抗體，與血管緊張肽或血管緊張肽部分結(jié)合。抗體的被動轉(zhuǎn)移也可用于RAS相關(guān)疾病的治療和預(yù)防。
我們發(fā)現(xiàn)，血管緊張肽偶聯(lián)物或與病毒樣顆粒(VLP)附著的血管緊張肽部分的偶聯(lián)物誘導(dǎo)高水平的血管緊張肽特異性的IgG抗體。因此本發(fā)明提供RAS相關(guān)疾病的一種治療劑，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，它以一種有序、重復(fù)的VLP-血管緊張肽/部分偶聯(lián)物為基礎(chǔ)。這種治療劑在接種的動物中能夠誘導(dǎo)高滴度的抗血管緊張肽抗體。甚至在不使用佐劑時也能誘導(dǎo)高滴度抗體，不僅包含IgG亞型，而且包含IgA亞型。而且，令人吃驚的是，這種治療劑與可能的病理性免疫應(yīng)答(如炎癥)的誘發(fā)無關(guān)。本發(fā)明的治療偶聯(lián)物包含至少一種血管緊張肽或血管緊張肽部分和一種VLP，優(yōu)選RNA噬菌體的VLP，或者至少一種血管緊張肽或血管緊張肽部分和另一種核心顆粒，如HBcAg或菌毛。
根據(jù)本領(lǐng)域的知識、下列本發(fā)明的附圖、描述以及權(quán)利要求書，普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的其它實施方案。
附圖簡述

圖1是使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 1、Angio 2、Angio 3或Angio 4肽免疫的小鼠血清中，Angio 1肽和血管緊張肽II特異性IgG抗體的ELISA分析。
圖2是使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 1、Angio 2、Angio 3或Angio 4肽免疫的小鼠血清中，Angio 2肽和血管緊張肽I特異性IgG抗體的ELISA分析。
圖3是使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 5、Angio 6、Angio 7、Angio 8或Angio 9肽免疫的小鼠血清中，Angio 1肽和血管緊張肽II特異性IgG抗體的ELISA分析。
圖4是使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 5、Angio 6、Angio 7、Angio 8或Angio 9肽免疫的小鼠血清中，Angio 2肽和血管緊張肽I特異性IgG抗體的ELISA分析。
發(fā)明詳述定義在下列描述中廣泛使用了大量分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的術(shù)語。為了更清楚、一致地理解本說明書和權(quán)利要求書，包括這些術(shù)語定義的范圍，給出了下列非限制性定義。
主動免疫在此使用時，術(shù)語“主動免疫”是指通過施用免疫原、疫苗、抗原或血管緊張肽-載體偶聯(lián)物引起的，個體(一般是動物)中免疫應(yīng)答的誘發(fā)。相反，被動免疫是指通過向所述個體內(nèi)轉(zhuǎn)移免疫分子或細(xì)胞使該個體具有免疫力。
甲病毒在此使用時，術(shù)語“甲病毒”是指甲病毒屬包括的任何RNA病毒。Strauss和Strauss，Microbiol.Rev.，58491-562(1994)中有關(guān)于該屬成員的描述。甲病毒的例子包括奧拉病毒、畢巴魯病毒、卡巴蘇病毒、屈曲病毒、東部馬腦炎病毒、摩根堡病毒、蓋塔病毒、克孜勒阿加什病毒、馬亞羅病毒、米德爾堡病毒、穆茨布病毒、恩杜姆病毒、皮克孫納病毒、托納特病毒、特里尼蒂病毒、烏納病毒、西部馬腦炎病毒、沃達(dá)羅河病毒、辛德畢斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)和羅斯河病毒。
氨基酸接頭本說明書中的“氨基酸接頭”，也被稱為“接頭”，在此使用時，使抗原或抗原決定簇與第二附著位點結(jié)合，或者更優(yōu)選地，已經(jīng)包含或含有第二附著位點，該位點一般—但不是必需—是一種氨基酸殘基，優(yōu)選的是半胱氨酸殘基。然而，術(shù)語“氨基酸接頭”在此使用時并非意味著這種氨基酸接頭只是由氨基酸殘基組成，盡管由氨基酸殘基組成的氨基酸接頭是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。氨基酸接頭的氨基酸殘基優(yōu)選地包含本領(lǐng)域公知的自然存在的氨基酸或非天然氨基酸，所有L-或所有D-氨基酸或其混合物。然而，本發(fā)明也包括一種氨基酸接頭，其含有一種含巰基或半胱氨酸殘基的分子。該分子優(yōu)選地含有C1-C6烷基、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分。然而，除了氨基酸接頭外，優(yōu)選地含有C1-C6烷基、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分且不含任何氨基酸的接頭也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)?？乖蚩乖瓫Q定簇或任選地第二附著位點與氨基酸接頭之間的結(jié)合優(yōu)選地是通過至少一種共價鍵，更優(yōu)選地是通過至少一種肽鍵。
血管緊張肽部分在此使用時，術(shù)語“血管緊張肽部分”是指能夠作為天然血管緊張肽的免疫模擬物(即，免疫學(xué)模擬的血管緊張肽，從而產(chǎn)生可與天然血管緊張肽結(jié)合的抗體)的任何部分，而無論該部分是否具有體內(nèi)天然血管緊張肽的生物活性(例如受體處的天然激素活性，包括血管緊張肽I和II)。因此，該部分可適當(dāng)包含血管緊張肽，優(yōu)選地血管緊張肽原、血管緊張肽I(一種十肽Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)或血管緊張肽II(一種八肽Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)，或其功能相當(dāng)?shù)淖凅w。因此，“血管緊張肽部分”包括如此處術(shù)語定義的“血管緊張肽”。功能相當(dāng)?shù)淖凅w可包含通過單氨基酸或多氨基酸置換、添加或刪除對血管緊張肽I或II序列的修飾，以及氨基酸殘基被化學(xué)修飾、但仍保留血管緊張肽免疫原活性的序列。這些功能(或免疫學(xué))相當(dāng)?shù)淖凅w可以是天然生物學(xué)變異，或者可利用周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，如化學(xué)合成或修飾、誘變，例如定點或隨機誘變等。對于該定義而言，關(guān)于修飾的一個主要特征是血管緊張肽保留作為天然血管緊張肽的免疫模擬物的能力。因此，例如，一種氨基酸可以用另一種保留了血管緊張肽或其表位的物理化學(xué)特征(例如，在電荷密度、親水性/疏水性、大小和構(gòu)型方面)、因而保留了免疫結(jié)構(gòu)的氨基酸代替。“添加”變體可包括N端或C端融合，以及單個或多個氨基酸的序列內(nèi)插入。缺失可以是序列內(nèi)的，或者可以是N端或C端的截短。優(yōu)選的缺失突變體是那些可以誘導(dǎo)N端、優(yōu)選地誘導(dǎo)C端抗體的突變體。這些抗體可防止活性血管緊張肽II的產(chǎn)生，但仍允許抗體結(jié)合的血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的降解。
血管緊張肽在此使用時，術(shù)語“血管緊張肽”包括所有的、優(yōu)選天然的血管緊張肽及其功能相當(dāng)?shù)淖凅w。因此，“血管緊張肽”可以被認(rèn)為是如此處定義的“血管緊張肽部分”的一部分(subset)。實際上，血管緊張肽(或血管緊張肽部分)的特定變體與一種(優(yōu)選天然)血管緊張肽是否“功能相當(dāng)”，可以用測定血管緊張肽生物活性的多種測定方法來確定。此處描述了一些這樣的測定方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟悉其它方法。
抗體在此使用時，術(shù)語“抗體”是指能夠結(jié)合表位或抗原決定簇的分子。該術(shù)語應(yīng)該包括完整的抗體及其抗原結(jié)合片段，包括單鏈抗體。這些抗體包括人抗原結(jié)合性抗體片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段?？贵w可來源于任何動物，包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選地，抗體是哺乳動物抗體，例如人、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬等，或者其它合適的動物，如雞。在此使用時，“人”抗體包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，包括從人免疫球蛋白文庫分離的抗體，或者來自表達(dá)一種或多種人免疫球蛋白但不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的抗體，如美國專利號5,939,598所述，其公開內(nèi)容在此完整引用作為參考。
抗原在此使用時，術(shù)語“抗原”是指如果由MHC分子呈遞，即能夠被抗體或T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的分子。術(shù)語“抗原”在此使用時也包括T細(xì)胞表位。在MHC I類(存在于除紅細(xì)胞之外的所有體細(xì)胞上)或II類(存在于免疫細(xì)胞上和特定抗原呈遞細(xì)胞內(nèi))分子存在下，T細(xì)胞表位可被T細(xì)胞受體識別。這種識別事件導(dǎo)致T細(xì)胞的活化，及隨后的效應(yīng)機制，如T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌、穿孔素分泌等。另外，抗原能夠被免疫系統(tǒng)識別，并且/或者能夠誘發(fā)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有或連接于TH細(xì)胞表位，并且包含于佐劑中?？乖赡馨环N或多種表位(B和T表位)。上述特異性反應(yīng)是指抗原通常以高選擇性方式優(yōu)選地與其相應(yīng)抗體或TCR反應(yīng)，而不與可能由其它抗原誘導(dǎo)的許多其它抗體或TCR反應(yīng)。此處使用的抗原也可能是幾種不同抗原的混合物。
抗原決定簇在此使用時，術(shù)語“抗原決定簇”是指可被B或T淋巴細(xì)胞特異識別的抗原部分。B淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體與外源性抗原決定簇反應(yīng)，而T淋巴細(xì)胞則是細(xì)胞免疫的介質(zhì)。因此，抗原決定簇或表位是可被抗體識別或者(在MHC存在下)可被T細(xì)胞受體識別的抗原部分?？乖瓫Q定簇包含一個或多個表位。在脊椎動物中，變應(yīng)原也可作為抗原。
連接(association)在此使用時，術(shù)語“連接”當(dāng)用于第一和第二附著位點時，是指第一與第二附著位點優(yōu)選地通過至少一個非肽鍵結(jié)合。連接的性質(zhì)可能是共價、離子、疏水、極性的或其任意組合，優(yōu)選地，連接的性質(zhì)是共價結(jié)合。
第一附著位點在此使用時，短語“第一附著位點”是指非天然或天然來源的核心顆粒的一種元件，位于抗原或抗原決定簇上的第二附著位點可與之連接。第一附著位點可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)或其組合，或者是其化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)。第一附著位點通常且優(yōu)選地位于核心顆粒(優(yōu)選地如病毒樣顆粒)的表面。核心和病毒樣顆粒的表面上分別存在多個第一附著位點，一般是重復(fù)構(gòu)型。
第二附著位點在此使用時，短語“第二附著位點”是指與抗原或抗原決定簇結(jié)合的一種元件，位于核心顆粒和病毒樣顆粒表面的第一附著位點分別可與之連接。抗原或抗原決定簇的第二附著位點可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)或其組合，或者是其化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)?？乖蚩乖瓫Q定簇上存在至少一個第二附著位點。因此，術(shù)語“包含至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇”是指至少含有抗原或抗原決定簇和第二附著位點的抗原或抗原構(gòu)建體。然而，特別是對于非天然來源的第二附著位點(即在抗原或抗原決定簇內(nèi)非天然存在)，這些抗原或抗原構(gòu)建體含有一種“氨基酸接頭”。
結(jié)合(bound)在此使用時，術(shù)語“結(jié)合”是指結(jié)合或附著，它們可能是共價的，例如通過化學(xué)偶聯(lián)，或者是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。共價鍵可以是例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等。術(shù)語“結(jié)合”比術(shù)語如“偶聯(lián)”、“融合”和“附著”范圍更廣，并且包括后者。
外殼蛋白在此使用時，術(shù)語“外殼蛋白”是指噬菌體或RNA噬菌體的蛋白質(zhì)，它們能夠摻入噬菌體或RNA噬菌體的衣殼裝配體中。然而，當(dāng)指RNA噬菌體的外殼蛋白基因的特定基因產(chǎn)物時，使用術(shù)語“CP”。例如，RNA噬菌體Qβ的外殼蛋白基因的特定基因產(chǎn)物被稱為“Qβ CP”，而噬菌體Qβ的“外殼蛋白”包含“Qβ CP”以及A1蛋白。噬菌體Qβ的衣殼主要由Qβ CP組成，含有少量A1蛋白。同樣，VLPQβ外殼蛋白主要含有Qβ CP，以及少量A1蛋白。
核心顆粒在此使用時，術(shù)語“核心顆?！笔侵妇哂泄逃兄貜?fù)組織的剛性結(jié)構(gòu)。此處使用的核心顆?？梢允呛铣煞椒ǖ漠a(chǎn)物或生物學(xué)方法的產(chǎn)物。
有效量在此使用時，術(shù)語“有效量”是指達(dá)到希望的生物學(xué)效應(yīng)的量或必需的量。組合物的有效量是獲得這種選擇結(jié)果的量，此量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)確定。例如，治療免疫系統(tǒng)缺陷的有效量是引起免疫系統(tǒng)激活、在暴露于抗原后產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答所必需的量。該術(shù)語也與“足量”同義。
用于任何具體用途的有效量根據(jù)如下因素而不同，如所治療的疾病或病癥、施用的具體組合物、患者體重和/或疾病或病癥的嚴(yán)重程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)經(jīng)驗確定本發(fā)明的特定組合物的有效量，而不需要過多的實驗。
表位在此使用時，術(shù)語“表位”是指可被單個抗體或T細(xì)胞受體識別的基本組件或最小單位，因而是指所述抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的特定結(jié)構(gòu)域、區(qū)或分子結(jié)構(gòu)。一個抗原可由大量表位組成，而半抗原一般很少含表位。
融合在此使用時，術(shù)語“融合”是指通過編碼性核苷酸序列的框內(nèi)組合，將不同來源的氨基酸序列組合于一條多肽鏈中。除了與多肽鏈的末端之一融合外，術(shù)語“融合”還包括內(nèi)部融合，即將不同來源的序列插入一條多肽鏈內(nèi)。
異源序列在此使用時，術(shù)語“異源序列”是指核酸或蛋白質(zhì)的第二種序列，它不是該核酸或蛋白質(zhì)正常所見，通常是為了賦予特殊的性質(zhì)而人工添加到該序列中。在一個實例中，為了蛋白質(zhì)的純化或作為第一附著位點，可以向重組衣殼蛋白中添加異源氨基酸。
免疫應(yīng)答在此使用時，術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指個體免疫系統(tǒng)針對一種分子或化合物(如抗原)的任何作用。在哺乳動物中，免疫應(yīng)答包括細(xì)胞活性和可溶性分子(如細(xì)胞因子和抗體)的產(chǎn)生。因此該術(shù)語包括導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞的激活或增殖的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，在某些情況下，免疫應(yīng)答可能是低強度的，只有在使用至少一種根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)時才能檢測到?！懊庖咴詣笔侵敢环N試劑，其用來刺激活生物的免疫系統(tǒng)，使得免疫系統(tǒng)的一種或多種功能增強，并且針對該免疫原性劑。“免疫原性肽”是一種引發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的多肽，無論它是單獨的還是與載體相連接，使用或不使用佐劑。
免疫偏離在此使用時，術(shù)語“免疫偏離”是指與預(yù)先存在的免疫應(yīng)答性質(zhì)不同的免疫應(yīng)答的刺激。例如，一個個體，其對一種變應(yīng)原具有TH2免疫應(yīng)答，因而在接觸該變應(yīng)原后產(chǎn)生IgE抗體，可以通過本發(fā)明的實施方案誘導(dǎo)該個體產(chǎn)生針對該變應(yīng)原的TH1免疫應(yīng)答。這種TH1應(yīng)答將消除誘發(fā)TH2應(yīng)答的變態(tài)反應(yīng)，從而緩解變應(yīng)性疾病。
免疫治療在此使用時，術(shù)語“免疫治療”是指用于治療疾病、不適或病癥的偶聯(lián)物。更具體的講，該術(shù)語用來指一種治療方法，其中通過接種產(chǎn)生有益的免疫應(yīng)答。
免疫有效量在此使用時，術(shù)語“免疫有效量”是指當(dāng)導(dǎo)入個體時足以在該個體中誘發(fā)免疫應(yīng)答的偶聯(lián)物的量。達(dá)到免疫有效所需的偶聯(lián)物的量根據(jù)多種因素而不同，包括偶聯(lián)物、偶聯(lián)物中其它成分(例如佐劑)的存在、抗原、免疫途徑、個體、預(yù)先免疫或生理狀態(tài)等。
個體在此使用時，術(shù)語“個體”是指多細(xì)胞生物，包括植物和動物。優(yōu)選的多細(xì)胞生物是動物，更優(yōu)選的是脊椎動物，更加優(yōu)選的是哺乳動物，最優(yōu)選的是人。
分離的在此使用時，當(dāng)術(shù)語“分離的”用于一種分子時，該術(shù)語的含義是，該分子已經(jīng)從其天然環(huán)境中分離。例如，活動物中自然存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是與天然狀態(tài)的共存物質(zhì)分開的相同多核苷酸或多肽是“分離的”。此外，對于本發(fā)明的目的而言，載體中所含的重組DNA分子被認(rèn)為是分離的。分離的RNA分子包括DNA和RNA分子的體內(nèi)或體外RNA復(fù)制產(chǎn)物。分離的核酸分子還包括通過合成生產(chǎn)的分子。另外，重組宿主細(xì)胞中所含的載體分子也是分離的。因此，不是所有“分離的”分子都需要“純化”。
免疫治療劑在此使用時，術(shù)語“免疫治療劑”是一種偶聯(lián)物，其包含免疫分子和/或引發(fā)免疫應(yīng)答，用于疾病或不適的治療。
個體在此使用時，術(shù)語“個體”是指多細(xì)胞生物，包括植物和動物。優(yōu)選的多細(xì)胞生物是動物，更優(yōu)選的是脊椎動物，更加優(yōu)選的是哺乳動物，最優(yōu)選的是人。
低或不可檢測的在此使用時，當(dāng)短語“低或不可檢測的”用于基因表達(dá)水平時，是指表達(dá)水平顯著低于基因最大誘導(dǎo)時所見的水平(例如至少低5倍)，或者用下文實施例部分所述方法不易檢測到。
凝集素在此使用時，是指特別是從豆科植物種子獲得的，以及來自其它多種植物和動物來源的蛋白質(zhì)，它們具有特定單糖或寡糖的結(jié)合位點。實例包括伴刀豆球蛋白A和麥胚凝集素，它們在糖蛋白研究中廣泛用作分析和制備性試劑。
模擬位在此使用時，術(shù)語“模擬位”是指可誘發(fā)對一種抗原或抗原決定簇的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。術(shù)語模擬位通常用于特定抗原。例如，引起產(chǎn)生抗磷脂酶A2(PLA2)抗體的一種肽是與該抗體結(jié)合的抗原決定簇的一種模擬位。一種模擬位與一種抗原或抗原決定簇(誘發(fā)對它的免疫應(yīng)答)可能有基本的結(jié)構(gòu)相似性或有共同的結(jié)構(gòu)特征，或者可能沒有?？烧T發(fā)對特定抗原或抗原決定簇的免疫應(yīng)答的模擬位，其生產(chǎn)和鑒定方法在本領(lǐng)域公知，并在本文其它部分描述。
突變蛋白在此使用時，術(shù)語“突變蛋白”是指與給定參照(例如天然、野生型等)多肽相比有一個或多個氨基酸不同的蛋白質(zhì)或多肽。
天然來源在此使用時，術(shù)語“天然來源”是指其全部或部分不是合成的，而是自然存在或產(chǎn)生的。優(yōu)選地，在此使用時，術(shù)語“天然來源”是指全部不是合成的，而是自然存在或產(chǎn)生的。
非天然的在此使用時，該術(shù)語通常是指并非來源于自然，更具體而言，該術(shù)語是指來自人工的。
非天然分子支架在此使用時，短語“非天然分子支架”是指用來提供第一附著位點的剛性、重復(fù)陣列的人工制成的任何產(chǎn)物。理想地但不是必須地，這些第一附著位點為幾何順序。非天然分子支架的部分或全部可以是有機或無機的，可以是化學(xué)合成或通過生物學(xué)方法合成的。非天然分子支架包括(a)天然或非天然來源的核心顆粒；和(b)至少一個第一附著位點。非天然來源在此使用時，術(shù)語“非天然來源”通常是指合成的或并非來源于自然的；更具體而言，該術(shù)語是指來自人工的。
有序、重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列在此使用時，術(shù)語“有序、重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列”通常是指抗原或抗原決定簇的重復(fù)模式，其特征在于抗原或抗原決定簇分別相對于核心顆粒和病毒樣顆粒的典型且優(yōu)選地均勻空間排列。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種重復(fù)模式可能是一種幾何模式。合適的有序、重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列的典型和優(yōu)選實例具有抗原或抗原決定簇的嚴(yán)格重復(fù)的類結(jié)晶排列，優(yōu)選地具有0.5-30納米的間隔，該間隔優(yōu)選為5-15納米。
被動免疫在此使用時，術(shù)語“被動免疫”是指通過任何途徑向動物體內(nèi)施以外源產(chǎn)生的免疫分子(例如抗體)或細(xì)胞(例如T細(xì)胞)。被動免疫不同于“主動”免疫，后者是通過向個體內(nèi)導(dǎo)入免疫原、疫苗、抗原或半抗原-載體偶聯(lián)物，引發(fā)免疫應(yīng)答而獲得免疫。
菌毛在此使用時，術(shù)語“菌毛”是指細(xì)菌細(xì)胞的胞外結(jié)構(gòu)，它由蛋白質(zhì)單體(例如菌毛單體)組成，這些單體組成有序、重復(fù)的模式。此外，菌毛也是與多種過程有關(guān)的結(jié)構(gòu)，如細(xì)菌細(xì)胞與宿主細(xì)胞表面受體的附著、細(xì)胞間基因交換和細(xì)胞-細(xì)胞識別。菌毛的例子包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。菌毛的其它實例在本文其它部分描述。
菌毛樣結(jié)構(gòu)在此使用時，短語“菌毛樣結(jié)構(gòu)”是指具有類似于菌毛結(jié)構(gòu)的特征、由蛋白質(zhì)單體組成的結(jié)構(gòu)。“菌毛樣結(jié)構(gòu)”的一個實例是表達(dá)修飾的菌毛蛋白的一種細(xì)菌細(xì)胞形成的一種結(jié)構(gòu)，這種修飾的菌毛蛋白不形成與天然菌毛基本相同的有序、重復(fù)陣列。
多肽在此使用時，術(shù)語“多肽”是指由氨基酸殘基(通常是天然氨基酸殘基)通過肽鍵連接在一起組成的聚合體。多肽不一定有大小限制，包括蛋白質(zhì)和肽。肽是一般大小約5-約50個氨基酸的、或該范圍內(nèi)任何數(shù)量氨基酸的多肽。然而，肽也可具有更長的長度，例如可達(dá)120-150個氨基酸。
蛋白質(zhì)在此使用時，術(shù)語蛋白質(zhì)是指大小通常超過約5個或更多、10個或更多、20個或更多、25個或更多、50個或更多、75個或更多、100個或更多、200個或更多、500個或更多、1000個或更多、2000個或更多氨基酸的多肽。盡管不是必需，蛋白質(zhì)通常具有確定的三維結(jié)構(gòu)，通常被稱為折疊的，不同于通常不具有確定三維結(jié)構(gòu)的肽和多肽，后者能采取大量不同的構(gòu)象，被稱為非折疊的。然而，肽也可能具有確定的三維結(jié)構(gòu)。
純化的在此使用時，當(dāng)術(shù)語“純化的”用于分子時，是指相對于在其自然環(huán)境或其產(chǎn)生、發(fā)現(xiàn)或合成的環(huán)境中與之結(jié)合的分子，純化分子的濃度提高。自然結(jié)合的分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類和糖，但通常不包括水、緩沖液和為了保持純化分子的完整性或便于純化而添加的試劑。例如，即使在oligo dT柱層析過程中用水溶劑稀釋mRNA，如果自然結(jié)合的核酸和其它生物分子不與該柱結(jié)合，并且與所述mRNA分子分開，則該mRNA分子通過這種層析被純化。根據(jù)此定義，相對于污染物，一種物質(zhì)的純度可能是5％或以上、10％或以上、20％或以上、30％或以上、40％或以上、50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％。
受體在此使用時，術(shù)語“受體”是指能夠與被稱為配體的另外一種分子相互作用的蛋白質(zhì)或糖蛋白或其片段。配體可以屬于任何類別的生物化學(xué)或化學(xué)化合物。受體不一定必須是膜結(jié)合蛋白。可溶性蛋白質(zhì)，例如麥芽糖結(jié)合蛋白或視黃醇結(jié)合蛋白，也是受體。
殘基在此使用時，術(shù)語“殘基”是指多肽骨架或側(cè)鏈內(nèi)的具體氨基酸。
重組宿主細(xì)胞在此使用時，術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”是指已經(jīng)導(dǎo)入一種或多種本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞，包括哺乳動物、昆蟲、植物、鳥類、酵母的細(xì)胞；原核細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。
重組病毒在此使用時，短語“重組病毒”是指人工基因修飾的病毒。該短語覆蓋本領(lǐng)域所知的任何病毒。更具體而言，該短語是指一種人工基因修飾的甲病毒，最具體來說，該短語是指人工基因修飾的辛德畢斯病毒。
RNA-噬菌體在此使用時，術(shù)語“RNA-噬菌體”是指感染細(xì)菌的RNA病毒，更具體而言，是指感染細(xì)菌的單鏈正義RNA病毒。
載體在此使用時，術(shù)語“載體”是指用來向宿主細(xì)胞傳遞遺傳物質(zhì)的物質(zhì)(例如質(zhì)?；虿《?。載體可以由DNA或RNA組成。
病毒樣顆粒(VLP)在此使用時，術(shù)語“病毒樣顆?！笔侵敢环N類似于病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。而且，根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復(fù)制性和非傳染性的，因為它缺乏全部或部分病毒基因組，特別是病毒基因組的復(fù)制性和傳染性部分。根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核酸。根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒的一個典型且優(yōu)選的實施方案是病毒衣殼，如相應(yīng)病毒、噬菌體或RNA-噬菌體的病毒衣殼。術(shù)語“病毒衣殼”或“衣殼”在此可以互換使用，是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體。一般且優(yōu)選地，病毒蛋白質(zhì)亞單位被分別裝配為病毒衣殼和衣殼，它們具有固有重復(fù)組織的結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)一般是球形或管狀。例如，RNA-噬菌體或HBcAg的衣殼是二十面體對稱的球形。在此使用時，術(shù)語“衣殼樣結(jié)構(gòu)”是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體，它在上述方面類似于衣殼的形態(tài)，但是不同于典型的對稱裝配體，而保持了足夠程度的順序和重復(fù)性。
噬菌體的病毒樣顆粒在此使用時，術(shù)語“噬菌體的病毒樣顆?！笔侵割愃朴谑删w結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒，它是非復(fù)制性和非傳染性的，至少缺乏編碼噬菌體復(fù)制機制的基因，一般也缺乏編碼負(fù)責(zé)病毒附著或進(jìn)入宿主的蛋白質(zhì)的基因。然而，該定義也包括上述基因仍然存在但是無活性的噬菌體病毒樣顆粒，于是也產(chǎn)生非復(fù)制性和非傳染性的噬菌體病毒樣顆粒。
RNA噬菌體外殼蛋白的VLP由RNA噬菌體外殼蛋白的180個亞單位自裝配而成、任選地含有宿主RNA的衣殼結(jié)構(gòu)，被稱為“RNA噬菌體外殼蛋白的VLP”。一個具體實例是Qβ外殼蛋白的VLP。在此特定情況中，Qβ外殼蛋白的VLP可能僅僅由Qβ CP亞單位裝配而成(通過一種Qβ CP基因的表達(dá)產(chǎn)生，該基因含有例如一個TAA終止密碼子，通過抑制阻止更長A1蛋白的表達(dá)，參見Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))，或者在衣殼裝配體中還含有A1蛋白亞單位。
病毒顆粒術(shù)語“病毒顆粒”在此使用時是指病毒的形態(tài)學(xué)形式。一些病毒類型含有一個由蛋白質(zhì)衣殼圍繞的基因組；其它的具有附加結(jié)構(gòu)(例如包膜、尾等)。
一種(個)術(shù)語“一種(個)”在本公開內(nèi)容中使用時，除非另外說明，是指“至少一種(個)”或“一種(個)或一種(個)以上”。
在此使用時，當(dāng)涉及任何數(shù)值時，術(shù)語“大約”是指所述數(shù)值±10％(例如，“約50℃”包括45℃-55℃的溫度范圍；同樣，“約100mM”包括90mM-110mM的濃度范圍)。
概述如今，我們已經(jīng)研制了用來誘導(dǎo)血管緊張肽特異性抗體的強免疫原，它們甚至在不使用佐劑時仍然有效，并且能夠特異性地靶向于血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II。這些免疫原由與病毒樣顆粒(VLP)或其它核心顆粒(如細(xì)菌菌毛或菌毛樣顆粒)結(jié)合的血管緊張肽部分組成。這樣產(chǎn)生高免疫原性的重復(fù)抗原陣列，它甚至不使用佐劑即能刺激抗體形成。根據(jù)所使用的血管緊張肽部分的氨基酸序列，高抗體滴度能夠被誘導(dǎo)，而且能夠針對血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的N端或C端特異性誘導(dǎo)。這使得能夠特異性地靶向于僅僅一種血管緊張肽或其組合。因此本發(fā)明的免疫原能夠在免疫治療方法中使用，用來治療與血管緊張肽部分、特別是RAS產(chǎn)生的血管緊張肽II及其衍生物水平升高有關(guān)的病癥。
本發(fā)明的偶聯(lián)物的形成，即通過附著、連接、融合或其它結(jié)合(包括共價鍵和非共價鍵)實現(xiàn)將一種或多種血管緊張肽部分與核心顆粒(例如VLP)結(jié)合。在一個實施方案中，VLP含有第一附著位點，有機分子含有第二附著位點。有機分子的結(jié)合通過第一與第二附著位點直接連接或經(jīng)第三種分子連接而實現(xiàn)。附著位點可能天然存在，或者可能是導(dǎo)入的。
使用血管緊張肽部分與核心顆粒的偶聯(lián)物，或者使用包含本發(fā)明提供的這些偶聯(lián)物的制劑免疫動物，誘發(fā)針對所展示的血管緊張肽部分的強免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑可用于刺激針對多種血管緊張肽部分或其衍生物的免疫應(yīng)答，因而可用于動物。本發(fā)明也涉及一種疫苗，其包含免疫有效量的一種或多種本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑，以及藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑能夠用來接種動物對抗一種或多種血管緊張肽部分或其衍生物。這種接種能夠用于預(yù)防或治療目的，或者用于這兩種目的。在一個相關(guān)方面，產(chǎn)生的針對這些偶聯(lián)物或制劑的免疫分子，如抗體，可用于疾病、病癥或不適的治療、預(yù)防或診斷。這些抗體、偶聯(lián)物和本發(fā)明的偶聯(lián)物也可用作試劑盒的成分。
因此，一方面，本發(fā)明提供一種或多種血管緊張肽部分與一種載體以有序、重復(fù)的血管緊張肽部分-載體偶聯(lián)物形式的偶聯(lián)物，以及制備這種偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明也提供包含至少一種本發(fā)明的偶聯(lián)物和至少一種其它成分(適當(dāng)?shù)?，至少一種賦形劑或載體，特別是至少一種藥物可接受的賦形劑或載體)的制劑。本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑可用于誘發(fā)針對血管緊張肽部分的免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答能夠用來產(chǎn)生可用于治療、預(yù)防和診斷目的的抗體。
本發(fā)明的偶聯(lián)物包含一種或多種血管緊張肽部分的高度有序、重復(fù)的陣列。根據(jù)本發(fā)明該方面的偶聯(lián)物陣列包含(a)核心顆粒，其包含第一附著位點，(b)血管緊張肽部分，其包含第二附著位點，其中成分(a)和(b)通過第一和第二附著位點連接，形成所述有序、重復(fù)的血管緊張肽部分陣列。
適于在本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑中使用的核心顆?？梢允翘烊坏幕蚴欠翘烊坏?。在本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑中使用的天然核心顆粒包括病毒顆粒、病毒樣顆粒和菌毛。這些天然核心顆粒的蛋白質(zhì)可以是天然的或是重組的。核心顆粒上的第一附著位點可以是自然存在的，或者可以通過化學(xué)或重組方法導(dǎo)入的。在本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑中使用的血管緊張肽部分適于誘發(fā)針對RAS多種成分(即多種血管緊張肽部分或其衍生物)的免疫應(yīng)答，包括但不限于血管緊張肽，優(yōu)選地包含或者由下列序列或其片段組成血管緊張肽原、血管緊張肽I(式Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu的十肽)或血管緊張肽II(式Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe的八肽)，或其功能相當(dāng)?shù)淖凅w，包括本文其它部分所述的血管緊張肽部分。血管緊張肽部分上的第二附著位點可以自然存在或被導(dǎo)入。第一與第二附著位點之間的相互作用可能是直接的，或者可能涉及至少一種其它分子，例如接頭。此外，第一和第二附著位點的連接也可以根據(jù)本發(fā)明使用交聯(lián)分子。除了接頭之外一般還使用交聯(lián)分子。
本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑在誘發(fā)針對多種血管緊張肽部分的免疫應(yīng)答、特別是抗體方面驚人地有效。因此，可以在適于免疫動物的偶聯(lián)物中使用，用于治療或預(yù)防RAS相關(guān)疾病、不適或病癥，包括但不限于高血壓、中風(fēng)、梗塞、充血性心力衰竭、腎衰竭或視網(wǎng)膜出血。本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑免疫產(chǎn)生的抗體也可用于治療或預(yù)防目的。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑治療和預(yù)防一種疾病的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供適于診斷和篩選的試劑盒。
具有有序、重復(fù)陣列的偶聯(lián)物本發(fā)明提供偶聯(lián)物和偶聯(lián)物的制劑，其中包含一種或多種血管緊張肽部分的有序、重復(fù)陣列。此外，本發(fā)明使技術(shù)人員能夠方便地構(gòu)建用于不同目的的有序、重復(fù)陣列，優(yōu)選地誘發(fā)針對一種或多種血管緊張肽部分或其衍生物的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的偶聯(lián)物基本包含或由下列兩種成分組成(1)非天然分子支架；和(2)至少一種血管緊張肽部分，其含有至少一個第二附著位點，該位點能夠通過至少一個鍵與所述第一附著位點結(jié)合。
非天然分子支架包含或者由下列成分組成(a)核心顆粒，其選自(1)非天然來源的核心顆粒，和(2)天然來源的核心顆粒；(b)至少一個第一附著位點，它通過至少一個共價鍵與所述核心顆粒連接。在本發(fā)明的偶聯(lián)物、制劑和方法中使用的核心顆粒包括無機分子、病毒顆粒、病毒樣顆粒和細(xì)菌菌毛。在本發(fā)明的偶聯(lián)物、制劑和方法中使用的血管緊張肽部分含有至少一個第二附著位點，其選自(a)血管緊張肽部分內(nèi)非自然存在的附著位點；和(b)血管緊張肽部分內(nèi)自然存在的附著位點。
本發(fā)明提供一種有序、重復(fù)的陣列，它是由第二附著位點與第一附著位點通過至少一個鍵連接而形成的。因此，通過第一和第二附著位點的這種連接，血管緊張肽部分和非天然分子支架結(jié)合在一起，形成一種有序、重復(fù)的抗原陣列。
技術(shù)人員可以特異地設(shè)計血管緊張肽部分和第二附著位點，使得與非天然分子支架(或者在某些實施方案中，與核心顆粒)結(jié)合的所有血管緊張肽部分均一排列。例如，可以將單一的第二附著位點置于血管緊張肽部分上，從而通過設(shè)計確保與非天然分子支架附著的所有血管緊張肽部分均一排列。在本發(fā)明的一個方面，在血管緊張肽部分序列的C端或N端添加一個或多個其它氨基酸(形成非自然存在的第二附著位點)，以確保尤其與根據(jù)本發(fā)明的核心顆粒定向、有序的結(jié)合。因此，本發(fā)明提供一種便利的方法，用來將任何血管緊張肽部分以確定的順序和形成重復(fù)模式的方式置于非天然分子支架上。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，本發(fā)明的某些實施方案涉及使用重組核酸技術(shù)，如克隆、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA和RNA的純化、重組蛋白在原核和真核細(xì)胞中的表達(dá)等。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在發(fā)表的實驗室方法手冊中常見(例如，Sambrook，J.等人編著，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人編著，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。使用組織培養(yǎng)細(xì)胞系工作的基本實驗室技術(shù)(Celis，J.編著，《細(xì)胞生物學(xué)》，AcademicPress，第二版，(1988))和基于抗體的技術(shù)(Harlow，E.和Lane，D.，《抗體實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白質(zhì)純化指南”，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白質(zhì)純化原理與實踐》，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))在文獻(xiàn)中也有大量描述，全部在此引用作為參考。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知將有機分子與氨基酸偶聯(lián)的技術(shù)，和制備含有適當(dāng)?shù)诙街稽c(如實施本發(fā)明所必需)的血管緊張肽部分衍生物的方法。這些方法在化學(xué)教科書和公開文獻(xiàn)中可見，其實例包括如下文獻(xiàn)，在此引用作為參考美國專利號5,876,727；WO99/61054；Isomura，S.等人，J.Org.Chem.664115-4121(2001)；Matsushita，H.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.571006-1010(1974)；Langone，J.L.和Van Vunakis，H.，Methods Enzymol.84628-640(1982)；Wong，《蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)的化學(xué)》.CRC Press，Inc.，BocaRaton，F(xiàn)la(1991)。
核心顆粒與非天然分子支架在一個實施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)成一種或多種血管緊張肽部分的有序、重復(fù)陣列的方法。根據(jù)本發(fā)明，通過核心顆粒與一種或多種血管緊張肽部分通過第一和第二附著位點結(jié)合產(chǎn)生。
因此，某些情況下，本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑中的一種組分是非天然分子支架，其包含或由核心顆粒和一個第一附著位點組成。更具體而言，非天然分子支架包含或由下列成分組成(a)天然或非天然來源的核心顆粒，(b)通過至少一個共價鍵與核心顆粒連接的至少一個第一附著位點。
核心顆粒。在本發(fā)明的一個實施方案中，核心顆粒是一種合成聚合物、脂質(zhì)微團(tuán)或金屬。這類核心顆粒在本領(lǐng)域周知，為建立本發(fā)明的新型非天然分子支架提供基礎(chǔ)。例如，美國專利號5,770,380和美國專利號5,334,394公開了合成聚合物或金屬核心顆粒，在此完整引用作為參考。合適的金屬包括但不限于鉻、銣、鐵、鋅、硒、鎳、金、銀、鉑。合適的陶瓷材料包括但不限于二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋁、氧化釕和氧化錫。該實施方案的核心顆?？梢杂捎袡C材料制成，包括但不限于碳和適當(dāng)?shù)木酆衔铮ň郾揭蚁?、尼龍和硝酸纖維素。對于納米晶體顆粒，可以使用由氧化錫、二氧化鈦或碳(鉆石)制成的顆粒。用于本發(fā)明的脂質(zhì)微團(tuán)通過本領(lǐng)域周知的任何方法制備，例如，Baiselle和Millar(Biophys.Chem.4355-361(1975))或Corti等人(Chem.Phys.Lipids 38197-214(1981))或Lopez等人(FEBS Lett.426314-318(1998))或Topchieva和Karezin(J.Colloid Interface Sci.21329-35(1999))或Morein等人(Nature 308457-460(1984))，在此完整引用作為參考。
在本發(fā)明的一個實施方案中，核心顆粒通過生物學(xué)方法生產(chǎn)，可以是天然的或非天然的。例如，病毒和細(xì)菌菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)由可組織為有序、重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)構(gòu)成。因此，本發(fā)明包括包含有用的核心顆粒的偶聯(lián)物、制劑和方法，這些核心顆粒包括但不限于病毒、病毒樣顆粒、細(xì)菌菌毛、噬菌體、病毒衣殼顆?；蚱淦?。在某些這樣的實施方案中，蛋白質(zhì)可以是重組的。
在某些實施方案中，非天然分子支架的核心顆粒包括病毒、細(xì)菌菌毛、由細(xì)菌菌毛蛋白構(gòu)成的結(jié)構(gòu)、噬菌體、病毒樣顆粒、病毒衣殼顆?；蚱渲亟M形式?？梢赃x擇本領(lǐng)域周知的具有有序、重復(fù)外殼和/或核心蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何病毒，在本發(fā)明的方法、偶聯(lián)物和制劑中作為非天然分子支架使用。合適的病毒的實例包括但不限于辛德畢斯病毒和其它甲病毒，棒狀病毒(例如水泡性口膜炎病毒)，微小RNA病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)，披膜病毒(例如風(fēng)疹病毒)，正粘病毒(例如索戈托病毒、貝特肯病毒、家禽瘟疫病毒)，多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)，細(xì)小病毒，輪狀病毒，噬菌體Qβ，噬菌體R17，噬菌體M11，噬菌體MX1，噬菌體NL95，噬菌體fr，噬菌體GA，噬菌體SP，噬菌體MS2，噬菌體f2，噬菌體PP7，噬菌體AP205，諾瓦克病毒，口蹄疫病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，乙型肝炎病毒，煙草花葉病毒，獸棚病毒，和人乳頭瘤病毒(例如，參見Bachman，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today17553-558(1996)中的表1)。在本發(fā)明的一個更具體的代表性實施方案中，核心顆?？砂蛴上铝谐煞纸M成重組輪狀病毒蛋白，重組諾瓦克病毒蛋白，重組甲病毒蛋白，可形成細(xì)菌菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的重組蛋白，重組口蹄疫病毒蛋白，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白，重組乙型肝炎病毒蛋白(例如HBcAg)，重組煙草花葉病毒蛋白，重組獸棚病毒蛋白，和重組人乳頭瘤病毒蛋白。
在本發(fā)明的偶聯(lián)物、制劑和方法中使用的核心顆粒還可包含或由下列成分組成這些蛋白質(zhì)的一種或多種片段，以及這些蛋白質(zhì)的變體，它們?nèi)员Ａ舯舜私Y(jié)合形成有序、重復(fù)抗原或抗原決定簇陣列的能力。例如，如共同所有的共同未決的美國專利申請?zhí)?0/050.902(2002年1月18日提交，其公開內(nèi)容在此完整引用作為參考)所述，核心顆粒可以由人HBcAg的變體形式構(gòu)成，這種變體在氨基酸序列同一性和相似性和序列長度上與野生型顆粒顯著不同。例如，感染雪鵝和鴨的乙型肝炎病毒HBcAg的氨基酸序列與感染哺乳動物的病毒的HBcAg十分不同，以致難以進(jìn)行蛋白質(zhì)比對。然而，這兩種病毒都保留了適于形成有序、重復(fù)的抗原陣列的核心結(jié)構(gòu)的能力。類似地，在除去N端前導(dǎo)序列，進(jìn)一步對序列進(jìn)行缺失、置換或添加之后，HBcAg可以保留形成多聚顆粒(通常是病毒顆粒)的能力。能夠確定蛋白質(zhì)是否形成這種結(jié)構(gòu)的方法包括凝膠過濾、瓊脂糖凝膠電泳、蔗糖梯度離心和電子顯微鏡檢查(例如，Koschel，M.等人，J.Virol.732153-2160(1999))。
第一附著位點。無論是天然的還是非天然的，在本發(fā)明的偶聯(lián)物、制劑和方法中使用的核心顆粒通常含有一種成分，該成分包含一個第一附著位點，該位點通過至少一個共價鍵與天然或非天然核心顆粒附著。包含第一附著位點的組分以非隨機方式與核心顆粒結(jié)合，為產(chǎn)生有序、重復(fù)的陣列提供了一個核化位點。理想地但不是必須地，該組分與核心顆粒以幾何順序結(jié)合。第一附著位點可以是核心顆粒的天然部分，如適合與第二附著位點偶聯(lián)的表面暴露的氨基酸殘基。例如，賴氨酸和半胱氨酸可通過氨基酸上的反應(yīng)性基團(tuán)形成非肽鍵。此外，也可以通過化學(xué)偶聯(lián)或通過設(shè)計重組分子，將含有第一附著位點的組分導(dǎo)入核心顆粒內(nèi)。第一附著位點可以是通過至少一個共價鍵與核心顆粒結(jié)合的任何組分，或者存在于該組分上。
第一附著位點可包含或由下列成分組成蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸(即蛋白質(zhì)、多肽或肽的殘基)、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲磺酰氟)或其組合，或者是其化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)。在一個更具體的實施方案中，第一附著位點包括抗原、抗體或抗體片段、生物素、親和素、鏈霉親和素、受體、受體配體、配體、配體結(jié)合蛋白、相互作用亮氨酸拉鏈多肽、氨基、氨基反應(yīng)性的化學(xué)基團(tuán)；羧基，羧基反應(yīng)性的化學(xué)基團(tuán)，巰基，巰基反應(yīng)性的化學(xué)基團(tuán)，或其組合。
在一個實施方案中，本發(fā)明通過基因工程改造一種病毒產(chǎn)生有序、重復(fù)病毒包膜蛋白與包含第一附著位點的組分的融合，該組分包括異源蛋白質(zhì)、肽、抗原決定簇或選擇的反應(yīng)性氨基酸殘基。在非天然分子支架的構(gòu)建中可以使用本領(lǐng)域公知的其它遺傳操作；例如，希望通過基因突變限制重組病毒的復(fù)制能力。為了與含有第一附著位點的蛋白質(zhì)融合而選擇的病毒蛋白應(yīng)當(dāng)具有有序、重復(fù)的結(jié)構(gòu)。這種有序、重復(fù)結(jié)構(gòu)包括在病毒表面上間距為0.5-30nm、優(yōu)選5-15nm的類晶體結(jié)構(gòu)。這類融合蛋白的產(chǎn)生將在病毒表面產(chǎn)生多個有序、重復(fù)的第一附著位點。因此，由此產(chǎn)生的第一附著位點的有序、重復(fù)的結(jié)構(gòu)反映了天然病毒蛋白的正常組織結(jié)構(gòu)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，第一附著位點可以是任何合適的蛋白質(zhì)、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次級代謝物或其組合，或是它們的一部分，它們可用來使選擇的抗原或抗原決定簇與非天然分子支架特異附著。在一個實施方案中，附著位點是一種可選自本領(lǐng)域所知的蛋白質(zhì)或肽。例如，第一附著位點可以是配體、受體、凝集素、親和素、鏈霉親和素、生物素、表位如HA或T7標(biāo)簽、Myc、Max、免疫球蛋白域和本領(lǐng)域公知可以用作第一附著位點的其它任何氨基酸序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)一步理解，在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以在產(chǎn)生攜帶第一附著位點(例如蛋白質(zhì)或多肽)的組分后產(chǎn)生第一附著位點，該組分用于構(gòu)建與衣殼蛋白的框內(nèi)融合。例如，一種蛋白質(zhì)可以用來與包膜蛋白融合，其含有已知以特定方式糖基化的氨基酸序列，添加的糖部分然后可以作為病毒支架的第一附著位點，與作為抗原的第二附著位點的凝集素結(jié)合。此外，一種序列也可以在體內(nèi)被生物素標(biāo)記，生物素部分可以作為本發(fā)明的第一附著位點，或者序列可以在體外進(jìn)行氨基酸殘基的不同化學(xué)修飾，該修飾作為第一附著位點。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，第一附著位點是與乙型肝炎衣殼(核心)蛋白(HBcAg)框內(nèi)融合的JUN-FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，也可以在融合蛋白構(gòu)建體中使用其它病毒衣殼蛋白以定位本發(fā)明的非天然分子支架中的第一附著位點。例如，在本發(fā)明的其它實施方案中，選擇第一附著位點為與HBcAg框內(nèi)融合的賴氨酸或半胱氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解，在融合蛋白構(gòu)建體中也可以使用其它病毒衣殼或病毒樣顆粒以定位本發(fā)明的非天然分子支架中的第一附著位點。
病毒顆粒。在本發(fā)明的一個實施方案中，非天然分子支架是一種重組甲病毒，更具體而言，是一種重組辛德畢斯病毒。甲病毒科的幾個成員，辛德畢斯病毒(Xiong，C.等人，Science 2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(Liljestrm，P.& Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology 171189-204(1989))，在作為多種不同蛋白質(zhì)的基于病毒的表達(dá)載體(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))以及作為疫苗研制的候選物方面已經(jīng)受到極大關(guān)注。甲病毒在異源蛋白質(zhì)表達(dá)和疫苗研制中的用途已經(jīng)公開(參見美國專利號5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245；5,814,482；其公開內(nèi)容在此完整引用作為參考)。根據(jù)本發(fā)明該方面的甲病毒支架的構(gòu)建可以用本領(lǐng)域周知的重組DNA技術(shù)進(jìn)行，如上述文章所述，在此引用作為參考。能夠使用多種重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)基于病毒的核心顆粒，用于一種或多種血管緊張肽部分的附著。
包裝的RNA序列也能夠用來感染宿主細(xì)胞。這些包裝的RNA序列能夠通過添加到培養(yǎng)基中而導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。例如，在大量資料中描述了非傳染性甲病毒顆粒的制備，包括“辛德畢斯表達(dá)系統(tǒng)”，C版(Invitrogen Corporation，Carlsbad CA；目錄號K750-1)。
當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞作為重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)基于病毒的核心顆粒時，這些細(xì)胞通常在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中眾所周知(參見，例如Celis，J.編著，《(細(xì)胞生物學(xué)》，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等人編著，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人編著，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《動物細(xì)胞培養(yǎng)》，Alan R.Liss，Inc.(1993))。
本發(fā)明包括基于病毒的核心顆粒，其包含或由下列成分組成病毒、病毒樣顆粒、噬菌體、病毒衣殼顆?；蚱渲亟M形式。通常，熟練技術(shù)人員知道如何生產(chǎn)這些核心顆粒以及與第一附著位點附著。WO00/32227的實施例17-22公開了生產(chǎn)乙型肝炎病毒樣顆粒(特別是由HBcAg裝配或自裝配的)和麻疹病毒衣殼顆粒作為核心顆粒，在此引用作為參考。在這些實施方案中，可以用JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域或FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域作為本發(fā)明的非天然分子支架的第一附著位點。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道如何構(gòu)建攜帶含反應(yīng)性賴氨酸殘基之框內(nèi)融合肽的乙型肝炎核心顆粒，和攜帶基因融合的半胱氨酸殘基的血管緊張肽部分，分別作為第一和第二附著位點。
在其它實施方案中，在本發(fā)明的偶聯(lián)物中使用的核心顆粒由乙型肝炎衣殼(核心)蛋白(HBcAg)、HBcAg的片段或能夠形成病毒樣顆粒的其它蛋白質(zhì)或肽組成，它們是有序的陣列，已經(jīng)被修飾除去了游離半胱氨酸殘基或減少了其數(shù)量。Zhou等人(J.Virol.665393-5398(1992))證實，經(jīng)修飾除去自然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg保留結(jié)合并形成多聚體結(jié)構(gòu)的能力。因此，適于在本發(fā)明的偶聯(lián)物中使用的核心顆粒包括包含修飾的HBcAg或其片段的核心顆粒，其中一個或多個自然存在的半胱氨酸殘基已經(jīng)被刪除或被置換為另一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。在本發(fā)明的一個實施方案中，用包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的修飾的HBcAg或其亞部分制備非天然分子支架。具體而言，適用于本發(fā)明的修飾的HBcAg包含如下蛋白質(zhì)其中在對應(yīng)于具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的位點48、61、107、185的位點處，一個或多個半胱氨酸殘基已經(jīng)被刪除或被置換為其它氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在含有不同于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的HBcAg變體中，位于相似位點的半胱氨酸殘基也可能被刪除或被置換為其它氨基酸殘基。然后可以用修飾的HBcAg變體制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。
在某些情況下(例如，當(dāng)使用異雙功能交聯(lián)劑附著一個或多個血管緊張肽部分和非天然分子支架時)，認(rèn)為HBcAg中存在游離半胱氨酸殘基使得毒性成分與核心顆粒共價偶聯(lián)，以及單體交聯(lián)形成不確定的形式。另外，在許多情況中，對本發(fā)明偶聯(lián)物進(jìn)行的測定可能無法檢測到這些毒性成分。這是因為毒性成分與非天然分子支架的共價偶聯(lián)將導(dǎo)致形成一群不同的形式，其中毒性成分與HBcAg的不同半胱氨酸殘基連接，或者在某些情況下與HBcAg的非半胱氨酸殘基連接。換句話說，不是每個HBcAg的每個游離半胱氨酸殘基將與毒性成分共價連接。此外，在許多情況下，特定HBcAg的半胱氨酸殘基均不與毒性成分連接。因此，這些毒性成分的存在可能難以檢測，因為它們會混合在分子群中。然而，對個體施用包含毒性成分的HBcAg形式可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。
本領(lǐng)域眾所周知，游離半胱氨酸殘基能夠參與大量化學(xué)副反應(yīng)。這些副反應(yīng)包括二硫鍵交換，與例如在與其它物質(zhì)聯(lián)合治療中注射或形成的化學(xué)物質(zhì)或代謝物反應(yīng)，或暴露于紫外線后的直接氧化以及與核苷酸反應(yīng)。因而能夠產(chǎn)生毒性加合物，特別是考慮到HBcAg具有結(jié)合核酸的強烈傾向這一事實。使用以含有游離半胱氨酸的HBcAg和異雙功能交聯(lián)劑制備的衣殼，難以檢測抗原-衣殼偶聯(lián)物中的這些毒性產(chǎn)物，因為將產(chǎn)生大范圍分子量產(chǎn)物的分布。毒性加合物分布于多個形式之間，它們單個均以低濃度存在，但在一起存在時達(dá)到毒性水平。
根據(jù)如上所述，在疫苗偶聯(lián)物中使用經(jīng)修飾除去自然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg的一個優(yōu)點是，當(dāng)血管緊張肽部分與非天然分子支架附著時毒性形式能夠結(jié)合的位點在數(shù)量上減少或者完全消失。進(jìn)而，能夠用高濃度的交聯(lián)劑生產(chǎn)高度修飾的顆粒，而沒有產(chǎn)生大量不確定的HBcAg單體交聯(lián)形式(即交聯(lián)的單體HBcAg的不同混合物)的缺點。
適用于本發(fā)明的大量自然存在的HBcAg變體已經(jīng)被鑒定。例如，Yuan等人(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了在對應(yīng)于SEQ IDNO1的97位點處異亮氨酸殘基被置換為亮氨酸殘基或苯丙氨酸殘基的變體。大量HBcAg變體以及幾種乙型肝炎核心抗原前體變體的氨基酸序列公開于GenBank報告AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X8529、X85307、X65257、X85311、X85301、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520、P03153、AF110999和M95589中，每個公開內(nèi)容均在此引用作為參考。這些HBcAg變體在多個位點處的氨基酸序列不同，包括對應(yīng)于位于SEQID NO1中位點12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183處氨基酸殘基的氨基酸殘基。
WO 00/198333、WO 00/177158和WO 00/214478中描述了適于在本發(fā)明的組合物中使用，并可根據(jù)本申請書公開內(nèi)容進(jìn)一步修飾的其它HBcAg變體，在此完整引用作為參考。
適用于本發(fā)明的HBcAg能夠來源于任何生物，只要它們能夠結(jié)合形成有序、重復(fù)的抗原陣列。在本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物中一般使用加工的HBcAg(即缺乏前導(dǎo)序列的)。本發(fā)明包括疫苗偶聯(lián)物，以及應(yīng)用這些偶聯(lián)物的方法，它們使用上述變異HBcAg制備非天然分子支架。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括能夠結(jié)合形成二聚體或多聚體結(jié)構(gòu)的其它HBcAg變體。因此，本發(fā)明還包括包含HBcAg多肽的疫苗偶聯(lián)物，該多肽包含或由如下氨基酸序列組成它們與包括SEQ ID No1在內(nèi)的上述序列所示任何一種氨基酸序列至少約80％、約85％、約90％、約95％、約97％或約99％相同，以及必要時加工除去N端前導(dǎo)序列的這些蛋白質(zhì)的形式。
一種多肽的氨基酸序列是否具有與上述氨基酸序列之一或其亞部分至少約80％、約85％、約90％、約95％、約97％或約99％相同的氨基酸序列，能夠利用公知的計算機程序如Bestfit程序常規(guī)確定。當(dāng)利用Bestfit或其它任何序列比對程序確定一種特定序列與參照氨基酸序列是否例如95％相同時，設(shè)置參數(shù)，使得在參照氨基酸序列的全長上計算同一性百分?jǐn)?shù)，并且使同源性缺口可達(dá)參照序列中氨基酸殘基總數(shù)的5％。這樣，可以在SEQ ID NO1的HBcAg與其它HBcAg的氨基酸序列之間進(jìn)行比較。當(dāng)比較相對相似的蛋白質(zhì)時，HBcAg變體中位于對應(yīng)于SEQ ID NO1中特定位點的位置處的氨基酸殘基，是指SEQ ID NO1所示氨基酸序列中該位點處的氨基酸殘基。在感染哺乳動物的乙型肝炎病毒之間，這些HBcAg變體之間的同源性在很大程度上足夠高，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員不難檢查SEQ ID NO1所示的氨基酸序列及特定HBcAg變體的氨基酸序列，并鑒定“相應(yīng)的”氨基酸殘基。例如，在比較SEQ ID NO1與來源于感染土撥鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列時，顯然在該序列中在SEQ ID NO1的氨基酸殘基155與156之間插入了3個氨基酸殘基。
然而，當(dāng)難以比對時，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到序列中特定氨基酸殘基或基序的重要性。例如，來自人病毒的HBcAg的氨基酸序列不同于鴨病毒，因此難以比對，而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在包含于本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物之前，保守半胱氨酸殘基能夠被置換為另一種氨基酸殘基或刪除。
在一個實施方案中，具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的位點48和107處的半胱氨酸殘基缺失或被置換為另一種氨基酸殘基，而位點61處的半胱氨酸仍在原處。然后用修飾的多肽制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。
能夠用于本發(fā)明的優(yōu)選乙型肝炎病毒樣顆粒的制備在下列專利中公開，例如WO 00/32227，具體見實施例17-19和21-24，以及WO 01/85208，具體見實施例17-19、21-24、31-41，和本申請人于2002年1月18日提交的未決的美國申請?zhí)?0/050,902。最后一個申請具體參照實施例23、24、31和51。全部三篇文獻(xiàn)在此均引用作為參考。
如本申請人于2002年1月18日提交的美國申請?zhí)?0/050,902的實施例31所述，例如通過定點誘變可以除去溶劑可及的位點48和107處的半胱氨酸殘基。在一個這樣的實施例中，發(fā)現(xiàn)如2002年1月18日提交的共同未決的美國申請?zhí)?0/050,902(在此完整引用作為參考)所述構(gòu)建的Cys-48-Ser、Cys-107-Ser HBcAg雙突變體能夠在大腸桿菌中表達(dá)。
如上所述，除去游離半胱氨酸殘基減少了毒性成分能夠結(jié)合HBcAg的位點數(shù)量，也除去了同一或相鄰HBcAg分子的賴氨酸和半胱氨酸殘基能夠發(fā)生交聯(lián)的位點。位點61處的半胱氨酸，其參與二聚體的形成并且與另一個HBcAg位點61處的半胱氨酸形成二硫橋鍵，為了本發(fā)明的HBcAg二聚體和多聚體的穩(wěn)定，通常保持其完整。用(1)含有游離半胱氨酸殘基的HBcAg和(2)其游離半胱氨酸殘基與碘乙酰胺不反應(yīng)的HBcAg進(jìn)行的交聯(lián)實驗表明，HBcAg的游離半胱氨酸殘基通過異雙功能交聯(lián)劑衍化的賴氨酸側(cè)鏈與游離半胱氨酸殘基之間的反應(yīng)，引起HBcAg之間的交聯(lián)。也發(fā)現(xiàn)，HBcAg亞單位的交聯(lián)導(dǎo)致大小不確定的高分子量形式的形成，它們不能用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
當(dāng)血管緊張肽部分與非天然分子支架通過一個賴氨酸殘基連接時，置換或刪除位于相對于SEQ ID NO1位點7和96的位點處的自然存在的賴氨酸殘基之一或全部以及HBcAg變體中存在的其它賴氨酸殘基是有利的。除去這些賴氨酸殘基導(dǎo)致除去了可能破壞有序陣列的血管緊張肽部分的結(jié)合位點，應(yīng)能提高終疫苗偶聯(lián)物的質(zhì)量和均一性。
在許多情況下，當(dāng)對應(yīng)于SEQ ID NO1位點7和96的位點處自然存在的兩個賴氨酸殘基均被去除時，向HBcAg中引入另一個賴氨酸作為血管緊張肽部分的附著位點。插入這種賴氨酸殘基的方法在例如2002年1月18日提交的共同未決的美國申請?zhí)?0/050,902中描述，具體參照美國申請?zhí)?0/050,902的實施例23(在此完整引用作為參考)。例如，當(dāng)對應(yīng)于SEQ ID NO1位點7和96的位點處自然存在的兩個賴氨酸殘基均被改變，并且試圖利用異雙功能交聯(lián)劑將血管緊張肽部分與非天然分子支架附著時，向HBcAg內(nèi)引入一個賴氨酸殘基通常是有利的。
已經(jīng)證明HBcAg的C端引導(dǎo)該蛋白質(zhì)的核定位(Eckhardt等人，J.Virol.65575-582(1991))。而且也認(rèn)為該蛋白質(zhì)的這一區(qū)域使HBcAg具有結(jié)合核酸的能力。
在一些實施方案中，本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物含有具有核酸結(jié)合活性的HBcAg(例如含有自然存在的HBcAg核酸結(jié)合域)。含有一個或多個核酸結(jié)合域的HBcAg可用于制備顯示出增強的T細(xì)胞刺激活性的疫苗偶聯(lián)物。因此，本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物包括含有具有核酸結(jié)合活性的HBcAg的偶聯(lián)物。另外還包括疫苗偶聯(lián)物，以及這些偶聯(lián)物在接種方案中的用途，其中HBcAg與核酸結(jié)合。這些HBcAg在對個體施用之前可以與核酸結(jié)合，或者可以在施用后與核酸結(jié)合。
適用于本發(fā)明的其它HBcAg包括N端和C端截短突變體，以及突變型蛋白，其氨基酸序列包含或由這樣的氨基酸序列組成它們與上述截短突變體至少約80％、約85％、約90％、約95％、約97％或約99％相同。
如上所述，在本發(fā)明的某些實施方案中，向構(gòu)成非天然分子支架的一種多肽內(nèi)引入一個賴氨酸殘基作為第一附著位點。在優(yōu)選實施方案中，使用一種HBcAg制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物，該HBcAg包含或由下列氨基酸組成SEQ ID NO1的氨基酸1-144或氨基酸1-149或氨基酸1-185，其經(jīng)過修飾，使得對應(yīng)于位點79和80的氨基酸被替換為具有氨基酸序列Gly-Gly-Lys-Gly-Gly的肽，位點48和107處的半胱氨酸殘基缺失或被置換為另一種氨基酸殘基，而位點61處的半胱氨酸仍在原處。
本發(fā)明還包括包含HBcAg片段的疫苗偶聯(lián)物，該片段包含或由不同于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成，該序列中不在SEQ IDNO1相應(yīng)位點處存在的半胱氨酸殘基已經(jīng)被刪除。
本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物可包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗偶聯(lián)物可由氨基酸序列不同的HBcAg組成。例如，可以制備包含“野生型”HBcAg和修飾的HBcAg的疫苗偶聯(lián)物，在修飾的HBcAg中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被改變(例如缺失、插入或置換)。
本發(fā)明還包括使用與另一種蛋白質(zhì)融合的HBcAg制備非天然分子支架的疫苗偶聯(lián)物。如上所述，這種融合蛋白的一個例子是HBcAg/FOS融合蛋白。適于在本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物中使用的HBcAg融合蛋白的其它實例包括已經(jīng)添加了一種有助于形成和/或穩(wěn)定HBcAg二聚體和多聚體的氨基酸序列的融合蛋白。這種添加的氨基酸序列可與HBcAg的C端融合。這種融合蛋白的一個實例是HBcAg與釀酒酵母GCN4螺旋區(qū)的融合蛋白，它通過非共價相互作用形成同型二聚體，可以用來制備并穩(wěn)定HBcAg二聚體和多聚體。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供使用HBcAg融合蛋白制備的疫苗偶聯(lián)物，該融合蛋白包含HBcAg或其片段，以及與C端融合的GCN4多肽(PAALKRARNEAARRSRARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKK)。該GCN4多肽也可與HBcAg的N端融合。
HBcAg/src同源3(SH3)域融合蛋白也可以用來制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。SH3域是在大量蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的相對較小的域，它提供與蛋白質(zhì)結(jié)合性配偶體中特定富含脯氨酸序列相互作用的能力(參見McPherson，Cell Signal 11229-238(1999))。HBcAg/SH3融合蛋白可以以幾種方式使用。首先，SH3域能夠構(gòu)成第一附著位點，該位點可與血管緊張肽部分的第二附著位點相互作用。同樣，可以向HBcAg中添加富含脯氨酸的氨基酸序列，并作為對于血管緊張肽部分的SH3域第二附著位點的第一附著位點。其次，SH3域能夠與引入HBcAg內(nèi)的富含脯氨酸區(qū)結(jié)合。因此，SH3域和富含脯氨酸的SH3相互作用位點可以被插入相同或不同的HBcAg內(nèi)，用來構(gòu)成并穩(wěn)定本發(fā)明的二聚體和多聚體。
上述實例證實，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道如何由HBcAg和HBcAg衍生的突變型蛋白構(gòu)成包含核心顆粒和第一附著位點的分子支架。應(yīng)用本領(lǐng)域周知的技術(shù)和常規(guī)實驗，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解如何類似地使用其它病毒構(gòu)建分子支架。
如本說明書其它部分所述，病毒衣殼可用于(1)一種或多種血管緊張肽部分的呈遞，和(2)本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物的制備。特別是，在本發(fā)明的實施中有用的是病毒衣殼蛋白，在此也稱為“外殼蛋白”，它在表達(dá)后形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)。因此，這些衣殼蛋白能夠形成核心顆粒和非天然分子支架。這些衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)通常形成有序、重復(fù)的陣列，后者可用于抗原決定簇的呈遞和本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物的制備。
一種或多種(例如1、2、3、4、5種等)血管緊張肽部分可以通過任何方法與一種或多種(例如1、2、3、4、5種等)形成病毒衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)(例如噬菌體外殼蛋白)的蛋白質(zhì)以及其它蛋白質(zhì)附著。例如，血管緊張肽部分可以利用第一和第二附著位點附著于核心顆粒。此外，也可以用一種或多種(例如1、2、3、4、5種等)異雙功能交聯(lián)劑使一種或多種血管緊張肽部分附著于一種或多種形成病毒衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。
例如，可以使用病毒衣殼蛋白或其片段制備核心顆粒和本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。例如，噬菌體Qβ外殼蛋白能夠在大腸桿菌中重組表達(dá)。進(jìn)而，這些蛋白質(zhì)在表達(dá)后自發(fā)形成衣殼，它們是病毒樣顆粒。另外，這些顆粒形成有序、重復(fù)的抗原陣列，能夠在血管緊張肽部分的呈遞和疫苗偶聯(lián)物的制備中使用。
在一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由或者由RNA-噬菌體的重組蛋白或其片段組成。優(yōu)選地，RNA-噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；l)噬菌體PP7；m)噬菌體AP205。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含或基本由或由RNA-噬菌體Qβ或RNA-噬菌體fr或RNA-噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。
可以用來制備本發(fā)明偶聯(lián)物的噬菌體外殼蛋白的具體實例包括RNA噬菌體的外殼蛋白，如噬菌體Qβ(SEQ ID NO3；PIR數(shù)據(jù)庫，登錄號VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO4；登錄號AAA16663指Qβ A1蛋白)，噬菌體R17(PIR登錄號VCBPR7)，噬菌體fr(PIR登錄號VCBPFR)，噬菌體GA(GenBank登錄號NP-040754)，噬菌體SP(GenBank登錄號CAA30374指SP CP，和涉及SP A1蛋白的登錄號)，噬菌體MS2(PIR登錄號VCBPM2)，噬菌體M11(GenBank登錄號AAC06250)，噬菌體MX1(GenBank登錄號AAC14699)，噬菌體NL95(GenBank登錄號AAC14704)，噬菌體f2(GenBank登錄號P03611)，噬菌體PP7，噬菌體AP205(SEQ ID NO11)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，能夠用形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的任何蛋白質(zhì)制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。此外，噬菌體Qβ的A1蛋白(Genbank登錄號AAA16663(SEQ ID NO4))或從C端丟失多達(dá)約100、約150或約180個氨基酸的C端截短形式也可參與Qβ外殼蛋白的衣殼裝配。A1蛋白也可融合含有第一附著位點的一種組分，以與含有第二附著位點的血管緊張肽部分附著。為了確保衣殼形成，衣殼裝配中A1蛋白相對于Qβ CP的百分比通常受到限制。
也發(fā)現(xiàn)Qβ外殼蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時自裝配為衣殼(Kozlovska TM.等人，GENE 137133-137(1993))。獲得的衣殼或病毒樣顆粒顯示二十面體噬菌體樣衣殼結(jié)構(gòu)，直徑25nm，T＝3半對稱。噬菌體Qβ的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析。該衣殼含有180個外殼蛋白拷貝，它們通過二硫橋鍵連接為共價五聚體和六聚體(Golmohammadi R.等人，Structure 4543-5554(1996))。也發(fā)現(xiàn)其它RNA噬菌體外殼蛋白在細(xì)菌宿主中表達(dá)后自裝配(Kastelein，RA.等人，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。Qβ噬菌體衣殼除了外殼蛋白外還含有所謂的連讀蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通過在UGA終止密碼子處抑制而產(chǎn)生，長度為329個氨基酸。本發(fā)明中使用的噬菌體Qβ重組外殼蛋白的衣殼缺乏A2裂解蛋白，而含有來自宿主的RNA。RNA噬菌體的外殼蛋白是一種RNA結(jié)合蛋白，與復(fù)制酶基因的核糖體結(jié)合位點的莖環(huán)相互作用，在病毒的生命周期中作為一種翻譯阻遏物。這種相互作用的序列和結(jié)構(gòu)組件已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 2871-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.27131839-31845(1996))。已知莖環(huán)和RNA通常參與病毒裝配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-5554(1996))。
我們通過N端Edman測序發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中表達(dá)后，Qβ外殼蛋白的N端蛋氨酸通常被除去，該方法如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252990-993(1977)中所述。本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括由其中N端蛋氨酸尚未去除的Qβ外殼蛋白組成的VLP，或者含有其中N端蛋氨酸被切除和仍然存在的Qβ外殼蛋白混合物的VLP。
1.在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由或由RNA-噬菌體AP205的重組蛋白或其片段組成。
2.AP205基因組由成熟蛋白質(zhì)、外殼蛋白、復(fù)制酶和相關(guān)噬菌體中不存在的兩個開放閱讀框組成；一種裂解基因和開放閱讀框在成熟基因的翻譯中起作用(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205外殼蛋白能夠由質(zhì)粒pAP283-58(SEQ ID NO11)表達(dá)，該質(zhì)粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene137133-37(1993))，含有一個AP205核糖體結(jié)合位點。此外，AP205外殼蛋白也可以被克隆到pQb185內(nèi)，位于載體中核糖體結(jié)合位點的下游。這兩種方法都導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)和衣殼的形成，如2002年7月17日本申請人提交的題目為“分子抗原陣列”的共同未決的美國臨時專利申請?zhí)?0/396,126中所述，在此完整引用作為參考，具體如所述專利申請的實施例2所述。載體pQb10和pQb185是由pGEM載體衍生的載體，克隆到這些載體中的基因的表達(dá)受trp啟動子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))。質(zhì)粒pAP283-58(SEQ ID NO11)包含推斷的具有下列序列的AP205核糖體結(jié)合位點，位于AP205外殼蛋白的XbaI位點下游和ATG起始密碼子直接上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg。載體pQb185在XbaI位點下游和起始密碼子上游包含一個SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg，SD序列以下劃線標(biāo)出)。
3.在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由或由RNA-噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段組成。
4.本發(fā)明的這一優(yōu)選實施方案包含可形成衣殼的AP205外殼蛋白。這些蛋白質(zhì)重組表達(dá)或從天然來源制備。電子顯微鏡檢查(EM)和免疫擴散證實，在細(xì)菌中產(chǎn)生的AP205外殼蛋白自發(fā)形成衣殼。在EM中觀察時，AP205外殼蛋白(SEQ ID NO12)形成的衣殼與AP205RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼的結(jié)構(gòu)特征幾乎無法辨別。AP205VLP具有高度免疫原性，能夠與抗原和/或抗原決定簇連接，產(chǎn)生展示以重復(fù)方式定向的抗原和/或抗原決定簇的疫苗構(gòu)建體。產(chǎn)生針對這樣展示的抗原的高滴度，這表明結(jié)合的抗原和/或抗原決定簇容易與抗體分子相互作用，并且具有免疫原性。
5.在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、基本由或由RNA-噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段組成。
6.AP205 VLP的可裝配突變形式，包括氨基酸5處的脯氨酸被置換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白(SEQ ID NO13)，也可以在本發(fā)明中使用，形成本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案。這些VLP、來自天然來源的AP205 VLP或AP205病毒顆?？梢耘c抗原結(jié)合，產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的有序、重復(fù)的抗原陣列。
7.AP205 P5-T突變外殼蛋白能夠由質(zhì)粒pAP281-32(SEQ IDNO14)表達(dá)，該質(zhì)粒由pQb185直接衍生，含有突變的AP205外殼蛋白基因而不是Qβ外殼蛋白基因。為了表達(dá)AP205外殼蛋白，用表達(dá)AP205外殼蛋白的載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌。
8.分別表達(dá)外殼蛋白和突變外殼蛋白、導(dǎo)致自裝配為VLP的方法，在2002年7月17日本申請人提交的題目為“分子抗原陣列”的共同未決的美國臨時專利申請?zhí)?0/396,126中描述，在此完整引用作為參考。合適的大腸桿菌株包括但不限于大腸桿菌K802、JM 109、RR1。合適的載體和菌株及其組合能夠通過SDS-PAGE分別檢測外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達(dá)而鑒定，衣殼的形成和裝配如下鑒定首先任選通過凝膠過濾純化衣殼，隨后用免疫擴散試驗(Ouchterlony試驗)或電子顯微鏡檢查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))檢測。
9.由載體pAP283-58和pAP281-32表達(dá)的AP205外殼蛋白由于在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中加工，可能缺乏最初的蛋氨酸。AP205 VLP的切割形式、未切割形式或其混合物是本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。
10.在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由或由RNA-噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段和RNA-噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段的混合物組成。
11.在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含、或基本由或由RNA-噬菌體AP205的重組外殼蛋白或重組突變型外殼蛋白的片段組成。
12.在本發(fā)明中也可使用能夠分別裝配為VLP和衣殼的重組AP205外殼蛋白片段。可以通過內(nèi)部刪除或分別在外殼蛋白和突變型外殼蛋白的末端刪除產(chǎn)生這些片段。只要與VLP裝配相容，向外殼蛋白和突變型外殼蛋白序列中插入，或抗原序列與外殼蛋白和突變型外殼蛋白序列融合是本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案，分別產(chǎn)生嵌合AP205外殼蛋白和顆粒。插入、缺失以及與外殼蛋白序列融合的結(jié)果，以及是否與VLP裝配相容，能夠通過電子顯微鏡檢查確定。
13.由上述AP205外殼蛋白、外殼蛋白片段和嵌合外殼蛋白形成的顆粒能夠被分離為純化形式，分離方法是組合使用通過沉淀的分級分離步驟和通過凝膠過濾的純化步驟，例如使用Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其組合，如2002年7月16日本申請人提交的題目為“分子抗原陣列”的共同未決的美國臨時專利申請中所述，在此完整引用作為參考。分離病毒樣顆粒的其它方法在本領(lǐng)域公知，可以用來分離噬菌體AP205的病毒樣顆粒(VLP)。例如，美國專利號4,918,166描述了利用超速離心分離酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty的VLP，在此完整引用作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，一種或多種血管緊張肽部分可附著于RNA噬菌體外殼蛋白衣殼的一個亞單位上。RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼、特別是Qβ衣殼的每個亞單位偶聯(lián)幾個血管緊張肽部分的能力使得能夠產(chǎn)生密集的血管緊張肽部分陣列。其它病毒衣殼通過化學(xué)交聯(lián)可與血管緊張肽部分共價附著，例如在主要免疫顯性區(qū)中含有一個賴氨酸殘基的修飾的HBcAg(MIR；WO 00/32227)。HBcAg刺突之間的距離(對應(yīng)于MIR)是50埃(Wynne，SA.等人，Mol.Cell 3771-780(1999))，因此不能產(chǎn)生間距小于50A的血管緊張肽部分陣列。
Qβ外殼蛋白的衣殼在其表面展示數(shù)量確定的賴氨酸殘基，具有確定的布局，有3個賴氨酸殘基指向衣殼內(nèi)部，并與RNA相互作用，其它4個賴氨酸殘基暴露于衣殼外面。這些明確的特征有利于血管緊張肽部分附著于顆粒外部，而不是賴氨酸殘基與RNA相互作用的顆粒內(nèi)部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼在其表面也有數(shù)量確定的賴氨酸殘基，這些賴氨酸殘基有確定的布局。來源于RNA噬菌體的衣殼的另一個優(yōu)點是它們在細(xì)菌中的高表達(dá)量，這允許以可負(fù)擔(dān)的成本大量生產(chǎn)材料。
Qβ外殼蛋白的衣殼的另一個特征是其穩(wěn)定性。Qβ亞單位通過二硫橋鍵彼此結(jié)合，共價連接亞單位。Qβ衣殼蛋白也顯示對有機溶劑和變性劑不同尋常的抗性。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，能夠使用高至約30％的DMSO和乙腈濃度和高至約1M的胍鹽濃度，而不影響衣殼的穩(wěn)定性或形成血管緊張肽部分陣列的能力。因此，可以使用這些有機溶劑偶聯(lián)疏水分子，如某些血管緊張肽部分。特別是對于在哺乳動物和人的免疫和接種中的用途而言，Qβ外殼蛋白的衣殼的高穩(wěn)定性是一個重要特征。衣殼對有機溶劑的抗性使得在水性緩沖液中不可溶的血管緊張肽部分或其衍生物能夠偶聯(lián)。
美國專利號5,698,424描述了向RNA噬菌體MS-2的外殼蛋白的N端β發(fā)夾中插入一個半胱氨酸殘基，該專利在此完整引用作為參考。然而我們注意到，衣殼中存在暴露的游離半胱氨酸殘基可通過形成二硫橋鍵導(dǎo)致衣殼寡聚化。上述美國專利中所述的其它附著涉及血管緊張肽部分與Qβ顆粒之間二硫橋鍵的形成。這些附著對含有巰基部分的分子不穩(wěn)定。
最初Qβ上的半胱氨酸殘基形成的二硫橋鍵與含有游離巰基殘基的抗原之間的反應(yīng)釋放含巰基的形式，而不是血管緊張肽部分。這些新形成的含巰基形式能夠與顆粒上存在的其它二硫橋鍵再次反應(yīng)，從而建立平衡。一旦與顆粒上形成的二硫橋鍵反應(yīng)，血管緊張肽部分即可與來自顆粒的半胱氨酸殘基，或者與在顆粒上形成最初二硫橋鍵的離去基團(tuán)分子的半胱氨酸殘基形成二硫橋鍵。而且，使用一側(cè)與Qβ顆粒上的半胱氨酸反應(yīng)、另一側(cè)與血管緊張肽部分上的賴氨酸殘基反應(yīng)的異雙功能交聯(lián)劑，所述的其它附著方法可導(dǎo)致血管緊張肽部分在顆粒上的隨機定向。
我們進(jìn)一步注意到，與Qβ和Fr外殼蛋白的衣殼不同，美國專利號5,698,424所述的重組MS-2基本不含核酸，而在上述兩種衣殼內(nèi)包裝有RNA。
我們在此描述了本發(fā)明的允許形成堅固的血管緊張肽部分陣列的新的偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物中含有不同密度的血管緊張肽表位。我們證實，通過將血管緊張肽部分附著于VLP能夠獲得極高的表位密度。此外，通過改變含有適當(dāng)?shù)谝桓街稽c的殘基的數(shù)量和類型也能夠修飾血管緊張肽部分的密度和間距。例如，2002年1月18日提交的共同未決的美國專利申請?zhí)?0/050,902公開了一種含有額外賴氨酸殘基的Qβ突變外殼蛋白，它比野生型Qβ外殼蛋白更適于獲得高密度的陣列。此外，上述申請也公開了適于以適當(dāng)間距同時展示幾種抗原的偶聯(lián)物，和以適當(dāng)和希望的方式添加輔助分子提高溶解度或修飾衣殼的偶聯(lián)物。其它Qβ外殼蛋白突變體、形成的衣殼(是病毒樣顆粒)，在共同未決的美國專利申請?zhí)?0/050,902中公開，適于生產(chǎn)本發(fā)明的組合物。特別是，當(dāng)血管緊張肽部分和Qβ-血管緊張肽抗原陣列的可溶性限制了能夠與Qβ病毒樣顆粒附著的血管緊張肽部分的數(shù)量時，可以使用賴氨酸殘基已經(jīng)被置換為精氨酸(它沒有與賴氨酸殘基相同的反應(yīng)性)的突變體。在制備這些組合物時，可以用高濃度的血管緊張肽部分或經(jīng)修飾含有第二附著位點的血管緊張肽部分陣列在突變型Qβ病毒樣顆粒上的賴氨酸殘基處獲得完全反應(yīng)，而不會象使用野生型Qβ病毒樣顆粒時那樣，產(chǎn)生可能不溶的含有較多附著的血管緊張肽部分的顆粒。
幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被測定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-554(1996))。利用這些信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地鑒定表面暴露的殘基并修飾噬菌體外殼蛋白，以便能夠插入一個或多個反應(yīng)性氨基酸殘基。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地生產(chǎn)和鑒定可用于本發(fā)明中的噬菌體外殼蛋白的修飾形式。因此，也可以用形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)變體(例如噬菌體Qβ、噬菌體R17、噬菌體fr、噬菌體GA、噬菌體SP和噬菌體MS2的外殼蛋白)制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。
盡管上述變異蛋白質(zhì)的序列不同于其野生型，但是這些變異蛋白質(zhì)通常保留形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力。因此，本發(fā)明還包括包含可形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)變體的疫苗偶聯(lián)物，以及制備這些疫苗偶聯(lián)物的方法，用來制備這些疫苗偶聯(lián)物的各種蛋白質(zhì)亞單位。因此，本發(fā)明的范圍內(nèi)包括野生型蛋白質(zhì)的變體形式，它們可形成有序、重復(fù)的陣列(例如可形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)變體)，并保留結(jié)合并形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力。C端和N端截短變體通常保留形成病毒樣顆粒的能力。因此，包括缺失、添加或置換在內(nèi)的變體形式、嵌合形式和自然存在的變體是本發(fā)明的適當(dāng)?shù)某煞帧?br> 細(xì)菌菌毛和菌毛蛋白。在其它實施方案中，細(xì)菌菌毛、細(xì)菌菌毛的亞部分，或含有細(xì)菌菌毛或其亞部分的融合蛋白，可以用來制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。菌毛蛋白的實例包括大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產(chǎn)生的菌毛蛋白。適用于本發(fā)明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank報告所述的AJ000636、AJ132364、AF229646、AF051814、AF051815和X00981，其完整內(nèi)容在此引用作為參考。
細(xì)菌菌毛蛋白在輸入細(xì)菌周質(zhì)之前，通常被加工除去N端前導(dǎo)序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，用來制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物的細(xì)菌菌毛蛋白通常不含自然存在的前導(dǎo)序列。
適用于本發(fā)明的菌毛蛋白的一個具體實例是大腸桿菌的P-菌毛蛋白(GenBank報告AF237482)。適用于本發(fā)明的大腸桿菌1型菌毛蛋白的一個實例是含有GenBank報告P04128所述氨基酸序列(SEQID NO2)的菌毛蛋白，它由具有GenBank報告M27603所示核苷酸序列的核酸編碼。這些GenBank報告的完整公開內(nèi)容在此引用作為參考。另外也常用上述蛋白質(zhì)的成熟形式制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。
適用于本發(fā)明的細(xì)菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亞部分通常能夠結(jié)合形成非天然分子支架。在體外制備菌毛和菌毛樣結(jié)構(gòu)的方法為本領(lǐng)域周知。例如，Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312890-12895(1996)描述了大腸桿菌P-菌毛亞單位的體外重建。此外，Eshdat等人(J.Bacteriol.148308-314(1981))描述了適于分離大腸桿菌1型菌毛和菌毛重建的方法。簡言之，這些方法如下通過在飽和鹽酸胍中37℃下孵育裂解菌毛。然后通過層析純化菌毛蛋白，之后用5mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚體。Eshdat等人也發(fā)現(xiàn)，在用含有5mM MgCl2的5mM三(羥甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋白二聚體重裝配形成菌毛蛋白。
另外，例如使用常規(guī)基因工程和蛋白質(zhì)修飾方法，可以修飾菌毛蛋白，使之含有第一附著位點，血管緊張肽部分通過第二附著位點與之連接。此外，血管緊張肽部分也可以通過第二附著位點與這些蛋白質(zhì)中自然存在的氨基酸殘基直接連接。這些修飾的菌毛蛋白然后可用于本發(fā)明的免疫性偶聯(lián)物。
用來制備本發(fā)明偶聯(lián)物的細(xì)菌菌毛蛋白可以用類似于此處所述對HBcAg修飾的方式進(jìn)行修飾。例如，可以將半胱氨酸和賴氨酸殘基刪除或置換為其它氨基酸殘基，并且可以向這些蛋白質(zhì)中添加第一附著位點。此外，菌毛蛋白也可以以修飾形式表達(dá)，或者可以在表達(dá)后進(jìn)行化學(xué)修飾。類似地，也可以從細(xì)菌中收獲完整的菌毛，然后進(jìn)行化學(xué)修飾。
在另一個實施方案中，從細(xì)菌(例如大腸桿菌)中收獲菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)，用來形成本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物。適于制備疫苗偶聯(lián)物的一個實例是大腸桿菌1型菌毛，它由具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的菌毛蛋白單體構(gòu)成。
本領(lǐng)域周知多種收獲細(xì)菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74623-632(1998))描述了一種從大腸桿菌中收獲P-菌毛的菌毛純化方法。根據(jù)該方法，從含有P-菌毛質(zhì)粒的多菌毛大腸桿菌上剪切菌毛，通過溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的多個循環(huán)純化。2002年1月18日提交的共同未決的美國專利申請?zhí)?0/050,902公開了從自然產(chǎn)生菌毛或者已經(jīng)導(dǎo)入編碼負(fù)責(zé)菌毛產(chǎn)生的fim操縱子的載體的細(xì)菌中收獲和純化I型菌毛。
一旦收獲后，即可用多種方式修飾菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)。例如，可以向菌毛中添加第一附著位點，一種或多種血管緊張肽部分可通過第二附著位點與之連接。換句話說，可以收獲并修飾細(xì)菌菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)，形成非天然分子支架。
也可以在沒有非天然第一附著位點的情況下通過血管緊張肽部分的附著修飾菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)。例如，抗原或抗原決定簇可以被連接到自然存在的半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基上。在這些情況下，自然存在的氨基酸殘基的高度有序和重復(fù)性將引導(dǎo)血管緊張肽部分與菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)偶聯(lián)。例如，使用異雙功能交聯(lián)劑，菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)可以與血管緊張肽部分的第二附著位點連接。
當(dāng)使用生物自然合成的結(jié)構(gòu)(例如菌毛)制備本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物時，遺傳改造這些生物使它們產(chǎn)生具有所希望的特征的結(jié)構(gòu)通常是有利的。例如，當(dāng)使用大腸桿菌1型菌毛時，可以修飾收獲菌毛的大腸桿菌，使之產(chǎn)生具有特定特征的結(jié)構(gòu)。可能的菌毛蛋白修飾的實例包括一個或多個賴氨酸殘基的插入、一個或多個自然存在的賴氨酸殘基的缺失或置換、一個或多個自然存在的半胱氨酸殘基的缺失或置換(例如SEQ ID NO2位點44和84處的半胱氨酸殘基)。
另外也可以對菌毛蛋白基因進(jìn)行其它修飾，產(chǎn)生含有并非賴氨酸殘基的第一附著位點(例如FOS或JUN域)的表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)然，合適的第一附著位點通常僅限于不妨礙菌毛蛋白形成適于在本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物中使用的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的位點。重組菌毛蛋白形成菌毛的能力可以用包括電子顯微鏡檢查在內(nèi)的多種方法測定。
細(xì)菌細(xì)胞中自然存在的菌毛蛋白基因可以在體內(nèi)修飾(例如通過同源重組)，或者可以將具有特定特征的菌毛蛋白基因插入這些細(xì)胞內(nèi)。例如，可以將菌毛蛋白基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞中，作為復(fù)制型克隆載體或插入細(xì)菌染色體內(nèi)的載體的一種成分。插入的菌毛蛋白基因也可以與表達(dá)調(diào)節(jié)控制序列(例如lac操縱子)連接。
在大多數(shù)情況下，在本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)物中使用的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)由一種類型的菌毛亞單位構(gòu)成。然而，本發(fā)明的偶聯(lián)物也包括包含由異源菌毛蛋白亞單位構(gòu)成的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的疫苗。通常使用由相同亞單位組成的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)，因為預(yù)期它們能夠形成表現(xiàn)為高度有序、重復(fù)抗原陣列的結(jié)構(gòu)。
第二附著位點。本發(fā)明提供了有序、重復(fù)陣列的分子支架的制備，包括高表位密度的RNA噬菌體外殼蛋白衣殼的偶聯(lián)物。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，血管緊張肽部分的性質(zhì)和該部分上第二附著位點的性質(zhì)和位置，是可能影響構(gòu)建本發(fā)明的偶聯(lián)物的方法和這些偶聯(lián)物誘發(fā)免疫應(yīng)答的效果的重要因素。
設(shè)計第二附著位點的一個前提條件是融合、插入或基因改造或附著位點的選擇。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道如何找到選擇第二附著位點的位置的指示，可以考慮與這種決定有關(guān)的多種因素。血管緊張肽部分的化學(xué)和/或晶體結(jié)構(gòu)可以提供關(guān)于適于偶聯(lián)的分子結(jié)構(gòu)域的可用性的信息。一種反應(yīng)性結(jié)構(gòu)域的溶劑可及性可能是與第一附著位點化學(xué)偶聯(lián)的動力學(xué)的限制因素。適于偶聯(lián)的基團(tuán)必須是可以利用的，如巰基殘基。如果用血管緊張肽部分免疫旨在抑制血管緊張肽部分(也可能是一種自身抗原)與其天然配體(如底物或受體)的相互作用，通常添加第二附著位點，以便產(chǎn)生針對與天然配體相互作用的位點的抗體。因此選擇第二附著位點的位置，避免第二附著位點或含有它的任何氨基酸接頭的空間位阻。在其它實施方案中，希望有針對一種位點的抗體應(yīng)答，該位點不同于自身抗原與其天然配體的相互作用位點。在這些實施方案中，選擇第二附著位點，防止產(chǎn)生針對自身抗原與其天然配體的相互作用位點的抗體。考慮的其它因素包括血管緊張肽部分的性質(zhì)、其生物化學(xué)性質(zhì)如pI、電荷分布、進(jìn)一步的修飾。通常優(yōu)選柔性接頭。
選擇第二附著位點位置的其它標(biāo)準(zhǔn)包括血管緊張肽部分的寡聚狀態(tài)、寡聚位點、輔因子的存在以及現(xiàn)有的揭示該部分結(jié)構(gòu)和序列中存在如下位點的實驗證據(jù)該位點的修飾與功能部分相容，或者適于產(chǎn)生可識別該部分、優(yōu)選地可阻斷該血管緊張肽部分的功能的抗體。在某些實施方案中，向血管緊張肽部分序列的C端或N端添加一個或多個其它氨基酸(產(chǎn)生非自然存在的第二附著位點)，以確保特別是血管緊張肽部分與根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒定向、有序地結(jié)合。
多肽抗原與VLP、特別是與RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼附著的一個特別優(yōu)選的方法是RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼表面的賴氨酸殘基與抗原上的巰基殘基(如半胱氨酸殘基中所見)連接。類似地，血管緊張肽部分上的游離巰基也可能是有效的附著位點。為了作為第二附著位點，氧化的巰基必須是還原狀態(tài)，可以用例如DTT、TCEP或β-巰基乙醇進(jìn)行還原。
根據(jù)本發(fā)明，通過選擇交聯(lián)劑和其它反應(yīng)條件能夠調(diào)節(jié)RNA噬菌體外殼蛋白衣殼上的表位密度。例如，用交聯(lián)劑Sulfo-GMBS和SMPH能夠獲得高表位密度。高濃度反應(yīng)物正向影響衍化，可以用操作反應(yīng)條件來控制與RNA噬菌體衣殼蛋白偶聯(lián)的、特別是與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的抗原數(shù)量。另外，核心顆粒上第一附著位點的數(shù)量是影響血管緊張肽部分陣列的密度的另一個因素。在本發(fā)明的一個實施方案中，我們提供了一種含有額外賴氨酸殘基的Qβ突變型外殼蛋白，它適于獲得更高密度的陣列。
在最優(yōu)選的實施方案中，血管緊張肽部分包含單一的第二附著位點或單一的反應(yīng)性附著位點，它們分別能夠與核心顆粒和VLP或VLP亞單位上的第一附著位點結(jié)合。這確保了至少1個、一般1個以上、優(yōu)選地超過10、20、40、80、120個抗原分別與核心顆粒和VLP固定、均勻地結(jié)合、連接。因此，抗原上單一的第二附著位點或單一的反應(yīng)性附著位點確保了一種單一、均勻類型的結(jié)合和連接，分別產(chǎn)生極其高度有序、重復(fù)的陣列。例如，如果通過賴氨酸(作為第一附著位點)和半胱氨酸(作為第二附著位點)的相互作用分別實現(xiàn)結(jié)合和連接，根據(jù)本發(fā)明該優(yōu)選實施方案，確保每個抗原只有一個半胱氨酸殘基能夠分別與VLP和核心顆粒的第一附著位點結(jié)合和連接，而無論該半胱氨酸殘基在抗原上是自然存在還是非自然存在。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，共價鍵是一種非肽鍵。
在一些實施方案中，在抗原上構(gòu)建第二附著位點需要融合氨基酸接頭，根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，該接頭含有適于作為第二附著位點的氨基酸。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，一個氨基酸接頭通過至少一個共價鍵與抗原或抗原決定簇結(jié)合。優(yōu)選地，該氨基酸接頭包含或由第二附著位點組成。在一個更優(yōu)選的實施方案中，氨基酸接頭包含一個巰基或半胱氨酸殘基。在另一個優(yōu)選實施方案中，該氨基酸接頭是半胱氨酸。氨基酸接頭的一些選擇標(biāo)準(zhǔn)以及根據(jù)本發(fā)明的氨基酸接頭的優(yōu)選實施方案在上文中已經(jīng)提及。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗原或抗原決定簇，即PrP蛋白、PrP肽或PrP域，分別與核心顆粒和病毒樣顆粒融合。如上所述，VLP一般由至少一種可裝配為VLP的亞單位組成。因此，在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，抗原或抗原決定簇，優(yōu)選地至少一種血管緊張肽部分，與病毒樣顆?；蛞环N能夠摻入VLP內(nèi)的蛋白質(zhì)的至少一種亞單位融合，產(chǎn)生嵌合VLP-亞單位-血管緊張肽部分融合蛋白。
血管緊張肽部分的融合可以按如下實現(xiàn)插入VLP亞單位序列內(nèi)，或與VLP亞單位或能夠摻入VLP內(nèi)的蛋白質(zhì)的N端或C端融合。在下文中，當(dāng)提到一種肽與VLP亞單位的融合蛋白時，包括該肽與亞單位序列任一端的融合或向亞單位序列內(nèi)的內(nèi)部插入。
也可以通過向VLP亞單位變體內(nèi)插入血管緊張肽部分的序列來實現(xiàn)融合，其中亞單位序列的一部分缺失，被稱為截短突變體。截短突變體可能有VLP亞單位序列N端或C端缺失或內(nèi)部的一部分缺失。例如，氨基酸殘基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有內(nèi)部缺失的截短突變體。血管緊張肽部分與截短突變體VLP-亞單位的N端或C端的融合也是本發(fā)明的實施方案。同樣，一種表位向VLP亞單位序列內(nèi)的融合也可以通過置換實現(xiàn)，例如對于特定VLP HBcAg，用一種外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所述，實現(xiàn)融合的方法包括向VLP亞單位的序列中插入血管緊張肽部分序列，用血管緊張肽部分序列置換VLP亞單位序列的一部分，或者缺失、置換或插入的組合。
嵌合血管緊張肽部分-VLP亞單位通常能夠自裝配為VLP。展示與其亞單位融合的表位的VLP在此也稱為嵌合VLP。如所說明的，病毒樣顆粒包含或由至少一種VLP亞單位組成。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含或由嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位(即不含融合抗原的VLP亞單位)的混合物組成，產(chǎn)生所謂的鑲嵌顆粒。這可能有利于確保VLP的形成和裝配。在這些實施方案中，嵌合VLP-亞單位的比例可能是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
可以將側(cè)翼氨基酸殘基添加到與VLP亞單位序列任一端融合的肽或表位序列的任一端，或者向VLP亞單位序列內(nèi)部插入這種肽序列。甘氨酸和絲氨酸殘基是特別優(yōu)選的氨基酸，可以在添加到待融合的血管緊張肽部分的側(cè)翼序列中使用。甘氨酸殘基提供額外的柔韌性，這可降低外源序列與VLP亞單位序列融合時可能的去穩(wěn)定作用。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，VLP是一種乙型肝炎核心抗原VLP。與HBcAg N端(Neyrinck，S.等人，Nature Med.51157-1163(1999))或與所謂的主要免疫顯性區(qū)(MIR)中的插入融合的融合蛋白已經(jīng)被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，WO 01/98333)，并且是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。MIR中含有缺失的HBcAg的自然存在的變體也已經(jīng)被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，在此完整引用作為參考)，與N端或C端的融合，以及與野生型HBcAg相比在對應(yīng)于缺失位點的MIR位點處的插入，也是本發(fā)明的實施方案。與C端的融合也已經(jīng)被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地找到如何利用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建融合蛋白的指示(Sambrook，J.等人編著，《(分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho等人，Gene 7751(1989))。編碼HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表達(dá)HBcAg和HBcAg融合蛋白的載體和質(zhì)粒已經(jīng)被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.51157-1163(1999))，可以在本發(fā)明的實施中使用。通過實施例(實施例6)，我們也描述了向HBcAg的MIR內(nèi)插入一種表位，產(chǎn)生自裝配的嵌合HBcAg。優(yōu)化自裝配效率和展示插入HBcAg MIR內(nèi)的表位的一個重要因素是插入位點的選擇，以及插入時從MIR內(nèi)HBcAg序列上刪除的氨基酸數(shù)量(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 421 635；美國專利號6,231,864)，換句話說，HBcAg的哪些氨基酸將被置換為新的表位。例如，已經(jīng)有用外源表位置換HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81的描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864)。HBcAg含有一個長的精氨酸尾(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))，它不是衣殼裝配所必需的，并能夠結(jié)合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺乏這一精氨酸尾的HBcAg是本發(fā)明的兩個實施方案。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP。RNA噬菌體的主要外殼蛋白在細(xì)菌、特別是在大腸桿菌中表達(dá)后自發(fā)裝配為VLP。能夠用來制備本發(fā)明的組合物的噬菌體外殼蛋白的具體實例包括RNA噬菌體如噬菌體Qβ(SEQ ID NO10；PIR數(shù)據(jù)庫，登錄號VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登錄號AAA16663指Qβ A1蛋白)和噬菌體fr(SEQ ID NO4；PIR登錄號VCBPFR)的外殼蛋白。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，至少一種血管緊張肽部分與一種Qβ外殼蛋白融合。已經(jīng)描述了融合蛋白構(gòu)建體，其中表位與Qβ A1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白內(nèi)(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白是通過UGA終止密碼子的抑制產(chǎn)生的，長度為329個氨基酸，或者如果考慮N端蛋氨酸的切除，為328個氨基酸。丙氨酸(QβCP基因編碼的第二個氨基酸)之前的N端蛋氨酸的切除通常在大腸桿菌中發(fā)生，Qβ外殼蛋白CP的N端也是如此。位于UGA琥珀密碼子3’的A1基因的一部分編碼長度為195個氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位點72與73之間插入至少一個血管緊張肽部分產(chǎn)生本發(fā)明的另外的實施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))。血管緊張肽部分在C端截短的QβA1蛋白C端的融合產(chǎn)生本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))描述了Qβ A1融合蛋白，其中該表位在位點19處平截的Qβ CP延伸的C端融合。
如Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))所述，展示融合表位的顆粒的裝配一般需要存在A1蛋白-血管緊張肽部分融合和野生型CP，才能形成鑲嵌顆粒。然而，本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括包含病毒樣顆粒、特別是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP(其僅僅由融合至少一個血管緊張肽部分的VLP亞單位組成)的實施方案。
鑲嵌顆粒的產(chǎn)生可以用許多方法實現(xiàn)。Kozlovska等人，Intervirology 399-15(1996)描述了兩種方法，它們均能在本發(fā)明的實施中使用。第一種方法，通過在大腸桿菌株中表達(dá)在CP與CP延伸之間含有一個UGA終止密碼子的編碼QβA1融合蛋白的質(zhì)粒，介導(dǎo)VLP上融合表位的有效展示，該大腸桿菌株攜帶編碼克隆的UGA抑制性tRNA的質(zhì)粒，使UGA密碼子翻譯為Trp(pISM3001質(zhì)粒(SmileyB.K.等人，Gene 13433-40(1993))。另一種方法，將CP基因終止密碼子修飾為UAA，與表達(dá)A1蛋白-血管緊張肽部分融合蛋白的第二種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。該第二種質(zhì)粒編碼一種不同的抗生素耐藥性，其復(fù)制起點與第一種質(zhì)粒相一致(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))。第三種方法，CP和A1蛋白-血管緊張肽部分融合蛋白以雙順反子的形式編碼，與一種啟動子如Trp啟動子有效連接，如Kozlovska等人，Intervirology 399-15(1996)的圖1所示。
在另外一個實施方案中，血管緊張肽部分被插入fr CP的氨基酸2與3之間(切割的CP的編號，即其中N端蛋氨酸被切除)，從而產(chǎn)生血管緊張肽部分-fr CP融合蛋白。用于構(gòu)建和表達(dá)可自裝配為VLP的fr CP融合蛋白并且在本發(fā)明中有用的載體和表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被描述(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一個具體實施方案中，血管緊張肽部分序列被插入fr CP缺失變體內(nèi)氨基酸2之后，其中fr CP的殘基3和4已缺失(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。
表位在RNA噬菌體MS-2外殼蛋白N端突起的β-發(fā)夾中的融合，以及隨后融合表位在RNA噬菌體MS-2的自裝配VLP上的呈遞，也已經(jīng)被描述(WO 92/13081)，血管緊張肽部分通過插入或置換融合到MS-2 RNA噬菌體的外殼蛋白內(nèi)也屬于本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，血管緊張肽部分與乳頭瘤病毒的衣殼蛋白融合。在一個更具體的實施方案中，血管緊張肽部分與1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1融合。用于構(gòu)建及在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)BPV-1融合蛋白的載體和表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被描述(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用一種血管緊張肽部分置換BLV-1 L1的氨基酸130-136產(chǎn)生BPV-1 L1-血管緊張肽部分融合蛋白，是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。在桿狀病毒載體中的克隆以及在桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中的表達(dá)已經(jīng)被描述，并能夠在本發(fā)明的實施中應(yīng)用(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。展示融合血管緊張肽部分的裝配顆粒可以用多種方法進(jìn)行純化，如凝膠過濾或蔗糖梯度超速離心(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，血管緊張肽部分與能夠摻入TyVLP內(nèi)的Ty蛋白融合。在一個更具體的實施方案中，血管緊張肽部分與p1或TYA基因編碼的衣殼蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))。酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1、2、3、4已經(jīng)從釀酒酵母中分離，而逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1已經(jīng)從粟酒裂殖酵母中分離(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“酵母轉(zhuǎn)座因子”，《酵母的分子和細(xì)胞生物學(xué)基因組動力學(xué)、蛋白質(zhì)合成和能量學(xué)》，p.193，Cold Spring HarborLaboratory Press(1991))。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1和2與植物和動物組分的copia類別有關(guān)，而Ty3屬于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的gypsy家族，它與植物和動物逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)。在Ty1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中，p1蛋白，也被稱為Gag或衣殼蛋白，長度為440個氨基酸。在VLP的成熟過程中p1在位點408處被切割，產(chǎn)生p2蛋白，后者是VLP的基本成分。
與p1的融合蛋白和在酵母中表達(dá)所述融合蛋白的載體已經(jīng)被描述(Adams，S.E.等人，Nature 32968-70(1987))。例如，通過向pMA5620質(zhì)粒的BamHI位點內(nèi)插入編碼血管緊張肽部分的序列，該血管緊張肽部分可以與p1融合(Adams，S.E.等人，Nature 32968-70(1987))。將編碼外源表位的序列克隆到pMA5620載體內(nèi)導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)，該融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端與外源表位的N端融合。同樣，血管緊張肽部分的N端融合，或向p1序列內(nèi)的內(nèi)部插入，或p1序列一部分的置換，也屬于本發(fā)明的范圍。具體而言，血管緊張肽部分被插入Ty序列內(nèi)Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之間(EP0677111)，產(chǎn)生本發(fā)明的優(yōu)選適于融合血管緊張肽部分的其它VLP有，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒(WO9630523)、HIV2 Gag(Kang，Y.C.等人，Biol.Chem.380353-364(1999))、豇豆花葉病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380387-392(1999))、細(xì)小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等人，Virology26389-99(1999))、HBsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。
適于本發(fā)明的嵌合VLP的實例還包括Intervirology 391(1996)所述?？稍诒景l(fā)明中使用的VLP的其它例子有HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、煙草花葉病毒。也已經(jīng)制備了SV40、多瘤病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、輪狀病毒和諾瓦克病毒的病毒樣顆粒，這些VLP的嵌合VLP也屬于本發(fā)明的范圍。
交聯(lián)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道連接血管緊張肽部分與核心顆粒的方法，有大量參考文獻(xiàn)可幫助技術(shù)人員(例如，Sambrook，J.等人編著，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人編著，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Celis，J.編著，《細(xì)胞生物學(xué)》，Academic Press，第二版，(1998)；Harlow，E.和Lane，D.，《抗體實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)，全部在此完整引用作為參考。
本文描述了核心顆粒與血管緊張肽部分結(jié)合的不同方法，并在2002年1月18日提交的共同未決的美國專利申請?zhí)?0/050,902中進(jìn)一步描述，在此完整引用作為參考。方法包括，JUN和FOS亮氨酸拉鏈蛋白域分別用作本發(fā)明的第一和第二附著位點。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括非天然分子支架與血管緊張肽部分通過化學(xué)交聯(lián)偶聯(lián)。已經(jīng)研制了大量化合物來促進(jìn)蛋白質(zhì)/肽的交聯(lián)或蛋白質(zhì)與衍化分子(例如血管緊張肽部分)的偶聯(lián)。包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的羧酸衍化的活性酯(活化的化合物)、混合酸酐、酰鹵、?；B氮、烷基鹵、N-馬來酰亞胺、亞氨基酯、異氰酸酯和異硫氰酸酯。它們能夠與蛋白質(zhì)分子的反應(yīng)性基團(tuán)形成共價鍵。根據(jù)活性基團(tuán)的不同，反應(yīng)性基團(tuán)是一種蛋白質(zhì)分子上的賴氨酸殘基的氨基，或一種載體蛋白質(zhì)或修飾載體蛋白質(zhì)分子中的硫醇基，它們在反應(yīng)時導(dǎo)致酰胺、胺、硫醚、脒、脲或硫脲鍵的形成。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定其它合適的活性基團(tuán)，例如，見普通參考文獻(xiàn)，如《(蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)的化學(xué)》(Wong(1991)CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)la.)。大多數(shù)試劑優(yōu)先與賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)。
在一些實施方案中，使用異雙功能交聯(lián)劑，使血管緊張肽部分通過化學(xué)交聯(lián)附著于核心顆粒。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知。在一個實施方案中，異雙功能交聯(lián)劑含有一個能夠與核心顆粒的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基反應(yīng)的功能基團(tuán)，以及另一個能夠與血管緊張肽部分上存在(可通過還原使之能夠參與反應(yīng))或構(gòu)建(任選地也可通過還原使之能夠參與反應(yīng))的半胱氨酸殘基或巰基反應(yīng)的功能基團(tuán)。該方法的第一步，稱為衍化，是核心顆粒與交聯(lián)劑反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物是活化的核心顆粒，也稱為活化載體。第二步，用常用方法如凝膠過濾或透析除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。第三步，抗原(例如血管緊張肽部分)與活化的核心顆粒反應(yīng)，該步驟被稱為偶聯(lián)步驟。未反應(yīng)的抗原任選地可在第四步除去。
在一個替代實施方案中，用適于交聯(lián)第一附著位點的活性部分衍化血管緊張肽部分，產(chǎn)生活化的血管緊張肽部分。這種衍化可以在分離的血管緊張肽部分上發(fā)生或者通過化學(xué)合成發(fā)生?；罨难芫o張肽部分然后與核心顆粒反應(yīng)，從而發(fā)生偶聯(lián)。
有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知。包括交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它可利用的交聯(lián)劑，例如可從Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)獲得，含有一個氨基反應(yīng)性的功能基團(tuán)和一個SH殘基反應(yīng)性的功能基團(tuán)。上述交聯(lián)劑均能導(dǎo)致硫醚鍵的形成。適用于本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑，其特征在于偶聯(lián)后在血管緊張肽部分與核心顆粒之間引入一個二硫鍵。屬于這一類的交聯(lián)劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。根據(jù)有機化學(xué)領(lǐng)域的反應(yīng)理論，眾所周知，交聯(lián)劑衍化核心顆粒的程度可能受不同實驗條件影響，如每個反應(yīng)物的濃度，一種試劑相對于另一種試劑的過量程度，pH，溫度和離子強度。偶聯(lián)程度，即每個載體上血管緊張肽部分的數(shù)量，可通過改變上述實驗條件來調(diào)節(jié)，以滿足疫苗的要求。血管緊張肽部分的溶解度可能限制能夠在每個亞單位上偶聯(lián)的抗原的數(shù)量，當(dāng)獲得的疫苗不可溶時，減少每個亞單位上抗原的數(shù)量是有利的。
在一個具體實施方案中，化學(xué)試劑是異雙功能交聯(lián)劑ε-馬來酰亞氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Tanimori等人，J.Pharm.Dyn.4812(1981)；Fujiwara等人，J.Immunol.Meth.45195(1981))，其含有(1)氨基反應(yīng)性的琥珀酰亞胺基，和(2)SH基反應(yīng)性的馬來酰亞胺基?？梢愿脑斓谝桓街稽c的異源蛋白質(zhì)或多肽，使之含有一個或多個賴氨酸殘基，作為異雙功能交聯(lián)劑的琥珀酰亞胺部分的反應(yīng)部分。一旦與異源蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基化學(xué)偶聯(lián)，異雙功能交聯(lián)劑的馬來酰亞胺基即可與抗原或抗原決定簇上半胱氨酸殘基的SH基反應(yīng)。在此情況下，抗原或抗原決定簇的制備可能需要構(gòu)建一個巰基作為第二附著位點，使其可與交聯(lián)劑上的游離馬來酰亞胺功能基團(tuán)反應(yīng)，而該交聯(lián)劑與非天然分子支架第一附著位點結(jié)合。因此，在這種情況下，異雙功能交聯(lián)劑與非天然分子支架的第一附著位點結(jié)合，并且將該支架與血管緊張肽部分的第二結(jié)合位點連接。
血管緊張肽部分與核心顆粒偶聯(lián)的其它方法包括血管緊張肽部分與核心顆粒利用碳二亞胺鍵交聯(lián)的方法。這包括碳二亞胺EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS。一種方法，EDC與含有游離羧酸、氨基或氨基部分的血管緊張肽部分混合，然后添加到蛋白質(zhì)載體上。其它方法中，使用同雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或其它已知的均一雙功能交聯(lián)劑(其含有對核心顆粒的胺基或羧基具有反應(yīng)性的功能基團(tuán))，使該部分附著于核心顆粒。
適于將半抗原分別附著于核心顆粒和病毒樣顆粒的其它交聯(lián)方法和交聯(lián)劑，以及進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)和使用化學(xué)交聯(lián)劑的指示和化學(xué)交聯(lián)方法，可見Hermanson，G.T.《生物偶聯(lián)技術(shù)》，Academic Press Inc.，SanDiego，CA，USA。
將核心顆粒與血管緊張肽部分結(jié)合的其它方法包括核心顆粒被生物素標(biāo)記、該部分與鏈霉親和素融合的方法，或該部分和核心顆粒均被生物素標(biāo)記的方法。在這種情況下，通過調(diào)節(jié)血管緊張肽部分與鏈霉親和素的比例，首先使該部分與鏈霉親和素或親和素結(jié)合，使得仍有游離結(jié)合位點可與下一步添加的核心顆粒結(jié)合。此外，也可以在“一鍋”反應(yīng)中混合所有成分。其它配體-受體對也可以作為結(jié)合血管緊張肽部分與核心顆粒的結(jié)合劑，其中有能夠與核心顆粒或血管緊張肽部分交聯(lián)的受體和配體的可溶形式。
血管緊張肽部分因此，本發(fā)明的一個方面是提供適用于針對血管緊張肽部分免疫的這些部分的有序、重復(fù)陣列。優(yōu)選的血管緊張肽部分是包含或由血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的序列或其片段組成的。如上所述，可以向血管緊張肽部分序列的C端或N端適當(dāng)添加一個或多個額外氨基酸，以確保特別是血管緊張肽部分與核心顆粒定向、有序的結(jié)合。
在本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑中使用的優(yōu)選的血管緊張肽部分是包含或由血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的全長序列組成的。優(yōu)選地，血管緊張肽部分包含或由下列序列組成血管緊張肽II的全長序列，如CGGDRVYIHPF(在此稱為“Angio 1”；血管緊張肽序列之外的氨基酸用斜體表示)，或血管緊張肽I的全長序列，如CGGDRVYIHPFHL(“Angio 2”)，DRVYIHPFHL GGC(“Angio 3”)和CDRVYIHPFHL(“Angio 4”)。其它優(yōu)選的實施方案是包含或由血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II序列的片段組成的血管緊張肽部分。一些這樣的實施方案包括包含或由血管緊張肽C端的至少3個氨基酸組成的血管緊張肽部分，在一個替代實施方案中，其N端的至少4個氨基酸被刪除。其它有關(guān)實施方案包括來源于血管緊張肽I的血管緊張肽部分，如CHPFHL(“Angio 5”)和CGPFHL(“Angio6”)，或來源于血管緊張肽II的血管緊張肽部分，如CYIHPF(“Angio7”)、CGIHPF(“Angio 8”)和CGGHPF(“Angio 9”)。
本發(fā)明的其它實施方案使用包含或由血管緊張肽N端至少3個氨基酸組成的血管緊張肽部分，在一個更優(yōu)選的實施方案中，C端至少4個、優(yōu)選地5個氨基酸被刪除。其它相關(guān)實施方案有DRVYIGGC(“Angio 13”)、DRVYGGC(“Angio 14”)和DRVGGC(“Angio 15”)。
然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，血管緊張肽部分的上述例子是非限制性實例，為了偶聯(lián)在C端或N端添加的氨基酸的數(shù)量和性質(zhì)可能不同。
在本發(fā)明中，用于免疫的血管緊張肽部分不是必須含有任何特定血管緊張肽部分的全部完整分子。可以使用血管緊張肽部分的片段或其衍生物、突變體或突變型蛋白產(chǎn)生對目的血管緊張肽部分的適當(dāng)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明包括不同的連接位點和血管緊張肽部分與核心顆粒的連接方法，本文的其它部分描述了其非限制性實例。優(yōu)選的連接位點和連接方法也可由普通熟練技術(shù)人員根據(jù)已有經(jīng)驗、理論和常規(guī)實驗確定。
偶聯(lián)物、疫苗和使用方法本發(fā)明提供可用于預(yù)防和/或緩解與RAS的一種或多種成分(特別是一種或多種血管緊張肽部分)有關(guān)的疾病的偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供用來預(yù)防和/或緩解個體、特別是動物(如哺乳動物，特別是人)疾病或病癥的接種方法。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑刺激免疫應(yīng)答，導(dǎo)致可與一種或多種血管緊張肽部分結(jié)合的免疫分子(包括抗體)的產(chǎn)生。本發(fā)明還提供用來預(yù)防和/或緩解個體的RAS相關(guān)疾病或病癥的接種方法。
免疫應(yīng)答的性質(zhì)或類型不是本公開內(nèi)容的限制性因素。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的原則，根據(jù)疾病的不同，治療或預(yù)防性免疫應(yīng)答所希望的結(jié)果可能不同。下面的技術(shù)性說明并非意在限制本發(fā)明，本發(fā)明的偶聯(lián)物可誘導(dǎo)與一種以上血管緊張肽部分結(jié)合的抗體，從而同時阻斷所有相關(guān)的血管緊張肽種類?；蛘?，誘導(dǎo)的抗體可特異性結(jié)合血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的C端。在這些條件下，誘導(dǎo)的抗體將阻斷腎素或ACE分別對血管緊張肽原或血管緊張肽I的激活。然而，不同于ACE或腎素的蛋白酶，如內(nèi)肽酶和氨肽酶，能夠從N端降解血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II，從而阻止與抗體結(jié)合的完整的血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的積累。
此外，根據(jù)本領(lǐng)域公知的原則，根據(jù)不同疾病，可能希望刺激不同類型的免疫應(yīng)答。例如，眾所周知，某些免疫應(yīng)答比其它免疫應(yīng)答更適于特定抗原。某些免疫應(yīng)答實際上是不適當(dāng)?shù)?，能夠引起病狀，如病理性炎癥。
抗原性質(zhì)、導(dǎo)入體內(nèi)的途徑、劑量、給藥方案、抗原的重復(fù)性質(zhì)、宿主背景和免疫系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)因子可能夠影響免疫應(yīng)答的性質(zhì)。這些知識在本領(lǐng)域眾所周知。同樣，利用本領(lǐng)域公知的理論和常規(guī)實驗可以調(diào)整免疫應(yīng)答。
此外，本發(fā)明還包括在對血管緊張肽部分接種過程中使用不同的核心顆粒。對核心顆粒如菌毛產(chǎn)生強烈免疫應(yīng)答的個體，可以用包含相同血管緊張肽部分但核心顆粒不同的偶聯(lián)物免疫。
不希望局限于理論，作為產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物制劑，特別是作為針對一種或多種血管緊張肽部分的疫苗，本發(fā)明的現(xiàn)有偶聯(lián)物具有新的出人意料的優(yōu)點。本領(lǐng)域周知的其它載體，包括BSA、匙孔血藍(lán)素、破傷風(fēng)類毒素、細(xì)菌外膜蛋白、霍亂毒素和銅綠假單胞菌外毒素A，對個體可能不適用，特別是對于人。上述載體可誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)，或刺激病理性免疫應(yīng)答(例如霍亂毒素、KLH、BSA)。上述載體可能需要使用佐劑，如現(xiàn)在認(rèn)為不適于人用的弗氏完全佐劑。有大量載體可能是現(xiàn)有疫苗的成分(例如，破傷風(fēng)類毒素、霍亂毒素、外毒素A)。因此，一個個體可能已經(jīng)具有對這些載體的高水平免疫，因此用抗原-載體偶聯(lián)物免疫將比新型抗原誘發(fā)針對載體的相對更強的免疫應(yīng)答。由于其中一個或全部這些原因，本發(fā)明的偶聯(lián)物和制劑與上述載體蛋白相比是有益的改進(jìn)。
在本發(fā)明實施方案的應(yīng)用中，與核心顆粒偶聯(lián)的一種或多種血管緊張肽部分能夠被抗原呈遞細(xì)胞攝取，從而刺激T細(xì)胞輔助誘發(fā)免疫應(yīng)答。T輔助細(xì)胞應(yīng)答可被分為1型(TH1)和2型(TH2)T輔助細(xì)胞應(yīng)答(Romagnani，Immunol.Today 18263-266(1997))。TH1細(xì)胞分泌干擾素-γ和其它細(xì)胞因子，引發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1-3抗體。相反，TH2細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子是IL-4，它使B細(xì)胞產(chǎn)生IgG4和IgE。在許多實驗系統(tǒng)中，TH1和TH2應(yīng)答的發(fā)展互相排斥，因為TH1細(xì)胞抑制TH2細(xì)胞的誘導(dǎo)，反之亦然。因此，引發(fā)強烈TH1應(yīng)答的抗原同時抑制TH2應(yīng)答的發(fā)展，因此抑制IgE抗體的產(chǎn)生。有趣的是，實際上所有病毒都在宿主中誘發(fā)TH1應(yīng)答，但不能引發(fā)IgE抗體的產(chǎn)生(Coutelier等人，J.Exp.Med.16564-69(1987))。IgE同型抗體是變態(tài)反應(yīng)的重要成分。肥大細(xì)胞在其表面結(jié)合IgE抗體，并且在特異抗原與結(jié)合在肥大細(xì)胞表面的IgE分子結(jié)合后，釋放組胺和變態(tài)反應(yīng)的其它介質(zhì)。TH1應(yīng)答典型的同型模式不限于活病毒，用滅活或重組病毒顆粒也可觀察到(Lo-Man等人，Eur.J.Immunol.281401-1407(1998))。因此，利用本發(fā)明的方法(例如AlphaVaccine技術(shù))，病毒顆粒能夠裝載不同的血管緊張肽部分，用于免疫。由于產(chǎn)生這種陣列的“病毒結(jié)構(gòu)”，將引發(fā)TH1應(yīng)答，產(chǎn)生“保護(hù)性”IgG1-3抗體，并且阻止產(chǎn)生引起變態(tài)反應(yīng)的IgE抗體。因此，本發(fā)明包括能夠誘發(fā)優(yōu)選的免疫應(yīng)答(特別是TH1型應(yīng)答)的偶聯(lián)物。此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明的偶聯(lián)物對抗由針對目的抗原的其他疫苗誘發(fā)的變態(tài)反應(yīng)的用途。
本發(fā)明的另一個有利特征是，血管緊張肽部分可以在顆粒上以有序、重復(fù)的陣列存在，無論是否有T細(xì)胞輔助，均能夠誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的這一特征特別有用。
與分離的蛋白質(zhì)不同，在不使用任何佐劑、有及沒有T細(xì)胞輔助的情況下，病毒均誘發(fā)快速、有效的免疫應(yīng)答(Bachmann &Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。盡管病毒通常僅含極少的蛋白質(zhì)，但它們比其分離成分能引發(fā)更強的免疫應(yīng)答。對于B細(xì)胞應(yīng)答，已知病毒免疫原性的一個關(guān)鍵因素是表面表位的重復(fù)性和順序。許多病毒展示一種準(zhǔn)晶體表面，其表面顯示有序的表位陣列，可有效交聯(lián)B細(xì)胞上表位特異性免疫球蛋白(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。B細(xì)胞上表面免疫球蛋白的這種交聯(lián)是一種強激活信號，可直接誘導(dǎo)細(xì)胞周期的進(jìn)展和IgM抗體的產(chǎn)生。進(jìn)而，這些觸發(fā)的B細(xì)胞能夠激活T輔助細(xì)胞，T輔助細(xì)胞隨后誘導(dǎo)B細(xì)胞由產(chǎn)生IgM抗體向產(chǎn)生IgG抗體的轉(zhuǎn)換，以及長期B細(xì)胞記憶的產(chǎn)生一這是所有接種的目標(biāo)(Bachmann &Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。本發(fā)明提供一種提高接種效果的方法，是通過血管緊張肽部分與核心顆粒結(jié)合，提高用于免疫的血管緊張肽部分的重復(fù)程度。如前所述，本發(fā)明提供所含的核心顆粒經(jīng)修飾改變了形成體(orgnizer)數(shù)量和/或排列的偶聯(lián)物。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)對個體施用本發(fā)明的偶聯(lián)物時，該偶聯(lián)物可存在于含有鹽、緩沖液、佐劑或希望用來提高偶聯(lián)物效能的其它物質(zhì)的制劑(conjugate)中。大量資料，包括Remington’sPharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))中提供了適于制備藥物制劑的材料的例子。
如果接受個體能夠耐受本發(fā)明偶聯(lián)物的施用，則認(rèn)為該偶聯(lián)物是“藥物學(xué)可接受的”。進(jìn)而，本發(fā)明的偶聯(lián)物將以“治療有效量”(即產(chǎn)生希望的生理學(xué)效果的量)施用。
為了誘發(fā)免疫應(yīng)答，可以用本領(lǐng)域周知的多種方法對動物(適當(dāng)?shù)貫椴溉閯游?，如?施用本發(fā)明的偶聯(lián)物，但是通常通過注射、輸液、吸入、口服或其它適當(dāng)?shù)奈锢矸椒ńo藥。該偶聯(lián)物也可肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮膚或皮下施用。給藥制劑的成分包括無菌水(例如生理鹽水)或非水性溶液和懸液。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和注射用有機酯如油酸乙酯?？梢岳幂d體或封閉敷料提高皮膚通透性并促進(jìn)抗原吸收。
本發(fā)明的其它實施方案包括用本發(fā)明的偶聯(lián)物免疫產(chǎn)生的免疫分子。免疫分子包括抗體和T細(xì)胞受體。這些免疫分子可用于接種的個體，結(jié)合一種或多種靶性血管緊張肽部分。當(dāng)轉(zhuǎn)移給未對本發(fā)明的偶聯(lián)物或制劑免疫的另外的個體時，免疫分子也可能是有用的，從而“被動”轉(zhuǎn)移了免疫。在一個實施方案中，免疫分子是一種抗體?？梢詫⑦m于結(jié)合一種或多種血管緊張肽部分的一種單克隆抗體轉(zhuǎn)移到個體內(nèi)，實現(xiàn)治療或預(yù)防。
本發(fā)明也包括用本發(fā)明的偶聯(lián)物免疫產(chǎn)生的抗體在試劑盒中的使用，用于通過免疫測定(例如ELISA)檢測一種或多種血管緊張肽部分。在一個相關(guān)實施方案中，血管緊張肽部分的重復(fù)、有序陣列能夠用于通過結(jié)合試驗檢測這些部分的抗體。本發(fā)明的其它實施方案包括生產(chǎn)本發(fā)明的偶聯(lián)物的方法，和使用這些偶聯(lián)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療的方法，特別是治療一種或多種RAS相關(guān)疾病，如高血壓、中風(fēng)、梗塞、充血性心力衰竭、腎衰竭或視網(wǎng)膜出血。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明的范圍或其任何實施方案的情況下，可以對此處所述的方法和用途進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和修改?，F(xiàn)在已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，通過下列實施例將能更清楚地理解本發(fā)明，這些實施例只是用于說明，并非意在限制本發(fā)明。
實施例實施例1來源于血管緊張肽I和血管緊張肽II的肽與Qβ的偶聯(lián)，以及用獲得的偶聯(lián)物對小鼠的免疫A.偶聯(lián)物的產(chǎn)生化學(xué)合成下列血管緊張肽部分CGGDRVYIHPF(“Angio 1”)，CGGDRVYIHPFHL(“Angio 2”)，DRVYIHPFHLGGC(“Angio 3”)，CDRVYIHPFHL(“Angio 4”)，CHPFHL(“Angio 5”)，CGPFHL(“Angio6”)，CYIHPF(“Angio 7”)，CGIHPF(“Angio 8”)，CGGHPF(“Angio9”)，DRVYIGGC(“Angio 13”)，DRVYGGC(“Angio 14”)，DRVGGC(“Angio 15”)。如下所述用它們與Qβ化學(xué)偶聯(lián)。
對于肽Angio 1-Angio 45ml 2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mMHepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液與507μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上25℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析兩次各2小時。665μl透析的反應(yīng)混合液然后與2.8μl每種相應(yīng)100mM肽貯存溶液(DMSO溶液)在25℃搖床上反應(yīng)2小時。反應(yīng)混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析2次各2小時。
對于肽Angio 5-9和Angio 13-153ml 2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與86μl 100mM SMPH(琥珀酰亞胺基-6-(β-馬來酰亞氨基丙酰氨基己酸酯，Pierce)DMSO溶液在25℃搖床上反應(yīng)50分鐘。反應(yīng)溶液隨后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl，pH7.2透析兩次各2小時。514μl透析的反應(yīng)混合液然后與3.6μl每種相應(yīng)100mM肽貯存溶液(DMSO溶液)在25℃搖床上反應(yīng)4小時。反應(yīng)混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析2次各2小時。
B.免疫對雌性Balb/C小鼠接種與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的9種血管緊張肽衍生物之一，其中不添加佐劑。每種樣品的50μg(Qβ-Angio 1-4疫苗)或20μg(Qβ-Angio 5-9疫苗)總蛋白用PBS稀釋為200μl，于第0天和第14天皮下注射(100μl，腹部兩側(cè))。對小鼠在第21天眼眶后放血，用血管緊張肽特異的ELISA分析其血清。
應(yīng)當(dāng)注意到，人和鼠的血管緊張肽序列彼此相同。因此，分別用本發(fā)明的包含血管緊張肽部分作為抗原決定簇的疫苗或偶聯(lián)物免疫人或小鼠，是針對自身抗原的接種。
實施例2接種與Qβ偶聯(lián)的來源于血管緊張肽I和血管緊張肽II的肽的小鼠血清的ELISA分析使用化學(xué)交聯(lián)劑sulfo-SPDP，將如實施例1所述制備的Angio 1-Angio 9和Angio 13-15肽衍生物分別與牛RNAse A(Sigma)偶聯(lián)。ELISA板用溶于包被緩沖液(0.1M NaH2CO3，pH9.6)的濃度為10μg/ml的偶聯(lián)的RNAse制品4℃包被過夜。此外，血管緊張肽I或血管緊張肽II(SIGMA)也用相同的包被緩沖液稀釋為200μg/ml的濃度。在37℃下用封閉緩沖液(2％牛血清白蛋白(BSA)，PBS(pH7.4)/0.05％Tween 20)封閉板2小時，用PBS(pH7.4)/0.05％Tween 20洗滌，然后在室溫下與封閉緩沖液無菌稀釋的小鼠血清孵育2小時。用PBS(pH7.4)/0.05％Tween 20洗板，然后在室溫下與1μg/ml辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch)孵育1小時。用PBS(pH7.4)/0.05％Tween 20洗板，添加底物溶液(0.066M Na2HPO4，0.035M檸檬酸(pH5.0)+0.4mg OPD(1，2-苯二胺二鹽酸鹽)+0.01％H2O2)。10分鐘后，用5％H2SO4終止顯色反應(yīng)，在450nm處讀取吸光度。
檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。用與Qβ或其它載體交聯(lián)的無關(guān)肽免疫小鼠，用其血清進(jìn)行對照ELISA實驗，表明檢測到的抗體是對各自肽特異的抗體。ELISA滴度計算為在ELISA中產(chǎn)生半數(shù)最大信號(最大光密度的50％)的血清稀釋度倒數(shù)。
結(jié)果圖1顯示在使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 1-4肽免疫的小鼠血清中，Angio 2肽和血管緊張肽I特異性IgG抗體的ELISA分析。在圖中，Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio 4代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，見上述對血管緊張肽的定義。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接種溶于PBS的50μg疫苗。于第21天測定接種Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 2、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio4的小鼠血清中針對與RNAseA偶聯(lián)的Angio 2肽和針對血管緊張肽I的IgG抗體。分析免疫前血清作為對照。指定血清稀釋度的結(jié)果顯示為450nm處的光密度。對于Angio 2，顯示了每組3只小鼠的平均值(包括標(biāo)準(zhǔn)差)。對于血管緊張肽I，顯示了每組兩只小鼠的平均值。接種的所有小鼠均產(chǎn)生抗Angio 2肽及血管緊張肽1的特異性IgG抗體，但是用Angio 2、Angio 3或Angio 4肽免疫的小鼠比接種Angio1肽的小鼠顯示更高的滴度，這與Angio 2、Angio 3和Angio 4肽與血管緊張肽I的密切相似性有關(guān)。
圖2顯示在使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 1-4肽免疫的小鼠血清中，Angio 1肽和血管緊張肽II特異性IgG抗體的ELISA分析。在圖中，Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio 4代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，見上述血管緊張肽的定義。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接種溶于PBS的50μg疫苗。于第21天測定接種Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 2、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio 4的小鼠血清中針對與RNAseA偶聯(lián)的Angio 1肽和針對血管緊張肽II的IgG抗體。分析免疫前血清作為對照。指定血清稀釋度的結(jié)果顯示為450nm處的光密度。對于Angio 1，顯示了每組3只小鼠的平均值(包括標(biāo)準(zhǔn)差)。對于血管緊張肽II，顯示了每組兩只小鼠的平均值。接種的所有小鼠均產(chǎn)生抗Angio 1肽及血管緊張肽II的特異性IgG抗體，但是用Angio 1肽免疫的小鼠顯示最高的滴度，這與Angio 1肽與血管緊張肽II的密切相似性有關(guān)。
圖3顯示在使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 5-9肽免疫的小鼠血清中，Angio 2肽和血管緊張肽I特異性IgG抗體的ELISA分析。在圖中，Qβ-Angio 5、Qβ-Angio 6、Qβ-Angio 7、Qβ-Angio 8和Qβ-Angio9代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，見上述血管緊張肽的定義。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接種溶于PBS的20μg疫苗。于第21天測定接種Qβ-Angio 4、Qβ-Angio 5、Qβ-Angio 6、Qβ-Angio7、Qβ-Angio 8和Qβ-Angio 9的小鼠血清中針對與RNAseA偶聯(lián)的Angio 2肽和針對血管緊張肽I的IgG抗體。指定血清稀釋度的結(jié)果顯示為450nm處的光密度。顯示了每組2只小鼠的平均值。接種Qβ-Angio 8和Qβ-Angio 9的2只小鼠顯示極低的或者沒有抗Angio 2肽及血管緊張肽I的特異性滴度，表明這兩種類型的疫苗誘導(dǎo)主要對血管緊張肽II的C端特異但不是血管緊張肽I特異的抗體(參見圖4)。
圖4顯示在使用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio 5-9肽免疫的小鼠血清中，Angio 1肽和血管緊張肽II特異性IgG抗體的ELISA分析。在圖中，Qβ-Angio 5、Qβ-Angio 6、Qβ-Angio 7、Qβ-Angio 8和Qβ-Angio9代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，見上述血管緊張肽的定義。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接種溶于PBS的20μg疫苗。于第21天測定接種Qβ-Angio 4、Qβ-Angio 5、Qβ-Angio 6、Qβ-Angio7、Qβ-Angio 8和Qβ-Angio 9的小鼠血清中針對與RNAseA偶聯(lián)的Angio 1肽和針對血管緊張肽II的IgG抗體。指定血清稀釋度的結(jié)果顯示為450nm處的光密度。顯示了每組2只小鼠的平均值。接種Qβ-Angio 5和Qβ-Angio 6的2只小鼠顯示極低的或者沒有抗Angio 1肽及血管緊張肽II的特異滴度，表明這兩種類型的疫苗誘導(dǎo)主要對血管緊張肽I的C端特異但不是血管緊張肽II特異的抗體(參見圖3)。
下表概括了接種與Qβ偶聯(lián)的Angio肽1-9的小鼠血清的ELISA分析。第21天的平均ELISA滴度如實施例2所述計算。
表1用于接種小鼠的血管緊張肽衍生的肽，以及產(chǎn)生的針對所使用的肽及血管緊張肽I和血管緊張肽II的抗體應(yīng)答
*n.t.＝未檢測注意對于檢測的所有抗原，免疫前血清的滴度低于50。
Angio 5和Angio 6的結(jié)果表明，能夠誘導(dǎo)選擇性識別血管緊張肽I的肽。此外，Angio 7-9的結(jié)果表明，能夠誘導(dǎo)選擇性識別血管緊張肽II而非血管緊張肽I的抗體。血管緊張肽I和II僅在C端有兩個氨基酸不同，而仍有8個氨基酸相同，這些結(jié)果證實，Angio 5或Angio6誘導(dǎo)的所有抗體均選擇性識別血管緊張肽I的C端，而Angio 7-9、特別是Angio 8-9誘導(dǎo)的抗體選擇性識別血管緊張肽II的C端。因此，共有的8個氨基酸不被識別，特別是共有的N端不被識別。這表明，當(dāng)結(jié)合時N端不會被埋藏于抗體內(nèi)部，因此蛋白酶可及。
為了清楚地理解，已經(jīng)通過說明和實施例全面、詳細(xì)地描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在廣泛和相當(dāng)范圍的條件、組成和其它參數(shù)內(nèi)修改或改變本發(fā)明，也能夠進(jìn)行本發(fā)明，而不影響本發(fā)明或其任何具體實施方案的范圍，這些修改或改變將包括在附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本說明書中提到的所有公開文本、專利和專利申請均代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，在此引用作為參考，如同每個公開文本、專利或?qū)＠暾執(zhí)貏e地、單獨地被指出作為參考引用。
序列表SEQ ID No. 1Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185SEQ ID No. 2Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Thr Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr20 25 30Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala35 40 45Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser50 55 60Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln65 70 75 80Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe85 90 95Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln100 105 110Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp115 120 125Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu130 135 140Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr145 150 155 160Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr165 170 175Phe Lys Val Gln Tyr Gln180
SEQ ID No. 3Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130SEQ ID No. 4Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Ser Lys pro Asp Pro Val Ile Pro Asp pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325SEQ ID No.5有意留白SEQ ID No.6“Qβ 240”AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYSEQ ID No. 7“Qβ 243”AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYSEQ ID No. 8“Qβ 250”ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYSEQ ID No. 9“Qβ 259”ARLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYSEQ ID No. 10“Qβ 251”AKLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYSEQ ID No. 11CGAGCTCGCCCCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGA
GGAAAATCACATGGCAAATAAGCCAATGCAACCGATCACATCTACAGCAAATAAAATTGTGTGGTCGGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTGTTACGCCAACGTGTTAAAGTTGGTATAGCCGAACTGAATAATGTTTCAGGTCAATATGTATCTGTTTATAAGCGTCCTGCACCTAAACCGGAAGGTTGTGCAGATGCCTGTGTCATTATGCCGAATGAAAACCAATCCATTCGCACAGTGATTTCAGGGTCAGCCGAAAACTTGGCTACCTTAAAAGCAGAATGGGAAACTCACAAACGTAACGTTGACACACTCTTCGCGAGCGGCAACGCCGGTTTGGGTTTCCTTGACCCTACTGCGGCTATCGTATCGTCTGATACTACTGCTTAAGCTTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTTCCGCACCCCGGAAATGGTCACCGAACCAATCAGCAGGGTCATCGCTAGCCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGCGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATCGCCAGGGTGCCGACGCGCATCTCGACTGCATGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCCGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGCGGAATT
SEQ ID No. 12MANKPMQPITSTANKIVWSDPTRLSTTFSASLLRQRVKVGIAELNNVSGQYVSVYKRPAPKPEGCADACVIMPNENQSIRTVISGSAENLATLKAEWETHKRNVDTLFASGNAGLGFLDPTAAIVSSDTTASEQ ID No. 13MANKTMQPITSTANKIVWSDPTRLSTTFSASLLRQRVKVGIAELNNVSGQYVSVYKRPAPKPEGCADACVIMPNENQSIRTVISGSAENLATLKAEWETHKRNVDTLFASGNAGLGFLDPTAAIVSSDTTASEQ ID No. 14CGAGCTCGCCCCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGATTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCATGGCAAATAAGACAATGCAACCGATCACATCTACAGCAAATAAAATTGTGTGGTCGGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTGTTACGCCAACGTGTTAAAGTTGGTATAGCCGAACTGAATAATGTTTCAGGTCAATATGTATCTGTTTATAAGCGTCCTGCACCTAAACCGGAAGGTTGTGCAGATGCCTGTGTCATTATGCCGAATGAAAACCAATCCATTCGCACAGTGATTTCAGGGTCAGCCGAAAACTTGGCTACCTTAAAAGCAGAATGGGAAACTCACAAACGTAACGTTGACACACTCTTCGCGAGCGGCAACGCCGGTTTGGGTTTCCTTGACCCTACTGCGGCTATCGTATCGTCTGATACTACTGCTTAAGCTTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTTCCGCACCCCGGAAATGGTCACCGAACCAATCAGCAGGGTCATCGCTAGCCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCC
GGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGCGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATCGCCAGGGTGCCGACGCGCATCTCGACTGCATGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCCGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGCGGAATT
權(quán)利要求
1.一種血管緊張肽部分-載體偶聯(lián)物，其包含(a)一種載體，其含有至少一個第一附著位點，和(b)至少一種血管緊張肽部分，其含有至少一個第二附著位點；其中所述載體包含一個核心顆粒；和其中所述第二附著位點能夠通過至少一個共價鍵與所述第一附著位點結(jié)合，以形成有序、重復(fù)的血管緊張肽部分-載體偶聯(lián)物。
2.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述核心顆粒是一種病毒或病毒樣顆粒。
3.一種血管緊張肽部分-載體偶聯(lián)物，其包含(a)一種載體，其含有至少一個第一附著位點，和(b)至少一種血管緊張肽部分，其含有至少一個第二附著位點；其中所述載體包含一個核心顆粒，該顆粒是一種病毒或病毒樣顆粒；其中所述第二附著位點能夠通過至少一個共價鍵與所述第一附著位點結(jié)合，以形成有序、重復(fù)的血管緊張肽部分-載體偶聯(lián)物。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述病毒樣顆粒包含選自下組的重組蛋白或其片段(a)重組乙型肝炎病毒蛋白；(b)重組麻疹病毒蛋白；(c)重組辛德畢斯病毒蛋白；(d)重組輪狀病毒蛋白；(e)重組口蹄疫病毒蛋白；(f)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白；(g)重組諾瓦克病毒蛋白；(h)重組甲病毒蛋白；(i)重組人乳頭瘤病毒蛋白；(j)重組多瘤病毒蛋白；(k)重組噬菌體蛋白；(l)重組RNA噬菌體蛋白；(m)重組Qβ-噬菌體蛋白；(n)重組GA-噬菌體蛋白；(o)重組fr-噬菌體蛋白；(p)重組AP205噬菌體蛋白；和(q)重組Ty蛋白。
5.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述病毒樣顆粒是一種乙型肝炎病毒衣殼蛋白。
6.權(quán)利要求5的偶聯(lián)物，其中乙型肝炎病毒衣殼蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO1的序列80％相同。
7.權(quán)利要求5的偶聯(lián)物，其中通過刪除至少一個賴氨酸殘基、通過插入添加至少一個賴氨酸殘基或置換至少一個賴氨酸殘基，修飾所述外殼蛋白。
8.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述病毒或病毒樣顆粒包含RNA-噬菌體的蛋白質(zhì)或其片段。
9.權(quán)利要求8的偶聯(lián)物，其中所述RNA-噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體AP205；和(1)噬菌體PP7。
10.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述病毒樣顆粒包含噬菌體Qβ的重組蛋白或其片段。
11.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述病毒樣顆粒包含噬菌體fr或噬菌體AP205的重組蛋白或其片段。
12.權(quán)利要求8的偶聯(lián)物，其中所述RNA噬菌體的所述重組蛋白包含突變型外殼蛋白。
13.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述突變型外殼蛋白是通過置換刪除至少一個賴氨酸殘基或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾的。
14.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述突變型外殼蛋白是通過刪除至少一個賴氨酸殘基或者通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾的。
15.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述重組蛋白包含一種或多種含有SEQ ID NO3的氨基酸序列的外殼蛋白。
16.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述重組蛋白包含具有SEQ IDNO4的氨基酸序列的外殼蛋白或其突變體和具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的外殼蛋白的混合物。
17.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述重組蛋白包含突變型Qβ外殼蛋白。
18.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述突變型Qβ外殼蛋白是通過置換除去至少一個賴氨酸殘基或者通過置換添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾的。
19.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述突變型Qβ外殼蛋白通過刪除至少一個賴氨酸殘基或者通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾的。
20.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述突變型Qβ外殼蛋白包含具有選自下組的氨基酸序列的蛋白質(zhì)a)SEQ ID NO6的氨基酸序列；b)SEQ ID NO7的氨基酸序列；c)SEQ ID NO8的氨基酸序列；d)SEQ ID NO9的氨基酸序列；和e)SEQ ID NO10的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述病毒樣顆粒包含一種或多種突變型Qβ外殼蛋白，后者具有選自下組的氨基酸序列a)SEQ ID NO6的氨基酸序列；b)SEQ ID NO7的氨基酸序列；c)SEQ ID NO8的氨基酸序列；d)SEQ ID NO9的氨基酸序列；和e)SEQ ID NO10的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述第一附著位點包含(a)氨基；(b)羧基；(c)巰基；(d)羥基；(e)胍基；或(f)組胺?；?。
23.權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述至少一個第一附著位點選自賴氨酸殘基、精氨酸殘基、半胱氨酸殘基、天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、組氨酸殘基和酪氨酸殘基。
24.權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述至少一個第一附著位點是賴氨酸殘基。
25.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述核心顆粒是一種細(xì)菌菌毛或菌毛樣顆粒。
26.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中菌毛或菌毛樣顆粒包含選自下組之生物產(chǎn)生的菌毛蛋白的蛋白質(zhì)或片段(a)大腸桿菌；(b)流感嗜血桿菌；(c)腦膜炎奈瑟氏球菌；(d)淋病奈瑟氏球菌；(e)新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)；(f)施氏假單胞菌；(g)銅綠假單胞菌；(h)沙門氏菌屬；和(i)霍亂弧菌。
27.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中菌毛顆粒包含選自下組的菌毛蛋白的蛋白質(zhì)或片段(a)1型菌毛蛋白；和(b)P-菌毛蛋白。
28.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中菌毛顆粒包含重組蛋白。
29.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中菌毛顆粒包含重組和非重組蛋白的混合物。
30.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中菌毛顆粒包含I型菌毛蛋白或其片段。
31.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中菌毛顆粒包含突變型菌毛蛋白。
32.權(quán)利要求31的偶聯(lián)物，其中所述突變型菌毛蛋白是通過置換除去至少一個賴氨酸殘基、通過置換添加至少一個賴氨酸殘基、通過刪除至少一個賴氨酸殘基或者通過插入添加至少一個賴氨酸殘基而被修飾的。
33.權(quán)利要求30的偶聯(lián)物，其中所述菌毛顆粒由具有SEQ IDNO2的氨基酸序列的菌毛蛋白組成。
34.權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述血管緊張肽部分是一種血管緊張肽，其中該血管緊張肽優(yōu)選地選自血管緊張肽原、血管緊張肽I、血管緊張肽II及其片段或衍生物。
35.權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中含有所述第二附著位點的所述血管緊張肽部分具有選自下組的氨基酸序列a)CGGDRVYIHPF；b)CGGDRVYIHPFHL；c)DRVYIHPFHLGGC；d)CDRVYIHPFHL；e)CHPFHL；f)CGPFHL；g)CYIHPF；h)CGIHPF；i)CGGHPF；j)DRVYIGGC；k)DRVYGGC；和l)DRVGGC。
36.一種藥物組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物以及一種藥物可接受的載體或賦形劑。
37.一種疫苗組合物，其包含免疫有效量的權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物以及一種免疫學(xué)可接受的載體或賦形劑。
38.權(quán)利要求37的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物還包含至少一種佐劑。
39.一種免疫動物抗血管緊張肽部分的方法，包括在動物能夠發(fā)生對所述血管緊張肽部分的免疫應(yīng)答的條件下，對所述動物施用權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物。
40.權(quán)利要求39的方法，其中通過一種給藥途徑對所述動物施用所述偶聯(lián)物，給藥途徑選自鼻內(nèi)給藥、口服給藥、皮下給藥、經(jīng)皮膚給藥、肌肉內(nèi)給藥和靜脈內(nèi)給藥。
41.權(quán)利要求39的方法，其中對所述動物鼻內(nèi)施用所述偶聯(lián)物。
42.一種免疫動物抗血管緊張肽部分的方法，包括在動物能夠發(fā)生對所述血管緊張肽部分的免疫應(yīng)答的條件下，對所述動物施用權(quán)利要求37的疫苗組合物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中通過一種給藥途徑對所述動物施用所述組合物，給藥途徑選自鼻內(nèi)給藥、口服給藥、皮下給藥、經(jīng)皮膚給藥、肌肉內(nèi)給藥和靜脈內(nèi)給藥。
44.權(quán)利要求42的方法，其中對所述動物鼻內(nèi)施用所述組合物。
45.一種治療或預(yù)防與腎素激活的血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的疾病的方法，包括對需此治療的動物施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的偶聯(lián)物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述與腎素激活的血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的疾病選自高血壓、中風(fēng)、梗塞、充血性心力衰竭、腎衰竭和視網(wǎng)膜出血。
47.一種治療或預(yù)防與腎素激活的血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的疾病的方法，包括對需此治療的動物施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求36的藥物組合物。
48.一種治療或預(yù)防與腎素激活的血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的疾病的方法，包括對需此治療的動物施用免疫有效量的權(quán)利要求37的疫苗組合物。
49.權(quán)利要求47或權(quán)利要求48的方法，其中所述與腎素激活的血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的疾病選自高血壓、中風(fēng)、梗塞、充血性心力衰竭、腎衰竭和視網(wǎng)膜出血。
全文摘要
本發(fā)明提供哺乳動物肽激素血管緊張肽原、血管緊張肽I和血管緊張肽II的肽衍生物的偶聯(lián)物，通過肽衍生物與一種載體特別是病毒樣顆粒(VLP)偶聯(lián)，它們被呈遞在重復(fù)支架中。本發(fā)明還提供生產(chǎn)這些偶聯(lián)物的方法，以及獲得的免疫原偶聯(lián)物在治療和預(yù)防與腎素激活血管緊張肽系統(tǒng)有關(guān)的疾病中的免疫治療用途。
文檔編號A61K39/00GK1558774SQ02818924
公開日2004年12月29日 申請日期2002年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月5日
發(fā)明者馬丁·巴克曼, 馬丁 巴克曼 申請人:賽托斯生物技術(shù)公司