專利名稱：：利用mda－7增強免疫誘導(dǎo)的方法
背景技術(shù)：
：本申請要求2002年8月21日申請的美國臨時專利申請No.60/404,932、2002年8月5日申請的美國臨時專利申請No.60/370,335和2002年三月5日申請的美國臨時專利申請No.60/361,755的優(yōu)先權(quán)，本文已特地將其全部公開信息納入作為參考。美國政府依據(jù)授予國立癌癥研究所的基金CA86587而擁有本發(fā)明的權(quán)利。A.發(fā)明領(lǐng)域一般來說本發(fā)明涉及免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及通過提供有效量的MDA-7多肽增強或誘導(dǎo)針對免疫原性分子的免疫應(yīng)答的診斷、預(yù)防和治療組合物及方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過給予有效量的MDA-7多肽來增強疫苗如腫瘤疫苗的免疫原性。B.相關(guān)領(lǐng)域描述免疫治療在腫瘤研究中是一個進展快速的領(lǐng)域，通過免疫治療可以在亞細(xì)胞水平、細(xì)胞水平、分子水平和大分子水平開發(fā)肌體天然的保護外源侵襲的能力。免疫治療也被稱為生物學(xué)治療、生物治療或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)治療，直接或間接地通過攻擊腫瘤細(xì)胞或降低其他腫瘤治療方法(如化療)的副作用為某些類型腫瘤的治療提供了一種可供選擇的方法。例如，免疫系統(tǒng)可以將腫瘤細(xì)胞識別為外源物質(zhì)，因此腫瘤細(xì)胞被免疫系統(tǒng)作為摧毀的靶位。不幸的是，免疫應(yīng)答一般不足以阻止腫瘤的生長。但是，免疫治療領(lǐng)域最近的研究集中在探索增強或補充免疫系統(tǒng)天然防御機制的方法上。最近在研究或在使用的免疫治療的例子是免疫佐劑(如牛型結(jié)核菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美國專利5,801,005；5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)，細(xì)胞因子治療(如干擾素，IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)和基因治療(如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等，1998；Austin-Edward和Villaseca，1998；美國專利5,830,880和5,846,945)以及單克隆抗體(如抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2抗體、抗HER-2抗體、抗p185抗體)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美國專利5,824,311)。可應(yīng)用免疫治療的一個領(lǐng)域是腫瘤的治療。正常組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是一個細(xì)胞增殖和死亡高度平衡的過程。這種平衡一旦被破壞就會發(fā)展到生癌狀態(tài)(Solyanik等，1995；Stokke等，1997；Mumby和Walter，1991；Natoli等，1998；Magi-Galluzzi等，1998)。例如，頭頸癌、腎癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和腦癌就是這種結(jié)果導(dǎo)致的許多癌癥中的幾種(Erlandsson，1998；Kolmel，1998；Mangray和King，1998；Gertig和Hunter，1997；Mougin等，1998)。事實上，腫瘤的發(fā)生率很高以至于單單美國每年死于腫瘤的人數(shù)就超過500,000。到目前為止，對于許多普通類型的腫瘤來說只有少數(shù)幾種有效的治療方案可供選擇。不同的個體要根據(jù)腫瘤的類型、疾病的發(fā)展階段以及其他因素如年齡、性別和健康狀況來選擇治療方案。最常規(guī)的治療方案是手術(shù)治療、放射治療和化療。手術(shù)在腫瘤的診斷和治療中扮演主要角色。放療、化療和免疫治療是手術(shù)治療的替代方案(Mayer，1998；Ohara，1998；Ho等，1998)?；熗ǔ驗樗幬镫y以達到實體瘤內(nèi)而受到限制(el-Kareh和Secomb，1997)。編碼MDA-7蛋白的cDNA，本文被稱為MDA-7，已被Jiang等，1995(WO95/11986，本文已納入作為參考)所描述。mda-7cDNA編碼的蛋白被認(rèn)為是黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的強力調(diào)節(jié)因子。Jiang等利用消減雜交技術(shù)(Jiang等，1995，本文已納入作為參考)鑒定出了參與人黑色素瘤細(xì)胞生長和分化調(diào)節(jié)的基因。將活躍增殖的人HO-1黑色素瘤細(xì)胞來源的cDNA與干擾素-β(IFN-β)和mezerin-分化的人HO-1黑色素瘤細(xì)胞來源的cDNA進行消減雜交得到了一個cDNA文庫，然后用該文庫鑒定出了幾個黑色素瘤分化相關(guān)(mda)cDNA，其中包括mda-7。Mda-7mRNA的表達是與黑色素瘤的惡性進展程度成負(fù)相關(guān)的，因為試驗證明與原發(fā)和轉(zhuǎn)移的黑色素瘤相比正常的黑色素細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達水平是升高的，而在裸鼠體內(nèi)增強腫瘤形成的處于垂直生長期的黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的mda-7mRNA的表達水平是下降的?，F(xiàn)在還不清楚MDA-7是否可誘導(dǎo)凋亡，也不清楚MDA-7是否參與免疫應(yīng)答?；蛑委熓巧镝t(yī)藥研究中另一個新出現(xiàn)的領(lǐng)域，其焦點集中在通過將治療性重組核酸導(dǎo)入患者的體細(xì)胞內(nèi)而治療疾病?，F(xiàn)在已有多個基因治療的臨床試驗開始進行，其中包括各種腫瘤、AIDS、囊性纖維化、腺苷脫氨酶缺乏癥、心血管疾病、Gaucher病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的治療。到目前為止，腺病毒是轉(zhuǎn)移基因治療藥物最常用的工組。利用腺病毒作為基因治療藥物的優(yōu)點在于其較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、不感染非分裂細(xì)胞、其基因組易于操作以及與宿主基因組發(fā)生非同源重組的概率較低等。利用基因治療方法治療腫瘤的主要模式是誘導(dǎo)凋亡。這可以通過使腫瘤細(xì)胞對其他藥物敏感或通過刺激細(xì)胞內(nèi)通路直接誘導(dǎo)凋亡來實現(xiàn)。其他腫瘤治療方法利用了腫瘤需要血管形成以供應(yīng)促進其生長所必要的營養(yǎng)成分。內(nèi)皮抑制素和血管他丁就是這種治療方法的例子(WO00/05356和WO00/26368)。利用裸DNA或非病毒載體作為免疫原性分子的載體進行基因免疫在腫瘤和感染性疾病的動物模型中已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)某晒?。但是，這些研究與人的臨床試驗所取得的結(jié)果不相吻合，在臨床試驗中所觀察到的免疫誘導(dǎo)/增強通常都是很有限的。而且，增強免疫應(yīng)答的能力可以作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。利用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)免疫來檢測患者就可以確定該患者是否適于進行免疫治療。因此，本發(fā)明對于提高基因免疫和鑒定免疫分子的可行性是十分有益的。不論從治療前景(免疫治療)來看，還是從預(yù)防性和可能的診斷前景來看，在免疫應(yīng)答領(lǐng)域取得進展都有持續(xù)的需求。發(fā)明概述本發(fā)明的基礎(chǔ)部分在于我們觀察到MDA-7能以依賴蛋白激酶(PKR)的方式誘導(dǎo)和/或活化，PKR活化導(dǎo)致eIF-2α的磷酸化。在增強或促進免疫應(yīng)答的方法中已經(jīng)使用過PKR。本發(fā)明所基于的其他現(xiàn)象見于實施例部分。因此，本發(fā)明涉及增強和/或促進免疫應(yīng)答的方法和組合物，這種免疫應(yīng)答是通過MDA-7肽、多肽或編碼MDA-7肽或多肽的核酸、以及任何可誘導(dǎo)這種免疫應(yīng)答的化合物所誘導(dǎo)的。本發(fā)明的組合物包括免疫原性組合物，其中術(shù)語“免疫原性組合物”是指能產(chǎn)生抗該組合物的免疫應(yīng)答的組合物(細(xì)胞免疫或體液免疫)。在本發(fā)明的某些實施方案中，免疫原性組合物包括一個分子，使用該分子后能產(chǎn)生或可檢測到抗該分子的免疫應(yīng)答(在存在或不存在本發(fā)明的MDA-7組合物的情況下)，以及部分或全部重組MDA-7多肽或者編碼該多肽的核酸。MDA-7肽或多肽優(yōu)選至少含有SEQIDNO2的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200或206個連續(xù)氨基酸，或者含有SEQIDNO2的全部氨基酸。重組MDA-7多肽可以是經(jīng)修飾的，或者是其末端被截短的。在本發(fā)明的某些實施方案中，MDA-7多肽含有SEQIDNO2的49-206、75-206或100-206位的氨基酸。分泌型MDA-7多肽含有SEQIDNO2的49-206位的氨基酸，但是第一個48位氨基酸是缺失的，這種分泌形式的多肽特別適于被稱為“MDA-7多肽”，可用于本發(fā)明的任何組合物和方法中。另外，MDA-7氨基酸序列還可以包含異源氨基酸序列，如分泌信號序列。在某些實施方案中，分泌信號序列是一個帶正電荷的N端序列，含有一個疏水的核。在另外一些實施方案中，分泌信號可以引導(dǎo)MDA-7或其片段進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體。需要注意的是在本發(fā)明的任何一個涉及多肽的實施方案中，編碼該多肽的核酸也可以利用。因此，在本發(fā)明的某些方面，利用的是編碼MDA-7的核酸和/或編碼免疫原性肽或多肽的核酸。核酸可包含在表達載體或構(gòu)建體中。載體可以是病毒載體也可以是非病毒載體。在某些實施方案中，構(gòu)建體是病毒載體，如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、多瘤病毒、彈狀病毒或甲病毒。組合物可包含約103到1015、105到1013、107到1011或1010個病毒顆粒。核酸還可以包含與核酸相連接的啟動子。優(yōu)選一個核酸分子編碼多個多肽，如1、2、3、4、5或更多個多肽，其中包括一個MDA-7多肽和一個或多個免疫原性多肽。編碼MDA-7的核酸可編碼上述的任何MDA-7多肽，或至少含有SEQIDNO1的20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610或618個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明組合物所含有的“免疫原性分子”是指單獨或與本發(fā)明的組合物一起可激發(fā)免疫應(yīng)答的分子。免疫原性分子在無MDA-7和/或佐劑存在的情況下是不能誘導(dǎo)或激發(fā)免疫應(yīng)答的；另外，如果免疫原性分子在無MDA-7和/或佐劑存在的情況下能誘導(dǎo)或激發(fā)免疫應(yīng)答，MDA-7或佐劑可以增強抗該免疫分子的免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，免疫原性分子含有一個或多個多肽。在本發(fā)明另外的實施方案中，針對一種免疫原的免疫應(yīng)答可通過注射MDA-7或編碼MDA-7的核酸再加上細(xì)胞因子、趨化因子或其類似物來激發(fā)，這些細(xì)胞因子包括而不限于白細(xì)胞介素和干擾素，特別是IFNα、IFNβ、IFNγ和λIFNs。細(xì)胞因子或趨化因子可以多肽或編碼多肽的核酸的形式提供。通過給予含MDA-7和細(xì)胞因子或趨化因子的組合物可以起到治療效果，如激發(fā)針對免疫原、癌癥細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、過度增殖細(xì)胞或其他疾病狀況的免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子、趨化因子及其類似物優(yōu)選包含在藥物制劑中。組合物可以同時包含MDA-7和細(xì)胞因子或趨化因子，也可以是兩個不同的組合物分別包含MDA-7和細(xì)胞因子或趨化因子，二者聯(lián)合使用。如果用兩種組合物，則可以同時或先后注射。其中一個于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小時或1、2、3、4、5、6、7天注射，另一個在其前或后注射。細(xì)胞因子、趨化因子或其類似物可以是哺乳動物來源的，特別優(yōu)選人源的多肽。本發(fā)明的免疫原性分子包括抗原或表位，抗該抗原或表位的免疫應(yīng)答是可以觀察到的，或者是我們所期望的?！翱乖笔侵改鼙豢贵w或T細(xì)胞受體特異識別的一種物質(zhì)或物質(zhì)的一部分。其同義詞是“免疫原”。本發(fā)明的抗原包括一個或多個表位，表位是指抗原決定簇?？乖瓫Q定簇是指抗原分子上與抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合位點相互作用的結(jié)構(gòu)，這種相互作用是分子互補的結(jié)構(gòu)?？贡景l(fā)明的免疫分子的免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞免疫也可以是體液免疫。本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含編碼本發(fā)明的抗原和表位的核酸。這種核酸是包含在上述表達載體中的與編碼MDA-7有關(guān)的核酸。而且這種核酸可以連接上啟動子。編碼免疫原性多肽的核酸包括免疫基因。在某些實施方案中，免疫基因編碼結(jié)核桿菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性調(diào)節(jié)素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外殼-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨針抗原、風(fēng)疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETSG250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、或WT1。任何蛋白類的免疫原性分子都可以以免疫原的形式包含在組合物中。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗原是腫瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原、真菌抗原或其他疾病相關(guān)抗原。疾病相關(guān)抗原是一種由于某種特定疾病而產(chǎn)生的抗原，或者是某種特定疾病的標(biāo)記物。腫瘤抗原也是一種疾病相關(guān)抗原，這種疾病是指腫瘤。腫瘤抗原包括而不限于PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA?？捎糜诒景l(fā)明的特別是那些人腫瘤抗原，其中一些已在上面作了描述。在某些情況下，利用異種抗原即那些來自于嚙齒類動物的抗原有特別的優(yōu)勢，有時異種抗原活化免疫系統(tǒng)的能力比同種抗原更強。微生物抗原、病毒抗原和真菌抗原是指來源于微生物、病毒或真菌的抗原。微生物包括而不限于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌以及本文討論的其他微生物。病毒抗原特別包括但不限于本文所討論的病毒來源的抗原。因此，本發(fā)明的方法和組合物特別適用于誘導(dǎo)或激發(fā)抗病毒、微生物或真菌的免疫應(yīng)答。免疫原性分子可以是小分子、核酸、肽或多肽。在某些特殊實施方案中，免疫原性分子是T細(xì)胞活化分子。本發(fā)明的組合物包含疫苗。疫苗是分離抗原的制劑，這些抗原在某些情況下是從病毒、細(xì)菌或其他病原中分離的，疫苗可注射給肌體以誘導(dǎo)免疫。本發(fā)明還有一個實施方案，其中所述組合物還包括膠體載體。膠體載體包括而不限于類蛋白、乳劑或脂質(zhì)體。組合物還包括除MDA-7多肽以外的佐劑。本發(fā)明的組合物特別優(yōu)選包含在藥物制劑、稀釋劑或溶液中。本發(fā)明還包括涉及本發(fā)明組合物的方法。本發(fā)明的方法一般都涉及如何促進患者的免疫應(yīng)答，其中包括給予患者有效量的MDA-7多肽或啟動子控制下的編碼MDA-7的核酸。在其他實施方案中，本發(fā)明的方法還包括通過給予患者有效量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸加上細(xì)胞因子、趨化因子或其類似物以激發(fā)免疫應(yīng)答，其中細(xì)胞因子、趨化因子包括而不限于IFNα、IFNβ、IFNγ、λIFNs、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10或IL-12?！坝行Я俊笔侵改苓_到預(yù)期效果的劑量。另外“有效量”也指能產(chǎn)生治療效果的劑量。因此，在某些特定實施方案中，優(yōu)選需要促進或增強免疫應(yīng)答的受體。在本發(fā)明的某些實施方案中，“有效量”是指能達到特定目的的劑量，如增強、提高、誘導(dǎo)、改善或促進免疫應(yīng)答，這種效果是可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法直接或間接檢測的。本發(fā)明還有一個實施方案，其中最后成為免疫原性的分子也提供給受體。在這種情況下，分子和MDA-7多肽或編碼MDA-7的核酸在同一組合物中提供或先后提供。提供的方法包括體內(nèi)或體外。在本發(fā)明的某些實施方案中，方法涉及治療或預(yù)防的目的以誘導(dǎo)、促進或增強受體的免疫應(yīng)答。如果是體內(nèi)則將免疫原性分子組合物和MDA-7組合物(指含有MDA-7肽或多肽、或者含有編碼MDA-7肽或多肽的核酸的組合物)給予受體。在各種實施方案中，至少含有一種細(xì)胞因子、趨化因子或其類似物的組合物可以包含在本發(fā)明的MDA-7組合物中，或者和本發(fā)明的MDA-7組合物一起提供。本文所討論的任何組合物都可用于本發(fā)明的方法。在某些實施方案中，受體是人或其他哺乳動物。本發(fā)明的方法優(yōu)選包括抗特定免疫原性分子的疫苗。另外，本發(fā)明的方法還可用于診斷或預(yù)后的目的。這時所觀察到的抗特定分子的免疫應(yīng)答就是疾病或其預(yù)后的指示劑。本發(fā)明的所有方法和組合物都可用于體內(nèi)或體外。免疫應(yīng)答可通過各種方法檢測，其中包括而不限于測定細(xì)胞因子濃度或產(chǎn)量的增加、T細(xì)胞增殖的提高、B細(xì)胞增殖的提高、T細(xì)胞活性的升高、NK細(xì)胞活性的升高、巨噬細(xì)胞活性的升高、或者抗體產(chǎn)生量的增加。在某些實施方案中，細(xì)胞因子如干擾素(即IFN-α，IFN-β，IFN-γ)或白細(xì)胞介素(如IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10或IL-12)可作為免疫應(yīng)答的指示劑。在某些情況下，組合物可分多次給予受體，至少或最多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。組合物可每小時、每天、每周、雙周、每月或每年給予一次，或者每1，2，3，4，5，6或7天或者更多天、每1，2，3，4或5周或者更多周、或者每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個月或更多個月給一次藥。組合物可通過口服、靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、連續(xù)灌注、直接注射、區(qū)域注射、氣管內(nèi)灌注、損傷部位注射或血管內(nèi)注射給予細(xì)胞或受體。全身給藥或全身治療也是本發(fā)明特別值得注意的一部分。組合物的給予可結(jié)合其他治療措施。在某些實施方案中，除了本發(fā)明的組合物外還提供抗腫瘤、抗微生物或抗病毒治療。在某些實施方案中，抗腫瘤治療是指化療、手術(shù)治療、放療、激素治療或基因治療?；蛑委熞部梢宰鳛榭刮⑸锘蚩共《局委煹姆椒?。另外，也可使用細(xì)胞因子或趨化因子治療，如IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10和/或IL-12。特別值得注意的是有關(guān)本發(fā)明的一個實施方案的方面或特征也可適用于本文所討論的本發(fā)明的其他任何實施方案。本發(fā)明的另外一個實施方案是增強抗免疫原免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予患者編碼免疫原的核酸；并且給予患者有效量的MDA-7多肽，其中MDA-7多肽能增強抗免疫原的免疫應(yīng)答。免疫原也可以產(chǎn)物、肽或多肽的方式提供。在另一個實施方案中，MDA-7與至少一種細(xì)胞因子或趨化因子如IFNα、IFNβ或IFNγ聯(lián)合給藥。免疫原包括結(jié)核桿菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性調(diào)節(jié)素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外殼-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨針抗原、風(fēng)疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETSG250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2，MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2或WT1。本發(fā)明還提供了一種治療患者腫瘤的方法，該方法包括給予患者腫瘤抗原；以及給予有效量的MDA-7多肽，其中MDA-7多肽可增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，為患者提供治療效果。治療腫瘤的方法還包括給予患者有效量的細(xì)胞因子或趨化因子，其中MDA-7和細(xì)胞因子或趨化因子可增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，為患者提供治療效果。本文所以的術(shù)語“治療效果”是指任何能增強或促進與患者疾病治療有關(guān)的健康水平的結(jié)果，其中包括癌前病變、癌癥和過度增殖疾病的治療。下列所舉的例子是非窮盡性的患者生命延長一段時期，疾病的惡性程度降低或延遲，過度增殖減弱，腫瘤生長放緩，轉(zhuǎn)移延遲，腫瘤細(xì)胞減少或腫瘤細(xì)胞增殖速度降低，以及患者由于疾病而導(dǎo)致的疼痛減弱。在某些特定實施方案中，本發(fā)明涉及在患者體內(nèi)治療腫瘤的方法，其中包括(a)給予患者免疫原性分子以誘導(dǎo)抗該免疫原性分子的免疫應(yīng)答；以及(b)給予患者有效量的MDA-7多肽，其中MDA-7能增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，與單獨使用免疫原性分子相比可縮小腫瘤。治療腫瘤的方法還包括給予患者至少一種有效量的細(xì)胞因子或趨化因子。所得到的腫瘤縮小是指腫瘤大小的縮小或腫瘤生長速率的降低。在某些實施方案中，免疫原性分子是腫瘤抗原，包括PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。在某些特定實施方案中，本發(fā)明涉及從細(xì)胞的線粒體中釋放細(xì)胞色素c的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸接觸以誘導(dǎo)或促進細(xì)胞色素c從線粒體內(nèi)的釋放。在某些實施方案中，細(xì)胞是指腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞包括而不限于肺、頭頸、胰腺、前列腺、腎、骨、睪丸、乳腺、頸、胃腸、淋巴、腦、卵巢、白血病、骨髓瘤、結(jié)腸、食管、皮膚、甲狀腺、肝或膀胱腫瘤細(xì)胞。編碼MDA-7的核酸可包含在載體內(nèi)。本文所用的載體是指表達載體或轉(zhuǎn)移載體。表達載體含有mda-7編碼多聚核苷酸轉(zhuǎn)錄所必須的核酸序列。轉(zhuǎn)移載體是將表達載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的方式。在各種實施方案中，載體指表達載體。表達載體可通過病毒載體或非病毒載體轉(zhuǎn)移。病毒載體包括腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、α病毒載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。在其他的實施方案中，MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸是給予患者或受體的。MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸可通過下列方法給藥瘤內(nèi)注射、氣管內(nèi)注射、靜脈注射、心包內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、局部涂藥、粘膜給藥、口服、洗胃、皮下或直接注射到免疫應(yīng)答減弱的位點。MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸的使用劑量可在103到1015個病毒顆粒之間。在其他的實施方案中，MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸可以多次給藥。在切除腫瘤前或切除腫瘤后，或者前后都可將MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸注射到腫瘤床內(nèi)。在某些實施方案中，MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸可在化療、手術(shù)、免疫治療、激素治療或放療前、期間或之后給予患者。MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸可在化療、手術(shù)、免疫治療、激素治療或放療之前72小時、24小時、或者之后72小時、24小時給予患者。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及促進或增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)腫瘤抑制蛋白-上皮細(xì)胞鈣粘蛋白或PETN表達的方法。該方法包括使細(xì)胞與有效量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸接觸以促進或增加上述一種或兩種腫瘤抑制蛋白的表達。在各種實施方案中，本發(fā)明涉及降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)原癌蛋白PI3K表達的方法，該方法包括使細(xì)胞與一定量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸接觸以有效降低PI3K的表達。在某些實施方案中，原癌蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞之間的粘附作用和/或細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞。在其他一些實施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2期細(xì)胞周期停滯的方法，該方法包括使一定量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸與細(xì)胞接觸以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的G2期細(xì)胞周期停滯。G2期細(xì)胞周期停滯可被Cdc25c通路抑制所誘導(dǎo)。本發(fā)明還有一些實施方案涉及誘導(dǎo)腫瘤抗血管形成的方法，該方法包括使腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞臨近的內(nèi)皮細(xì)胞與有效量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸接觸，其中MDA-7多肽可與IL-22受體結(jié)合以有效誘導(dǎo)抗血管形成。在某些實施方案中，抗血管形成是內(nèi)皮細(xì)胞向生長因子的遷移被抑制造成的。生長因子包括而不限于VEGF和/或bFGF?？寡苄纬梢部蓙碜杂趯?nèi)皮細(xì)胞分化的抑制。本發(fā)明的某些實施方案涉及將MDA-7轉(zhuǎn)移給細(xì)胞的方法，該方法包括獲得MDA-7靶向性構(gòu)建體，其中MDA-7靶向性構(gòu)建體包含編碼MDA-7多肽的DNA分子或編碼MDA-7多肽的核酸以及啟動子控制下的靶向性序列，使細(xì)胞與一定量的靶向性構(gòu)建體接觸以有效地將MDA-7靶向性構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。在某些實施方案中，靶向性構(gòu)建體含有編碼MDA-7的DNA，其中MDA-7無功能性信號肽，但是卻有核定位信號肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽或線粒體信號肽。本發(fā)明的其他實施方案涉及MDA-7與特定分子和/或其活性抑制劑的聯(lián)合使用。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括給予MDA-7蛋白或編碼MDA-7的核酸和NF-κB的抑制劑以誘導(dǎo)或促進腫瘤細(xì)胞的死亡。NF-κB的抑制劑包括IκB和舒林酸，后者是一種非甾體類抗炎藥物。在其他實施方案中，COX-2蛋白或其活性抑制劑也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還包括Hsp90的抑制劑，如格爾德霉素及其類似物。值得注意的是蛋白激酶及其活性抑制劑也是本發(fā)明的一部分。而且，除舒林酸之外的其他抗炎藥物也可作為本發(fā)明的一部分，如萘普生。一旦MDA-7與IL-22受體結(jié)合，IL-22受體就可抑制血管形成。在本發(fā)明的某些方面，IL-22激動劑可單獨或與MDA-7聯(lián)合作為抗血管形成藥物。而且，從MDA-7的相互作用和活性來看可以清楚地看到MDA-7包括在某種通路中，這可作為本發(fā)明的一部分加以利用。MDA-7可影響β-鏈蛋白和P13激酶(PI3K)信號通路。而且MDA-7還可以促進IL-6，IFN-γ，IL-12，TNF-α和GM-CSF的分泌。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，有促進外周血單核細(xì)胞(PMBC)分泌IL-6，IFN-γ，IL-12，TNF-α和/或GM-CSF的方法，該方法包括給予細(xì)胞有效量的MDA-7。MDA-7還可以活化STAT3的表達，因此可用于本發(fā)明的方法和組合物中以達到這種活化的目的。值得注意的是本文所討論的與本發(fā)明一個方面有關(guān)的實施方案也適用于與本發(fā)明其他方面有關(guān)的實施方案。而且，本發(fā)明的任一組合物都可用于本發(fā)明的所有方法中。本發(fā)明的其他方法涉及利用MDA-7誘導(dǎo)腫瘤的抗血管形成。腫瘤是血管化的，在腫瘤周圍被誘導(dǎo)生成許多血管。本發(fā)明利用MDA-7多肽通過誘導(dǎo)抗血管形成抑制或反轉(zhuǎn)這一過程。術(shù)語“誘導(dǎo)抗血管形成”是指血管化的反轉(zhuǎn)或抑制，或者是指已開始的血管形成的抑制。在某些實施方案中，給予患有腫瘤的患者以有效量的MDA-7多肽使其與IL-22受體陽性細(xì)胞上的IL-22受體結(jié)合從而誘導(dǎo)腫瘤的抗血管形成。IL-22受體陽性細(xì)胞是細(xì)胞表面表達IL-22受體的細(xì)胞，IL-22受體可結(jié)合MDA-7。因此，在某些實施方案中，患者的IL-22受體陽性細(xì)胞可給予有效量的MDA-7。其載體實施方案中，IL-22受體陽性細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。因此，給予MDA-7多肽的細(xì)胞就是患者的內(nèi)皮細(xì)胞。另外，這些細(xì)胞不需要靠近(臨近或緊靠)腫瘤或腫瘤細(xì)胞。它們可以遠(yuǎn)離(不靠近)腫瘤。而且在某些實施方案中，MDA-7多肽可以是分泌形式的MDA-7，并且可以是糖基化的。除非有明確的說明，本說明書中所用的“一個”或“一種”可以指一個或多個。如本文權(quán)利要求中所用的，當(dāng)“一個”或“一種”與單詞“含有”連用時可以指一個，也可以指一個以上。本文所用的“另一個”至少是指第二個或更多個。附圖簡述下面的附圖形成本說明書的一部分，還用于證明本發(fā)明的特定方面。通過參考這些附圖中的一個或多個結(jié)合本文特定實施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1A.Ad-mda-7(2500個病毒顆粒)處理后A549(野生型p53)和H1299(p53缺失)細(xì)胞的細(xì)胞死亡情況。圖1B.Ad-mda-7處理后A549和H1299細(xì)胞內(nèi)劑量依賴的PKR表達情況。圖1C.Ad-mda-7處理后A549和H1299細(xì)胞的免疫熒光共聚焦顯微鏡照片。圖2A.PBS、Ad-Luc或Ad-mda7處理后A549細(xì)胞裂解物內(nèi)PKR、磷酸化-PKR、eIF-2α和磷酸化eIF-2α的表達情況。以肌動蛋白的表達作為對照。圖2B.經(jīng)Ad-Luc或Ad-mda7處理48小時的A549細(xì)胞裂解物蛋白部分與抗人Tyk2、Stat1、Stat3或p38抗體進行免疫沉淀，然后用抗人磷酸化Tyk2、Stat1、Stat3或p38抗體染色。圖2C.經(jīng)PBS、Ad-Luc或Ad-mda7處理的A549細(xì)胞內(nèi)Bid、PARP、胱冬酶-3、胱冬酶-8和胱冬酶-9的表達情況。以肌動蛋白的表達作為對照。圖3A-3C.Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)后經(jīng)2-AP處理的肺癌細(xì)胞。圖3A.Ad-mda7和2-AP聯(lián)合處理的A549細(xì)胞的死亡情況。圖3B.經(jīng)Ad-mda7和10mM2-AP聯(lián)合處理后的A549細(xì)胞蛋白部分的免疫染色情況。試驗設(shè)三復(fù)孔。圖3C.Ad-mda7或Ad-Luc聯(lián)合10mM2-AP處理后細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成情況。圖4A-4C.PKR+/+和PKR+/-細(xì)胞來源的MEFs內(nèi)PKR依賴的Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡。圖4A.Ad-mda7處理48小時后PKR、MDA-7和肌動蛋白的表達。圖4B.PBS、Ad-Bak、或Ad-mda7處理48小時后細(xì)胞死亡情況。圖4C.經(jīng)Ad-mda7處理后形態(tài)學(xué)顯示只有PKR+/+細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。圖5A-5B.腺病毒介導(dǎo)的MDA-7過量表達抑制肺癌細(xì)胞的增殖并可誘導(dǎo)其死亡。圖5A.XTT分析細(xì)胞的存活能力。圖5B.PBS、Ad-Luc(2500vp)或Ad-mda-7(2500vp)處理后A549細(xì)胞的死亡百分率。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后用流式細(xì)胞儀分析。每個細(xì)胞系都設(shè)三復(fù)孔，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖6A-6B.Ad-mda7對線粒體膜電位及凋亡的影響。線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的釋放是通過H1299細(xì)胞(圖6A)和1549細(xì)胞(圖6B)的免疫印跡檢測的。圖7A-7B.Ad-mda7對線粒體膜電位的影響。Ad-mda-7、Ad-p53和星形孢菌素(1μM)轉(zhuǎn)導(dǎo)后測定線粒體膜電位。其中所指示的細(xì)胞用CsA(10μM)預(yù)處理。H1299(圖7A)和A549(圖7B)細(xì)胞用電位敏感性的染料-四甲基羅丹明乙酯高氯酸鹽(TMRE)和熒光染色，然后通過流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果以三個獨立試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖8A-8B.環(huán)孢霉素(CsA)不能阻止線粒體膜電位的丟失。H1299(圖8A)和A549(圖8B)細(xì)胞用Ad-mda-7、Ad-p53和星形孢菌素(1μM)處理。其中所指示的細(xì)胞用CsA(10μM)預(yù)處理。然后將細(xì)胞裂解，通過熒光燃料TMRE染色測定線粒體膜電位。圖9.Ad-mda-7上調(diào)外通路。Ad-mda-7-處理的A549細(xì)胞通過免疫印跡分析BAK、BAX、Bcl-2、TNF-α、TNF-R1、TRADD、FasL、Fas和FADD表達的改變。圖10.用示意圖表示幾種能誘導(dǎo)線粒體膜電位改變的促凋亡基因的效應(yīng)，這些基因可打開MMP依賴的通道使細(xì)胞色素c釋放出來，從而與APAF-1和胱冬酶8形成凋亡小體。圖11A-11C.Ad-mda-7不能明顯改變β-聯(lián)蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。圖11A.MDA-MB-435不經(jīng)過任何處理(條帶1)，或每個細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)2000vp的Ad-Luc(條帶2)或Ad-mda-7(條帶3)。處理后48小時收獲細(xì)胞并裂解，利用特異性的單克隆抗體通過Western印跡分析其MDA-7蛋白、β-聯(lián)蛋白和β-肌動蛋白的表達。圖11B.H1299或HUVEC轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-Luc或Ad-mda-7(MOI1000vp/細(xì)胞)，處理后48小時用抗MDA-7的多克隆抗體染色，通過免疫熒光觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)MDA-7蛋白的表達情況。圖中顯示的是兩個不同試驗的具有代表性的視野。圖11C.Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)的H1299和HUVEC細(xì)胞的凋亡。H1299和HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-Luc或Ad-mda-7后48小時通過AnnexinV染色分析細(xì)胞的凋亡情況。顯示的結(jié)果是3個以上試驗的代表。圖12A-12C.圖12A.MDA-7對β-聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)。乳腺癌細(xì)胞用Ad-Luc或Ad-mda-7處理48小時，每個細(xì)胞轉(zhuǎn)染2000vp。細(xì)胞固定后用免疫熒光顯微鏡觀察β-聯(lián)蛋白的位置。結(jié)果顯示的是3個不同試驗的典型代表。圖12B.MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞或HUVEC細(xì)胞用Ad-Luc、Ad-p53或Ad-mda-7處理(MOI1000vp/細(xì)胞)，48小時后通過免疫熒光染色分析β-聯(lián)蛋白。圖12C.MDA-7調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的反式激活。H1299細(xì)胞通過脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)轉(zhuǎn)染帶LEF/TCF啟動子的TopFlash質(zhì)粒或帶LEF/TCF啟動子的FopFlash質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后3小時細(xì)胞再轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-GFP或Ad-mda-7病毒，MOI為1000(H1299)。48小時后分析熒光素酶的活性。數(shù)據(jù)用3個樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本試驗進行了兩次，結(jié)果一致。圖13A-13C.Ad-mda-7上調(diào)上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達并抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。圖13A.NSCLC腫瘤細(xì)胞(H1299，A549)用PBS、Ad-mda-7或Ad-Luc處理(MOI為2000vp/細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染后48小時用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌并與抗上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的一抗共孵育。通過FACS分析發(fā)現(xiàn)Ad-mda-7可以增加這兩株肺癌細(xì)胞系表面的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達。數(shù)據(jù)用3個樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本試驗進行了三次以上，結(jié)果一致。圖13B.H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-mda-7或Ad-Luc以評價細(xì)胞-細(xì)胞的粘附作用。Ad-mda-7處理的細(xì)胞比Ad-Luc處理的細(xì)胞遷移少。圖13C.H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-mda-7或Ad-Luc以評價細(xì)胞-細(xì)胞的粘附作用。Ad-mda-7處理的細(xì)胞比Ad-Luc或PBS處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更強的同質(zhì)性粘附作用。這些試驗至少進行了2次，結(jié)果一致。圖14A-14C.Ad-mda-7調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白和PI3K通路中的分子。圖14A.Ad-mda-7上調(diào)(i)APC和(ii)GSK-3β。檢測MDA-MB-453細(xì)胞的裂解物中GSK-3β和APC蛋白的穩(wěn)定態(tài)水平。條帶1，未處理的細(xì)胞；條帶2，Ad-Luc處理的細(xì)胞；條帶3，Ad-mda-7處理的細(xì)胞。每個細(xì)胞2000vp處理48小時。圖14B.Ad-mda-7下調(diào)PI3K、ILK-1、PLC-γ和FAK的表達。檢測Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-453細(xì)胞的裂解物中PI3K、ILK-1、PLC-γ和FAK的穩(wěn)定態(tài)水平。圖14C.(i)Ad-mda-7調(diào)節(jié)H1299細(xì)胞內(nèi)的pFAK。條帶1，未處理的；條帶2，Ad-Luc處理的；條帶3，Ad-mda-7處理的；條帶4，LY294002，終濃度為20μM。每個細(xì)胞1000vp處理48小時。(ii).Ad-mda-7上調(diào)MDA-MB-453腫瘤細(xì)胞內(nèi)的PTEN?？?PTEN單克隆抗體用于檢測細(xì)胞裂解物，Western印跡分析未處理的(條帶1)、Ad-Luc-處理的(條帶2)和Ad-mda-7處理的(條帶3)MDA-MB-453細(xì)胞。這些試驗至少進行了2次，結(jié)果一致。圖15.示意圖說明Ad-mda-7誘導(dǎo)的β-聯(lián)蛋白和PI3K通路的調(diào)節(jié)。MDA-7上調(diào)腫瘤抑制蛋白的表達，下調(diào)原癌蛋白的表達。圖16.DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌細(xì)胞內(nèi)MDA-7的表達。這些細(xì)胞用Ad-mda-7、Ad-Luc轉(zhuǎn)染，或者加入PBS為空白對照。分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72小時收獲細(xì)胞，用SDS樣品緩沖液裂解。然后將蛋白固定到硝酸纖維素膜上與抗MDA-7抗體進行雜交。相應(yīng)的β-肌動蛋白水平作為載樣對照。圖17.DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌細(xì)胞以及PrEC上皮細(xì)胞的存活能力分析。這些細(xì)胞用Ad-mda-7、Ad-Luc轉(zhuǎn)染，或者用PBS處理。在轉(zhuǎn)染后1到4天內(nèi)每天收獲一些細(xì)胞，用0.4％的臺盼藍(lán)染色直到出現(xiàn)死細(xì)胞。存活的細(xì)胞用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。數(shù)據(jù)是三個復(fù)孔得來的；顯示的是與PBS處理組相比所得到的細(xì)胞存活百分率，橫條代表標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。圖18A-18B.MDA-7誘導(dǎo)的凋亡。圖18A.DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌細(xì)胞以及PrEC上皮細(xì)胞用Ad-mda-7、Ad-Luc轉(zhuǎn)染，或者用PBS處理。處理后72小時收獲細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析處于亞G0/G1期的細(xì)胞作為凋亡細(xì)胞。每個試驗組取20000個細(xì)胞；用直方圖表示數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)得自兩復(fù)孔；顯示的是平均值，橫條代表標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。圖18B.轉(zhuǎn)染72小時后，用煙酸己可堿33258染色分析粘附的細(xì)胞。箭頭指正在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞。所有的細(xì)胞系放大倍數(shù)都是×20。圖19.轉(zhuǎn)染Ad-mda-7后的DU145、LNCaP和PC-3前列腺癌細(xì)胞以及PrEC上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。處理后72小時收獲細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。每個試驗組取20000個細(xì)胞；用直方圖表示數(shù)據(jù)。細(xì)胞周期用X軸代表。數(shù)據(jù)得自兩復(fù)孔；顯示的是平均值，橫條代表標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。圖20A-20B.DU145和LNCaP細(xì)胞內(nèi)MDA-7負(fù)調(diào)節(jié)的靶蛋白。細(xì)胞用Ad-mda-7、Ad-Luc轉(zhuǎn)染或用PBS處理，轉(zhuǎn)染或處理48小時后收獲細(xì)胞，用SDS樣品緩沖液裂解細(xì)胞。蛋白固定到硝酸纖維素膜上，然后與MDA-7靶通路相關(guān)的各種抗體雜交。利用Western印跡分析Du145細(xì)胞(圖20A)和LNCaP細(xì)胞(圖20B)內(nèi)MDA-7活化的凋亡級聯(lián)反應(yīng)(胱冬酶9、-3和PARP)和負(fù)調(diào)節(jié)的靶蛋白。相應(yīng)的β-肌動蛋白的水平也顯示在圖中。圖21A-21B.轉(zhuǎn)染Ad-mda-7、Ad-Luc或用PBS處理的DU145和LNCaP細(xì)胞內(nèi)MDA-7下調(diào)的與G2細(xì)胞周期停滯有關(guān)的蛋白質(zhì)。處理72小時后收獲細(xì)胞，用SDS樣品緩沖液裂解細(xì)胞。蛋白固定到硝酸纖維素膜上，然后與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白的抗體雜交。圖21A，DU145細(xì)胞；圖21B，LNCaP細(xì)胞。相應(yīng)的β-肌動蛋白的水平表示為載樣對照。圖22A-22C.圖22A.內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC和HMVEC)與各種濃度的sMDA-7(b，c，e，f)或內(nèi)皮抑制素(h，i，k，l)混合，接種到96孔板中。未處理的細(xì)胞作為對照(a，d，g，j)。24小時后在光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的能力。HUVEC(b，c)和HMVEC(e，f)細(xì)胞內(nèi)毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)形成的能力都可被sMDA-7抑制，并且是劑量依賴性的。但是在HUVEC(h，i)和HMVEC(k，l)細(xì)胞內(nèi)相同濃度的內(nèi)皮抑制素卻都沒有抑制效應(yīng)。圖22B.sMDA-7的免疫耗竭可導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞(b，c)毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)形成能力的恢復(fù)，其形成能力與未處理的對照組(a)相似(×4放大)。圖22C.sMDA-7抑制100ng/mlVEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移的能力。與不含sDMA-7蛋白的對照組相比，sMDA-7可顯著抑制HUVEC細(xì)胞的遷移。圖23A-23B.Western印跡和免疫熒光分析sMDA-7處理的HUVEC和HMVEC細(xì)胞內(nèi)pSTAT-3蛋白的表達情況。圖23A.Western印跡分析4小時和24小時時HUVEC(a)和HMVEC(b)細(xì)胞內(nèi)pSTAT-3蛋白的表達。圖23B.免疫熒光分析sMDA-7處理的HUVEC細(xì)胞內(nèi)pSTAT-3在核內(nèi)的定位，結(jié)果表明與對照組一樣pSTAT-3定位于胞漿內(nèi)。圖24.用IL-22R1封閉抗體(1ng/ml和5ng/ml)處理HUVEC細(xì)胞。24小時后收獲細(xì)胞，與sMDA-7(5ng/ml)的基質(zhì)膠(Matrigel)混合物觀察管狀結(jié)構(gòu)形成情況。未處理細(xì)胞(a)；5ngsMDA-7處理細(xì)胞(b)；IL-22R1抗體(1ng)處理細(xì)胞(c)；IL-22R1(1ng)和sMDA-7(5ng)處理細(xì)胞(d)；IL-22R1抗體(5ng)處理細(xì)胞(e)；IL-22R1抗體(5ng)和sMDA-7(5ng)處理細(xì)胞(f)；抗IL-10R抗體(5ng)處理細(xì)胞(g)；抗IL-10R抗體(5ng)和sMDA-7(5ng)處理細(xì)胞(h)；(4×放大)。半定量分析HUVEC細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的數(shù)目，結(jié)果證明sMDA-7處理的HUVEC細(xì)胞與未處理的或用IL-22R1抗體處理的細(xì)胞相比數(shù)目顯著下降。sMDA-7的抑制效應(yīng)與pSTAT-3表達量的增加相關(guān)，而存在IL-22R1抗體時，sMDA-7對pSTAT-3的活化被抑制。橫條代表標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。圖25A-25B.sMDA-7和內(nèi)皮抑制素(12.5ng)包裹到含bFGF(60ng)的基質(zhì)膠內(nèi)，皮下植入到無胸腺的裸鼠中。含bFGF的基質(zhì)膠作為陽性對照，而單獨的基質(zhì)膠作為陰性對照。在第10天，將基質(zhì)膠取出，觀察新血管形成的情況(圖25A)和血紅蛋白的含量(圖25B)。與對照相比，含sDMA-7的基質(zhì)膠血紅蛋白含量顯著下降。圖26A-26D.圖26A.A549腫瘤細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞的等量混合物包裹到基質(zhì)膠(1×106)中，然后植入到裸鼠的皮下(n＝10)。植入后用測徑尺測量腫瘤，利用t檢驗來計算腫瘤體積改變的統(tǒng)計學(xué)意義。移植腫瘤細(xì)胞和親本293細(xì)胞等量混合物的動物作為對照組(n＝10)。與經(jīng)親本293細(xì)胞處理的腫瘤相比，含293-mda-7細(xì)胞的腫瘤的生長明顯受到抑制(p＝0.001)。每一時間點代表每一組腫瘤的平均直徑。橫條代表標(biāo)準(zhǔn)誤。圖26B.含293-mda-7細(xì)胞的腫瘤組織內(nèi)MDA-7蛋白的檢測(條帶3和條帶4)以及含親本293細(xì)胞的腫瘤內(nèi)MDA-7蛋白的檢測(條帶1和2)。圖26C.試驗結(jié)束時收獲腫瘤并進行分析。(a)移植293細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞的動物所獲得的腫瘤總的外觀和大小；(b)蘇木精和伊紅染色的組織切片；(c)CD31免疫組化染色表明293-mda-7處理的腫瘤血管形成減少；(d)TUNEL染色表明內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤周圍細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。圖26D.腫瘤樣品中血紅蛋白含量分析表明與接受親本293細(xì)胞的動物相比接受293-mda-7細(xì)胞的動物腫瘤內(nèi)血紅蛋白含量下降。圖27A-27B.圖27A.(a)小鼠右下腹皮下注射5×106A549細(xì)胞以建立A549腫瘤。當(dāng)可明顯感覺到腫瘤時，將動物分為兩組(每組8只)，分別進行如下處理對照組在小鼠的右上腹植入包裹293細(xì)胞的基質(zhì)膠，試驗組動物植入包裹293-mda-7細(xì)胞的基質(zhì)膠。用測徑尺測量腫瘤，利用t檢驗來計算腫瘤體積改變的統(tǒng)計學(xué)意義。與經(jīng)293細(xì)胞處理的腫瘤相比，用293-mda-7細(xì)胞處理的腫瘤的生長明顯受到抑制(p＝0.001)。每一時間點代表標(biāo)準(zhǔn)誤；(b)Western印跡分析血清中的sMDA-7，結(jié)果表明與對照組(條帶2和4)相比，試驗組動物產(chǎn)生sMDA-7，如致密的條帶所顯示(條帶1、3和5)。圖27B.在試驗結(jié)束時收集腫瘤并進行分析。(a)移植293細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞的動物所獲得的腫瘤總的外觀和大??；(b)蘇木精和伊紅染色的組織切片；(c)CD31免疫組化染色表明293-mda-7處理的腫瘤血管形成減少；(d)免疫組化染色表明基質(zhì)膠包裹的細(xì)胞染色呈MDA-7陽性。圖28.MDA-7的加工和分泌。圖的上面是用圖示表示的MDA-7的一級氨基酸序列。下面(左邊)是MDA-7蛋白的親水性指數(shù)。下面(右邊)是內(nèi)源性和分泌的MDA-7的Western印跡分析結(jié)果。圖29A-29B.Ad-mda7活化非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)通路(UPR)蛋白。H1299細(xì)胞用Ad-luc和Ad-mda7處理，48小時后將細(xì)胞裂解，Western印跡分析應(yīng)激蛋白的表達。細(xì)胞裂解物中BiP、GADD34和PP2A的表達情況(圖29A)。細(xì)胞裂解物中胱冬酶7、胱冬酶12和XBP-1的表達情況(圖29B)。圖30.Ad-mda7可破壞鈣離子流，增加線粒體的不穩(wěn)定性。分析Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的H1299腫瘤細(xì)胞。鈣離子流和線粒體的完整性通過共聚焦顯微鏡分析。圖31A-31B.MDA-7蛋白是高度糖基化的。穩(wěn)定表達MDA-7蛋白的293-mda-7細(xì)胞用不同的去糖苷酶處理，其中包括糖肽酶F(GlycoF)、唾液酸酶和內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)(圖31A)。Western印跡分析表明MDA-7是高度糖基化的(圖31B)。圖32A-32B.圖32A.衣霉素和布雷菲德菌素A可阻斷MDA-7蛋白的分泌。衣霉素和布雷菲德菌素A(用量為1和2μg/mL)都可以抑制MDA-7蛋白的分泌，使Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的H1299細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性MDA-7蛋白的濃度增加。圖32B.Ad-mda7介導(dǎo)的凋亡不需要MDA-7的分泌。分泌的MDA-7蛋白不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的殺傷，也不是Ad-MDA7介導(dǎo)的凋亡以及最終的腫瘤細(xì)胞的殺傷所必須的。圖33A-33B.圖33A.靶向性質(zhì)粒的構(gòu)建。構(gòu)建不同的mda-7構(gòu)建體以便把MDA-7靶向性地導(dǎo)入到各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。其中包括含N端信號肽的全長版本(為分泌用)、無信號肽的mda-7構(gòu)建體(為胞漿表達)、含核定位信號(NLS)的mda-7構(gòu)建體以及含ER信號肽的mda-7構(gòu)建體。這些構(gòu)建體都被克隆到pShooter載體(Invitrogen)中。圖33B.靶向性載體的細(xì)胞內(nèi)表達及分泌蛋白的表達。Western分析用于檢測圖27A所描述的不同構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞裂解物以及上清液中MDA-7蛋白的表達。圖34.MDA-7靶向性進入不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。免疫熒光分析不同MDA-7靶向性構(gòu)建體(如圖27A所描述)轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞內(nèi)MDA-7蛋白的表達情況。圖35.MDA-7的ER靶向性可阻斷克隆形成。通過克隆形成單位(CFU)試驗發(fā)現(xiàn)靶向性進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的MDA-7蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)MDA-7在胞漿和核內(nèi)表達時無抗腫瘤活性。圖36.ER靶向性的MDA-7是細(xì)胞毒性的。H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染MDA-7靶向性質(zhì)粒，用存活/死亡試驗進行評價。靶向性進入ER的MDA-7蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，因為可見到死亡的細(xì)胞增加(紅色的，溴化乙錠染色)?？瞻?、胞漿的以及核靶向性的MDA-7的殺傷效應(yīng)很弱。圖37.ER靶向性的MDA-7是促凋亡因子。通過Hoescht分析發(fā)現(xiàn)MDA-7蛋白靶向性地進入ER可誘導(dǎo)凋亡。圖38.CFU分析PC3細(xì)胞內(nèi)MDA-7的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位。PC3前列腺癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼GFP對照、全長MDA-7和線粒體靶向性MDA-7的質(zhì)粒，分析其克隆形成能力。與對照組相比，全長MDA-7可使克隆形成能力下降35％，而線粒體靶向性MDA-7可使PC3細(xì)胞的克隆形成能力和存活能力進一步下降。圖39A-39B.Ad-mda7和NF-κB通路的關(guān)系。圖39A.通過電子遷移率漂移分析發(fā)現(xiàn)Ad-mda7可提高A549細(xì)胞內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性。圖39B.顯性負(fù)性突變體I-kB轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞的生長。圖40.舒林酸而不是吲哚美辛可抑制NF-κB通路的活化。圖41.舒林酸以劑量依賴的方式抑制TNF介導(dǎo)的NF-κB的活化。圖42.Ad-mda7協(xié)同舒林酸誘導(dǎo)H1299細(xì)胞的凋亡。圖43.聯(lián)合治療(72小時)可使處于亞G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增加。圖44.舒林酸和Ad-mda7聯(lián)合治療可顯著增加凋亡。圖45.劑量逐漸升高的I期臨床試驗的設(shè)計，其中mda-7通過瘤內(nèi)注射給予晚期腫瘤患者，所用的是非復(fù)制型的腺病毒構(gòu)建體(Ad-mda7)。試驗設(shè)計標(biāo)明每組患者的數(shù)目、病毒的劑量和活組織檢測的時間。圖46.用圖表表示Ad-mda7誘導(dǎo)的血清細(xì)胞因子動力學(xué)，結(jié)果用血清細(xì)胞因子升高的百分率對注射后的天數(shù)來表示。結(jié)果表明瘤內(nèi)注射Ad-mda7后血清細(xì)胞因子出現(xiàn)瞬時升高。圖47.每組內(nèi)瘤內(nèi)注射Ad-mda7所產(chǎn)生的血清細(xì)胞因子。大多數(shù)患者出現(xiàn)全身細(xì)胞因子(IL-6，IL-10，IFNγ，TNFα，GM-CSF)的瞬時升高。圖48.接受瘤內(nèi)注射Ad-mda7的患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞百分率增加的水平。在mda7處理后15天CD3+CD8+T細(xì)胞增加30±13％。圖49.瘤內(nèi)注射Ad-mda7后患者外周血CD8+細(xì)胞增加。說明性實施方案的描述本發(fā)明涉及增強患者免疫應(yīng)答的方法。增強和提高免疫應(yīng)答可通過肌體阻止、抑制和降低發(fā)生感染、疾病的能力而達到預(yù)防和治療效果。因此，在某些實施方案中，MDA-7多肽的功能是作為治療的佐劑。在另外一些實施方案中，MDA-7多肽可與細(xì)胞因子、趨化因子及其類似物聯(lián)合應(yīng)用，如干擾素α、β和/或γ以增強或提高患者的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及增強或提高免疫應(yīng)答以檢測和鑒定以前未發(fā)現(xiàn)具有免疫原性的分子。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的方法用于診斷的目的以確定免疫原性分子，特別是用于免疫治療的免疫原性分子。在其他的實施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)測免疫治療對候選患者的治療效果。本發(fā)明的方法和組合物可用于患者，并檢測所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的檢測可預(yù)測患者是否適于進行免疫治療。A.MDA-7本發(fā)明的組合物和方法是利用MDA-7多肽來增強免疫應(yīng)答。MDA-7多肽是另一類推斷的腫瘤抑制因子，已經(jīng)證明可抑制p53野生型、p53缺失型及p53突變型腫瘤細(xì)胞的生長。另外，p53缺失型細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)的BAX基因的表達上調(diào)說明MDA-7能夠以不依賴p53的機制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的損傷。申請人觀察到腺病毒介導(dǎo)的MDA-7的過量表達可導(dǎo)致雙鏈RNA活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKR)快速誘導(dǎo)和活化，從而使eIF-2α以及其他PKR靶底物磷酸化，凋亡被誘導(dǎo)。如PKR缺失型成纖維細(xì)胞所顯示，Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡不依賴功能性的PKR通路。這些特征說明MDA-7可作為PKR的誘導(dǎo)因子，具有廣泛的治療、預(yù)后及診斷價值，因此可作為所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的增強因子。PKR具有抗病毒和抗細(xì)胞功能，可參與某些生理過程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞的生長和分化(美國專利No.6,326,466；Feng等，1992；Petryshyn等，1988；Petryshyn等，1984；Judware等，1991)、腫瘤抑制(Koromilas等，1992；Meurs等，1993)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)(Leonardo等，1989；Kumar等，1994；Maran等，1994)。PKR的上調(diào)可誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞系的凋亡。而且，在脊髓發(fā)育不良中，染色體5q上IRF-1基因的關(guān)鍵性致癌性缺失也顯示與PKR表達水平的降低有關(guān)(Beretta等，1996)，肺癌和結(jié)腸癌的免疫組化分析結(jié)果表明與PKR的表達和生存期的延長有關(guān)(Haines等，1992)。PKR可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化介導(dǎo)抗腫瘤形成活性，從而達到抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用。這些通路的活化發(fā)生在潛伏的無活性的同源二聚體被活化的信號誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等，2001)。PKR一旦活化以后就能使各種靶底物磷酸化，這在生長調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)中有很重要的作用(Saelens等，2001；Sudhakar等，2000)。免疫系統(tǒng)的刺激與凋亡有關(guān)(Albert等，1998；Chen等，2001；Saif-Muthama等，2000；Restifo等，2001)。另外，人工誘導(dǎo)的凋亡已被證明可增強疫苗的免疫原性，這是因為通過凋亡細(xì)胞的轉(zhuǎn)染而活化的樹突狀細(xì)胞的刺激效應(yīng)(Sasaki等，2001；Chattergoon等，2000)。Mda-7mRNA已在人PMBC中被鑒定(Ekmekcioglu等，2001)，據(jù)報道人MDA-7無細(xì)胞因子活性。根據(jù)其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名為IL-24(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號XM_001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4-誘導(dǎo)的分泌蛋白)已報道為Th2特異性的細(xì)胞因子(Schaefer等，2001)。FISP的轉(zhuǎn)錄可被TCR和IL-4受體的結(jié)合及隨后的PKC和STAT6的活化所誘導(dǎo)，這可被敲除試驗所證實。FISP的表達特點已被證實，但還沒有發(fā)現(xiàn)這個推斷出的細(xì)胞因子的功能17。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)與mda-7基因有78％的同源性，已被證實與傷口愈合有關(guān)(Soo等，1999；Zhang等，2000)。Mob-5也是一種分泌蛋白，在大鼠轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可能是一種細(xì)胞表面受體(Zhang等，2000)。因此，mda-7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物可在各物種中表達和分泌。但是，沒有數(shù)據(jù)顯示MDA-7具有細(xì)胞因子活性。這種活性可通過增強抗原的免疫原性用于治療各種疾病和感染。Mda-7cDNA(SEQIDNO1)編碼一種新型的、進化保守的、具有206個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQIDNO2)，預(yù)測的分子量為23.8kDa。據(jù)推測氨基酸序列含有一個疏水性骨架，位置約為氨基酸26到45，具有信號序列的特征。除了一個含42個氨基酸殘基的片段與白細(xì)胞介素10(IL-10)有54％的同源性外，該蛋白質(zhì)的序列與已知的蛋白無顯著的同源性。結(jié)構(gòu)分析表明MDA-7(IL-BKW或IL-20)具有細(xì)胞因子家族的結(jié)構(gòu)特征(WO98/28425，本文已納入作為參考)。其結(jié)構(gòu)特征和一小段氨基酸片段的有限一致性顯示MDA-7可能具有細(xì)胞外功能。MDA-7的表達與黑色素瘤的惡性程度成負(fù)相關(guān)關(guān)系，因為試驗證明與原發(fā)和轉(zhuǎn)移的黑色素瘤相比正常的黑色素細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達水平是升高的，而在裸鼠體內(nèi)增強腫瘤形成的處于垂直生長期的黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的mda-7mRNA的表達水平是下降的。其他有關(guān)MDA-7的信息和數(shù)據(jù)見專利申請09/615,154和10/017,472，本文已納入作為參考。其他的試驗證明MDA-7表達的升高可在體外抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并且可以選擇性地誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞的凋亡和抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(Jiang等，1996和Su等，1998)。Jiang等(1996)報道認(rèn)為mda-7在各種起源的腫瘤細(xì)胞內(nèi)都是一種有效的生長抑制基因，其中包括乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、宮頸、結(jié)腸、前列腺和結(jié)締組織?？寺∫种品治隹捎糜谧C明MDA-7表達的上升可增強人宮頸癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、結(jié)腸癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑色素瘤(HO-1和C8161)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤多形體(glioblastomemultiforme)(GBM-18和T98G)以及骨肉瘤(Saos-2)細(xì)胞生長的抑制作用。Mda-7在正常細(xì)胞(HMECs、HBL-100和CREF-Trans6)內(nèi)的過量表達顯示出有限的生長抑制作用，這說明mda-7轉(zhuǎn)基因的效應(yīng)在正常細(xì)胞內(nèi)是不明顯的。綜上所述，這些數(shù)據(jù)說明MDA-7表達升高所產(chǎn)生的體外生長抑制作用對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)高于對正常細(xì)胞的效應(yīng)。Su等(1998)報道了對MDA-7抑制腫瘤細(xì)胞生長的機制的研究。研究結(jié)果表明MDA-7在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D內(nèi)的異位表達可誘導(dǎo)凋亡，但是對正常的HBL-100細(xì)胞無影響，結(jié)果是通過細(xì)胞周期分析和TUNEL分析得出的。轉(zhuǎn)染腺病毒mda-7(“Ad-mda-7”)的細(xì)胞裂解物經(jīng)Western印跡分析表明凋亡刺激蛋白BAX的表達上調(diào)。Ad-mda-7轉(zhuǎn)染上調(diào)BAX蛋白的表達只發(fā)生在MCF-7和T47D細(xì)胞內(nèi)，而不發(fā)生在正常的HBL-100和HMEC細(xì)胞內(nèi)。這些結(jié)果使研究人員提高了Ad-mda-7體外轉(zhuǎn)導(dǎo)對MCF-7腫瘤細(xì)胞異種移植腫瘤形成的效應(yīng)。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制腫瘤異種移植模型中腫瘤的形成和發(fā)展。在本發(fā)明的某些實施方案中，mda-7是作為表達MDA-7多肽的核酸來提供的。在某些特殊的實施方案中，核酸是病毒載體，其中載體的劑量至少為103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013，1014，1015或更高的pfu或病毒顆粒。在某些實施方案中，病毒載體是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、α病毒載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。最優(yōu)選的病毒載體是腺病毒載體。在其他特殊的實施方案中，核酸是非病毒載體。在某些實施方案中，表達多肽的核酸是與啟動子相連接的。適于本發(fā)明的啟動子的非限定性例子包括CMVIE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22和MHCII類分子的啟動子，但是任何可用于啟動mda-7基因或本發(fā)明的免疫原的啟動子，如本文所描述的那些啟動子，相信都可用于實現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明的核酸優(yōu)選通過注射給藥。其他的實施方案也包括通過多次注射給予核酸。在某些實施方案中，注射可在疾病或腫瘤位點的局部、疾病或腫瘤位點的某個區(qū)域、或遠(yuǎn)離疾病或腫瘤位點。在某些實施方案中，核酸的注射是通過連續(xù)灌注、瘤內(nèi)注射、腹腔注射或靜脈注射。在其他的實施方案中，核酸是在切除腫瘤前、或切除腫瘤后，或者切除腫瘤前后都注射到腫瘤床的部位。另外，核酸可在化療、生物治療、免疫治療、手術(shù)或放療前、期間或之后給予患者?；颊邇?yōu)選人。在其他的實施方案中，患者是腫瘤患者。1.核酸、載體和調(diào)節(jié)信號本發(fā)明涉及mda-7基因及其基因產(chǎn)物MDA-7有關(guān)的多聚核苷酸或核酸分子。另外，本發(fā)明還涉及與免疫原性分子相關(guān)的多聚核苷酸或核酸分子。這些多聚核苷酸或核酸分子可以從哺乳動物細(xì)胞內(nèi)分離并純化。值得注意的是，分離和純化的MDA-7核酸分子，不論是分泌的或是全長的版本，都是與mda-7基因產(chǎn)物有關(guān)的核酸分子，都可以是RNA或DNA的形式。同樣，與免疫原性分子有關(guān)的核酸分子也可以是RNA或DNA的形式。本文所用的術(shù)語“RNA轉(zhuǎn)錄子”是指DNA核酸分子轉(zhuǎn)錄出來的產(chǎn)物-RNA分子。這種轉(zhuǎn)錄子可編碼一種或多種多肽。如本申請所使用的，術(shù)語“多聚核苷酸”是指核酸分子、RNA或DNA，可從總基因組核酸中分離。因此，“編碼MDA-7的多聚核苷酸”是指含MDA-7編碼序列的核酸片段，也可以從基因組總DNA和蛋白中分離或純化。當(dāng)本申請指MDA-7編碼多聚核苷酸或核酸的功能或活性時，它就意味著編碼能增強免疫應(yīng)答的分子的多聚核苷酸。另外，“編碼免疫原的多聚核苷酸”是指含免疫原編碼序列的核酸片段，也可以從基因組總DNA和蛋白中分離或純化。當(dāng)本申請指編碼免疫原的免疫基因的功能或活性時，它就意味著編碼能誘導(dǎo)人體免疫應(yīng)答的免疫原性分子的多聚核苷酸。術(shù)語“cDNA”是指以RNA為模板制備的DNA。與基因組DNA或RNA轉(zhuǎn)錄子相比，利用cDNA的優(yōu)勢在于其穩(wěn)定性和易于利用重組DNA技術(shù)進行操作的能力(見Sambrook，1989；Ausubel，1996)。當(dāng)全部或部分基因組序列有一些時則需要時間。另外，cDNA是有優(yōu)勢的，因為它代表了多肽的編碼區(qū)，已經(jīng)剔除了內(nèi)含子和其他調(diào)節(jié)序列。另外需要注意的是從一個給定細(xì)胞內(nèi)分離出的給定的MDA-7編碼核酸或mda-7基因可被核酸序列稍微有差異但還能編碼MDA-7多肽的天然突變體或突變株替代；人的MDA-7多肽是特殊的實施方案。因此，本發(fā)明也包括具有細(xì)微氨基酸改變但活性相同的MDA-7的衍生物。術(shù)語“基因”簡單地說就是指功能性蛋白、多肽或肽編碼單位。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這個功能術(shù)語包括能表達或適于表達蛋白、多肽、功能域、肽、融合蛋白以及突變體的基因組序列、cDNA序列和較小的基因工程基因片段。編碼MDA-7或其他治療性多肽如免疫原的核酸分子含有下列長度，或至少含有下列長度的連續(xù)核酸序列5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多個核苷酸、核苷或堿基對。這種序列與SEQIDNO1(MDA-7編碼序列)一致或互補。“與其他編碼序列有實質(zhì)區(qū)別的”是指目的基因為核酸片段的部分編碼序列，這個片段不含有天然編碼核酸的大部分，如大的染色體片段或其他功能基因或cDNA編碼區(qū)。當(dāng)然，這是指天然分離的核酸片段，不包括后來人工添加到片段上的基因或編碼區(qū)。在某些特定的實施方案中，本發(fā)明涉及獨立的DNA片段和插入編碼MDA-7蛋白、多肽或肽的DNA序列的重組載體，這些MDA-7蛋白、多肽或肽含有包含在其氨基酸序列內(nèi)的與上述SEQIDNO2一致的連續(xù)氨基酸序列，與MDA-7相應(yīng)的序列被命名為“人MDA-7”或“MDA-7多肽”。術(shù)語“與上述SEQIDNO2基本一致的序列”是指與部分SEQIDNO2基本對應(yīng)的序列，其中只有相當(dāng)少的氨基酸是與SEQIDNO2的氨基酸不一致，但其生物功能是等價的。術(shù)語“生物功能等價”是本領(lǐng)域所熟知的，在本文中還有更詳細(xì)的定義。因此，如果一個序列的氨基酸有約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或者約99％，以及二者之間的，如約70％到約80％、優(yōu)選的是約81％到約90％；或者更優(yōu)選的是約91％到約99％與SEQIDNO2的氨基酸一致或功能等價，則該序列是“與上述SEQIDNO2基本一致”，因而蛋白的生物活性得以保持。在某些特定的實施方案中，MDA-7蛋白、多肽或肽或生物功能等價物的生物活性包括增強免疫應(yīng)答的活性。在其他特定的實施方案中，為蛋白、多肽或肽或者生物功能等價物的免疫原、免疫原性分子具有免疫原性，這是指該分子能誘導(dǎo)人體的免疫應(yīng)答。在其他某些實施方案中，本發(fā)明涉及獨立的DNA片段和重組載體，這些片段和載體的序列內(nèi)具有與上述SEQIDNO1基本一致的序列。術(shù)語“與上述SEQIDNO1基本一致”與上面所描述的意義一樣，是指核酸序列與部分SEQIDNO1基本一致，只有少數(shù)幾個密碼子與SEQIDNO1的密碼子不同，但功能是等價的。而且，編碼具有MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段是最常用的。在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及獨立的核酸片段和插入編碼MDA-7多肽或肽的DNA序列的重組載體，這些多肽或肽的氨基酸序列具有與MDA-7多肽一致或基本一致的連續(xù)氨基酸序列。在其他的實施方案中，本發(fā)明涉及獨立的核酸片段和插入編碼免疫原、蛋白、多肽或肽的DNA序列的超組載體，這些免疫原、蛋白、多肽或肽的氨基酸序列具有與免疫原一致或基本一致的連續(xù)氨基酸序列。本發(fā)明的載體主要用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞使其含有可調(diào)控的真核細(xì)胞啟動子(即可誘導(dǎo)的、可抑制的、組織特異性的)控制下的mda-7基因。另外，如果無其他原因，為了便于載體的體外操作，載體內(nèi)也可以包含篩選標(biāo)記。但是，篩選標(biāo)記在產(chǎn)生重組細(xì)胞時可能發(fā)揮重要作用。表1和2，見下，列出了可用于本發(fā)明的各種調(diào)節(jié)信號。表1-可誘導(dǎo)元件表2-其他啟動子/增強子元件真核細(xì)胞內(nèi)控制蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子是由多個基因元件組成的。細(xì)胞內(nèi)的機器能將每個元件所傳遞的調(diào)節(jié)信息收集起來并整合，使不同的基因分別進化，通常形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物。本文所用的術(shù)語“啟動子”是指一組轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊，在RNA多聚酶II的起始位點周圍成簇。許多關(guān)于啟動子是如何組織的構(gòu)想都來自于對幾種病毒啟動子的分析，其中包括HSV胸腺嘧啶激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的啟動子。這些試驗再加上最近的研究表明啟動子是由不連續(xù)的功能模塊組成的，每個模塊約含7-20bp的DNA，并且每個模塊都有一個或多個轉(zhuǎn)錄活化蛋白的識別位點。每個啟動子中至少有一個模塊的功能是定位RNA合成的起始位點。最知名的例子是TATA框，但是某些啟動子沒有TATA框，如哺乳動物末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶基因和SV40晚期基因的啟動子，這些啟動子含有與起始位點本身重疊的一個不連續(xù)元件以固定起始的位置。另外一些啟動子元件可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。一般來說，這些元件位于起始位點上游30-110bp的區(qū)域，盡管最近發(fā)現(xiàn)有許多啟動子也含有位于起始位點下游的功能元件。不同元件之間的距離是很靈活的，因此當(dāng)元件反轉(zhuǎn)或相對移動時啟動子的功能保持不變。對于tk啟動子來說，不同元件之間的距離增加到50bp時活性才開始下降。根據(jù)啟動子的不同，其每個元件或者協(xié)同、或者獨立發(fā)揮功能以活化轉(zhuǎn)錄。增強子最初被鑒定為能增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的基因元件，位于同一DNA分子的較遠(yuǎn)位置。這種在遠(yuǎn)處發(fā)揮作用的能力在原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的經(jīng)典研究中是沒有先例的。后來的試驗表明具有增強子活性的DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)與啟動子很相似。它們是由許多單個的元件組成的，其中每個元件都可以結(jié)合一個或多個轉(zhuǎn)錄蛋白。增強子和啟動子的基本區(qū)別是其調(diào)控方式。增強子區(qū)必須以整體的形式才能在遠(yuǎn)處刺激轉(zhuǎn)錄；而啟動子區(qū)或其組成元件則不需要這樣。另一方面，啟動子必須含有一個或多個在特定位點并且以特定方向啟動RNA合成起始的元件，而增強子缺乏這種活性。除了這種調(diào)控方式的不同，啟動子和增強子是十分相似的。啟動子和增強子具有相似的活化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的基本功能。它們之間通常是重疊的，并且相鄰，具有很相似的組織結(jié)構(gòu)。通盤考慮這些特征就會發(fā)現(xiàn)增強子和啟動子是同源性實體，結(jié)合到這些序列上的轉(zhuǎn)錄活化蛋白與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機器以基本相同的方式相互作用。在某些實施方案中，本發(fā)明所用的啟動子是巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動子。該啟動子位于pcDNAIII內(nèi)，可從Invitrogen購買，在本發(fā)明中普遍使用。其他可用于本發(fā)明的啟動子有dectin-1和dectin-2啟動子。下面列出了其他一些可用于本發(fā)明的病毒啟動子、細(xì)胞啟動子/增強子和可誘導(dǎo)的啟動子/增強子。其他任何的啟動子/增強子的結(jié)合(如真核啟動子數(shù)據(jù)庫中的每一個)也都可以用于調(diào)控編碼寡糖處理酶、蛋白折疊輔助蛋白、篩選標(biāo)記蛋白或異源目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因的表達。另外被證明是有用的信號是多聚腺苷酸信號。這種信號可來自人生長激素(hGH)基因，牛生長激素(BGH)基因或SV40。內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(IRES)元件的使用可產(chǎn)生多基因、多順反子信使RNA。IRES能繞過5-甲基化帽子依賴的翻譯所需要的核糖體掃描模式，在內(nèi)部位點起始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。來自小核糖核酸病毒家族的兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒)的IRES元件已被描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，另外還有來自哺乳動物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可與異源的開放閱讀框架相連接。多個開放閱讀框架可一起轉(zhuǎn)錄，每個都被IRES分開，形成多順反子信使RNA。利用IRES元件的這一特點，每個開放閱讀框架都可以接近核糖體以有效翻譯。多個基因可在單個啟動子/增強子的控制下高效表達轉(zhuǎn)錄出一條信使RNA。在任何情況下都應(yīng)該清楚啟動子是一種DNA元件，當(dāng)其位于基因的上游時才能發(fā)揮功能導(dǎo)致該基因的表達。本發(fā)明的大多數(shù)目的基因構(gòu)建體都位于啟動子元件的下游。2.蛋白、肽和多肽a.生物功能等價物本發(fā)明涉及通過提供有效量的MDA-7多肽增強免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，MDA-7多肽是直接提供的。在某些特殊的實施方案中，MDA-7多肽是在治療前提供的。在另外一些特殊的實施方案中，MDA-7多肽與其他免疫原性分子，如抗原同時給予以達到免疫治療的目的。在其他特殊的實施方案中，MDA-7多肽是在治療后提供，在某些情況下是在提供免疫原性分子以后，以達到加強、檢測或預(yù)測所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的目的。本發(fā)明的其他實施方案包括使用純化的蛋白組合物，該組合物中含有MDA-7蛋白、截短形式的MDA-7以及MDA-7氨基酸序列來源的肽，后者可給予細(xì)胞或肌體以抑制血管形成。截短的MDA-7分子包括從MDA-7氨基酸殘基46-49開始的分子以及N端截短的分子。優(yōu)選的分子起始于46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182、以及末端在206位殘基。在其他的實施方案中，殘基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45和46也包含在MDA-7的其他連續(xù)氨基酸殘基內(nèi)，如SEQIDNO2所示。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可對MDA-7多肽或肽、免疫原性分子或免疫基因產(chǎn)物進行修飾和改變，所得到的分子具有相似的或預(yù)期的特征。例如，某些氨基酸可被蛋白結(jié)構(gòu)中的其他氨基酸所替代，但是不會丟失與某些結(jié)構(gòu)如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或某些分子如Tat和RNA聚合酶II的結(jié)合位點的結(jié)合活性。由于蛋白的結(jié)合能力和性質(zhì)可決定蛋白的生物功能活性，因此在蛋白序列上可進行某些氨基酸序列的替代(當(dāng)然也包括其編碼DNA序列)而得到具有相似活性的蛋白質(zhì)(拮抗的)。因此，發(fā)明者可在HIV多肽或肽(或其編碼DNA)進行各種改變而不會丟失其生物功能或活性。對于功能等價物來說，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應(yīng)該理解這個概念來自于生物功能等價蛋白或肽的定義，是指一個分子的特定部位內(nèi)發(fā)生一些有限的改變，所得到的分子具有與原分子相似的生物活性。因此本文所定義的生物功能等價肽是指某些而不是大多數(shù)或全部氨基酸被替代的那些肽。特別是對于小肽來說，可以改變的氨基酸很少。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明可以很容易地在多種不同的蛋白/肽上進行不同的替代。很容易理解的是某些殘基對于維持蛋白或肽的生物活性或結(jié)構(gòu)特性是十分重要的，就是那些位于酶或RNA聚合酶II結(jié)合區(qū)的活性位點上的殘基，這些殘基一般不允許改變。對于本發(fā)明來說，那些誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所必須的殘基一般不應(yīng)改變，對于MDA-7多肽和免疫基因產(chǎn)物來說都是如此。氨基酸的替代一般是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，如其疏水性、親水性、電荷、大小等。通過對氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型的分析發(fā)現(xiàn)精氨酸、賴氨酸和組氨酸是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸是較小的氨基酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有基本一致的形狀。因此，基于這些考慮，本文把下列的亞類定義為生物功能等價物精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。為了有效地量化這種改變，需要考慮氨基酸的水性指數(shù)?；谄涫杷院碗姾商卣?，每個氨基酸都被賦予一個水性指數(shù)，分別為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。氨基酸的水性指數(shù)對于一個蛋白的結(jié)合活性的重要性是本領(lǐng)域所熟知的(Kyte&Doolittle，1982，本文已納入作為參考)。已知某些氨基酸被具有相似水性指數(shù)或分?jǐn)?shù)的其他氨基酸替代可以保持相似的生物活性。在基于水性指數(shù)進行改變時，優(yōu)選用水性指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸進行替代，更優(yōu)選的是水性指數(shù)在±1以內(nèi)的，最優(yōu)選的是水性指數(shù)在±0.5以內(nèi)的?；谟H水性進行有效的氨基酸替代也是本領(lǐng)域所熟知的，尤其是當(dāng)用于免疫實施方案中的所產(chǎn)生的生物功能等價蛋白或肽時，如本發(fā)明的實施方案。美國專利4,554,101，本文已納入作為參考，描述了蛋白質(zhì)的局部最大平均親水性是由其臨近氨基酸的親水性控制的，與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與蛋白的生物特性有關(guān)。如美國專利4,554,101詳細(xì)描述的，每個氨基酸都被賦予了一個親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的親水性值進行改變時，優(yōu)選用親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸進行替代，更優(yōu)選的是親水性值在±1以內(nèi)的，最優(yōu)選的是親水性值在±0.5以內(nèi)的。當(dāng)討論集中在因氨基酸改變而導(dǎo)致的功能等價多肽時，也需要注意編碼DNA的改變也會造成上述氨基酸的變化，也需要考慮基因密碼子的退化以及兩個或多個密碼子可以編碼同一個氨基酸。一個氨基酸及其密碼子的表列在本文的下面以便于這種實施方案的應(yīng)用，或其他的應(yīng)用，如設(shè)計探針和引物等。b.合成肽本發(fā)明的組合物可以包括經(jīng)修飾來保護其生物功能的肽。生物功能保護肽與未保護肽相比在給予人體時具有某種優(yōu)勢，見美國專利5,028,592的描述，本文已納入作為參考，保護肽通常具有更高的藥理活性。本發(fā)明所用的組合物也可包括包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或其混合物的肽。D氨基酸的使用可以提高蛋白質(zhì)對人體內(nèi)天然蛋白酶的耐受性，降低其免疫原性，因而可能具有更長的生物半衰期。本發(fā)明還描述了用于本發(fā)明的各個實施方案的MDA-7肽和/或免疫原。分析了特殊肽激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。在肽相對較小的特定實施方案中，本發(fā)明的肽也可利用常規(guī)技術(shù)在溶液或固相支持物上合成。各種自動合成儀都是商業(yè)化的，可根據(jù)已知的操作方法使用。見Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)，本文都已納入作為參考。短肽序列或重疊肽文庫一般約含有35到50個氨基酸，與本文所描述的所選區(qū)域相對應(yīng)，可以很容易地合成并通過篩選試驗找到具有活性的肽。另外，重組DNA技術(shù)也可以使用，其中編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列被插入到表達載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)，在適宜表達的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明的組合物可以包括經(jīng)修飾來保護其生物功能的肽。生物功能保護肽與未保護肽相比在給予人體時具有某種優(yōu)勢，見美國專利5,028,592的描述，本文已納入作為參考，保護肽通常具有更高的藥理活性。本發(fā)明所用的組合物也可包括包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或其混合物的肽。D氨基酸的使用可以提高蛋白質(zhì)對人體內(nèi)天然蛋白酶的耐受性，降低其免疫原性，因而可能具有更長的生物半衰期。c.體外制備蛋白按照本發(fā)明的某些實施方案轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒載體后，初級哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物可通過各種方式制備。為了使細(xì)胞在體外以及與表達構(gòu)建體接觸時保持存活需要在含正確比例的氧、CO2和養(yǎng)分的環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，并且確保不被微生物污染。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已有很多報道，本文以參考文獻的方式描述(Freshner，1992)。上述的一個實施方案包括利用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)永生化的細(xì)胞以制備和/或生產(chǎn)蛋白質(zhì)。目的蛋白的基因可按上面描述的方法轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，然后在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。事實上任何多肽的基因都適用這種方法。重組表達載體的制備及其所包含的元件都已在上面討論過。另外，所產(chǎn)生的蛋白可以是細(xì)胞所正常合成的內(nèi)源性蛋白。本發(fā)明的其他實施方案利用自身的B淋巴細(xì)胞系，這些細(xì)胞系用表達免疫基因產(chǎn)物、尤其是具有免疫活性的蛋白的病毒載體轉(zhuǎn)染。哺乳動物宿主細(xì)胞系的其他例子包括Vero和HeLa細(xì)胞、其他B細(xì)胞系和T細(xì)胞系，如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji等，以及中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞。另外，還可以選擇表達插入序列或能以所希望的方式修飾和處理基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞系。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(如糖基化)和處理(如斷裂)對于蛋白的功能來說是十分重要的。不同的宿主細(xì)胞具有不同的蛋白質(zhì)翻譯后處理和修飾機制。可選擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保所表達外源蛋白正確修飾和處理。許多篩選系統(tǒng)可以使用，其中包括而不限于HSV胸腺嘧啶激酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分別位于tk-、hgprt-和aprt-細(xì)胞內(nèi)。另外，抗代謝耐受性也可作為篩選的基礎(chǔ)dhfr使細(xì)胞對耐受；gpt使細(xì)胞對霉酚酸耐受；neo使細(xì)胞對氨基糖苷G418耐受；hygro使細(xì)胞對潮霉素耐受。動物細(xì)胞可以兩種模式在體外增殖非錨定依賴的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)物懸液中生長，錨定依賴的細(xì)胞需要粘附在固相基質(zhì)上增殖(即細(xì)胞呈單層生長)。能連續(xù)傳代的細(xì)胞系通過非錨定依賴的方式或用懸液培養(yǎng)是廣泛應(yīng)用的大規(guī)模制備細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物的主要方式。但是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也有其局限性，如與粘附細(xì)胞相比其致瘤性弱，蛋白產(chǎn)生能力低。B.增強免疫應(yīng)答1.雙鏈RNA活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKR)本發(fā)明的方法可用于增強免疫應(yīng)答。該方法利用了干擾素誘導(dǎo)的雙鏈(ds)RNA活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKR)在Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡中的作用。PKR是一種68kDa的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要以潛伏的形式存在于哺乳動物細(xì)胞的胞漿內(nèi)(Jagus等，1999)。位于氨基端的兩個dsRNA結(jié)合區(qū)與dsRNA或其他活化因子相互作用使PKR的構(gòu)象改變從而發(fā)生自身磷酸化和活化(Zhang等，2001；Vattem等，2001)。PKR一旦活化就能磷酸化各種靶底物，其中了解最多的eIF2α，它的磷酸化可以抑制蛋白的合成，抑制生長和誘導(dǎo)凋亡(Saelens等，2001；Sudhakar等，2000)。PKR在HeLa、Cos1、U937和NIH3T3腫瘤細(xì)胞內(nèi)的活化可誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞死亡(Jagus等，1999)。另外，PKR敲除鼠來源的胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)對各種刺激因子如dsRNA、TNF-α和脂多糖誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡耐受(Der等，1997)。在本發(fā)明的某些實施方案中，MDA-7和/或編碼MDA-7核酸可與干擾素合用來活化細(xì)胞內(nèi)的PKR。這種組合物活化的PKR可導(dǎo)致PKR活性的升高。某些情況下的PKR活化可誘導(dǎo)靶細(xì)胞在體外或體內(nèi)的凋亡。PKR表達的上調(diào)可誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞系的凋亡。而且，對于脊髓發(fā)育不良來說，染色體5q上的IRF-1基因的關(guān)鍵性瘤性缺失明顯與PKR水平的降低有關(guān)(Beretta等，1996)，肺癌和結(jié)腸癌的免疫組化分析結(jié)果表明PKR的表達與生存期的延長有關(guān)(Haines等，1992)。PKR可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化介導(dǎo)抗腫瘤形成活性，從而發(fā)揮抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用。這些通路的活化發(fā)生在潛在的無活性同源二聚體形成之后，這種同源二聚體的形成是由于活化信號的誘導(dǎo)通過構(gòu)象改變而發(fā)生自身磷酸化和活化(Vattem等，2001)。PKR一旦活化以后就能使各種靶底物磷酸化，這在生長調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)中有很重要的作用(Saelens等，2001；Sudhakar等，2000)。免疫系統(tǒng)的刺激與凋亡有關(guān)(Albert等，1998；Chen等，2001；Saif-Muthama等，2000；Restifo等，2001)。另外，人工誘導(dǎo)的凋亡已被證明可增強疫苗的免疫原性，這是因為通過凋亡細(xì)胞的轉(zhuǎn)染而活化的樹突狀細(xì)胞的刺激效應(yīng)(Sasaki等，2001；Chattergoon等，2000)。幾種病毒RNA可抑制PKR的活化(Kitajewski等，Cell45195-200(1986)；Clarke等，NucleicAcidsRes.19243-248(1991)；Ghadge等，J.Virol.684137-4151(1994))，其他是有效的活化因子(Hovanessian，A.G.，J.InterferonRes.9641-647(1989))。HIV-1mRNA轉(zhuǎn)錄子的TAR序列已被證明在低濃度時既可以活化(Edery等，Cell56303-312(1989)；SenGupta等，NucleicAcidsRes.17969-978(1989)；Judware等，J.InterferonRes.13153-160(1993))又可以抑制(Gunnery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA878687-8691(1990))PKR的活化。人(Meurs等，Cell62379-390(1990))和鼠的PKR(Feng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895447-5451(1992)；Baier等，NucleicAcidsRes.214830-4835(1993))都已被克隆出來并被測序，這兩個cDNA具有高度的核苷酸序列一致性(Feng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895447-5451(1992))。以前幾個試驗的結(jié)果顯示PKR的RNA結(jié)合區(qū)位于激酶的N端部分(Feng等，1992；McCormack等，1992；Patel等，1994；Green等，1992；Patel等，1992)。盡管已經(jīng)有試驗表明PKR序列中幾個富含正電荷的殘基所在的短片段的缺失可以消除dsRNA誘導(dǎo)的PRK活化。美國專利6,326,466描述了一個不連續(xù)的PKR或氨基酸基序是結(jié)合調(diào)節(jié)性dsRNA所必須的，也是足夠的(Feng等，1992)。另外，有試驗表明PKR拮抗劑可用于治療不成熟或細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病，如HIV-1感染所導(dǎo)致的T細(xì)胞耗竭。相反，在本發(fā)明的某些實施方案中也涉及了增強PKR表達的分子。給予該分子可升高宿主內(nèi)的MDA-7水平并且可以增強宿主的免疫應(yīng)答。因此，作為本發(fā)明的一個備選實施方案，有一種組合物包含具有增強PKR表達的生物活性的分子。在另外一個實施方案中，該分子是在給予免疫原性分子，如抗原，之前或之后提供的。這種具有增強PKR表達的生物活性的分子可以是干擾素。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ad-mda7可誘導(dǎo)和活化ds-RNA依賴的蛋白激酶(PKR)，導(dǎo)致eIF-2α的磷酸化和肺癌細(xì)胞的凋亡。用絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑--氨基嘌呤(2-AP)處理可消除Ad-mda7誘導(dǎo)PKR活化、eIF2α磷酸化和凋亡。另外，無PKR的非野生型成纖維細(xì)胞對Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡耐受。這些數(shù)據(jù)說明PKR在Ad-mda7介導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另外，PKR已被證明為一個重要的致瘤性調(diào)節(jié)因子，MDA-7誘導(dǎo)的PKR活化說明MDA-7在改善本領(lǐng)域現(xiàn)有的治療、預(yù)測和診斷方法中具有重要價值。PKR的活化還可以增強參與免疫活化的許多分子的表達。因此Ad-mda7或其他方法誘導(dǎo)的PKR活化有利于增強抗致病因子的免疫應(yīng)答。2.線粒體滲透性轉(zhuǎn)變以前的研究已經(jīng)表明免疫系統(tǒng)的刺激與凋亡有關(guān)(Albert等，2001；Chen等，2001；Saif-Muthama等，2000；Restifo等，2001)。另外通過肺癌患者的I期和II期臨床試驗證明將含野生型p53的腺病毒(Ad-p53)轉(zhuǎn)移到肺癌中可誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞死亡。但不幸的是由于凋亡下游介質(zhì)中某些分子的改變使某些患者對Ad-p53基因轉(zhuǎn)移耐受。因此需要找到其他的基因來治療對野生型p53基因轉(zhuǎn)移耐受的腫瘤患者。Mda-7是一個新型的腫瘤抑制基因，試驗證明它可以誘導(dǎo)p53敏感性和p53耐受性腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是卻不能誘導(dǎo)正常細(xì)胞的凋亡(Jiang等，1996；Su等，1998；Ekmekcioglu等，2001；Mhashilkar等，2001；Saeki等，2000)。已經(jīng)證實線粒體的活化和細(xì)胞色素c的釋放是細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一類促凋亡刺激因子(包括p53、BAX、BAK和星形孢菌素)依賴于線粒體膜電位(MMP)的變化，從而誘導(dǎo)線粒體滲透性轉(zhuǎn)變(MPT)依賴的通道的開放。這些通道是一種跨越線粒體內(nèi)外膜的多蛋白復(fù)合物。隨著MMP的改變，細(xì)胞色素c和其他凋亡因子從線粒體內(nèi)釋放出來進入細(xì)胞漿。這類凋亡因子中細(xì)胞色素c通過MMT依賴的通道的釋放可被環(huán)孢霉素A(CyA)和bonkregicacid阻斷，因而抑制了凋亡和細(xì)胞死亡的發(fā)生。但是，其他誘導(dǎo)凋亡的因子如Bid可能不依賴于MMP的變化來釋放細(xì)胞色素c，而是通過MPT非依賴的通道釋放細(xì)胞色素c，這樣就不會被CyA或bonkregicacid阻斷。試驗證明MDA-7可通過MPT非依賴的通道誘導(dǎo)釋放細(xì)胞色素c，這種釋放不會被CyA阻斷。p53敏感性和p53耐受性細(xì)胞內(nèi)都可以發(fā)生這種獨特的作用機制說明Ad-mda-7和Ad-p53發(fā)生作用的分子機制不同。Ad-mda-7如何通過MPT非依賴的通道誘導(dǎo)凋亡還不清楚，也許部分是由于外在的死亡受體通路的活化，如上述的FasL表達水平的升高。FasL可通過活化胱冬酶8作用于外在的死亡受體通路，從而導(dǎo)致Bid的斷裂和線粒體的活化。Kim等(2000)也報道Bid不象BAK或BAX，它可以通過一個不依賴MPT依賴通道的通路誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放。Patae等(2002，已提交)證明腺病毒介導(dǎo)的MDA-7的過量表達可導(dǎo)致p53敏感性和p53耐受性肺癌細(xì)胞的快速凋亡。Ad-mda-7在線粒體內(nèi)的作用機制好像是通過MPT非依賴的通道釋放細(xì)胞色素c，進而活化處決者胱冬酶并裂解細(xì)胞。FasL的表達上調(diào)、胱冬酶8的活化和Bid的斷裂說明Ad-mda-7優(yōu)先通過外在的死亡受體通路活化線粒體并導(dǎo)致MPT非依賴的細(xì)胞色素c釋放。而且，使用Ad-mda-7是一種治療對Ad-p53和其他MPT依賴的細(xì)胞死亡過程耐受的腫瘤患者的新型方法。3.β-聯(lián)蛋白和PI3K信號通路β-聯(lián)蛋白和PI3K控制的信號通路都參與凋亡和細(xì)胞存活通路的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞與細(xì)胞的粘附、遷移及轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。已知這些信號通路中的某些通路在許多不同類型的腫瘤內(nèi)都有遺傳的或后天的改變，其中包括肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌(Lebedeva等，2002；Novak等，1999)。β-聯(lián)蛋白是Wnt通路中一個關(guān)鍵的下游效應(yīng)因子，可以結(jié)合和活化TCF/LEF家族中的轉(zhuǎn)錄因子引起TCF/LEF反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄。β-聯(lián)蛋白參與細(xì)胞-細(xì)胞的粘附、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。在許多人的腫瘤中有β-聯(lián)蛋白表達水平的升高，其中較顯著的是結(jié)腸癌和胃癌。最近發(fā)現(xiàn)β-聯(lián)蛋白表達水平的升高與人乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。另外，某些推測出的β-聯(lián)蛋白/TCF反應(yīng)性基因，包括那些調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進展及細(xì)胞分化能力喪失的基因如細(xì)胞周期蛋白D1、基質(zhì)溶解因子和c-myc，以及這些基因的產(chǎn)物在乳腺腫瘤及表達活化的β-聯(lián)蛋白的細(xì)胞系中的表達都有升高(McCormickF，1999)。這些現(xiàn)象說明致癌性的Wnt通路是通過β-聯(lián)蛋白發(fā)揮作用的，參與乳腺增生及乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展(Michaelson等，2001；Smalley等，2001)。另外，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、APC和GSK-3β表達水平的下降和β-聯(lián)蛋白表達水平的上升可導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白在核內(nèi)的積聚，從而激活β-聯(lián)蛋白-LEF/TCF信號通路(Yang等，2001)。在多種類型的腫瘤內(nèi)參與Wnt/β-聯(lián)蛋白通路信號傳遞的分子都有突變或異常調(diào)節(jié)。例如，多數(shù)結(jié)腸癌發(fā)生結(jié)腸腺瘤性息肉病相關(guān)基因(APC)的突變(BerrieC，2001)。APC可結(jié)合并促進β-聯(lián)蛋白的降解，因此APC的突變會導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的積聚。含有野生型APC的結(jié)腸癌內(nèi)與β-聯(lián)蛋白有關(guān)的基因發(fā)生突變，因此β-聯(lián)蛋白對APC介導(dǎo)的降解耐受。因而β-聯(lián)蛋白活性的增加是大多數(shù)(＞80％)結(jié)腸癌以及其他組織來源的腫瘤的一個普遍特征(Easwaran等，1999；Peifer等，2000)。在Wnt信號級聯(lián)中，APC、軸蛋白、凝聚蛋白和GSK-3β組成破壞復(fù)合體，調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定性。在沒有接受Wnt信號的細(xì)胞內(nèi)，GSK-3β被認(rèn)為可以磷酸化β-聯(lián)蛋白，從而使后者被蛋白酶體降解。Wnt信號抑制GSK-3β的活性。因此β-聯(lián)蛋白不再被磷酸化，因而積聚并與TCF/LEF形成核復(fù)合體，活化Wnt反應(yīng)性基因如myc、細(xì)胞周期蛋白D1等(vanNoort等，2002)。Ad-mda-7處理可增加腫瘤抑制基因如APC、GSK-3β和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達水平，降低PI3K信號通路中原癌基因的表達水平。在Ad-mda-7處理的腫瘤細(xì)胞中，β-聯(lián)蛋白游離到漿膜上，被阻止向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，最終抑制了生長促進基因的轉(zhuǎn)錄活性。上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達和調(diào)節(jié)是控制腫瘤進展和生長的重要因素。Ad-mda-7誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達的上升在阻止β-聯(lián)蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)運的機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用人腫瘤標(biāo)本進行相關(guān)的試驗，以及利用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因鼠模型進行的功能試驗表明上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的丟失有時與上皮腫瘤的發(fā)生有關(guān)。盡管這種“概念蛋白開關(guān)”的功能還不清楚，但是最近的研究證明鈣粘蛋白可與酪氨酸激酶受體相互作用，提示鈣粘蛋白表達的變化不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的粘附，還可以影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進而改變腫瘤細(xì)胞的表型(Parker等，2001)。對磷酸肌醇3激酶(PI3Ks)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架的重排及膜交換中的作用的了解是相當(dāng)廣泛的。有證據(jù)表明PI3K超家族的成員及PI3K信號通路中的成分對于人的許多腫瘤的發(fā)展起重要作用。已知這個復(fù)合通路參與細(xì)胞生長、分化、遷移、增殖和存活的調(diào)節(jié)，因此PI3K通路中的成分就成為控制腫瘤細(xì)胞生長和擴散的潛在靶位(FryMJ，2001)。試驗證實PI3K信號通路的抑制可作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效方法(Katso等，2001；Cavallaro等，2002)。PI3K在各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，如生長、存活以及惡變。PI3K本身具有癌基因活性和活化其他信號蛋白如癌蛋白的能力。PI3K的抗凋亡效應(yīng)是通過活化其他信號通路的蛋白如蛋白激酶B(Akt/PKB)和/或PKB依賴的酶(GSK-3β、ILK-1)而實現(xiàn)的。PI3K在細(xì)胞的惡性變中扮演關(guān)鍵角色，可與某些病毒或細(xì)胞癌蛋白(src，ras，rac，T-antigen，etc.)形成復(fù)合物，這些癌蛋白只有在PI3K存在的情況下才有惡性轉(zhuǎn)化活性。試驗證實Ad-mda-7能直接抑制PI3K的功能，也能抑制PI3K調(diào)節(jié)的其他原癌基因的功能(Mhashilkar等，2002，已提交)。Ad-mda-7編碼一個新型的腫瘤抑制基因，可以上調(diào)其他腫瘤抑制基因如上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、GSK-3β、APC和PTEN的表達。尤其重要的是，Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞可明顯下調(diào)癌蛋白如PLC-γ、PI3K、Akt、FAK和β-聯(lián)蛋白的表達(圖15)。生長因子、整合素和其他配基與不同的膜受體結(jié)合后產(chǎn)生信號傳遞的過程中，會產(chǎn)生一個分子事件的復(fù)合級聯(lián)反應(yīng)。配基與受體的結(jié)合可活化PLC-γ→FAK→PI3K→Akt級聯(lián)，最終導(dǎo)致基因表達的從新開始。Ad-mda-7可下調(diào)這個級聯(lián)中各個成員的表達。腫瘤抑制因子PTEN可阻斷FAK、PI3K和Akt信號傳遞。因此，Ad-mda-7對這些信號分子的作用可以通過PTEN上調(diào)這些分子的表達來解釋。然而，Ad-mda-7也可以下調(diào)PLC-γ的表達，這不是由PTEN調(diào)節(jié)的。因此，MDA-7可能對PLC-γ和PTEN上游的分子起作用。Ad-mda-7通過活化β-聯(lián)蛋白和PI3K通路中的分子發(fā)揮其在肺癌和乳腺癌細(xì)胞中抗增殖效應(yīng)。已經(jīng)證實癌基因的活化可導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白和PI3K通路中的分子之間相互作用。例如，β-聯(lián)蛋白可被PI3K的p85-α亞單位穩(wěn)定。另外，由于β-聯(lián)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的固定而活化的細(xì)胞周期蛋白D1可被Wnt-1和ILK信號通路調(diào)節(jié)，ILK對細(xì)胞周期蛋白D1的誘導(dǎo)包括乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的CREB信號通路(Woodfield等，2001；D’Amico等，2000)。試驗證明Ad-mda-7可通過增加乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞內(nèi)腫瘤抑制蛋白穩(wěn)定態(tài)的水平以及降低癌蛋白的表達水平來調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白和PI3K信號通路。某些試驗結(jié)果清楚地表明β-聯(lián)蛋白和PI3K信號通路是相對富余的，但是Ad-mda-7可以協(xié)調(diào)地調(diào)節(jié)這些信號通路的多個成員以發(fā)揮抗增殖、凋亡及抗轉(zhuǎn)移表型的作用。Ad-mda-7的轉(zhuǎn)染可引起β-聯(lián)蛋白在細(xì)胞核及漿膜上的從新分布，這樣就可以調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞之間的粘附作用和細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞從而有效地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴散(Mhashilkar等，2002，已提交)。4.G2細(xì)胞周期調(diào)控試驗表明利用復(fù)制缺陷型的腺病毒過量表達MDA-7可導(dǎo)致許多類型的腫瘤發(fā)生生長抑制和凋亡，其中包括黑色素瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、骨肉瘤、以及乳腺癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌和前列腺癌，但是不包括正常的人上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(Jiang等，1996；Su等，1998；Madiredi等，2000；Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)。另外還有報道顯示MDA-7介導(dǎo)的腫瘤抑制是通過胱冬酶級聯(lián)和/或PKR的活化、促凋亡蛋白(BAX，BAK)和抗凋亡蛋白(BCL-2，BCL-XL)比例的改變和/或處于G2/M期的細(xì)胞增加誘導(dǎo)的(Saeki等，2000；Lebedeva等，2002；Pataer等，2002)。MDA-7是兩個異源二聚體受體的配基，IL-22R1/IL-22R2和IL-20R1/IL-20R2。MDA-7與這些受體的結(jié)合可導(dǎo)致Jak-Stat通路的活化(Dumoutier等，2001；Wang等，2002；Kotenko等，2000)。Jak1和Tyk2是酪氨酸蛋白激酶Jak家族的成員，可與細(xì)胞因子的受體相互作用并活化之，其中包括IL-10(Aringer等，1999)。IL-10通過Jak1和Tyk2激酶活化Stat1或Stat3(Kotenko等，2000)。前炎癥細(xì)胞因子-腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可通過胱冬酶級聯(lián)、JNK通路和IKK/NF-κB之間的相互作用誘導(dǎo)腫瘤抑制和凋亡。另外它還可以誘導(dǎo)BAX-BAK的相互作用，在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中扮演重要角色(Baud等，2001，Wang等，1998；Sundararajan等，2001)。TNF-α通過與1型和2型受體(TNF-R1和TNF-R2)的相互作用產(chǎn)生生物學(xué)活性，活化多種類型細(xì)胞內(nèi)的多個信號通路(Tartaglia等，1992)。TNF-R1信號復(fù)合體是由三聚體的受體、TNF-R1結(jié)合死亡域蛋白(TRADD)、FAS結(jié)合死亡域蛋白(FADD)、TRAF2以及受體相互作用蛋白(RIP)組成的(Locksley等，2001)。FADD可補充和活化胱冬酶原8，啟動凋亡通路，其中胱冬酶3和胱冬酶7是兩個主要的效應(yīng)胱冬酶(Muzio等，1996；Cryns等，1998)?；罨碾锥?也可以裂解Bid(BHS作用域死亡激動劑)，使細(xì)胞色素c從線粒體內(nèi)釋放誘導(dǎo)凋亡(Li等，1998；Green等，1998)。與此相對應(yīng)的是，TRAF2和RIP參與c-JunN-端激酶(JNK)和IKK的活化，結(jié)果分別導(dǎo)致c-Jun和NF-κB的活化(Ashkenazi等，1998)。盡管JNK/c-Jun活化對TNF-α-誘導(dǎo)的凋亡的影響還不十分清楚，但是在多數(shù)類型的細(xì)胞內(nèi)IKK和NF-κB的活化可抑制TNF-α誘導(dǎo)的凋亡(Ahkenazi等，1998)。IKK/NF-κB通路所產(chǎn)生的保護作用在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡中不起作用，這是因為在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡過程中IKK是被胱冬酶3相關(guān)的胱冬酶蛋白酶解(Tang等，2001)。這些靶蛋白組成TNF-α誘導(dǎo)的凋亡的信號通路，顯示與MDA-7誘導(dǎo)的凋亡信號通路相似，都是通過胱冬酶級聯(lián)的活化、NF-κB的抑制和JNK的活化。這說明TNF-R1作為TNF-α的受體之一是MDA-7配基的關(guān)鍵部分。已有報道顯示MDA-7通過抑制Cdc25C通路誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G2/M期(Saeki等，2000；Lebedeva等，2002；Ekmekcioglu等，2001；Peng等，1997)。MDA-7對Cdc25C的抑制可以導(dǎo)致Chk1和Chk2的基礎(chǔ)水平下降，二者是由DNA損傷誘導(dǎo)的(Peng等，1997)。p53的狀態(tài)也可能與MDA-7誘導(dǎo)的G2期停滯細(xì)胞增加有關(guān)，因為在G1期停滯時活化的p21和p27在含野生型p53的LNCaP細(xì)胞內(nèi)被激活，而在含突變型p53的DU145細(xì)胞內(nèi)不被激活。另外，LNCaP細(xì)胞處于G2期的百分率比Du145細(xì)胞低很多(Toyoshima等，1994)。PKR還可以促進G2期停滯，因為PKR在DU145細(xì)胞內(nèi)而不是LNCaP細(xì)胞內(nèi)被活化，而且已有報道顯示PKR的活化可誘導(dǎo)G2/M停滯(Dagon等，2001；Zamanian-Daryoush等，1999)。另外，Saito(2002，已提交)研究證實cdc2、細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白B1在IFN-E和密執(zhí)霉素(MEZ)誘導(dǎo)的G2/M期停滯中的表達模式與以前所報道的細(xì)胞周期基因的表達模式一致(Tang等，2001)。Ad-mda-7導(dǎo)致的G2停滯好像不被DNA損傷或DNA復(fù)制的抑制所誘導(dǎo)，因為含突變或缺失p53的DU145和PC細(xì)胞內(nèi)檢測不到非整倍體或多倍體染色體(Tsuiki等，2001；Cross等，1995)。這些結(jié)果說明MDA-7可通過抑制Cdc25C通路直接誘導(dǎo)G2期停滯。TNF-α的這些效應(yīng)器功能好像與MDA-7的相似。因此，Ad-MDA-7可通過胱冬酶級聯(lián)、Jak-Stat和JNK通路的活化以及IKK/NF-κB的抑制誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞生長抑制和選擇性凋亡，通過抑制Cdc25C通路誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G2期(Saito，2002，已提交)。5.分泌型MDA-7具有抗腫瘤形成活性MDA-7的過量表達可抑制多種類型腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生長。最近報道了一種分泌型的MDA-7(sMDA-7)，是一種腫瘤形成的強力抑制因子。Ramesh等(2002，已提交)已經(jīng)證實在體外sMDA-7可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化(微管形成)和內(nèi)皮細(xì)胞向內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的遷移。而且，sMDA-7的抗內(nèi)皮細(xì)胞血管形成活性通常是由IL-22受體(IL-22r)介導(dǎo)的，如加入sMDA-7蛋白后可活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(STAT-3)所提示的。IL-22r的阻斷抗體與sMDA-7共同使用可取消對微管形成的抑制。sMDA-7在體內(nèi)可阻斷基質(zhì)膠試驗中的腫瘤血管形成，血管化程度降低，血紅蛋白含量減少。sMDA-7的抑制活性比相同濃度的重組內(nèi)皮抑制素高25倍。人肺癌細(xì)胞與穩(wěn)定表達MDA-7的293細(xì)胞的體內(nèi)混合試驗(1∶1)表明可顯著抑制腫瘤的生長和血管形成。另外，sMDA-7的系統(tǒng)給藥可抑制鼠異種移植模型中肺癌的體內(nèi)生長。腫瘤微血管密度的減少和血紅蛋白含量的下降說明腫瘤的抑制是因為sMDA-7的抗血管形成活性。這說明胞內(nèi)形式的MDA-7的腫瘤抑制活性是通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞來介導(dǎo)的，而分泌型MDA-7的腫瘤抑制活性是由抑制血管形成來介導(dǎo)的。這些結(jié)果證明可以開發(fā)以MDA-7為基礎(chǔ)的治療措施來治療原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移瘤，這是因為它們不僅可以作用于腫瘤細(xì)胞，而且可以作用于腫瘤的血管(Ramesh等，2002，已提交)。將mda-7基因?qū)敫鞣N類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)都可以抑制其在體外和體內(nèi)的生長，而對于正常細(xì)胞的毒性卻很小(Su等，1998；Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001；Saeki等，待發(fā)表；Dumoutier等，2001)。這種抗腫瘤活性歸功于MDA-7蛋白的過量表達。最近的試驗表明糖基化的MDA-7可在體外分泌(Madireddi等，2000；Jiang等，1996；Saeki等，待發(fā)表；Dumoutier等，2001)。盡管MDA-7的分泌及其與兩個不同受體的結(jié)合已有報道，但是sMDA-7蛋白在腫瘤中的功能意義還未作評價(Madireddi等，2000；Rich等，2001)。已知sMDA-7在人PBMC中的功能是作為原-Th1細(xì)胞因子，引起IFN-γ、IL-6和TNF-α的表達(Caudel等，待發(fā)表)。在最近的研究中，Ad-mda-7抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化和降低Ad-mda-7處理的異種移植肺腫瘤的血管密度的能力已被確證(Saeki等，2000；Wang等，2002)。MDA-7的抗腫瘤活性和細(xì)胞因子活性是與其他Th1型細(xì)胞因子如IL-12和IFN-γ所觀察到的是一致的(Ekmekcioglu等，2001；Ellerhorst等，2002；Huang等，2001)。Ramesh等(2002，已提交)的試驗表明sMDA-7在體內(nèi)和體外都有很高的抗血管形成活性，sMDA-7可抑制腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長。另外，sMDA-7不能反轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞的表型，但是可以阻斷分化的起始，與IFN-γ對內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)相似(Lebedeva等，2002；Maheshwari等，1991)。除了對微管形成的抑制效應(yīng)以外，sMDA-7還可以阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，這種效應(yīng)其他抗血管形成藥物如內(nèi)皮抑制素和乳腺絲抑蛋白也有(Pataer等，2002；Madireddi等，2000；Zhang等，2000)。比較sMDA-7和重組人內(nèi)皮抑制素對微管形成的抑制活性發(fā)現(xiàn)相同濃度的sMDA-7所產(chǎn)生的效應(yīng)至少比內(nèi)皮抑制素高25倍。據(jù)推測sMDA-7比內(nèi)皮抑制素的活性高可能是因為sMDA-7產(chǎn)生抗血管活性只需要極低的濃度，過量表達的sMDA-7可直接抑制腫瘤的生長。因此MDA-7的這種雙重功能使其成為一種獨特的治療藥物(Ramesh等，2002，已提交)。也有試驗表明sMDA-7的抗血管形成活性是受體介導(dǎo)的，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子-3(STAT-3)的活化。受體介導(dǎo)的抗血管形成活性也見于IFN-γ和血小板反應(yīng)蛋白(Fickenscher等，2002；Jimenez等，2000)。最近已經(jīng)報道了內(nèi)皮抑制素的受體(Joki等，2001)。PKR作為Ad-mda-7介導(dǎo)的凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)已被Pataer等(2002)證明。但是，在同一個試驗中，PKR在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達水平好像是不變化的，因此排除了sMDA-7的抗血管形成活性是PKR介導(dǎo)的可能性(Pataer等，2002)。MDA-7可以較早地作用于分化程序，因為它對去分化的內(nèi)皮細(xì)胞不起作用。另外，mda-7基因被認(rèn)為在黑色素瘤細(xì)胞的分化過程中是上調(diào)的(Jiang等，1995)。MDA-7蛋白表達的丟失與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)展的過程中MDA-7蛋白逐漸丟失，從而腫瘤的分化程度逐漸降低(Ellerhorst等，2002；Jiang等，1995)。因此，MDA-7在調(diào)節(jié)黑色素瘤和內(nèi)皮細(xì)胞的分化過程中起關(guān)鍵作用。這說明mda-7可有效治療原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌。6.MDA-7的腫瘤抑制活性是由細(xì)胞內(nèi)的蛋白介導(dǎo)的MDA-7誘導(dǎo)各種不同類型的腫瘤的凋亡，并釋放出可溶性的MDA-7蛋白產(chǎn)物。將含可溶性MDA-7蛋白的MDA-7表達細(xì)胞的上清液直接轉(zhuǎn)移到原發(fā)腫瘤中卻發(fā)現(xiàn)不能誘導(dǎo)旁觀者介導(dǎo)的凋亡。共培養(yǎng)試驗也得到了同樣的結(jié)果。試驗證明Ad-mda7(含mda-7腫瘤抑制基因的腺病毒載體)對正常細(xì)胞的毒性很小，但卻可以快速誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞系發(fā)生高水平的凋亡。Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞可在胞內(nèi)表達高水平的MDA-7蛋白并且可以分泌一種可溶性的糖基化的蛋白，其分子量比胞內(nèi)的MDA-7高。這些可溶性蛋白可以被純化，但是其對腫瘤細(xì)胞的毒性是有限的?，F(xiàn)在正在設(shè)計一個試驗來確定如果細(xì)胞內(nèi)的MDA-7靶向定位到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它的殺傷活性是否能得到提高。利用能使表達的蛋白靶向性地到達各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的載體構(gòu)建出了幾個mda-7的質(zhì)粒構(gòu)建體。mda-7cDNA被人工刪除了分泌信號序列，因此構(gòu)建出的mda-7表達載體可使表達的蛋白定位到胞漿、細(xì)胞核或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。另外，包含分泌信號的全長mda-7cDNA被亞克隆到胞漿骨架中。這種靶向性載體通過轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞內(nèi)評價其MDA-7蛋白的表達，通過Western印跡分析發(fā)現(xiàn)所有的載體都可以表達高水平的胞內(nèi)MDA-7。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)靶向性的MDA-7蛋白表達是通過免疫組化方法確定的。利用流式細(xì)胞術(shù)和克隆形成試驗，靶向性MDA-7殺傷腫瘤細(xì)胞的能力得以評價。胞漿和細(xì)胞核mda-7構(gòu)建體不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而全長的MDA-7(分泌型)具有細(xì)胞毒性。ER靶向性的mda-7構(gòu)建體也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡。因此從這些數(shù)據(jù)中可以得到幾個結(jié)論。首先，MDA-7是一種具有腫瘤抑制活性和細(xì)胞因子活性的分子。MDA-7在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的定位可影響細(xì)胞的反應(yīng)，胞內(nèi)MDA-7誘導(dǎo)的凋亡需要進入分泌通路。最后，MDA-7可從ER中激發(fā)信號從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡和胞漿應(yīng)激分子的活化。另外，已有試驗證明定位到線粒體的MDA-7蛋白與全長的MDA-7蛋白相比可引起死亡細(xì)胞的增加。因此，進入線粒體的靶向性MDA-7還可以增強其抗腫瘤活性和抗凋亡效應(yīng)。7.判斷候選患者預(yù)后的方法和組合物因而，本發(fā)明涉及一種增強免疫應(yīng)答的新方法。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)測候選患者的預(yù)后以確定是否適合進行免疫治療的方法和組合物。候選患者給予或共同給予MDA-7多肽，然后測定其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該熟知測定免疫應(yīng)答的方法，在下面的部分討論了一些非限定性的例子。對免疫應(yīng)答的檢測顯示患者是免疫應(yīng)答的良好候選者是指該患者可以各種方式受益于免疫治療。在特殊的實施方案中，免疫治療是指給予候選患者以本發(fā)明的組合物。在其他的實施方案中，本發(fā)明包括診斷或預(yù)后試驗以確定受體是否能產(chǎn)生抗免疫原性分子的免疫應(yīng)答。加入MDA-7可以檢測到不加MDA-7時所觀察不到的免疫應(yīng)答。在另一個實施方案中，診斷或預(yù)后試驗用于確定受體內(nèi)的T細(xì)胞、NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的活性是否升高。在另外一個實施方案中，診斷或預(yù)后試驗用于確定受體內(nèi)的細(xì)胞因子濃度是否升高。在上述各種試驗中，如果得到肯定的答案，則本發(fā)明包括利用文本所描述的組合物來激發(fā)免疫應(yīng)答。在其他的實施方案中，出現(xiàn)免疫應(yīng)答或被誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的受體用本發(fā)明的方法治療以增強其免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，組合物和方法涉及增加一種相對較新的腫瘤治療途徑生物治療，也稱為免疫治療、生物治療或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)治療。免疫治療可刺激肌體產(chǎn)生直接或間接抗腫瘤的天然免疫系統(tǒng)，或者降低某些腫瘤治療措施所產(chǎn)生的副作用。在本領(lǐng)域中已知免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜的細(xì)胞和器官網(wǎng)絡(luò)，這些細(xì)胞和器官一起使肌體抵抗外源或非自身入侵者的攻擊。這個網(wǎng)絡(luò)是肌體抵抗疾病的一個主要系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)保護肌體所用的一個機制是識別健康細(xì)胞和外源細(xì)胞的區(qū)別然后清除外源細(xì)胞。當(dāng)免疫系統(tǒng)的完整性部分或全部降低時就會產(chǎn)生腫瘤。腫瘤已經(jīng)成為西方世界死亡的主要因素，僅次于心臟病。據(jù)估計目前在美國有三分之一的人會患癌癥，五分之一的人會死于癌癥。腫瘤可被視為失去正常生長調(diào)節(jié)機制的細(xì)胞。利用裸DNA或非病毒載體的核酸免疫或疫苗已在腫瘤和感染疾病的動物模型中取得了相當(dāng)?shù)某晒?。但是，這些研究與人的臨床試驗所取得的結(jié)果不相吻合，在核酸免疫的臨床試驗中所觀察到的免疫誘導(dǎo)/增強通常都是很有限的。本發(fā)明描述了一種通過共注射mda-7基因或MDA-7蛋白來增強人體內(nèi)免疫誘導(dǎo)的方法，該方法可激發(fā)天然的免疫應(yīng)答，活化PKR，因而可以增強抗外源目的基因或目的蛋白產(chǎn)物的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的其他實施方案包括細(xì)胞因子如干擾素(即IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ)與MDA-7或編碼MDA-7的核酸共同注射的方法和組合物。本發(fā)明的新方法可提高現(xiàn)有的免疫治療的效果。本發(fā)明涉及本領(lǐng)域已知疫苗的利用，優(yōu)選那些免疫誘導(dǎo)能力低的疫苗，以及增強抗各個疫苗的免疫應(yīng)答。腫瘤疫苗是另一種形式的免疫治療。感染疾病如麻疹、腮腺炎和破傷風(fēng)的疫苗是有效的，因為這些疫苗可使肌體的免疫細(xì)胞暴露到位于感染物質(zhì)表面的弱抗原上。這樣就可以使免疫細(xì)胞產(chǎn)生較多的漿細(xì)胞，后者可產(chǎn)生抗體。T細(xì)胞識別感染物質(zhì)后也可增殖，并且一旦活化后就可以產(chǎn)生記憶。因此當(dāng)感染物質(zhì)再次進入肌體時，免疫系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞就已經(jīng)產(chǎn)生并對感染發(fā)生反應(yīng)，然后阻止這種感染。腫瘤疫苗可幫助患者的免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞。這些疫苗可幫助肌體排斥腫瘤并阻止腫瘤的復(fù)發(fā)。與抗感染疾病的疫苗不同，腫瘤疫苗是在疾病確診后注射的，而不是在疾病發(fā)生前。當(dāng)腫瘤很小時就給予腫瘤疫苗可以根除腫瘤。例如，給患者注射以防止皮膚癌復(fù)發(fā)的腫瘤疫苗已研制出來，目前正在進行臨床試驗(MelanA/MART1和gp100)。其他正在研究的腫瘤疫苗有Avicine，這是一種以抗原為基礎(chǔ)的治療措施，可治療晚期結(jié)腸癌，以及一種含惡性B細(xì)胞特異性受體分子的基因工程融合蛋白，可用于治療和防止淋巴瘤的復(fù)發(fā)。其他可作為腫瘤疫苗靶位的腫瘤包括腎癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌?？贵w如Herceptin和Rituxan可用于免疫治療。Herceptin被用于治療產(chǎn)生過量HER-2的轉(zhuǎn)移乳腺癌。Rituxan用于治療復(fù)發(fā)的或?qū)煵幻舾械腂細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤。在本發(fā)明中，給予免疫原性分子如惡性B細(xì)胞特異性的受體分子可在患者體內(nèi)誘導(dǎo)抗該受體分子的免疫應(yīng)答。再給予MDA-7多肽可以增強這種免疫應(yīng)答，因此可以提高免疫治療的效率，降低達到治療效果所需要的劑量。在這種情況下，受體分子含有來源于腫瘤特異性表位或腫瘤相關(guān)表位的肽。表位就是指含有抗原的抗原決定簇。本發(fā)明所用的抗原可以有一個或多個表位，其中至少一個表位是免疫原性的，以及/或是可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的。注射的肽可連接到載體蛋白上以便于轉(zhuǎn)移到體內(nèi)。在其他的實施方案中，肽可以連接到MDA-7多肽上。對于癌性腫瘤來說，聯(lián)合治療包括了給予腫瘤疫苗和編碼MDA-7多肽的核酸，給藥的時間可在常規(guī)治療如腫瘤切除、化療和放療之前、之后和之間。如果在切除腫瘤后進行免疫治療，編碼MDA-7和/或免疫原性分子的表達構(gòu)建體和載體可注射到腫瘤床內(nèi)。在某些實施方案中，核酸是包含在病毒載體或非病毒載體內(nèi)。在其他的實施方案中，含mda-7的組合物位于膠體懸液中，如脂質(zhì)體、乳液或類蛋白。盡管沒有關(guān)于這些構(gòu)建體操作性的特定原理可以遵循，但是MDA-7與IL-10的某些氨基酸具有明顯同源性，并且其位于C端的D螺旋區(qū)在不同物種之間具有保守性，可能是受體結(jié)合區(qū)。因此優(yōu)選含有這個30-35氨基酸區(qū)域的分子。在某些實施方案中，本發(fā)明包括通過提供有效量的MDA-7以增強抗共注射的免疫原性分子的免疫應(yīng)答的方法。下列現(xiàn)象表明免疫應(yīng)答的增強細(xì)胞因子表達或活性的升高、T細(xì)胞或T細(xì)胞群(例如，輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、NK細(xì)胞)的增殖、B細(xì)胞或B細(xì)胞群的增殖、細(xì)胞毒T細(xì)胞的活化以及抗體的產(chǎn)生。在本發(fā)明的某些實施方案中，也可以提供抗原以誘導(dǎo)抗該抗原的免疫應(yīng)答，在這種實施方案中，接受抗原的宿主具有免疫系統(tǒng)?？乖梢允悄[瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原，以及上述物質(zhì)的混合物。在某些特殊的實施方案中，抗原是腫瘤抗原，如PSA，CEA，MART，MAGE1，MAGE3，gp100，BAGE，GAGE，TRP-1，TRP-2，AFP，muc1，NY-ESO，bcr-abl或PMSA。本發(fā)明的其他實施方案涉及加快或促進康復(fù)的方法，或者降低創(chuàng)傷性治療所導(dǎo)致的損傷的方法，創(chuàng)傷性治療是指引起正常細(xì)胞損傷的治療方法。這種損傷可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少、貧血、血小板減少以及淋巴細(xì)胞減少。在某些實施方案中，創(chuàng)傷性治療是指化療和/或放療。MDA-7可給予將要實施、正在實施或已經(jīng)實施了創(chuàng)傷性治療的患者。MDA-7可在治療前、治療后或治療過程中提供，優(yōu)選免疫治療。在某些實施方案中，增強免疫應(yīng)答的方法包括通過給予細(xì)胞或患者有效量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸以誘導(dǎo)干擾素或白細(xì)胞介素如IL-6、干擾素γ(IFNγ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)的表達，從而誘導(dǎo)免疫增強分子如IL-6、IFNγ或TNFα的產(chǎn)生。另外也可以提供外源的或重組的干擾素或白細(xì)胞介素(即不是由經(jīng)處理的細(xì)胞或患者所產(chǎn)生的干擾素或白細(xì)胞介素)。本發(fā)明的另外一個目的涉及通過提供分子和MDA-7來增強抗該免疫分子的免疫應(yīng)答的方法，其中MDA-7是通過給受體注射表達構(gòu)建體的方式提供給受體的，表達構(gòu)建體含有至少編碼SEQIDNO2的10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200或206個連續(xù)氨基酸的核酸，其中核酸被置于控制轉(zhuǎn)錄的啟動子的調(diào)控之下。本文已討論了許多啟動子，都可用于本發(fā)明中，但是本發(fā)明并不限于這些啟動子。在某些特殊的實施方案中，表達構(gòu)建體是病毒載體。病毒載體包括腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、痘苗病毒載體和多瘤病毒載體。受體可以不止一次地注射MDA-7、免疫原性分子或者某些特定實施方案中的細(xì)胞因子(即干擾素)，比如兩次、三次、四次或更多次。MDA-7、免疫原性分子或者某些特定實施方案中的細(xì)胞因子(即干擾素)可以同時給予或在不同的時間給予。而且這些化合物可以通過靜脈注射、直接注射、腹腔注射、局部注射、全身注射或口服提供給受體。本發(fā)明的某些實施方案涉及治療腫瘤的方法，該方法可以使腫瘤縮小或降低腫瘤的生長速度，該方法包括給予患者免疫原性分子，其中免疫原性分子可在患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；給予患者以有效量的MDA-7多肽，其中MDA-7多肽可增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，與單純用免疫原性分子治療相比可以縮小腫瘤。在這種實施方案中，MDA-7多肽可以被認(rèn)為是治療的佐劑。MDA-7多肽也可以和上述已討論的本領(lǐng)域已知的其他佐劑聯(lián)合使用。在各個實施方案中，MDA-7多肽都可以和干擾素如IFN-α、IFN-β或IFN-γ聯(lián)合使用。在其他的實施方案中，各種癌性狀態(tài)的治療方法都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭部腫瘤、頸部腫瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦瘤、結(jié)腸癌和膀胱癌。一般來說，本發(fā)明的組合物和方法直接用于治療各種腫瘤，可從增強的免疫應(yīng)答中受益。在某些實施方案中，MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸可與細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的核酸一起使用。細(xì)胞因子包括而不限于干擾素α(登錄號為E00175和CAA23798，本文已納入作為參考)、干擾素β(登錄號為M28622和AAA36040，本文已納入作為參考)或干擾素登錄號為X13274和CAA31639，本文已納入作為參考)(Allen和Fantes，1980；Lawn等，1981；Diaz等，1993；本文都已納入作為參考)。細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)的細(xì)胞增長、分化及免疫防御。干擾素(IFN)家族是一類獨特的細(xì)胞因子，包含分泌型的多功能蛋白。IFNs是脊椎動物抗病毒、抗細(xì)菌以及抗寄生蟲感染的成分，也是防御某些腫瘤的成分。它們通過誘導(dǎo)各種蛋白的合成來發(fā)揮其活性。有幾個直接或間接的證據(jù)表明這些蛋白中的某些蛋白具有腫瘤抑制活性。本發(fā)明適用的干擾素誘導(dǎo)的蛋白包括而不限于(i)雙鏈RNA活化的蛋白激酶，它可被磷酸化進而滅活真核細(xì)胞肽鏈起始因子eIF-2；(ii)干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-1和IRF-2，它們可以調(diào)節(jié)干擾素以及某些干擾素可誘導(dǎo)蛋白的表達；以及(iii)RNA酶L，這是一個可被(2’-5’)寡聚腺苷酸活化的潛在的內(nèi)源性核糖核酸酶，也是一種干擾素可誘導(dǎo)的酶家族的產(chǎn)物。本發(fā)明的組合物和方法可與干擾素或編碼干擾素的核酸聯(lián)合使用。其他的實施方案包括活化PKR的組合物和方法。某些類型的細(xì)胞如腫瘤和其他過度增殖的細(xì)胞內(nèi)的PKR活化一般都可誘導(dǎo)凋亡。因此，MDA-7和IFN聯(lián)合使用的方法和組合物可作為一種治療方式來增強免疫應(yīng)答，以及一種抗腫瘤方法。利用干擾素的組合物和方法可見美國專利Nos.6,379,701、6,372,218、6,350,589、6,331,525、6,250,469、6,207,145、6,204,022和6,177,074所描述的例子，本文都已納入作為參考。C.基因轉(zhuǎn)移本發(fā)明的組合物和方法用于給予患者本發(fā)明的組合物和方法。1.病毒轉(zhuǎn)化a.腺病毒感染轉(zhuǎn)移重組DNA的一個方法涉及腺病毒表達載體的應(yīng)用。盡管腺病毒載體整合到基因組DNA效率很低，但是這一缺點被其基因轉(zhuǎn)移的高效率所掩蓋。“腺病毒表達載體”是指那些含腺病毒序列的載體，這些腺病毒序列足以(a)支持構(gòu)建體的包裝以及(b)最終使克隆到其中的重組基因得以表達。載體是經(jīng)基因工程改造的腺病毒。根據(jù)腺病毒的基因結(jié)構(gòu)我們知道腺病毒是一個36kb的線性雙鏈DNA病毒，它允許長達7kb的外源序列替換腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同的是，腺病毒感染宿主細(xì)胞不會導(dǎo)致染色體的整合，因為腺病毒DNA是以游離體的方式進行復(fù)制，沒有潛在的遺傳毒性。另外，腺病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大量擴增后也沒檢測到基因組重排的發(fā)生。腺病毒特別適于作為基因轉(zhuǎn)移的載體，因為它具有中等大小的基因組、易于操作、高滴度、靶細(xì)胞范圍廣以及很高的感染性。病毒基因組的兩端各含有一個100-200堿基對的反向重復(fù)序列(ITRs)，這是病毒DNA復(fù)制和包裝所必須的順式作用元件。基因組的早期(E)和晚期(L)區(qū)含有不同的轉(zhuǎn)錄單位，二者被一組病毒DNA復(fù)制子分開。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼調(diào)節(jié)病毒基因組以及少數(shù)幾個細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的蛋白。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達可導(dǎo)致參與病毒復(fù)制的蛋白質(zhì)的表達。這些蛋白參與DNA的復(fù)制、晚期基因的表達和宿主細(xì)胞的關(guān)閉(Renan，1990)。晚期基因的產(chǎn)物，其中包括大多數(shù)病毒外殼蛋白，只在主要晚期啟動子(MLP)驅(qū)動的單個初級轉(zhuǎn)錄子經(jīng)有意義的處理后才得以表達。MLP(位于16.8m.u.)在感染的后期效率特別高，這個啟動子所控制的所有mRNA都含有一個5-三聯(lián)前導(dǎo)序列(TPL)序列，該序列可調(diào)控mRNA的翻譯。在現(xiàn)有的系統(tǒng)中，重組腺病毒是通過穿梭載體與原病毒載體之間的同源重組制備的。由于兩個原病毒載體之間可能發(fā)生重組，因此在這個過程中可能會產(chǎn)生野生型腺病毒。因此，關(guān)鍵的是從每個噬菌斑中分離出單個病毒克隆，然后檢驗其基因組結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有的腺病毒載體是復(fù)制缺陷型的，其制備和傳播依賴于獨特的輔助細(xì)胞系，稱為293細(xì)胞，該細(xì)胞是通過Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而得到的，可以表達E1蛋白(Graham等，1977)。由于腺病毒基因組中的E3區(qū)是可有可無的(Jones和Shenk，1978)，現(xiàn)有的腺病毒載體在293細(xì)胞的幫助下在E1區(qū)、D3區(qū)或者兩個區(qū)內(nèi)攜帶外源DNA(Graham和Prevec，1991)。天然的腺病毒大約包裝105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)，可以插入約2kb的外源DNA。由于E1區(qū)和E3區(qū)中有大約5.5kb的DNA可被替代，因此現(xiàn)有腺病毒的最大容量在7.5kb以下，或者約占載體總長度的15％。80％以上的腺病毒基因組必須保留在載體骨架內(nèi)。輔助細(xì)胞可來源于人的細(xì)胞，如人胚胎腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其他類型的人胚胎間質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。另外，輔助細(xì)胞也可以來自于其他哺乳動物的細(xì)胞，只要這些細(xì)胞可感染人的腺病毒。這類細(xì)胞包括Vero細(xì)胞或其他類型的猴胚胎間質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。如上所述，最常用的輔助細(xì)胞是293細(xì)胞。Racher等(1995)描述了一種培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改進方法。一種方式是通過將單個細(xì)胞接種到1升的硅化培養(yǎng)板(Techne，Cambridge，UK)中使天然細(xì)胞的聚集物生長，培養(yǎng)板中含有100-200ml培養(yǎng)基。以40rpm的速度攪拌猴通過臺盼藍(lán)染色估計細(xì)胞的存活率。在另一種方式中，按照如下方法使用Fibra-Cel微載體(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/l)將懸浮在5ml培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種物加到250mlErlenmeyer培養(yǎng)板的載體(50ml)內(nèi)，保持靜止1到4小時，并偶爾攪拌。然后用50ml新鮮的培養(yǎng)基替換原來的培養(yǎng)基并開始振蕩。為了制備病毒，使細(xì)胞生長到約80％融合，此后再替換培養(yǎng)基(總體積的25％)，然后加入MOI為0.05的病毒。培養(yǎng)物靜止過夜，然后將體積增加到100％，開始振蕩72小時。腺病毒可以是復(fù)制缺陷型的，或者至少在某些條件下是復(fù)制缺陷型的，腺病毒載體的特性被認(rèn)為不是成功實現(xiàn)本發(fā)明的關(guān)鍵。腺病毒可以是已知的42種不同血清型或A-F亞組中的任何一個。C亞組中的5型腺病毒是常用的起始材料以便于獲得本發(fā)明可用的條件復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這是因為5型腺病毒是一種大量生化信息和基因信息已知的人腺病毒，在利用腺病毒作為載體的構(gòu)建過程中已經(jīng)被大量采用。如上所述，根據(jù)本發(fā)明典型的載體都是復(fù)制缺陷型的并且不含腺病毒的E1區(qū)。因此，將轉(zhuǎn)化構(gòu)建體插入到E1編碼序列被刪除的位置上是最方便的。但是，腺病毒序列內(nèi)構(gòu)建體插入的位置不是本發(fā)明的關(guān)鍵。編碼目的基因的多聚核苷酸也可插入到E3替代載體的E3刪除區(qū)，如Karlsson等(1986)所描述，或者E4區(qū)，其中輔助細(xì)胞系或輔助病毒可補充這個E4缺陷。腺病毒的擴增和操作方法是本名譽技術(shù)人員所熟知的，腺病毒在體內(nèi)和體外都有很寬的宿主范圍。這組病毒可以獲得很高的滴度，如可達到每毫升109-1011噬菌斑形成單位，并且具有較高的感染性。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主基因組中。腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因可以是游離體，因此對宿主細(xì)胞的遺傳毒性很低。據(jù)報道用野生型腺病毒進行免疫沒有任何副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，說明腺病毒具有很高的安全性和治療價值，可以作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的載體。腺病毒載體已被用于真核細(xì)胞的基因表達(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗的研制(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。動物試驗表明重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。重組腺病毒可通過各種方式給予不同的組織，其中包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)以及立體定向地接種到腦內(nèi)(LeGalLaSalle等，1993)。b.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特點是可以在感染細(xì)胞內(nèi)通過逆轉(zhuǎn)錄過程將其自身的RNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA(Coffin，1990)。所得到的DNA能以前病毒的形式穩(wěn)定地整合到細(xì)胞染色體內(nèi)，指導(dǎo)病毒蛋白的合成。病毒的整合會導(dǎo)致病毒的基因滯留在受體細(xì)胞及其子代細(xì)胞內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有三個基因gag、pol和env，分別編碼外殼蛋白、聚合酶和包膜成分。gag基因上游有一個序列含有一個基因組包裝成病毒顆粒的所需要信號。兩個長末端重復(fù)序列(LTR)分別位于病毒基因組的5’和3’末端。其中含有強啟動子和增強子序列，也是整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)所必須的(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼目的基因的核酸插入到病毒基因組內(nèi)以替換某些病毒序列，構(gòu)建出一個復(fù)制缺陷型的病毒。為了制備病毒顆粒，需要構(gòu)建一個含有g(shù)ag、pol和env基因但是不含有LTR及包裝成分的包裝細(xì)胞系(Mann等，1983)。當(dāng)含cDNA的重組質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和包裝序列一起被導(dǎo)入到這個細(xì)胞系時(如通過鈣磷酸鹽沉淀法)，包裝序列就使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄子包裝成病毒顆粒，后者隨后分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，有選擇地濃縮，然后用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以感染多種類型的細(xì)胞。但是其整合和穩(wěn)定表達需要宿主細(xì)胞能夠分裂(Paskind等，1975)。需要注意的是使用缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也很有可能在包裝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生出有復(fù)制能力的野生型病毒，這可能是由重組事件導(dǎo)致的，其中g(shù)ag、pol、env序列上游的重組病毒插入片段的完整序列可以整合到宿主基因組中。但是包裝細(xì)胞的使用可以使重組發(fā)生的可能性大大降低(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。c.AAV感染腺伴隨病毒(AAV)是一種可用于本發(fā)明的誘人的載體系統(tǒng)，因為它的整合效率高、能感染非分裂的細(xì)胞，因此可用于將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)(Muzyczka，1992)。AAV具有很寬的宿主范圍(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)，這就意味著它可用于本發(fā)明。有關(guān)rAAV載體制備和使用的詳細(xì)描述見美國專利5,139,941和4,797,368，本文都已納入作為參考。利用AAV轉(zhuǎn)移基因的試驗包括LaFace等(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；以及Walsh等(1994)所描述的。重組AAV載體已被成功地用于標(biāo)記基因的體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)導(dǎo)(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1989；Shelling和Smith，1994；Yoder等，1994；Zhou等，1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等，1985；McLaughlin等，1988)以及轉(zhuǎn)導(dǎo)人類疾病相關(guān)的基因(Flotte等，1992；Luo等，1994；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近，利用AAV載體治療囊性纖維化的I期臨床試驗已被批準(zhǔn)。AAV是一種依賴性的細(xì)小病毒，它需要與其他病毒共同感染(腺病毒或皰疹病毒的其他成員)以便在培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生增殖性感染(Muzyczka，1992)。如果缺少輔助病毒的共感染，野生型AAV基因組就會通過其末端整合到人的19號染色體上，以原病毒的形式潛伏其中(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。但是rAAV所整合的對象不僅僅限于19號染色體，除非AAVRep蛋白也表達(Shelling和Smith，1994)。如果攜帶AAV原病毒的細(xì)胞再感染輔助病毒，AAV基因組就會從染色體或重組質(zhì)粒中“復(fù)活”，獲得正常的增殖性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。一般來說，重組AAV(rAAV)病毒是通過共感染含目的基因的質(zhì)粒制備的，目的基因的兩側(cè)是兩個AAV末端重復(fù)序列(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；本文都已納入作為參考)，也可以與含野生型AAV編碼序列的表達質(zhì)粒共感染，其中AAV編碼序列不含末端重復(fù)序列，如pIM45(McCarty等，1991；本文已納入作為參考)。細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)染或感染腺病毒或攜帶AAV輔助功能所需要的腺病毒基因的質(zhì)粒。以這種方法制備的rAAV病毒種子中所含有的腺病毒必須從rAAV病毒顆粒中分離出去(例如通過氯化銫密度梯度離心)。另外，含AAV編碼區(qū)的腺病毒載體以及含AAV編碼區(qū)和部分或全部腺病毒輔助基因的細(xì)胞系也可以使用(Yang等，1994a；Clark等，1995)。也可以使用攜帶整合原病毒形式的rAAVDNA的細(xì)胞系(Flotte等，1995)。d.其他的病毒載體其他的病毒載體也可用于構(gòu)建本發(fā)明的構(gòu)建體。病毒如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)和皰疹病毒來源的載體也可以使用。用它們轉(zhuǎn)染各種哺乳動物細(xì)胞有幾個吸引人的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒的一個分子克隆株經(jīng)基因工程改造后成為一個復(fù)制完整型疫苗載體，可用于表達外源病毒蛋白(Davis等，1996)。試驗證明VEE的感染可刺激很強的免疫應(yīng)答，因此VEE可能是一個免疫治療十分有用的載體(Caley等，1997)。本發(fā)明還說明VEE病毒可用于靶向性地轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞。隨著最近對缺陷型乙肝病毒的了解，對不同病毒序列的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系有了新的認(rèn)識。體外試驗表明即使其基因組缺失高達80％病毒依然保留輔助病毒依賴的包裝能力和反轉(zhuǎn)錄能力(Horwich等，1990)。這說明基因組的大部分可被外源核酸序列替代。Chang等(1991)最近已將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)氲进喴腋尾《镜木酆厦浮⒈砻婕扒氨砻婢幋a序列的位置上。它可以與野生型病毒一起共轉(zhuǎn)染到禽類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系內(nèi)。含高滴度重組病毒的培養(yǎng)基可用于轉(zhuǎn)染原代的鴨肝細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時可檢測到穩(wěn)定的CAT基因表達(Chang等，1991)。在本發(fā)明另外的實施方案中，需轉(zhuǎn)移的編碼MDA-7的核酸可置于感染性病毒內(nèi)，這些病毒已經(jīng)經(jīng)過改造可表達特異的結(jié)合配基。另外，需轉(zhuǎn)移的編碼MDA-7的核酸還可置于經(jīng)改造后表達免疫原的感染性病毒內(nèi)。因此病毒顆粒可以特異性地結(jié)合靶細(xì)胞上的同源受體并將內(nèi)含物轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)。最近通過將乳糖殘基加到病毒包膜上對逆轉(zhuǎn)錄病毒進行了化學(xué)修飾，基于這種修飾開發(fā)出了一種具有特異靶向性的新型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這種修飾可以使病毒通過唾液酸糖蛋白受體特異地感染肝細(xì)胞。例如，為了使重組逆轉(zhuǎn)錄病毒具有靶向性，使用了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的抗體和抗細(xì)胞特異性受體的抗體?？贵w用鏈親和素與生物素成分相連接(Roux等，1989)。通過抗主要組織相容性復(fù)合體I類分子和II類分子的抗體，這些病毒可以感染各種人源細(xì)胞，這些細(xì)胞的表面抗原被專宿病毒在體外打孔(Roux等，1989)。2.非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)除了利用病毒轉(zhuǎn)移編碼MDA-7蛋白的核酸外，下面還有一些其他的將重組基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的方法，也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。a.脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在本發(fā)明的另外一個實施方案中，基因構(gòu)建體可以包裹到脂質(zhì)體或脂質(zhì)制劑內(nèi)。脂質(zhì)體是一種包含磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有被水性介質(zhì)分開的多層脂質(zhì)。當(dāng)磷脂混懸到過量的水溶液中可以自然地形成脂質(zhì)體。在形成封閉的結(jié)構(gòu)前脂質(zhì)成分發(fā)生自身重排，將水和溶解到其中的溶質(zhì)包裹到脂雙層內(nèi)(Ghosh和Bachhawat，1991)。將基因構(gòu)建體與脂轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine)(GibcoBRL)混合也是本發(fā)明考慮的范圍。脂質(zhì)介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)及外源DNA在體外的表達技術(shù)已經(jīng)很成熟(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)的試驗證明利用脂質(zhì)體在培養(yǎng)的雞胚胎、HeLa細(xì)胞和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達外源DNA是可行的。以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的非病毒制劑提供了一種腺病毒基因治療的替代方法。但是許多細(xì)胞培養(yǎng)試驗表明以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的非病毒基因轉(zhuǎn)移、通過以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的制劑系統(tǒng)轉(zhuǎn)移基因的用途有限。以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的非病毒基因轉(zhuǎn)移的一個主要缺點是包含非病毒轉(zhuǎn)移載體的陽離子脂質(zhì)具有毒性。脂質(zhì)體在體內(nèi)的毒性可以部分解釋體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率的差異。導(dǎo)致這種矛盾結(jié)果的另外一個因素是當(dāng)存在和不存在血清蛋白時脂質(zhì)載體的穩(wěn)定性有差異。脂質(zhì)載體與血清蛋白之間的相互作用對脂質(zhì)載體的穩(wěn)定性有很大影響(Yang和Huang，1997)。陽離子脂質(zhì)可以吸引和結(jié)合帶負(fù)電荷的血清蛋白。脂質(zhì)載體與血清蛋白結(jié)合后或者被溶解或者被巨噬細(xì)胞吞噬而被排出循環(huán)外?，F(xiàn)有的體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移方法利用皮下注射、真皮內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射或顱內(nèi)注射以免陽離子脂質(zhì)在循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)毒性和穩(wěn)定性的問題。脂質(zhì)載體與血漿蛋白的相互作用導(dǎo)致了體外(Felgner等，1987)和體內(nèi)(Zhu等，1993；Philip等，1993；Solodin等，1995；Liu等，1995；Thierry等，1995；Tsukamoto等，1995；Aksentijevich等，1996)基因轉(zhuǎn)移效率的差異。最近在脂質(zhì)制劑工藝中所取得的進展改善了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的效率(Smyth-Templeton等，1997；WO98/07408)。一種新型脂質(zhì)制劑是由等摩爾的1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)和膽固醇組成的，可以明顯提高體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移效率，大約可以提高150倍。DOTAP膽固醇脂質(zhì)制劑據(jù)說可以形成獨特的結(jié)構(gòu)，被稱為“三明治脂質(zhì)體”。這種制劑據(jù)報道可以將DNA夾到雙層和“瓶狀結(jié)構(gòu)”之間。這種脂質(zhì)的這些結(jié)構(gòu)特征有許多優(yōu)點，如膽固醇可以增加陽離子膠體的穩(wěn)定性、兩個二維DNA包裝及血清穩(wěn)定性提高。脂質(zhì)制劑的制備通常是在脂質(zhì)體混合物經(jīng)(I)反相蒸發(fā)(II)脫水-水合(III)去污劑透析以及(IV)薄膜水合后再經(jīng)過超聲處理和系列擠出而獲得的。制備出來后這種脂質(zhì)結(jié)構(gòu)就可以用于包裹在循環(huán)中具有毒性的(化療藥物)或穩(wěn)定的(核酸)化合物。脂質(zhì)包裹可降低這些化合物的毒性并延長其在血清內(nèi)的半衰期(Gabizon等，1990)。許多疾病的治療都可以利用以脂質(zhì)體為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)移方法以增強常規(guī)治療措施或新型治療措施，特別是免疫治療措施的療效。在本發(fā)明的某些實施方案中，脂質(zhì)載體可與紅細(xì)胞凝集病毒混合。這樣可以促進脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，加快脂質(zhì)包裹的DNA進入細(xì)胞內(nèi)(Kaneda等，1989)。在其他的實施方案中，脂質(zhì)體可與細(xì)胞核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)混合或結(jié)合(Kato等，1991)。本發(fā)明還有一個實施方案是脂質(zhì)載體與HVJ和HMG-1二者混合或結(jié)合。3.藥物制劑及其輸遞在本發(fā)明的某些實施方案中，涉及通過輸遞編碼MDA-7蛋白的表達構(gòu)建體以增強免疫應(yīng)答的方法。另外，該方法還可以輸遞編碼免疫原的表達構(gòu)建體。表達構(gòu)建體還可以含有編碼MDA-7和免疫原的序列。涉及免疫應(yīng)答的疾病包括那些可用疫苗預(yù)防或治療的疾病。其中包括肺癌、頭頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺的癌前病變、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌以及其他任何與免疫應(yīng)答有關(guān)的、能通過給予MDA-7蛋白來增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答進行治療的疾病。藥用組合物的有效劑量一般定義為足以可檢測地、可重復(fù)地改善、減輕、降低或限制疾病或其癥狀的劑量。較嚴(yán)格的定義是指去除、根除或治愈疾病?；颊咦詈镁哂谐浞值墓撬韫δ?如外周粒細(xì)胞的絕對量＞2,000/mm3，血小板計數(shù)為100,000/mm3)、足夠的肝功能(膽紅素＜1.5mg/dl)和足夠的腎功能(肌氨酸酐＜1.5mg/dl)。a.給藥在某些特殊的實施方案中，期望利用本發(fā)明的方法和組合物殺死細(xì)胞、抑制細(xì)胞的生長、抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、降低腫瘤和組織的大小以及反轉(zhuǎn)和降低腫瘤細(xì)胞的惡性表型。給藥的途徑可以是多種多樣的，根據(jù)損傷的部位和性質(zhì)，包括真皮內(nèi)注射、胃腸外途徑給藥、靜脈注射、肌肉注射、鼻內(nèi)給藥以及口服給藥。瘤內(nèi)注射或腫瘤血管內(nèi)注射特別適于散發(fā)的、固體的、易接近的腫瘤。局部、區(qū)域或全身給藥都可以。對于＞4cm的腫瘤來說，注射的體積約為4-10ml(優(yōu)選10ml)，而對于＜4cm都腫瘤來說，注射的體積約為1-3ml(優(yōu)選3ml)。多點注射時單個劑量約為0.1-0.5ml。通過多點注射使病毒顆粒與腫瘤接觸是優(yōu)選的，間隔約為1cm。對于腫瘤的手術(shù)治療來說，可在手術(shù)前使用本發(fā)明以使那些不宜手術(shù)的腫瘤可以被切除。另外，本發(fā)明也可在手術(shù)時和/或手術(shù)后使用以治療殘存的腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤。例如，腫瘤切除后可在腫瘤床內(nèi)注射或灌注含MDA-7和免疫原性分子的組合物，或者編碼MDA-7的構(gòu)建體和免疫原性分子?？梢酝ㄟ^植入手術(shù)部位的導(dǎo)管在切除腫瘤后持續(xù)灌注。周期性的術(shù)后治療也可以考慮。本發(fā)明的一個實施方案是通過灌注將肽或肽復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的。也可以持續(xù)灌注表達構(gòu)建體或病毒構(gòu)建體。持續(xù)灌注的構(gòu)建體或肽的劑量由所期望的攝取量所決定。本發(fā)明描述了一個灌注的實施例，其中細(xì)胞培養(yǎng)物的起始濃度為每毫升106個細(xì)胞，細(xì)胞先被標(biāo)記、洗滌，然后與100μg合成肽共孵育兩小時。在適當(dāng)?shù)臅r候可以進行持續(xù)給藥，例如在切除腫瘤后需要處理腫瘤床以根除殘存的只能在顯微鏡下才能看到的腫瘤時。通過注射器或?qū)Ч芙o藥是最常用的。這種持續(xù)的灌注可以進行一段時間，如在開始治療后持續(xù)約1-2小時、約2-6小時、約6-12小時、約12-24、約1-2天、約1-2周或更長時間。一般情況下，通過持續(xù)灌注給予的治療組合物的劑量與單次給藥或多點注射的劑量相同，在灌注期間可以在一段時間內(nèi)略作調(diào)整。治療方案也是多種多樣的，一般根據(jù)腫瘤的類型、腫瘤的位置、疾病的惡性程度以及患者的健康狀況和年齡來定。顯然某些類型的的腫瘤需要攻擊性較強的治療措施，同時，某些患者卻無法耐受繁重的治療措施。醫(yī)生最適宜根據(jù)對治療藥物的效力和毒性(如果有)的了解作出決定。在某些實施方案中，被治療的腫瘤可能是，至少最初可能是無法切除的。利用治療性病毒構(gòu)建體處理可以增加切除腫瘤的可行性，因為經(jīng)處理后腫瘤的邊緣可能萎縮，或者某些侵潤性部位可能消失。經(jīng)治療后腫瘤就有可能被切除了。切除后進行的其他處理可用于根除腫瘤部位的只有在顯微鏡下才能看到的殘存腫瘤。對于原發(fā)腫瘤和切除后的腫瘤床來說，典型的治療方式是進行多次處理。一般來說原發(fā)腫瘤的治療是在2周內(nèi)進行6次注射。兩周的療程可重復(fù)進行1、2、3、4、5、6或更多次。在治療期間，可以從新評價是否需要完成已計劃的劑量。治療包括各種“單位劑量”。單位劑量是指預(yù)定量的治療組合物。注射的量以及注射途徑和制劑都是臨床治療領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。單位劑量不一定一次注射，還可以在一段時間內(nèi)連續(xù)注射。本發(fā)明的單位劑量用術(shù)語病毒構(gòu)建體的噬菌斑形成單位(pfu)和病毒顆粒來表示更方便。單位劑量可以是103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu或病毒顆粒(vp)，或者更高。給予患者的蛋白的劑量為，或者至少為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0.9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000ng/ml或更高。b.可注射的組合物和制劑轉(zhuǎn)移免疫原性分子、編碼MDA-7蛋白和/或免疫原的表達構(gòu)建體的某些方法是通過全身給藥完成的。但是，本文所描述的藥用組合物還可以通過胃腸外途徑、靜脈注射、真皮內(nèi)注射、肌肉注射或腹腔注射的方式給藥，見美國專利5,543,158；5,641,515和5,399,363的描述(本文都已完整納入作為參考)。核酸構(gòu)建體的注射可以通過注射器或注射溶液的其他方法完成，只要表達構(gòu)建體可以通過注射用針頭的孔徑。最近出現(xiàn)了一種新型無針注射系統(tǒng)(美國專利5,846,233)，該系統(tǒng)含有一個被稱為噴嘴的腔室用于盛溶液，一個動力裝置用于將溶液推出噴嘴到達注射部位。注射器系統(tǒng)也可用于基因治療，將預(yù)定量的溶液精確多點注射到任意深度(美國專利5,846,225)?；钚曰衔锶芤嚎梢杂坞x堿或藥用鹽的形式以水制備，混以適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?，如羥丙纖維素。分散劑可用甘油、液體聚乙烯甘油、及其混合物或油制備。在普通儲存或使用條件下，這些制劑需要加入防腐劑以防止微生物的生長。適宜注射的藥用形式包括無菌水溶液、無菌分散劑或無菌粉末，后者可在使用時制備成無菌水溶液或無菌分散劑(美國專利5,466,468，本文已完整納入作為參考)。無論何種形式都必須是無菌的，并且要有一定的流動性以便于用注射器注射。各種制劑在制造和儲存條件下都必須是穩(wěn)定的，并且必須要防止微生物，如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是溶劑和分散介質(zhì)，其中包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙烯甘油等)、以及上述物質(zhì)的適當(dāng)混合物和/或蔬菜油?？梢酝ㄟ^使用包被劑如卵磷脂、使分散劑中顆粒保持合適的尺寸、或加入表面活性劑使制劑保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｎ⑸锏鹊纳L可通過加入各種抗生素和抗真菌藥物如對羥基苯甲酸酯類(parabens)、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等來控制。大多數(shù)情況下優(yōu)選等滲物質(zhì)，如葡萄糖溶液或氯化鈉溶液?？稍诮M合物中加入延緩吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠來延遲注射組合物的吸收。為了通過胃腸外途徑給予水溶液，在需要時溶液應(yīng)適當(dāng)緩沖，液體首先用足量的鹽溶液和葡萄糖溶液稀釋以達到等滲。這些特殊的水溶液特別適于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、瘤內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射。在這種關(guān)系中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照本說明書的描述應(yīng)當(dāng)了解所用的無菌水性介質(zhì)。例如，單次劑量的藥物可溶解到1ml等滲NaCl溶液中，或者加入到1000ml皮下輸液液體中，或者注射到適當(dāng)?shù)讲课?見《Remington藥物學(xué)》(″Remington’sPharmaceuticalSciences″)，第15版，1035-1038頁和1570-1580頁)。根據(jù)所治療的患者的狀況可適當(dāng)調(diào)整注射的劑量。在任何情況下，都應(yīng)該由負(fù)責(zé)注射的人來確定每個個體的用藥劑量。而且用于人的治療時制劑都必須符合FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室要求的無菌、熱源、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。無菌注射液可通過如下過程制備將活性化合物加入到一定α量的合適溶劑中，然后與上面所描述的其他組分混合，如果需要再過濾除菌。一般來說，分散劑是通過如下過程制備的將各種無菌活性組分加入到含基礎(chǔ)分散介質(zhì)的無菌載體內(nèi)，再與所需要的上述其他組分混合。如果利用無菌粉末制備無菌注射液，最常用的方法是αα利用真空干燥和冷凍干燥技術(shù)制備活性組分的粉末，然后添加上述過濾除菌溶液中的所需組分。本文所描述的組合物可制備成中性溶液或鹽溶液。藥用鹽溶液包括加酸的鹽溶液(與蛋白的游離氨基結(jié)合)，可用無機酸如鹽酸或磷酸，或者有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等制備。用游離羧基制備的鹽溶液可以來源于無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等。制備完成后，溶液就可以通過與劑型相配的方式以及能產(chǎn)生治療效果的劑量給予受體。制劑可以各種劑型如注射液、藥物釋放顆粒等給藥。本文所用的“載體”包括各種溶劑、分散介質(zhì)、載體、包被劑、稀釋劑、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑和吸收延緩劑、緩沖液、載體溶液、懸液、膠體等。這些介質(zhì)和試劑作為藥用物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。除了那些與活性組分不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑外，都可用于治療組合物。額外的活性組分也可以摻入到組合物中。術(shù)語“藥用的”是指給予人體時不會產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)或不適當(dāng)反應(yīng)的分子實體和組合物。含有作為活性組分的蛋白的水性組合物的制備方法是本領(lǐng)域所熟知的。一般來說，這種組合物可制備成可注射的形式，如溶液或懸液；或者適于在注射前制備成溶液或懸液的固體。c.佐劑正如本領(lǐng)域所熟知的，免疫原性分子、免疫原或肽組合物的免疫原性可被免疫應(yīng)答的非特異性刺激因子增強，就是大家所熟知的佐劑。合適的佐劑包括所有可用的免疫刺激化合物，如細(xì)胞因子、毒素或合成的組合物。在本發(fā)明中，給予有效量的MDA-7多肽可增強免疫應(yīng)答，因而可被看作佐劑。在其他的實施方案中，增強PKR表達的分子也被認(rèn)為可以增強免疫應(yīng)答，也是本發(fā)明可用的免疫刺激化合物。除了MDA-7外，也可以用其他佐劑，其中包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干擾素、GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物、如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂質(zhì)A以及單磷酸脂質(zhì)A(MPL)。RIBI含有三種從細(xì)菌中提取的組分-MPL、海藻糖二真菌烷(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，溶于2％的角鯊?fù)?吐溫80中形成乳液。MHC抗原也可以使用。佐劑的例子包括完全弗氏佐劑(含滅活的結(jié)核桿菌的非特異性免疫應(yīng)答刺激因子)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。除了MDA-7外，本發(fā)明的某些方面也涉及其他具有佐劑活性的組合物。佐劑及其功能和轉(zhuǎn)運機制都是本領(lǐng)域所熟知的，其他佐劑的非限定性例子包括Adjumer(即PCPP鹽；聚磷腈)；Adju-Phos(即磷酸鋁凝膠)；AlgalGlucan(即b-葡聚糖；葡聚糖)；Algammulin(即γ菊糖/明礬混合佐劑)；Alhydrogel(即氫氧化鋁凝膠；明礬)；抗原制劑(即SPT，AF)；Avridine(即N，N-二八癸酰-N’，N’-雙(2-羥乙基)丙二酰胺；CP20，961)；BAYR1005(即N-(2-脫氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡萄糖酰)-N-八癸酰十二烷基胺羥乙酸鹽)；骨化三醇(即la，25-二羥維生素D3；1，25-二(OH)2D3；1，25-DHCC；la，25-二羥膽骨化醇)；磷酸鈣凝膠(即磷酸鈣)；霍亂毒素(CT)和霍亂毒素B亞單位(CTB)(即CT；CTB亞單位；CTB)；霍亂毒素A1-亞單位-蛋白AD-片斷融合蛋白(即CTA1-DD基因融合蛋白)；CRL1005(即封閉共聚物P1205)；含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體(即含細(xì)胞因子的脫水水合囊泡)；DDA(即溴化二甲基八癸酰胺；溴化二甲基二硬脂酰胺(CAS注冊號3700-67-2))；DHEA(即脫氫表雄酮；雄甾烯二酮；普拉睪酮)；DMPC(即二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿；1，2-二肉豆蔻酰-sn-3-磷脂酰膽堿；(CAS注冊號18194-24-6))；DMPG(即二肉豆蔻酰磷脂酰甘油；sn-3-磷脂酰甘油-1，2-二肉豆蔻酰鈉；(CAS注冊號67232-80-8))；DOC/鋁復(fù)合物(即脫氧膽酸鈉鹽；DOC/Al(OH)3/礦物質(zhì)載體復(fù)合物)；弗氏完全佐劑(即CIA；FCA)；弗氏不完全佐劑(即IFA；FIA)；γ菊酚；Gerbu佐劑；GM-CSF(即粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；沙莫司汀(酵母來源的rh-GM-CSF))；GMDP(即N-乙酰氨基葡萄糖-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-內(nèi)氨酰-D-異谷氨酰拿(CAS注冊號70280-03-4))；咪喹莫特(即1-(2-甲丙基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺；R-837；S26308)；ImmTherTM(即N-乙酰氨基葡萄糖-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二軟脂酸鹽；DTP-GDP)；含共刺激分子的抗體的免疫脂質(zhì)體(即從脫水-水合載體制備的免疫脂質(zhì)體(DRVs))；干擾素-g(即Actimmune(rhIFN-γ，Genentech，Inc.)；免疫干擾素；IFN-g；γ-干擾素)；白細(xì)胞介素-1β(即IL-10；IL-1；人白細(xì)胞介素1β成熟多肽117-259)；白細(xì)胞介素-2(即IL-2；T-細(xì)胞生長因子；阿地白介素(去-內(nèi)酰胺-1，絲氨酸-125人白細(xì)胞介素2)；Proleukin；Teceleukin)；白細(xì)胞介素-7(即IL-7)；白細(xì)胞介素-12(即IL-12；天然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKSF)；細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子(CLMF))；ISCOM(s)TM(即免疫刺激復(fù)合物)；Iscoprep7.0.3.TM；脂質(zhì)體(即含蛋白或Th細(xì)胞和/或B細(xì)胞肽的脂質(zhì)體，含有或不含有內(nèi)陷的白細(xì)胞介素-2的微生物，BisHOP或DOTMA；A，[L(抗原)])；洛索立賓(即7-烯丙基-8-氧鳥苷)；LT-OA或LT口服佐劑(即大腸桿菌不穩(wěn)定的腸毒素強親和毒素)；MF59；MONTANIDEISA51(即純化的IFA；不完全弗氏佐劑)；MONTANIDEISA720(即可代謝的油佐劑)；MPLTM(即3-Q-去乙酰-4’-單磷?；珹(3-Q-desacyl-4’-monophosphoryllipidA)；3D-MLA)；MTP-PE(即N-乙酰-L-內(nèi)氨酰-D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-(羥基-磷酰氧))乙胺單鈉鹽)；MTP-PE脂質(zhì)體(即MTP-PE抗原呈遞脂質(zhì)體)；Murametide(即Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；Murapalmitine(即Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-甘油二棕櫚酰)；D-Murapalmitine(即Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-二棕櫚酰)；NAGO(即神經(jīng)酰胺酶半乳糖氧化酶)；非離子表面活性載體(即NISV)；Pleuran(即b-葡聚糖；葡聚糖；PLGA，PGA和PLA(即乳酸和羥乙酸的同聚物或共聚物；丙交酯/乙交酯聚合物；聚乳酸共乙交酯)；PluronicL121(即泊洛沙姆401)；PMMA(即聚甲基甲基丙烯酸酯)；PODDSTM(即類蛋白微球)；PolyrAPolyrU(即多聚腺苷酸多聚尿苷酸復(fù)合物)；Polysorbate80(即吐溫80；脫水山梨糖醇單-9-八癸鹽聚(氧-1，2-乙烷二酰)衍生物)；ProteinCochleates；QS-21(即StimulonQS-21佐劑)；Quil-A(即Quil-A皂甙，Quillaja皂甙)；RehydragelHPA(即高蛋白吸附性氫氧化鋁凝膠；明礬)；RehydragelLV(即低粘度的氫氧化鋁凝膠；明礬)；S-28463(即4-氨基-otec，-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1(即SAF-m；Syntex佐劑)；Sclavo肽(即IL-1b163-171肽)；Sendai脂蛋白體，含Sendai的脂質(zhì)基質(zhì)(即含Sendai糖蛋白的載體；fusogenic脂蛋白體；FPLs)；Span85(即Arlacel85，脫水山梨醇三油酸酯)；Specol；Squalane(即Spinacane；Robane；2，6，10，15，19，23-六甲基二十四烷)；角鯊?fù)?Spinacene；Supraene；2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22二十四己烷)；硬脂酰酪氨酸(即八癸酰酪氨酸氫氯化物)；Theramide(即N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-二棕櫚氧丙胺(DTP-DPP))；蘇氨酰-MDP(即Termurtide；[thr1]-MDP；N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺)；Ty粒子(即Ty-VLPs，(病毒樣顆粒))；WalterReed脂質(zhì)體(即含吸附到氫氧化鋁上的脂質(zhì)A的脂質(zhì)體，[L(脂質(zhì)A+抗原)+鋁])。除了佐劑以外，共注射生物反應(yīng)性調(diào)節(jié)劑(BRM)也是所期望的，試驗表明該物質(zhì)可上調(diào)T細(xì)胞免疫或下調(diào)細(xì)胞抑制活性。這種BRM包括而不限于西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；或低劑量的環(huán)磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)以及細(xì)胞因子如γ-干擾素、IL-2、IL-12，或編碼具有免疫輔助功能的蛋白的基因，如B-7。d.聯(lián)合治療在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物可以通過提供MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的表達構(gòu)建體來增強疫苗的效應(yīng)。在某些實施方案中，疫苗是腫瘤疫苗。這些組合物以聯(lián)合有效劑量來提供以殺傷或抑制細(xì)胞的增殖。這個過程包括使細(xì)胞與表達構(gòu)建體、試劑或多種因子同時接觸。這一過程可通過使細(xì)胞與單個組合物或包含兩種藥物的藥物制劑接觸、或者通過使細(xì)胞與兩種不同的組合物或制劑同時接觸來完成，其中一種組合物包含表達構(gòu)建體，另一種組合物包含第二種藥物。在本發(fā)明的一個實施方案中，除了其他的抗凋亡藥物或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)藥物外，mda-7基因治療也可以和免疫治療聯(lián)合使用。另外，免疫治療可在其他藥物治療之前或之后數(shù)分鐘到數(shù)周內(nèi)進行。在其他藥物和表達構(gòu)建體分別給予細(xì)胞的實施方案中，一般要確保兩種治療措施實施的間隔不要超過每種治療的有效期，這樣藥物和表達構(gòu)建體就可以對細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在這種情況下，實施兩種治療措施的間隔一般在約12-24小時之內(nèi)，優(yōu)選6-12小時之內(nèi)。在某些情況下，可以適當(dāng)延長治療的間期，如兩種治療措施之間間隔數(shù)天(2，3，4，5，6或7)到數(shù)周(1，2，3，4，5，6，7或8)。不同治療措施的各種組合都可以使用，例如，A代表基因治療，B代表作為免疫治療方案一部分的免疫原性分子，如抗原A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A給予患者本發(fā)明的治療性表達構(gòu)建體要按照給予這種化合物的通用方法進行，同時要考慮載體的毒性(如果有的話)。如果需要可以進行多個療程。各種標(biāo)準(zhǔn)的治療措施以及手術(shù)都可以和本文描述的治療措施聯(lián)合應(yīng)用。i.化療腫瘤的治療也包括化療和放療在內(nèi)的各種方式的聯(lián)合治療。聯(lián)合化療包括順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合劑、紫杉醇、吉西他濱、新霉酰胺、法呢基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、transplatinum、5-氟尿嘧啶、長春新堿、長春花堿和氨甲蝶呤，以及上述物質(zhì)的類似物或衍生物。ii.放療引起DNA損傷并被廣泛應(yīng)用的因素包括大家所熟知的-射線、X-射線和/或向腫瘤細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移放射性同位素。其他形式的DNA損傷因子如微波、質(zhì)子束輻射(美國專利5,760,395和4,870287)和紫外輻射也可以考慮。所有這些因素最可能引起對DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的組裝和維持的大范圍損傷。X射線的劑量范圍從每天50-200倫琴，持續(xù)一段時間(3到4周)，到2000-6000倫琴的單次劑量。放射性同位素的使用劑量范圍很寬，可根據(jù)同位素的半衰期、所激發(fā)射線的強度和類型以及腫瘤細(xì)胞攝取的量而定。1945年，R.R.Wilson建議使用質(zhì)子束治療腫瘤。利用質(zhì)子治療的優(yōu)點在于其下列物理特性(1)質(zhì)子滲透到組織內(nèi)后所產(chǎn)生的輻射劑量隨質(zhì)子的向內(nèi)流動而上升，接近終點時達到最大劑量(″Bragg峰″)，超出終點后下降為零(2)單能束的質(zhì)子具有幾乎一樣的范圍，因此在相同的深度可轉(zhuǎn)移最大劑量，以及(3)強度相對較大的質(zhì)子在到達目的地的過程中不會偏離直線很多。在治療腫瘤或其他疾病時為了使質(zhì)子束達到最大的治療效果，醫(yī)生需要了解治療的準(zhǔn)確位置以及治療位點內(nèi)組織的特點?，F(xiàn)在已經(jīng)有一些新的成像技術(shù)如X射線電子計算機斷層攝影術(shù)(CT掃描)和磁共振成像技術(shù)(MRI)可以達到所需要的精確度?，F(xiàn)在利用質(zhì)子治療腫瘤患者是可行的。本文所用的術(shù)語“使接觸”或“暴露于”用于細(xì)胞時是指治療性構(gòu)建體和化療或放療藥物轉(zhuǎn)移給靶細(xì)胞、或直接與靶細(xì)胞一起放置的過程。為了達到殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的目的，兩種藥物要以能聯(lián)合有效殺死細(xì)胞或阻止細(xì)胞分裂的劑量給予細(xì)胞。iii.基因在另外的實施方案中，免疫原性分子作為基因治療方案的一部分提供。編碼mda-7的載體與編碼下列基因產(chǎn)物之一的第二載體一起轉(zhuǎn)移可聯(lián)合誘導(dǎo)對靶組織的效應(yīng)。另外，編碼兩個基因的單一載體也可以使用。(a.)抗原在某些實施方案中，本發(fā)明涉及改善免疫治療效果的方法。抗腫瘤抗原的免疫應(yīng)答也可以通過MDA-7來誘導(dǎo)。腫瘤抗原包括PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、結(jié)核桿菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性調(diào)節(jié)素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外殼蛋白-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨針抗原、風(fēng)疹抗原、流行性腮腺炎抗原、甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETSG250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m或WT1。誘導(dǎo)抗腫瘤抗原免疫應(yīng)答的使用方法是特別需要考慮的，見美國專利5,552,293和6,132,980的描述，本文已特地納入作為參考。(b.)細(xì)胞程序性死亡的調(diào)節(jié)因子凋亡或細(xì)胞程序性死亡是正常胚胎發(fā)育、成年組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持以及癌變的抑制中的一種基本過程(Kerr等，1972)。已知Bcl-2蛋白家族和ICE樣蛋白酶家族是其他系統(tǒng)中凋亡的重要調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)因子。試驗證明Bcl-2蛋白與濾泡淋巴瘤有關(guān)，在控制各種凋亡刺激因子引起的凋亡以及增加細(xì)胞的存活中扮演重要角色(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)進化保守的Bcl-2蛋白是相關(guān)蛋白家族的一個成員，可以被歸類為死亡激動劑或死亡拮抗劑。Bcl-2被發(fā)現(xiàn)以后，就被證明可以抑制各種刺激因素引起的細(xì)胞死亡。而且現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在一個Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白家族，它們具有相同的結(jié)構(gòu)，其序列同源。這個家族內(nèi)的不同成員或者具有與Bcl-2相似的功能(如BclXL、BclW、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或者具有與Bcl-2相反的功能，可促進細(xì)胞的死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。(c.)其他物質(zhì)可與本發(fā)明聯(lián)合使用以提高治療效果的其他物質(zhì)也可以考慮。這些物質(zhì)包括可上調(diào)細(xì)胞表面受體和GAP連接的免疫調(diào)節(jié)劑、抑制細(xì)胞增殖和分化的物質(zhì)、細(xì)胞粘附抑制劑以及能提高內(nèi)皮細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)因子敏感性的物質(zhì)。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β、γ；IL-2和其他細(xì)胞因子；F42K和其他細(xì)胞因子類似物；MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趨化因子。本發(fā)明還可以考慮上調(diào)細(xì)胞表面受體或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL的表達，通過其對內(nèi)皮細(xì)胞的自分泌或旁分泌效應(yīng)賦予本發(fā)明以凋亡誘導(dǎo)能力。通過增加GAP連接的數(shù)量來提高細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞也可以增強對臨近內(nèi)皮細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)。在其他的實施方案中，細(xì)胞增殖或分化抑制劑可與本發(fā)明聯(lián)合使用以提高治療的抗過度增殖效應(yīng)。細(xì)胞粘附的抑制劑也可以提高本發(fā)明的效應(yīng)。細(xì)胞粘附抑制劑的例子有病灶粘連激酶(FAKs)抑制劑和洛伐他丁。能增加內(nèi)皮細(xì)胞對凋亡的敏感性的其他物質(zhì)，如抗體c225，也可用于本發(fā)明以提高治療的效果。4.免疫原性分子的鑒定本發(fā)明利用了申請人所發(fā)現(xiàn)的MDA-7可上調(diào)干擾素誘導(dǎo)的、ds-RNA依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKR)的表達這一現(xiàn)象。PKR可以通過活化多個參與生長抑制和凋亡誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗腫瘤形成活性。這些通路的活化發(fā)生在潛伏的無活性的同源二聚體被活化的信號誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等，2001)。PKR一旦活化以后就能使各種靶底物磷酸化，這在生長調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)中有很重要的作用(Saelens等，2001；Sudharkar等，2000)。PKR的活化是Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡中的關(guān)鍵事件。利用特異性蘇氨酸/激酶抑制劑2氨基嘌呤(2-AP)抑制PKR可使Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡完全反轉(zhuǎn)，eIF-2α的磷酸化消失以及蛋白合成被抑制。蛋白合成的抑制對于凋亡的誘導(dǎo)來說是很關(guān)鍵的，這可能是因為一個或幾個短命的蛋白參與凋亡的抑制。另外，其他被PKR控制的通路也是很重要的，如參與NF-κB、p53、MEK、IRF-1或FADD調(diào)節(jié)的那些通路(Jagus等，1999；Gil等，1999；Cuddihy等，1999；Balachandran等，1998)。盡管有多個信號通路參與Ad-mda7介導(dǎo)的凋亡過程，但是PKR的活化是關(guān)鍵因素，因為缺少PKR的MEFs不能發(fā)生凋亡，而具有野生型PKR的MEFs可以發(fā)生凋亡。凋亡的這種抑制作用好像是mda-7特異性的，因為用促凋亡Ad-Bak載體轉(zhuǎn)導(dǎo)缺乏PKR的MEFs可以導(dǎo)致非損傷性凋亡。一個研究這種現(xiàn)象的模型被構(gòu)建出來，其中MDA-7和PKR位于凋亡級聯(lián)中Bak促凋亡基因的上游。在這個模型中，MDA-7可誘導(dǎo)PKR的活化，通過各種細(xì)胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)胱冬酶活化和凋亡的發(fā)生。Bak位于PKR的下游，因此它誘導(dǎo)凋亡就不依賴于PKR的活化。試驗結(jié)果還顯示發(fā)生了BID的裂解和胱冬酶8的活化，這與本領(lǐng)域以前所得到的研究結(jié)果一致，說明PKR誘導(dǎo)的凋亡一般都是通過Fas、FADD、胱冬酶-8和BID的活化介導(dǎo)的(Balachandran等，1998)。因此，腺病毒介導(dǎo)的MDA-7的過量表達可導(dǎo)致PKR被快速誘導(dǎo)和活化，隨即eIF-2α以及PKR的其他靶底物被磷酸化，然后凋亡被誘導(dǎo)。通過2-AP特異性抑制肺癌細(xì)胞內(nèi)的PKR可消除Ad-mda7誘導(dǎo)的PKR活化、PKR靶底物磷酸化和凋亡的發(fā)生。通過無PKR的成纖維細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡依賴于具有正常功能的PKR通路。這些結(jié)果說明多功能的PKR基因作為Ad-mda7介導(dǎo)的凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)具有一種新的作用。而且，由于通過本文的描述發(fā)現(xiàn)PKR對于MDA-7誘導(dǎo)的凋亡來說是一個關(guān)鍵因子，MDA-7已被證明可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因此，本發(fā)明的某些實施方案考慮通過誘導(dǎo)PKR的表達來增強免疫應(yīng)答，結(jié)果顯示MDA-7多肽可以增強免疫應(yīng)答。在另外的實施方案中，本發(fā)明的方法用于鑒定免疫原性分子。本發(fā)明特別適用于增強抗免疫原性分子的免疫應(yīng)答，這些免疫原性分子是以前未發(fā)現(xiàn)的，或者其免疫原性處于常規(guī)免疫檢測方法的檢測下限以下。本發(fā)明還涉及預(yù)測候選患者是否適于進行免疫治療的方法。按照本發(fā)明的描述進行診斷試驗可以通過分析抗免疫原性分子，如抗原的免疫應(yīng)答來判斷一個患者的病情是否能保持長期無進展。本發(fā)明涉及的其他診斷試驗可用于判斷一個患者是否適于采用本發(fā)明的方法來治療涉及免疫應(yīng)答的疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明包含一個確定受體是否產(chǎn)生了抗免疫原性分子的免疫應(yīng)答的診斷試驗。在另一個實施方案中，診斷試驗用于判斷受體體內(nèi)的T細(xì)胞、NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的活性是否升高。在其他的實施方案中，診斷試驗用于判斷受體體內(nèi)的細(xì)胞因子濃度是否升高。無論那種試驗，如果受體出現(xiàn)肯定的結(jié)果，則本發(fā)明可以利用本文所描述的組合物來激發(fā)免疫應(yīng)答。在另一個實施方案中，產(chǎn)生免疫應(yīng)答或者產(chǎn)生被誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的受體被處理以增強這種免疫應(yīng)答。D.免疫刺激1.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答細(xì)胞因子可促進抗化合物的免疫應(yīng)答。因為MDA-7具有細(xì)胞因子活性，這種活性可用于治療方法或預(yù)防方法?？瓜铝腥魏我粋€抗原的免疫應(yīng)答都可以影響與抗原有關(guān)的疾病的治療效果，或影響抗該疾病的預(yù)防效果。在本發(fā)明中，MDA-7可增強抗疾病相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗原與微生物、真菌、病毒或腫瘤藥物相關(guān)，或來源于微生物、真菌、病毒或腫瘤藥物。本發(fā)明的抗原所來源的微生物包括而不限于肺炎球菌屬的83個血清型或更多，鏈球菌屬的細(xì)菌如釀膿鏈球菌(S.pyogenes)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、馬鏈球菌(S.equi)、狗鏈球菌(S.canis)、牛鏈球菌(S.bovis)、馬腸鏈球菌(S.equinus)、咽峽炎鏈球菌(S.anginosus)、血鏈球菌(S.sanguis)、唾液鏈球菌(S.salivarius)、緩癥鏈球菌(S.mitis)、變異鏈球菌(S.mutans)，其它綠色鏈球菌屬、消化鏈球菌屬、鏈球菌屬的相關(guān)種、腸球菌屬的細(xì)菌如糞腸球菌、屎腸球菌，葡萄球菌屬的細(xì)菌如表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌，鼻咽內(nèi)的特異性細(xì)菌如流感嗜血桿菌，假單胞菌屬的細(xì)菌如銅綠假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、鼻疽假單胞菌，布魯氏菌如馬爾他布氏桿菌、豬布氏桿菌、流產(chǎn)布氏桿菌、百日咳博德特氏菌、腦膜炎奈瑟菌、淋球菌、粘膜炎莫拉菌、白喉棒狀桿菌、潰瘍棒桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌、假白喉棒狀桿菌、解脲棒桿菌、溶血隱秘桿菌(Corynebacteriumhemolyticum)、馬棒狀桿球菌等，單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌、星狀諾卡氏菌(Nocordiaasteroides)，擬桿菌，放線菌，梅毒螺旋體，細(xì)螺旋體，以及相關(guān)的微生物。本發(fā)明還可用于抗革蘭氏陰性細(xì)菌，如肺炎克雷白菌、大腸桿菌、變形菌、沙雷菌、不動桿菌、鼠疫桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yershiniaenterocolitica)、假結(jié)核耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯菌、腸桿菌、Bacteriodes和軍團菌等。另外，本發(fā)明還可用于控制寄生蟲感染以及微生物引起的微觀感染，如隱孢子蟲、貝氏等孢子球蟲、鼠弓形蟲、陰道毛滴蟲、環(huán)孢子菌，以及沙眼衣原體及其他衣原體感染，如鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體。本發(fā)明所涉及的細(xì)菌抗原和/或致病菌的致病因子包括而不限于結(jié)核桿菌可溶性因子(Mtb)，表皮葡萄球菌來源的酚可溶性調(diào)節(jié)素(PSM)，林球菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、親水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、肉毒梭菌芽孢桿菌的脂多糖(LOS)。本發(fā)明的病毒抗原所來源的病毒包括而不限于流感病毒A、B和C，副流感病毒、副黏液病毒、新城疫病毒、呼吸道合胞體病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、細(xì)小病毒、Epstein-Barr病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、?？刹《?、呼腸孤病毒、彈狀病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、冠狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒、人免疫缺陷病毒、巨細(xì)胞病毒(如CMV-G和CMV-M抗原)、人乳頭狀瘤病毒、B病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、痘病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、輪狀病毒和Kaposi相關(guān)的皰疹病毒、肝炎病毒A、B、C、D、E、F、G以及其他肝炎病毒、西尼羅河病毒、流感病毒、paopvaviruses、逆轉(zhuǎn)錄病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、和風(fēng)疹病毒。本發(fā)明的抗原所來源的真菌包括而不限于正圓形糠秕孢子菌、威尼克外瓶霉、Piedraiahorta、Trichosporonbeigelii、白色念珠菌、Sporothrixschenckii、Cladophialophoracarrionii、疣狀瓶霉、兩種著色霉、Pseudallescheriaboydii、足菌腫馬杜拉分支菌、灰色馬杜拉分支菌、甄氏外瓶霉、鐮形頂孢霉、甄氏外瓶霉、爛木瓶霉、長穗雙極菌、皮炎萬吉拉菌、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、P.brasiliensis、念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、卡氏肺孢子蟲、酒曲菌、根毛霉、犁頭霉、Blastomycesdermititidis、莢膜組織胞漿菌、Paracoccidiodes屬、蛙糞霉菌。另外還可以考慮將部分或全長MDA-7與其他細(xì)胞因子和/或要激發(fā)免疫應(yīng)答的抗原融合形成融合蛋白。這種融合蛋白可給予受體以誘導(dǎo)或促進抗該抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明包括促進受體免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予受體有效量的MDA-7以促進免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的促進可根據(jù)下列現(xiàn)象來觀察細(xì)胞因子表達或活性升高、T細(xì)胞或T細(xì)胞群(例如，輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、NK細(xì)胞)的增殖、B細(xì)胞或B細(xì)胞群的增殖、細(xì)胞毒T細(xì)胞的活化以及抗體的產(chǎn)生。在本發(fā)明的某些實施方案中，也可以提供抗原以誘導(dǎo)抗該抗原的免疫應(yīng)答。抗原可以是腫瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原，以及上述物質(zhì)的混合物。在某些特殊的實施方案中，抗原是腫瘤抗原，如PSA，CEA，MART，MAGE1，MAGE3，gp100，BAGE，GAGE，TRP-1，TRP-2或PMSA。本發(fā)明的其他實施方案包括促進或加快康復(fù)的方法，或減輕創(chuàng)傷性治療所導(dǎo)致的損傷的方法，創(chuàng)傷性治療是指引起正常細(xì)胞損傷的治療方法。這種損傷可導(dǎo)致中性白細(xì)胞減少、貧血、血小板減少以及淋巴細(xì)胞減少。在某些實施方案中，創(chuàng)傷性治療是指化療和/或放療?？山o予將要實施、正在實施或已經(jīng)實施了創(chuàng)傷性治療的患者有效量的MDA-7以提高免疫治療的效果。MDA-7可在治療前、治療后或治療過程中提供。MDA-7可與抗腫瘤藥物或具有抑制腫瘤增殖活性的化合物聯(lián)合給予患者以增強這種化合物抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。這種化合物包括腫瘤抑制劑和下面“聯(lián)合化療”部分所討論的化合物。在某些實施方案中，抗腫瘤化合物是p53、Rb、WT、FHIT、p16、PTEN、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27或TRAIL?？鼓[瘤抗原的免疫應(yīng)答也可以用MDA-7加強。腫瘤抗原包括PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、結(jié)核桿菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性調(diào)節(jié)素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外殼-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨針抗原、風(fēng)疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETSG250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m或WT1。誘導(dǎo)抗腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的用途是本發(fā)明需特別考慮的，見于美國專利5,552,293和6,132,980的描述，本文特地納入作為參考。有關(guān)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)、促進或增強的許多分析方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中有些在實施例中作了描述，并且已納入本文作為參考。一種分析方法是檢測其他細(xì)胞因子表達的增加，如IL-6、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-12。其他檢測所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法則是通過檢測T細(xì)胞、NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞所升高的活性。值得注意的是有關(guān)MDA-7和/或免疫原性分子如抗原的任何實施方案都適用于增強免疫應(yīng)答的方法。更特別的是，有關(guān)MDA-7的實施方案可增強抗各種免疫原性分子的免疫應(yīng)答，其中免疫原性分子可以是以前被鑒定出的，也可以是以前未知的。作為一種診斷方法，本發(fā)明涉及T細(xì)胞反應(yīng)的分析，包括分析自身B細(xì)胞系(B-LCL)、樹突狀細(xì)胞或MHC匹配的細(xì)胞來源的細(xì)胞。術(shù)語“自身的”是指來自于受體的細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞也來自同一受體。自身B-LCL可用將要被診斷、被治療或被轉(zhuǎn)化的受體的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)制備。在一個特殊的實施方案中，自身B-LCL來自于HIV感染的受體，被用作T細(xì)胞反應(yīng)試驗的靶細(xì)胞以預(yù)測B-LCL供體內(nèi)的長期無進展情況。樹突狀細(xì)胞(DC)作為一種抗原呈遞細(xì)胞在T細(xì)胞活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在抗原呈遞細(xì)胞(APC)中DC細(xì)胞是比較獨特的，因為這些細(xì)胞具有很強的活化幼稚T細(xì)胞的能力(Steinman，1991)。DC先天性地表達，或者在成熟后表達幾種分子，這些分子可介導(dǎo)與反應(yīng)性T細(xì)胞的物理相互作用，并且可將活化信號傳遞給反應(yīng)性T細(xì)胞。這些分子包括MHCI類分子和II類分子、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)、CD40、CD11a/CD18(LFA-1)、以及CD54(ICAM-1)(Steinman，1995；Steinman，1991)。DC可以將抗原呈遞給CD8+和CD4+T淋巴細(xì)胞。DC在被刺激后可分泌幾種T細(xì)胞刺激因子，其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(MIP-1α)和MIP-1γ(Mohamadzadeh，1996；Ariizumi，1995；Kitajima，1995；Caux，1994；Enk，1992；Heufler，1992；Matsue，1992；Schreiber，1992)。粘附分子表達和細(xì)胞因子分泌這兩種特性其他APC也具有(即活化的巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞)，但是其他APC活化幼稚T細(xì)胞的能力要比DC弱的多。在其他的實施方案中，淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物試驗可用于分析T細(xì)胞表面的各種受體是否存在，這些分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中包括免疫熒光分析和流式細(xì)胞術(shù)。T細(xì)胞反應(yīng)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種方法檢測。這些分析方法中的一些將在下面進行詳細(xì)描述。a.3[H]胸腺嘧啶摻入試驗不同樣品來源的PBMC的增殖反應(yīng)可通過標(biāo)準(zhǔn)的3[H]胸腺嘧啶摻入試驗進行分析，見已發(fā)表的文獻的描述(Nehete，1996；Nehete，1995)。T細(xì)胞增殖反應(yīng)對E6和E7肽的影響可通過細(xì)胞內(nèi)摻入的3[H]胸腺嘧啶的增加倍數(shù)來計算(以刺激指數(shù)(SI)來表示)，增加的倍數(shù)是通過與未加肽的對照組比較得來的。當(dāng)SI的值在2.0以上時，如約2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0以上時，被認(rèn)為是陽性反應(yīng)。SI的值通常用與肽共孵育細(xì)胞培養(yǎng)基的放射活性(cpm)除以未與肽共孵育細(xì)胞培養(yǎng)基(只有培養(yǎng)基)的放射活性值來計算。b.用51[Cr]標(biāo)記試驗檢測細(xì)胞的溶解細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞溶解(CML)可用于指示T細(xì)胞反應(yīng)的程度。靶細(xì)胞在與效應(yīng)細(xì)胞接觸前用放射性的鉻-51(51[Cr])標(biāo)記。釋放到培養(yǎng)基中的51[Cr]的量與細(xì)胞介導(dǎo)的溶解成正比。在本發(fā)明的一個特殊實施方案中，培養(yǎng)自身B淋巴細(xì)胞，在與細(xì)胞毒細(xì)胞共孵育前2小時加入51[Cr]鉻酸鈉。c.γ-干擾素的產(chǎn)生干擾素γ(γ-干擾素)也被稱為II型干擾素或免疫干擾素，是由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的。對T輔助細(xì)胞的發(fā)育非常重要。因為它是一個基礎(chǔ)的巨噬細(xì)胞活化因子，因此它在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中是一個強細(xì)胞因子。γ-干擾素可增加MHCI類分子和II類分子的表達水平，因此可促進抗原呈遞和其他識別反應(yīng)。它還可以放大TNF-α的效應(yīng)，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達水平，導(dǎo)致T細(xì)胞粘附和外滲。最后，作為本發(fā)明權(quán)利要求的一部分，γ-干擾素可由CTL分泌，因此γ-干擾素的水平可作為指示CTL活性及CTL反應(yīng)的指標(biāo)。γ-干擾素的水平可用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測。d.四聚物分析四聚物分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，見Altman，1996e.細(xì)胞因子的產(chǎn)生細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和不同類型細(xì)胞的分化通路的重要蛋白。其在T細(xì)胞的調(diào)節(jié)和發(fā)育中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，細(xì)胞因子包括γ-干擾素、白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、淋巴毒素、MIF、TGF-β、TNF-α以及其他趨化因子。細(xì)胞因子的檢測方法是本領(lǐng)域所熟知的。本發(fā)明還涉及確定受體是否表達，或者是否能夠表達能特異性指示免疫應(yīng)答的分子的方法。由于MDA-7提供了一種增強免疫應(yīng)答的方式，因此本發(fā)明的方法包括檢測免疫系統(tǒng)指示劑如蛋白、肽或多肽的表達，這些蛋白、肽或多肽可被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞分別表達。有許多方法可定量或定性地檢測分子的表達水平，其中包括檢測象征特定單體型的DNA序列，或者測定蛋白或mRNA的表達水平。這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。下面提供了一些例子。f.血清學(xué)分析本發(fā)明包括利用血清學(xué)試驗評價免疫系統(tǒng)指示劑表達水平的方法。這些試驗利用抗原-抗體反應(yīng)定量和定性地檢測抗原的水平。有許多分析方法可以使用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道如何在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用它們。g.ELISAs，免疫分析和免疫組化分析免疫分析一般都是結(jié)合分析。最常用的免疫分析方法是各種類型的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISAs)和放射免疫分析(RIA)，這些都是本領(lǐng)域所熟知的。用組織切片進行免疫組化檢測也是很有用的。本發(fā)明所涉及的免疫分析包括而不限于美國專利No.4,367,110(雙抗夾心法)和No.4,452,901(Western印跡)所描述的方法。其他分析方法包括體外和體內(nèi)的標(biāo)記配基的免疫沉淀分析和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。分析所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否存在可直接在組織樣品中進行。體外原位雜交方法是大家所熟知的，包括檢測抗原特異性抗體與組織、細(xì)胞或細(xì)胞提取物的結(jié)合。這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員能熟練掌握的常規(guī)技術(shù)。實施例下面的實施例用于證明本發(fā)明的某些特定實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解實施例中所描述的技術(shù)是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的具有代表性的技術(shù)，可以很好地實現(xiàn)本發(fā)明，因此可以被認(rèn)為是實現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本說明書可以對本文所描述的某些實施方案作各種修改，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下也可以得到相似或相同的結(jié)果。實施例1AD-MDA7誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞內(nèi)的PKR表達和細(xì)胞的凋亡a.細(xì)胞系和試劑人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(wtp53)、H1299(p53缺失)和H322J(突變型p53)得自美國典型培養(yǎng)物收集中心。PKR+/+和PKR-/-鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)由Dr.GlenBarber(邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院(UniversityofMiamiSchoolofMedicine))惠贈。MEF細(xì)胞用含10％胎牛血清、10mM谷氨酰胺、100units/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％CO2，溫度為37℃。2-氨基嘌呤硝酸鹽(2-AP)購自SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)。b.病毒Ad-mda7、Ad-Bax、AdBak、Ad-p53和Ad-Luc載體的構(gòu)建以前已有報道(Pataer等，2000)。腺病毒載體在各種腫瘤細(xì)胞系內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可通過Ad-LacZ感染細(xì)胞，然后測定轉(zhuǎn)染70％以上的細(xì)胞所需要的病毒滴度來確定。c.流式細(xì)胞術(shù)分析和XTT分析凋亡細(xì)胞用碘化丙錠染色，然后用FACS檢測。收獲細(xì)胞后離心，然后再懸浮于含50g/ml碘化丙錠、0.1％TritonX-100和0.1％檸檬酸鈉的磷酸鹽緩沖液中。樣品在4℃儲存16小時，在進行FACS(Becton-DickensonFACScan，MountainView，CA；FL-3channel)分析前劇烈振蕩。細(xì)胞的存活能力用XXT試驗進行分析，將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100L液體。用Ad-mda7或?qū)φ蛰d體處理后，按照Roche的說明書(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)使細(xì)胞與XTT四唑鹽共孵育。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測儀上所得到的吸光度來分析細(xì)胞的存活能力。d.免疫印跡分析轉(zhuǎn)染48小時后，制備細(xì)胞提取物進行免疫印跡分析，見以前的文獻描述(Pataer等，2000)。所使用的抗體如下Bcl-2、Bak、Bax、PKR(K-17)、eIF-2α、β-肌動蛋白、p38(A-12)、磷酸特異性p38(D-8)、stat1(C-136)、磷酸特異性stat1(A-2)、stat3(F-2)、磷酸特異性stat3(B-7)、抗-Tyk2(C-20)和磷酸特異性-Tyk(PY-99)(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)；胱冬酶3、胱冬酶-9、胱冬酶-8和Bid(PharMingen，SanDiego，CA)以及磷酸特異性PKR[pT451]和eIF-2α[pS51](BioSourceInternational，Camarillo，CA)。MDA-7的多克隆和單克隆抗體購自IntrogenTherapeutics，Inc.(Houston，TX)。e.重組腺病毒的制備構(gòu)建出的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)攜帶編碼人細(xì)胞外MDA-7(或熒光素酶)的核酸，該核酸與內(nèi)部CMVIE啟動子相連，其下游是SV40多聚腺苷酸(pA)信號。同時構(gòu)建了只含CMV-pA構(gòu)建體的對照載體。攜帶基因表達盒的Ad-5載體與質(zhì)粒pJM17(Graham和Prevec1992)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以獲得重組病毒Ad-mda7、AdLuc和AdCMVpA。挑取噬菌斑獲得病毒顆粒，用PCR/限制性酶切分析和序列測定確定基因組序列的正確性。在293細(xì)胞內(nèi)繁殖病毒并通過HPLC純化。f.轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖研究本試驗所用的腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞用Ad-mda7轉(zhuǎn)染(以AdCMVpA或AdLuc為對照)，轉(zhuǎn)染劑量MOIs逐漸增加(病毒顆粒/細(xì)胞；0、100、250、500、1000、2500、5000、10000vp/細(xì)胞，濃度逐漸增加)。細(xì)胞或者以500-2000個細(xì)胞/孔接種到96孔板中進行氚標(biāo)胸腺嘧啶摻入-細(xì)胞增殖試驗，或者以105-106個細(xì)胞/孔接種到6孔板中進行蛋白表達分析或凋亡分析，或者以104個細(xì)胞/孔接種進行Alamar-blue分析。Ad-mda7或AdLuc(或AdCMVpA)轉(zhuǎn)染用逐漸增加的MOIs(根據(jù)病毒顆粒/細(xì)胞；MOI范圍為0-10,000病毒顆粒/細(xì)胞)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后3到5天進行氚標(biāo)胸腺嘧啶/凋亡試驗、蛋白表達試驗以及alomar試驗。g.細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的檢測細(xì)胞用Ad-mda7或Ad-Luc處理48小時。在指示的位置用1mM2-AP處理細(xì)胞48小時。蛋白合成的檢測用以前所描述的方法進行(14)。經(jīng)處理后，約1×106細(xì)胞與2Ci/ml的L-[U-14C]氨基酸混合物(Amersham，Piscataway，NJ)在37℃共孵育10分鐘。加入20％(wt/vol)三氯醋酸終止反應(yīng)，酸可沉淀成分中的放射活性用閃爍掃描計數(shù)器測定。h.共聚焦分析以4×105細(xì)胞/孔的劑量將細(xì)胞接種到帶槽的波片中培養(yǎng)過夜，然后用Ad-mda7、Ad-Luc或PBS處理。48小時后用PBS洗滌細(xì)胞，然后在4％的多聚甲醛中固定過夜。用0.2％triton-X100在4℃處理細(xì)胞20分鐘使細(xì)胞的滲透性增加，然后用5％的正常馬血清和1％的正常羊血清封閉。加入兔多克隆抗MDA-7抗體和鼠單克隆抗-PKR(B-10)抗體在4℃共孵育過夜，然后加入羅丹明或FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG在37℃孵育30-45分鐘。然后在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。i.統(tǒng)計學(xué)分析附圖中顯示的數(shù)據(jù)代表三個或多個獨立試驗的平均值，橫條代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。多組和配對比較的統(tǒng)計學(xué)分析分別用ANOVA和兩端斯氏t檢驗(two-tailedStudent’ttest)進行分析，p＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。A549(wtp53)、H1299(p53缺失型)和H322J(突變型p53)肺癌細(xì)胞用Ad-mda7、Ad-Luc或PBS處理后24到96小時通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示Ad-mda7的轉(zhuǎn)染可以使三株肺癌細(xì)胞發(fā)生高百分率的凋亡(圖1A)。利用XTT試驗分析Ad-mda7、Ad-Luc或PBS轉(zhuǎn)染對細(xì)胞存活能力的抑制作用。與FACS結(jié)果一樣，Ad-mda7轉(zhuǎn)染后48小時可明顯抑制細(xì)胞的生長。Western印跡分析和共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Ad-mda7轉(zhuǎn)染后PKR的表達出現(xiàn)劑量依賴型的上升(圖1B，1C)，但是轉(zhuǎn)導(dǎo)對照載體(Ad-Luc)或其他促凋亡載體如Ad-Bax、Ad-p53或Ad-Bak的細(xì)胞或用PBS處理的細(xì)胞卻沒有出現(xiàn)上述結(jié)果。因此，干擾素誘導(dǎo)的、ds-RNA依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKR)的表達上調(diào)可在Ad-mda7處理后觀察到。Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)肺癌細(xì)胞可導(dǎo)致PKR以不依賴p53的方式活化(圖1A和1B)。PKR的表達上調(diào)也可見于其他類型的腫瘤細(xì)胞，包括結(jié)腸癌和乳腺癌，說明這種關(guān)系并不是肺癌細(xì)胞特異性的。PKR的上調(diào)表現(xiàn)出Ad-mda7特異性，因為用攜帶熒光素酶報告基因或其他促凋亡基因如p53(Ad-p53)、Bax(Ad-Bax)或Bak(Ad-Bak)的腺病毒載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞卻沒有出現(xiàn)PKR的變化(圖1B和1C)。另外，PKR的功能特性表面它是一個重要的致瘤性調(diào)節(jié)因子(Jagus等，1999)。PKR的上調(diào)可導(dǎo)致各種腫瘤細(xì)胞系的凋亡。另外，脊髓發(fā)育不良中染色體5q上IRF-1基因的關(guān)鍵性缺失好像與PKR的表達水平降低有關(guān)，肺癌和結(jié)腸癌的免疫組化分析表明PKR的表達與生存期延長有關(guān)。實施例2AD-MDA7活化PKR、EIF2α和PKR的其他靶底物利用實施例1描述的材料和方法可觀察到Ad-mda7在體外對PKR的活化。Ad-mda7處理細(xì)胞(A549)通過免疫印跡分析其磷酸化PKR的存在。試驗表明只有Ad-mda7處理的細(xì)胞內(nèi)PKR及其磷酸化活化形式的表達才會升高(圖2A)。PKR下游靶底物eIF-2α、Tyk2、Stat1、Stat3和p38的磷酸化也證明了絲氨酸/蘇氨酸激酶的活化(圖2A)。Ad-mda7的處理導(dǎo)致隨后的凋亡發(fā)生，胱冬酶3、8和9被活化，BID和PARP被裂解(T圖2C)。PKR的活化好像是Ad-mda7和下游胱冬酶活化特異性的，因為用胱冬酶抑制劑預(yù)處理不會阻斷PKR的磷酸化。PKR可通過多個參與生長抑制和凋亡誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化來介導(dǎo)抗腫瘤形成效應(yīng)。這些通路的活化發(fā)生在潛伏的無活性的同源二聚體被活化的信號誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等，2001).PKR一旦活化以后就能使各種靶底物磷酸化，這在生長調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)中有很重要的作用(Saelens等，2000；Sudharkar等，2000)。免疫沉淀試驗所得到的結(jié)果與這個模型所得到的結(jié)果是一致的，都表明Ad-mda7的轉(zhuǎn)導(dǎo)可活化PKR(圖2A)，導(dǎo)致磷酸化的PKR(活性形式)和磷酸化的eIF-2α的增加。其他與凋亡誘導(dǎo)和生長調(diào)控有關(guān)的PKR靶底物包括Stat1、Stat3、p38和Tyk2，試驗表面都可被PKR磷酸化(Deb等，2001；Goh等，2000)。PKR的活化是Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡中的關(guān)鍵事件，因為利用特異性蘇氨酸/激酶抑制劑2氨基嘌呤(2-AP)抑制PKR可使Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡幾乎完全反轉(zhuǎn)，eIF-2α的磷酸化消失以及蛋白合成被抑制。蛋白合成的抑制對于凋亡的誘導(dǎo)來說是很關(guān)鍵的，這可能是因為一個或幾個短命的蛋白參與凋亡的抑制。另外，其他被PKR控制的通路也是很重要的，如參與NF-κB、p53、MEK、IRF-1或FADD調(diào)節(jié)的那些通路(Jagus等，1999；Gil等，1999；Cuddihy等，1999；Balachandran等，1998)。實施例3AD-MDA7誘導(dǎo)凋亡依賴于PKR的活化利用實施例1所描述的材料和方法研究特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑2氨基嘌呤(2-AP)的效應(yīng)以確定Ad-mda7的凋亡誘導(dǎo)和PKR活化之間的關(guān)系。單純高濃度的2-AP(10mM)對細(xì)胞的存活率沒有影響。但是，2-AP卻可以劑量依賴的方式阻斷Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞殺傷(圖3A)。2-AP對凋亡的抑制好像是Ad-mda7特異性的，因為用Ad-Bak、Ad-Bax、Ad-p53或癌基因抑制劑處理的細(xì)胞沒有出現(xiàn)對凋亡的抑制現(xiàn)象。免疫沉淀試驗表明2-AP的處理可抑制PKR和eIF-2α的磷酸化，從而抑制PKR的活化(圖3B)。2-AP阻斷eIF-2α磷酸化的能力可導(dǎo)致eIF-2α蛋白合成抑制(圖3C)和凋亡誘導(dǎo)抑制(圖3A)的反轉(zhuǎn)。實施例4MEF細(xì)胞內(nèi)AD-MDA7誘導(dǎo)的凋亡和PKR的活化利用實施例1所描述的材料和方法評價PKR敲除小鼠來源的MEF細(xì)胞內(nèi)的PKR活化和Ad-mda7的凋亡誘導(dǎo)活性。盡管PKR缺失型(-/-)MEF細(xì)胞和PKR野生型MEF細(xì)胞都能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達MDA-7蛋白(圖4A)，但是只有PKR野生型MEF在Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)后出現(xiàn)凋亡，這說明Ad-mda7所誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷是PKR依賴型的。與Ad-mda7不同，Ad-BAK誘導(dǎo)的凋亡不依賴于PKR在基因組內(nèi)的狀態(tài)(圖4C)，PKR缺失型MEF和PKR野生型MEF都可以發(fā)生凋亡，說明PKR的活化不需要所有的促凋亡基因參與。盡管有多個通路參與，但是PKR的活化對Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡來說是很關(guān)鍵的，因為缺少PKR的MEF細(xì)胞不發(fā)生凋亡，而具有野生型PKR的MEF細(xì)胞正好相反。凋亡的這種抑制作用好像是mda-7特異性的，因為用促凋亡Ad-BAK載體轉(zhuǎn)染缺少PKR的MEF細(xì)胞卻可以導(dǎo)致非損傷性的凋亡?；谶@些結(jié)果合成了一個試驗?zāi)Ｐ?，其中MDA-7和PKR位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)中促凋亡BAK基因的上游。在這個模型中，MDA-7誘導(dǎo)PKR的活化，通過各種細(xì)胞內(nèi)通路誘導(dǎo)胱冬酶的活化和凋亡的發(fā)生。BAK位于PKR的下游，它對凋亡的誘導(dǎo)不依賴于PKR的活化。令人感興趣的是，與以前所得到的結(jié)果一致，也可以看到BID的裂解和胱冬酶8的活化，這說明PKR誘導(dǎo)的凋亡通常是通過Fas、FADD、胱冬酶-8和BID的活化介導(dǎo)的(Balachandran等，1998)。腺病毒介導(dǎo)的MDA-7的過量表達可導(dǎo)致PKR被快速誘導(dǎo)和活化，隨即eIF-2α以及PKR的其他靶底物被磷酸化，然后凋亡被誘導(dǎo)。通過2-AP特異性抑制肺癌細(xì)胞內(nèi)的PKR可消除Ad-mda7誘導(dǎo)的PKR活化、PKR靶底物磷酸化和凋亡的發(fā)生。通過無PKR的成纖維細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡依賴于具有正常功能的PKR通路。實施例5Ad-mda7誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞內(nèi)的PKR表達和細(xì)胞的凋亡材料和方法1.細(xì)胞系和免疫印跡試驗A549和H1299人肺癌細(xì)胞系得自美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC，Rockville，MD)。所有的細(xì)胞都用含10％胎牛血清、10mM谷氨酰胺、100units/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％CO2，溫度為37℃。所用的抗體如下BAK、BAX、Bcl-2、Fas、FasL、FADD、TNFα、TNFR1、TRADD、β-肌動蛋白(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)和細(xì)胞色素c(PharMingen，SanDiego，CA)。2.腺病毒的制備和轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-mda-7、Ad-p53、Ad-LacZ和Ad-Luc載體的構(gòu)建方法以前已有報道(Pataer等，2000)。腺病毒載體對細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通過Ad-LacZ感染細(xì)胞來確定。下面試驗所需要的病毒滴度至少能轉(zhuǎn)染70％的細(xì)胞。3.凋亡和細(xì)胞存活率分析凋亡細(xì)胞用碘化丙錠染色，然后用FACS檢測。收獲細(xì)胞后離心，然后再懸浮于含50g/ml碘化丙錠、0.1％TritonX-100和0.1％檸檬酸鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。樣品在4℃儲存16小時，在進行FACS(Becton-DickensonFACScan，MountainView，CA；FL-3channel)分析前劇烈振蕩。細(xì)胞的存活能力用XXT試驗進行分析，將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100L液體。第一天細(xì)胞用Ad-mda-7、Ad-p53和對照載體轉(zhuǎn)染。在第二天，按照Roche的說明書(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)使細(xì)胞與XTT四唑鹽共孵育4到24小時。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測儀上所得到的吸光度來分析細(xì)胞的存活率。4.線粒體膜電位測定電位敏感性的熒光染料四甲基羅丹明乙酯高氯酸鹽(TMRE)(MolecularProbes，Eugene，OR)用于測定ΔΨm。細(xì)胞與25nMTMRE在37℃、暗室中孵育30分鐘，然后用PBS洗滌，在FACS的FL-2通道上分析(FACScanBectonDickinson，MountainView，CA)。5.測定細(xì)胞色素c的釋放細(xì)胞色素c從線粒體內(nèi)的釋放通過免疫印跡試驗進行測定。收獲細(xì)胞后離心，在pH為7.4的含25mMTris和5mMMgCl2的冰冷緩沖液中溫和裂解5分鐘。細(xì)胞裂解物用16000g離心5分鐘，收獲上清液與1×Laemmli還原SDS-PAGE樣品緩沖液混合，10-20×106細(xì)胞的提取物用15％的SDS-PAGE溶解。將多肽轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(0.2μM，Schleicher&Scheull，Keene，NH)上，然后與單克隆抗體7H8.2C12(Pharmingen，SanDiego，CA)雜交以檢測細(xì)胞色素c。6.統(tǒng)計學(xué)分析附圖中顯示的數(shù)據(jù)代表三個或多個獨立試驗的平均值，橫條代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。多組和配對比較的統(tǒng)計學(xué)分析分別用ANOVA和兩端斯氏t檢驗進行分析，p＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞的存活率利用XTT試驗分析。p53-耐受的(A549)和p53-敏感的(H1299)肺癌細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染后48到72小時其細(xì)胞存活率都明顯下降(圖5A)。通過流式細(xì)胞儀檢測亞二倍體的細(xì)胞群來評價凋亡的誘導(dǎo)情況。A549(p53-耐受的)和H1299(p53-敏感的)肺癌細(xì)胞系在Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)后48到96小時都被誘導(dǎo)出現(xiàn)凋亡。而Ad-Luc或PBS處理的細(xì)胞沒有出現(xiàn)凋亡(圖5B)。Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)的A549和H1299肺癌細(xì)胞系在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時都發(fā)生了細(xì)胞色素c的釋放。這與凋亡的結(jié)果一致，說明線粒體參與凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。實施例6AD-MDA-7對線粒體膜電位變化和凋亡的影響線粒體膜電位(MMP)的中斷是MPT依賴性凋亡因子所誘導(dǎo)的凋亡過程中所發(fā)生的典型事件。對于H1299細(xì)胞來說，Ad-p53和癌基因抑制劑都可以通過MPT依賴的通道誘導(dǎo)MMP的變化和凋亡的發(fā)生，如實施例5所描述的材料和方法。MMP的變化和凋亡的發(fā)生都可以被CsA所阻斷，后者是一種選擇性的MPT依賴性通道阻斷劑(圖6A，7A)。但是，Ad-mda-7雖然不能誘導(dǎo)MMP的變化，依然能誘導(dǎo)凋亡，并且這種凋亡不被CsA抑制。Ad-p53不能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡或MMP的改變(圖6B，7B)。但是癌基因抑制劑所誘導(dǎo)的MMP改變和凋亡都可被CsA阻斷，因為CsA可抑制MMP依賴型通道。令人感興趣的是，Ad-mda-7可誘導(dǎo)MMP的改變，但是這種改變不能被CsA反轉(zhuǎn)。另外，CsA不能抑制Ad-mda-7所誘導(dǎo)的凋亡。這些數(shù)據(jù)都說明Ad-mda-7通過MMP非依賴型通道所誘導(dǎo)的凋亡和細(xì)胞色素c釋放可被CsA所阻斷。實施例7環(huán)孢霉素A可阻斷線粒體膜電位的丟失為了確定環(huán)孢霉素A對線粒體膜電位的影響，H1299細(xì)胞(圖8A)和A549細(xì)胞(圖8B)按上面描述的方法用Ad-mda-7、Ad-p53和星形孢菌素(1μM)處理。如圖所示，細(xì)胞用10μM的環(huán)孢霉素A預(yù)處理。然后裂解細(xì)胞，用TMRE染色后測定MMP的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)孢霉素A確實可以影響MMP的改變。實施例8AD-MDA-7上調(diào)外在通路為了確定Ad-mda-7是否能通過Bcl-2家族的基因或死亡受體通路活化線粒體，用免疫印跡試驗分析Ad-mda-7處理細(xì)胞(A549)內(nèi)上述BAK、BAX、Bcl-2、TNF-α、TNF-R1、TRADD、FasL、Fas和FADD表達的改變(圖9)。試驗表明Bcl-2家族的基因沒有發(fā)生變化，只有FasL的表達出現(xiàn)明顯上調(diào)。另外，以前的研究表明胱冬酶8的活化和BID的裂解與外在通路的活化一致，可能都是通過Ad-mda-7上調(diào)FasL的表達。實施例9線粒體膜電位的變化圖10用示意圖的形式表明幾種可誘導(dǎo)MMP變化的促凋亡基因(如BAX、BAK和p53)的效應(yīng)，MMP的改變可使MMP依賴型通道開放，細(xì)胞色素c釋放并與APAF-1和胱冬酶8形成凋亡復(fù)合體。這種凋亡復(fù)合體可啟動凋亡過程，最終由胱冬酶-3、-6和-7裂解各種細(xì)胞內(nèi)的底物。這些促凋亡基因可被CsA或bonkregicacid抑制，后者可封閉MMP依賴型通道防止MMP的變化和細(xì)胞色素c的釋放。實施例10AD-MDA-7調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞內(nèi)的-β聯(lián)蛋白通路材料和方法1.細(xì)胞系乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453、T47D、MCF-7、SkBr3以及肺癌細(xì)胞系H1299和A549得自美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC，Rockville，MD)。細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(GIBCO/BRL，LifeTechnologies，GrandIsland，NY)和10％的胎牛血清培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)得自CloneticsInc.(SanDiego，CA)?？?APC兔多克隆抗體、抗-GSK-3β單克隆抗體、抗-PLC-γ單克隆抗體、抗-FAK單克隆抗體、抗pAKT抗體、抗-ILK-1抗體、抗-PTEN抗體和二抗如FITC/羅丹明標(biāo)記的抗鼠IgG、抗兔IgG購自Santa-CruzBiotechnology；抗β-聯(lián)蛋白單克隆抗體、FITC標(biāo)記的抗-β-聯(lián)蛋白單克隆抗體、抗-E-鈣粘著蛋白單克隆抗體得自TransductionLabs?？?MDA-7多克隆抗體和單克隆抗體是按照以前所描述的方法制備的(Mhashilkar等，2001)。2.重組腺病毒的制備和轉(zhuǎn)染攜帶mda-7基因的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)按以前描述的方法制備(Su等，1998)。Ad-p53和Ad-Luc(熒光素酶)的構(gòu)建以前已有描述(Mhashilkar等，2001；Saeki等，2000)。細(xì)胞系用各種MOI的Ad-mda-7(以Ad-Luc為對照)轉(zhuǎn)染，如前所述(Mhashilkar等，2001)。注意這些病毒制備物的vp/pfu比例為25。3.微芯片分析MICROMAX人類cDNA系統(tǒng)I--定向試劑盒(MICROMAXHumancDNASystemI--Directkit)(NENLifeScienceProducts，Inc.)是一種含2400個人cDNA的通用篩選芯片，MICROMAX定向系統(tǒng)人癌基因和腫瘤一致基因(MICROMAXDirectSystemHumanOncogenesandTumorSuppressors)(NENLifeScienceProducts，Inc.)是一種含280個腫瘤相關(guān)人cDNA的芯片。從Ad-mda-7或Ad-Luc(1000vp/cell，24hr)轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞內(nèi)提取mRNA，按照廠商的說明書進行操作。4.Western印跡分析細(xì)胞裂解物(105-106個細(xì)胞懸浮于500μL含5％2-β-巰基乙醇(2βME)的Laemmli緩沖液中)用SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳和Western印跡進行分析，所用的是以前所描述的辣根過氧化物酶的Super-Signal底物(PierceInc.)(Mhashilkar等，2001)。β-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的熒光素酶分析TOPFLASH試劑盒(Clontech，PaloAlto，CA)利用的是一個含TCF/LEF啟動子的質(zhì)粒，該啟動子控制熒光素酶的表達。β-聯(lián)蛋白與TCF/LEF的結(jié)合以及向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位可誘導(dǎo)熒光素酶活化。腫瘤細(xì)胞用攜帶TCF啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)(1μg/每孔，用脂轉(zhuǎn)染胺介導(dǎo))。第二天，細(xì)胞用Ad-mda-7或Ad-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)，劑量為每個細(xì)胞1000vp。48小時后，洗滌細(xì)胞并用Reporter裂解試劑盒裂解，分析熒光素酶的活性。6.臺盼藍(lán)染色細(xì)胞的存活率用臺盼藍(lán)排出試驗進行檢測。腺病毒載體處理的腫瘤細(xì)胞用胰酶消化后，取一部分與0.1％的臺盼藍(lán)以1∶1的比例混合。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)總細(xì)胞樹和存活細(xì)胞數(shù)。7.FACS分析和AnnexinV試驗利用抗體通過FACS分析細(xì)胞表面標(biāo)記物如上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的變化及凋亡發(fā)生的情況，AnnexinV分析試劑盒的使用方法見以前的描述(Mhashilkar等，2001)。8.細(xì)胞-細(xì)胞粘附試驗載體處理后24小時用胰酶消化細(xì)胞，通過不斷地吹打混合制備單細(xì)胞懸液(單細(xì)胞的比例＞98％，t＝0時)。室溫下將細(xì)胞轉(zhuǎn)到含PBS/1％FBS的eppendorf管中，濃度為106細(xì)胞/ml。每2小時取一部分細(xì)胞分析處于懸浮狀態(tài)的單個活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(細(xì)胞團不計在內(nèi))。9.免疫熒光分析在帶槽的波片(Nunc)上生長的細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)染，48小時后分析MDA-7蛋白的表達水平和/或β-聯(lián)蛋白和PI3K通路中不同蛋白表達的變化。細(xì)胞用乙醇∶乙酸混合物(9.5∶0.5)固定，然后用一抗在4℃處理1小時。細(xì)胞用PBS洗滌并用二抗標(biāo)記。然后在Nikon熒光顯微鏡下觀察波片，并用Nikon數(shù)碼相機拍照(DXM1200System)。10.細(xì)胞遷移試驗以每孔5×105個細(xì)胞的量將腫瘤細(xì)胞(A549)接種到6孔組織培養(yǎng)板中。第二天，細(xì)胞用Ad-mda-7或Ad-Luc轉(zhuǎn)染，MOI為3000個病毒顆粒(vp)/細(xì)胞，轉(zhuǎn)染持續(xù)4小時。轉(zhuǎn)染完成后給細(xì)胞補充完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24小時收獲細(xì)胞用于遷移試驗。簡言之，將細(xì)胞沉降多支管(cellsedimentationmanifold)(CreativeScientificMethods，Mesa，AZ)置于Teflon包被的波片上。移去細(xì)胞沉降多支管后加上含10％FBS的新鮮RPMI-1640。用連接到倒置顯微鏡上的Nikon數(shù)碼相機拍攝每孔中粘附細(xì)胞所占的環(huán)形面積。11.統(tǒng)計學(xué)分析本試驗的結(jié)果是否具有統(tǒng)計學(xué)意義用斯氏t-檢驗進行計算。與未處理的細(xì)胞或Ad-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-453)內(nèi)MDA-7蛋白的表達水平明顯升高，而β-聯(lián)蛋白蛋白的穩(wěn)態(tài)水平只有輕微的下降(圖11A)。其他的乳腺癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系也得到了相似的結(jié)果。免疫熒光試驗表明Ad-mda-7-轉(zhuǎn)導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞(H1299)胞漿內(nèi)有明顯的MDA-7染色，而正常的HUVEC細(xì)胞內(nèi)MDA-7只有典型的點狀染色(圖11B)。Ad-mda-7可誘導(dǎo)H1299腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是卻不能誘導(dǎo)正常細(xì)胞的凋亡(圖11C)。Ad-mda-7還可以強烈地誘導(dǎo)所檢測的所有肺癌細(xì)胞(n＝5)和乳腺癌細(xì)胞(n＝6)的凋亡(Jiang等，1996；Mhashilkar等，2001；Saeki等，2000；Patae等，2002)。實施例11轉(zhuǎn)染Ad-Mda-7后β-聯(lián)蛋白的亞細(xì)胞定位和分布本試驗分析了轉(zhuǎn)染Ad-Mda-7后β-聯(lián)蛋白的亞細(xì)胞定位和分布。與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞一樣，未處理的細(xì)胞或Ad-Luc處理的乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-453、MCF-7和SkBr3)內(nèi)出現(xiàn)典型的胞漿和核β-聯(lián)蛋白染色(圖12A)。但是，Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞一般不出現(xiàn)核染色，β-聯(lián)蛋白位于MDA-7表達細(xì)胞的漿膜上。胞漿/核β-聯(lián)蛋白向漿膜的從新分布見于NSCLC細(xì)胞(H1299)。需要注意的是選擇適當(dāng)?shù)妮d體劑量和試驗時間可使誘導(dǎo)的凋亡程度降到最低；通過臺盼藍(lán)排出試驗發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中有75％是活的。為了確定β-聯(lián)蛋白的這種從新分布是否能使細(xì)胞進入凋亡的早期階段，用處理乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞，Ad-p53對這些細(xì)胞系來說是一種強凋亡誘導(dǎo)因子。在MDA-MB-453細(xì)胞內(nèi)，β-聯(lián)蛋白的亞細(xì)胞分布與Ad-p53、Ad-Luc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及未處理的細(xì)胞一致，而只有經(jīng)Ad-mda-7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)觀察到β-聯(lián)蛋白的從新分布(圖12B)，這說明β-聯(lián)蛋白的從新分布不單單是凋亡信號的結(jié)果。同樣的結(jié)果也見于H1299肺癌細(xì)胞。以前的研究已經(jīng)證明Ad-mda-7誘導(dǎo)凋亡具有腫瘤選擇性。因此，正常的人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)用于分析Ad-mda-7對β-聯(lián)蛋白從新分布的影響。用Ad-mda-7、Ad-p53和Ad-Luc處理的HUVECs與未處理的細(xì)胞一樣具有相似的核/胞漿彌散β-聯(lián)蛋白分布模式(圖12B)。因此，β-聯(lián)蛋白從核內(nèi)的排出應(yīng)該是MDA-7過量表達特異性的，并且只出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)。利用TopFlash/FopFlash系統(tǒng)分析β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的反式激活的功能活性，以此來評價β-聯(lián)蛋白從新分布所造成的影響。該系統(tǒng)利用TCF/LEF啟動子控制熒光素酶的表達。對于H1299NSCLC細(xì)胞來說，與作為對照的Ad-GFP構(gòu)建體相比，Ad-mda-7的轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著抑制TopFlash試驗中的熒光素酶活性(p＝0.001)。而在FopFlash試驗中(其中質(zhì)粒攜帶突變型TCF/LEF啟動子，因此不依賴于β-聯(lián)蛋白)，沒有發(fā)現(xiàn)對熒光素酶的影響(圖12C)。在MDA-MB-453細(xì)胞內(nèi)也觀察到了相似的對β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的熒光素酶活性的抑制。實施例12AD-MDA-7上調(diào)上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達、抑制細(xì)胞的遷移、促進細(xì)胞的粘附上皮細(xì)胞鈣粘蛋白代表了一個膜受體家族，該家族介導(dǎo)鈣依賴性的同型細(xì)胞-細(xì)胞的粘附作用。在腫瘤發(fā)展過程中如果鈣粘蛋白的表達缺失或功能喪失就會導(dǎo)致細(xì)胞的遷移和增殖失控(Ivanov等，2001)。利用實施例10描述的材料和方法用抗上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的單克隆抗體進行表面染色可以發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞經(jīng)Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)后其上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的表達水平顯著上升(p＝0.001)(圖13A)。上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達水平上調(diào)的功能意義還可以通過監(jiān)測細(xì)胞的遷移和細(xì)胞-細(xì)胞的粘附作用來作進一步評價。細(xì)胞經(jīng)Ad-mda-7或?qū)φ盏腁d-Luc處理后進行單層細(xì)胞遷移試驗。與Ad-Luc處理的細(xì)胞相比，Ad-mda-7可顯著降低細(xì)胞的遷移能力(圖13B)。檢測分散的單個細(xì)胞之間的同型細(xì)胞-細(xì)胞之間的粘附作用。與Ad-Luc或空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Ad-mda-7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)生聚集和同型粘附的比例要明顯提高。因此Ad-mda-7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中單細(xì)胞所占的比例下降(圖13C)。實施例13AD-MDA-7對APC、GSK-3B、PLC-Γ以及PI3K通路中其他促凋亡基因的調(diào)節(jié)APC和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)分子是β-聯(lián)蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)因子。Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)MDA-MB-453細(xì)胞(圖14A)和H1299細(xì)胞都可以上調(diào)腫瘤抑制蛋白APC和GSK-3β的表達。用Ad-mda-7轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分析PI3K通路中各種原癌基因的表達情況。原癌基因如PI3K、FAK、ILK-1和PLC-γ可被Ad-mda-7明顯抑制，但是在Ad-Luc處理的H1299細(xì)胞內(nèi)沒有變化(圖14B)。H1299肺癌細(xì)胞用于評價pFAK的調(diào)節(jié)(圖14C(i))。Ad-mda-7可以明顯下調(diào)H1299和A549NSCLC細(xì)胞內(nèi)pFAK和PI3K的表達。PI3K抑制劑LY294002作為陽性對照。Ad-mda-7對H1299細(xì)胞內(nèi)的pFAK的抑制能力比LY294002強(比較圖14C(i)的條帶3和條帶4)。Ad-mda-7處理的乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞內(nèi)Akt和pAkt的表達水平也下降。Ad-mda-7可明顯上調(diào)腫瘤抑制因子PTEN的表達，PTEN是PI3K信號通路中的中樞負(fù)調(diào)節(jié)因子(圖14C(ii))。實施例14AD-MDA-7感染的前列腺癌細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)MDA-7的表達材料和方法1.細(xì)胞系和細(xì)胞的培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞系DU145、LNCaP和PC-3得自美國典型培養(yǎng)物收集中心(Manassas，VA)。正常的前列腺上皮細(xì)胞系PrEC得自Clonetics(SanDiego，CA)，DU145、LNCaP和PC-3細(xì)胞用含10％胎牛血清、抗生素和L-谷氨酰胺(GIBCO/BRL)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。PrEC用PrEBM培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照廠家的說明書添加一些成分。2.重組腺病毒載體的構(gòu)建攜帶mda-7基因的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)載體按照如下過程構(gòu)建。mda-7基因連接上內(nèi)部CMV-IE啟動子，后面連接上SV40多聚腺苷酸尾巴[poly(A)]。Ad-Luc(熒光素酶)用作對照載體。簡言之，攜帶基因表達盒的Ad5載體與質(zhì)粒pJM17共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞以獲得重組病毒Ad-mda7和AdLuc。挑取噬菌斑獲得病毒顆粒，用PCR/限制性酶切分析和DNA序列測定確定基因組序列的正確性。在293細(xì)胞內(nèi)繁殖病毒并通過色譜純化。3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)利用編碼綠色熒光蛋白的Ad載體(Ad-GFP)進行的預(yù)試驗表明MOI為3000的腺病毒可使93.4％以上的DU145和PC-3細(xì)胞，76.2％以上的LNCaP細(xì)胞及82％以上的PrEC細(xì)胞感染。因此，MOI為3000的Ad-mda-7和Ad-Luc用于隨后的試驗。細(xì)胞接種到10-cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種5-10×105個細(xì)胞，用于蛋白表達的分析或者通過FACS分析細(xì)胞周期。細(xì)胞在接種后24小時用Ad載體感染。4.細(xì)胞增殖試驗所有細(xì)胞系都接種到6孔組織培養(yǎng)板中，接種密度為每孔1×105個細(xì)胞。然后用Ad-mda-7或Ad-Luc感染腫瘤細(xì)胞，或者以PBS為空白對照處理腫瘤細(xì)胞。每個處理組的細(xì)胞都接種3個復(fù)孔，培養(yǎng)5天。在預(yù)定的時間點上用胰酶消化并收獲細(xì)胞，然后用0.4％的臺盼藍(lán)(GIBCOBRL，GrandIsland，NY，USA)染色以顯示死細(xì)胞。用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)活細(xì)胞。5.凋亡細(xì)胞染色細(xì)胞接種到6孔組織培養(yǎng)板中，接種密度為每孔1×105個細(xì)胞，然后用Ad-mda-7或Ad-Luc感染。感染后72小時細(xì)胞通過Hoechst33258染色(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO，USA)分析凋亡情況。根據(jù)凋亡小體和/或染色體凝集情況確定凋亡細(xì)胞。6.細(xì)胞周期分析細(xì)胞接種到10cm的培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿接種5-10×105個細(xì)胞)，然后用Ad-mda-7和Ad-Luc感染，或者用PBS處理。在轉(zhuǎn)染后的特定時間點上，用胰酶消化后收獲細(xì)胞，用冰冷的PBS洗滌兩次，70％的乙醇固定，儲存在-20℃。細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌兩次后用RNA酶處理(37C處理30分鐘，500單位/ml；SigmaChemicalCo.)，DNA用PI染色(50g/ml；BoehringerMannheim，Indianapolis，IN，USA)。細(xì)胞所處的周期及凋亡的比例(處于亞-G0/G1期的細(xì)胞)利用FACScan(EPICSXL-MCL；BeckmanCoulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA，USA)檢測。7.有絲分裂指數(shù)Ad-mda-7感染后72小時收獲細(xì)胞并用細(xì)胞周期分析中的方法固定。固定后細(xì)胞用碘化丙錠染色，RNA酶處理，然后用熒光顯微鏡分析。每個樣品至少在熒光顯微鏡下隨機計數(shù)500個細(xì)胞，缺少核膜及染色體出現(xiàn)凝集的細(xì)胞被鑒定為發(fā)生有絲分裂的細(xì)胞。8.免疫印跡分析細(xì)胞用Ad-mda-7和Ad-Luc感染，或者用PBS處理。在37℃孵育細(xì)胞以指定的時間，然后收集細(xì)胞制備全細(xì)胞裂解物。制備方法為用含蛋白酶抑制劑(Roche，Germany)的1×SDS樣品緩沖液(62.5mMTris-HCL、2％SDS、10％甘油、50mM二硫蘇糖醇(dithiothereitol)、4mM尿素、0.01％溴酚藍(lán))裂解細(xì)胞。蛋白樣品在95℃的水浴中加熱5分鐘。12000rpm離心10分鐘后從上清液中收集蛋白樣品，利用BCA反應(yīng)(PierceChemicalCo.，Rockford，IL，USA)定量檢測蛋白含量。50g蛋白質(zhì)通過10％SDS-PAGE(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)分開，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Hybond-ECL；AmershamBiosciences，Inc.，Piscataway，NJ，USA)。用溶于PBS-Tween20(0.1％)中的5％乳液在室溫下封閉1小時，在4℃條件下以適當(dāng)稀釋度的一抗雜交過夜。然后用PBS-Tween20洗滌兩次，每次15分鐘，再與辣根過氧化物酶連接的二抗(AmershamBiosciences，Inc.)在室溫下共孵育1小時，二抗用5％milk/PBS-Tween20稀釋，稀釋度為1∶2000。用PBS-Tween20洗滌兩次，每次15分鐘，然后用ECLWestern印跡檢測試劑(AmershamBiosciences，Inc.)檢測增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)膠片(Hyperfilm；AmershamBiosciences，Inc.)以確定蛋白的量。另外，為了分析磷酸化的蛋白質(zhì)，用Tris緩沖鹽代替PBS。雜交膜用抗β-肌動蛋白抗體(SigmaChemicalCo.)探測。如圖所示，為了確保上樣量一致，轉(zhuǎn)移的蛋白量一致，重組MDA-7蛋白用于制備兔多克隆抗體，在用親和層析進一步純化。這個抗體所用的稀釋度為1∶5000(用1mg/ml的儲存液稀釋)；胱冬酶9(1∶500，兔多克隆抗體)，胱冬酶3(1∶500，兔多克隆抗體)，PARP(1∶250，鼠單克隆抗體)(Pharmingen，SanDiego，DA，USA)；β-肌動蛋白(1∶5000，鼠單克隆抗體)(SigmaChemicalCo.)；磷酸化-JNK(1∶1000，兔多克隆抗體)；NFkB(1∶500，兔多克隆抗體)，磷酸化-STAT3(1∶500，鼠單克隆抗體)(SantaCruzBiotechnology)；PKR，磷酸化-Tyk2，磷酸化-STAT1，Cdc25C(1∶1000，兔多克隆抗體)(CellSignalingTechnology，Inc.)；cyclinB1(1∶200，鼠單克隆抗體；LabVisionCorp.，F(xiàn)remont，CA，USA)；磷酸化-Jak1(1∶500，羊多克隆抗體)，p27Kip1(1∶500，兔多克隆抗體)，Chk1(1∶1000，鼠單克隆抗體)，Cdc2(1∶500，鼠單克隆抗體)(SantaCruzBiotechnology)；Chk2(1∶1500，兔多克隆抗體)，(NovusBiologicals，Littleton，Co，USA)；p21WAF1(OncogeneResearchProducts，Boston，MA)；周期蛋白A(1∶2000，鼠單克隆抗體)(SigmaChemicalCo.)；周期蛋白E(1∶1000，鼠單克隆抗體)(BDTransductionLaboratories)。為了檢測細(xì)胞內(nèi)MDA-7蛋白的表達，DU145、LNCaP和PC-3細(xì)胞接種到6孔組織培養(yǎng)板中(每孔1×105個細(xì)胞)，然后用編碼MDA-7的腺病毒載體(Ad-mda-7)或編碼熒光素酶的腺病毒載體(Ad-Luc)感染。用磷酸鹽緩沖液(PBS)處理的空白轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時，所有細(xì)胞的總裂解物用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分開，分析轉(zhuǎn)染Ad-mda-7的細(xì)胞內(nèi)MDA-7蛋白的表達情況(圖16)。轉(zhuǎn)染后24到72小時Mda-7在所有細(xì)胞內(nèi)成功誘導(dǎo)和表達。PrEC細(xì)胞也得到相似的結(jié)果。實施例15MDA-7的過量表達可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖DU145、LNCaP、PC-3和PrEC細(xì)胞接種到6孔組織培養(yǎng)板中(每孔1×105個細(xì)胞)，按照實施例13描述的方法感染。感染1-5天內(nèi)每天計數(shù)活細(xì)胞。與Ad-Luc感染的對照細(xì)胞或PBS處理的細(xì)胞相比，DU145和LNCaP細(xì)胞在Ad-mda-7感染后第四天出現(xiàn)明顯的增殖抑制(p＜0.01)。感染Ad-Luc或Ad-mda-7的PC-3和PrEC細(xì)胞沒有觀察到明顯的增殖抑制(圖17)。實施例16MDA-7的過量表達可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡用Ad-mda-7感染后，通過FACScan和Hoechst33258染色分析DU145、LNCaP、PC-3和PrEC細(xì)胞的凋亡變化。Ad-mda-7感染后72小時，利用熒光激活細(xì)胞分類儀(FACS)分析，結(jié)果表明三株腫瘤細(xì)胞中處于亞G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多，這是出現(xiàn)凋亡變化的標(biāo)志。但是，感染Ad-Luc的細(xì)胞或PBS處理的細(xì)胞沒有觀察到上述變化。同樣，轉(zhuǎn)染Ad-mda-7或Ad-Luc的正常細(xì)胞中處于亞G0/G1期的細(xì)胞數(shù)也沒有出現(xiàn)明顯的變化(圖18A)。為了進一步確證這種結(jié)果，在感染后72小時進行Hoechst33258染色。Ad-mda-7感染后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而正常細(xì)胞沒有出現(xiàn)。感染Ad-Luc的所有細(xì)胞都沒有出現(xiàn)變化(圖18B)。實施例17MDA-7的過量表達可誘導(dǎo)G2期停滯為了確定MDA-7是否如以前所報道的人肺癌細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系和黑色素瘤細(xì)胞系試驗(Saeki等，2000)一樣能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期停滯，利用實施例13所描述的FACScan分析細(xì)胞周期。用碘化丙錠(PI)染色的細(xì)胞周期試驗結(jié)果表明，與Ad-Luc感染的對照細(xì)胞或PBS處理的細(xì)胞相比，用Ad-mda-7感染后72小時，DU145、LNCaP、PC-3細(xì)胞中處于G2/M期的細(xì)胞百分率明顯增加(圖19)。但是，與腫瘤細(xì)胞相比，PrEC細(xì)胞出現(xiàn)的G2/M期抑制的很弱。這說明MDA-7可選擇性地影響腫瘤細(xì)胞。為了確定MDA-7是否可以誘導(dǎo)G2期停滯或M期停滯，測定DU145、LNCaP、PC-3和PrEc細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)(圖19)。結(jié)果表明Ad-mda-7可誘導(dǎo)G2-期停滯，但不能誘導(dǎo)M期停滯。實施例18MDA-7對前列腺癌細(xì)胞的抑制功能為了確定Ad-mda-7是否可以誘導(dǎo)凋亡，如實施例13所描述的那樣檢測DU145和LNCaP細(xì)胞內(nèi)胱冬酶的活化。結(jié)果表明DU145和LNCaP細(xì)胞經(jīng)Ad-mda-7轉(zhuǎn)染后72小時胱冬酶級聯(lián)被活化，其中包括胱冬酶9、胱冬酶3和多聚(ADP-核糖)多聚酶(PARP)的裂解。這些結(jié)果說明MDA-7可通過前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的胱冬酶級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡。另外，利用Western印跡分析DU145和LNCaP細(xì)胞內(nèi)MDA-7的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能以確定MDA-7是如何誘導(dǎo)生長抑制和凋亡的(圖20A和20B)。下游信號靶位Stat1、Stat3、JNK和NFkB出現(xiàn)磷酸化或被抑制。MDA-7誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞內(nèi)磷酸化Jak1的增加、DU145細(xì)胞內(nèi)磷酸化Tyk2的顯著增加以及DU145細(xì)胞內(nèi)磷酸化Jak1的輕微下降。Ad-mda-7可引起兩株細(xì)胞內(nèi)Stat1的磷酸化水平升高，而Stat3的磷酸化水平下降或保持不變。Ad-mda-7可顯著誘導(dǎo)兩株細(xì)胞內(nèi)JNK的磷酸化，而DU145細(xì)胞內(nèi)的NFkB下降。這些結(jié)果說明Ad-mda-7可調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。實施例19與CDC25C表達下調(diào)相關(guān)的G2期停滯為了研究Ad-mda-7有效誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生G2期停滯的機制，通過實施例13所描述的Western印跡分析與G1/S期轉(zhuǎn)換點和G2/M期轉(zhuǎn)換點有關(guān)的蛋白。在這個分析試驗中，DU145和LNCaP細(xì)胞用PBS處理，或者用Ad-mda-7或Ad-Luc感染。處理后72小時制備總細(xì)胞裂解物，進行FACS分析，蛋白濃度用SDS-PAGE檢測。與對照細(xì)胞相比(以未處理的細(xì)胞或感染Ad-Luc的細(xì)胞為對照)，Ad-mda-7感染的兩株細(xì)胞內(nèi)磷酸化和未磷酸化的Cdc25C都減少，Chk1、Chk2和細(xì)胞周期蛋白B1的表達下降(圖21A和21B)。另外，Ad-mda-7可明顯降低LNCaP細(xì)胞內(nèi)的Cdc2而不降低DU145細(xì)胞內(nèi)的Cdc2。而且，將Ad-mda-7加到兩株細(xì)胞內(nèi)可降低細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E的表達水平，這兩個蛋白與G1/S期轉(zhuǎn)換點和S期有關(guān)。LNCaP細(xì)胞內(nèi)與G1/S期轉(zhuǎn)換點和/或G2/M期轉(zhuǎn)換點有關(guān)的p27和p21表達升高，而DU145細(xì)胞內(nèi)的這兩個蛋白沒有變化。這說明Ad-mda-7通過促進p53的表達來增加p27和p21(圖21B)。這些結(jié)果表明可誘導(dǎo)與Cdc25C下調(diào)有關(guān)的G2期停滯，與以前所描述的細(xì)胞周期FACS分析結(jié)果一致。實施例20分泌型Mda-7抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化和遷移材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞A549(腺癌)和人胚胎腎細(xì)胞(293)得自美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC；Rockville，MD)，用添加10％胎牛血清(GIBCO-BRL，GrandIsland，NY)的Hams/F12培養(yǎng)基(A549)和DMEM(293)培養(yǎng)基培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人皮膚毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)購自Clonetics(Walkerville，MD)，用添加5％胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，再添加廠商提供的“彈頭試劑盒”內(nèi)的試劑。本試驗中所用的內(nèi)皮細(xì)胞是3-9代的細(xì)胞。2.分泌型MDA-7蛋白的制備和純化通過攜帶全長mda-7cDNA的真核表達載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞制備MDA-7蛋白。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在潮霉素(0.4μg/ml)中篩選14天。穩(wěn)定表達的細(xì)胞系(293-mda-7)通過Western印跡試驗和ELISA來檢測其產(chǎn)生可溶性MDA-7的情況。通過ELISA分析發(fā)現(xiàn)以每孔1×106細(xì)胞接種后24小時，293-mda-7細(xì)胞大約可產(chǎn)生30-50ng/mlsMDA-7。為了大規(guī)模純化MDA-7蛋白，使293-mda-7細(xì)胞在150mm組織培養(yǎng)板中生長到90％的細(xì)胞匯合。收集組織培養(yǎng)上清液，用以前所描述的親和層析方法純化蛋白(Blumberg等，2001)。sMDA-7蛋白的大小和純度通過銀染凝膠電泳和Western印跡分析確定。3.內(nèi)皮細(xì)胞分析內(nèi)皮細(xì)胞分化(微管形成)分析利用體外血管形成分析試劑盒(Chemicon，Temecula，CA)完成。簡言之，HUVEC和HMVEC細(xì)胞生長到80％匯合后，收集細(xì)胞，重懸到生長介質(zhì)中，然后以每孔2×104細(xì)胞的量接種到包被基質(zhì)膠的96孔板內(nèi)(Chemicon，Temecula，CA)。在孔內(nèi)加入不同濃度的MDA-7蛋白，37℃孵育24小時。以未加MDA-7蛋白的孔作為陰性對照。通過在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)微管的數(shù)目來確定sMDA-7抑制微管形成的能力。所有的樣品都設(shè)雙復(fù)孔。以MDA-7和內(nèi)皮抑制素(Calbiochem)作為對照試驗，細(xì)胞按照上述方法接種并用各種濃度的蛋白處理。微管形成分析前24小時，進行中和試驗的HUVEC細(xì)胞在6孔板內(nèi)用IL-22R中和抗體(5ng/ml)預(yù)處理。其他所有的試驗過程都與上面所描述的一樣。4.內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗用HUVEC細(xì)胞進行遷移試驗。細(xì)胞在含5％胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中饑餓過夜，然后收集細(xì)胞并重懸于同樣的培養(yǎng)基中，以每孔1×105個細(xì)胞的濃度接種到帶8μm濾膜(Millipore，Cambridge，MA)的24孔穿孔插入物(transwellinsert)的上表面。將插入物放到6孔板中，6孔板的孔中含有添加VEGF(100ng/ml)或VEGF+MDA-7(10ng/ml)的培養(yǎng)基。含穿孔的培養(yǎng)板在37℃孵育過夜使細(xì)胞遷移。在后面的時間中，拆開孔，膜用結(jié)晶紫固定，遷移到孔的下層的細(xì)胞在高倍顯微鏡(×40)下計數(shù)。5.Western印跡分析為了確定加入sMDA-7后pSTAT-3表達的變化，按照以前描述的方法進行Western印跡分析(Wang等，2002)。簡言之，胰酶消化后收集細(xì)胞，重懸到裂解緩沖液中(62.5mMTris-HCl、2％SDS、10％甘油、4M尿素)。每種蛋白樣品(50μg)都稀釋到20μl含5％2-巰基乙醇(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)的裂解緩沖液中，在95℃的水浴中加熱5分鐘。蛋白提取物通過在垂直板凝膠電泳儀(Bio-Rad)上進行10％SDS-PAGE而分開。分開的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Hybond-ECL；AmershamPharmaciaBiotech，Buckinghamshire，England)上，然后用封閉液(5％奶粉和0.3％Tween20，溶于PBS中)封閉1小時。膜與抗pSTAT-3的一抗(1∶1000)和抗β-肌動蛋白的一抗(1∶10000)共孵育，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Amersham)共孵育。最后，利用Amersham的增強型化學(xué)發(fā)光蛋白印跡檢測系統(tǒng)在增強型化學(xué)發(fā)光膠片(Hyperfilm，Amersham)上觀察蛋白。6.利用基質(zhì)膠PlusAssay分析體內(nèi)的血管形成為了確定sMDA-7的抗血管形成活性，進行體內(nèi)血管形成試驗。簡言之，sMDA-7和bFGF與500μl基質(zhì)膠(BecktonandDickenson)在冰上混合，然后注射到無胸腺裸鼠的皮下。注射只含bFGF(60ng)的基質(zhì)膠的動物作為陽性對照，注射不含生長因子的基質(zhì)膠的動物作為陰性對照。每組5只動物。試驗在第10天終止，收獲基質(zhì)膠，拍照后按照以前描述的方法進行血紅蛋白分析(Caudel等，2002)。7.體內(nèi)試驗在試驗開始前，將106親本293細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞注射到裸鼠皮下以觀察其在體內(nèi)形成腫瘤的能力，觀察期為1個月。以這種濃度的細(xì)胞接種沒有觀察到腫瘤形成。為了進行體內(nèi)混合試驗，人肺癌細(xì)胞(A549)生長到90％匯合時收集起來，重懸到無菌PBS中，濃度為5×106個細(xì)胞/毫升。這些腫瘤懸液與等量的親本293細(xì)胞或293-mda-7細(xì)胞(5×106個細(xì)胞/毫升)混合，溫和振蕩后注射到無胸腺的BALB/c雌裸鼠皮下(每只動物注射106個細(xì)胞)。每組含8只動物。如前所述監(jiān)測和測量腫瘤的生長情況(Maheshwari等，1991)。試驗結(jié)束時通過CO2吸入麻醉動物，取出腫瘤進行下一步的試驗。為了評價sMDA-7對遠(yuǎn)端腫瘤的影響，在裸鼠右下腹部皮下注射A549腫瘤細(xì)胞(5×106細(xì)胞)以建立皮下腫瘤。當(dāng)腫瘤長到50-60mm3時，將動物分成兩組(每組10只)。一組接受含親本293細(xì)胞(1×106)的基質(zhì)膠，一組接受293-mda-7細(xì)胞(1×106)。將含細(xì)胞的基質(zhì)膠皮下注射到荷瘤小鼠的右上腹部。按照上面描述的方法測量腫瘤，觀察sMDA-7對腫瘤生長的影響。在試驗結(jié)束時麻醉動物，取出腫瘤進行下一步的試驗。8.免疫組化分析按照以前描述的方法(Wang等，2002)將組織染色以檢測CD31和TUNEL。陰性對照是不用一抗染色或用同型抗體染色的組織切片。組織切片進行定量分析，用雙盲的方式解釋結(jié)果。9.統(tǒng)計學(xué)分析斯氏t-檢驗用于計算試驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義。實施例21分泌型MDA-7(SMDA-7)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化分泌型MDA-7(sMDA-7)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化。用HUVEC細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞評價sMDA-7抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力(圖22A)。加入sMDA-7蛋白可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)微管的形成。抑制效應(yīng)是劑量依賴性的，在10ng/ml時可完全抑制微管的形成(圖22A)。而未處理的細(xì)胞沒有出現(xiàn)對微管形成的抑制(圖22A)。去除試驗表明所觀察到的對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成的抑制是由于sMDA-7蛋白而不是制備物中不相關(guān)的蛋白。在與HUVEC細(xì)胞接觸前利用免疫方法使sMDA-7的活性喪失會導(dǎo)致對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成的抑制功能丟失(圖22B)。而且，相同濃度的sMDA-7對HUVEC細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞的抑制效應(yīng)是重組人血管他丁的25倍(圖22A)。sMDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成的這種抑制活性說明sMDA-7具有較高的抗血管形成活性。為了確定sMDA-7是否能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)存在的條件下進行遷移試驗。sMDA-7(10ng/ml)可阻斷血管形成誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，而在對照組中沒有觀察到抑制效應(yīng)(圖22C)。這種抑制作用是劑量依賴性的，濃度為50ng時達到最大抑制效應(yīng)。利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)作為誘導(dǎo)因子也可以觀察到相似的抑制活性。利用試驗來驗證sMDA-7對血管形成的抑制是否是通過IFN-γ和IP-10的產(chǎn)生來介導(dǎo)的。在不同時間點收集sMDA-7處理的HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測IFN-γ和IP-10的含量。IP-10而不是IFN-γ可被sMDA-7誘導(dǎo)。但是所產(chǎn)生的IP-10量(15-32pg/ml)沒有顯著增加，不足以解釋sMDA-7所產(chǎn)生的顯著抑制效應(yīng)。實施例22SMDA-7活化內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)STAT-3的表達sMDA-7與內(nèi)皮細(xì)胞接觸后所激發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制用實施例1所描述的材料和方法進行研究。利用Western印跡來分析HUVEC細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞內(nèi)STAT-3的活化(圖23A)。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入sMDA-7可使磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白表達顯著升高，最早在加入sMDA-74小時后就可以觀察到。pSTAT-3表達的增加是時間依賴性的，在處理后24小時達到最高值(圖23A)。經(jīng)sMDA-7處理后HUVEC細(xì)胞內(nèi)定位到細(xì)胞核內(nèi)的pSTAT-3蛋白增多，而未處理的細(xì)胞未出現(xiàn)這種變化也說明了sMDA-7對pSTAT-3的激活作用(圖23B)。實施例23MDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞分化成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)(微管形成)的抑制作用是由STAT-3的活化介導(dǎo)的，并且可通過阻斷IL-22R1部分恢復(fù)sMDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)是受體介導(dǎo)的。利用實施例19的材料和方法進行試驗以確定sMDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)是否是由受體介導(dǎo)的，試驗方法是在sMDA-7存在或不存在的情況下加入抗白細(xì)胞介素22的受體1(IL-22R1)的封閉抗體(圖24)。與對照組相比，經(jīng)sMDA-7(5ng)處理的HUVEC細(xì)胞微管形成能力被完全抑制(圖24)。但是，用IL-22R1封閉抗體預(yù)處理HUVEC細(xì)胞可完全消除MDA-7對微管形成的抑制效應(yīng)(圖24)。IL-22R1抗體的這種消除作用是劑量依賴性的。加入1ng封閉抗體(1∶5的比例)只能部分恢復(fù)細(xì)胞的微管形成能力(＜60％，圖24)，而加入5ng封閉抗體(1∶1的比例)就可以完全恢復(fù)HNVEC細(xì)胞的微管形成能力(＞90％，圖24)。加入中和性抗體對HUVEC細(xì)胞的微管形成能力沒有顯著影響(圖24)。為了進一步確定IL-22R1抗體的特異性，利用抗IL-10受體(IL-10R)的中和性抗體進行下一步的試驗。在存在IL-10R中和性抗體的情況下，未處理的對照組與sMDA-7處理組一樣可以抑制HUVEC細(xì)胞形成的微管(圖24)。這些結(jié)果說明sMDA-7通過IL-22R1介導(dǎo)對內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抑制效應(yīng)。半定量分析試驗表明與對照組相比，sMDA-7可顯著抑制sMDA-7/IL-24和IL-22R1抗體處理細(xì)胞所形成的微管數(shù)量(p＝0.001)(圖24)。HUVEC細(xì)胞內(nèi)pSTAT-3蛋白表達的活化也可以證明sMDA-7的抑制效應(yīng)是由受體介導(dǎo)的。加入sMDA-7后HUVEC細(xì)胞內(nèi)的磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白的表達明顯增高(圖24)。但是在存在IL-22R1抗體的情況下sMDA-7不能介導(dǎo)pSTAT-3表達的增高(圖24)。這些結(jié)果說明sMDA-7的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性是由IL-22R1介導(dǎo)的。實施例24包裹SMDA-7蛋白的基質(zhì)膠可抑制體內(nèi)的血管生成為了確定sMDA-7是否能在體內(nèi)抑制血管形成，按照實施例19所描述的方法進行基質(zhì)膠分析試驗。SMDA-7蛋白(10ng)包裹到含bFGF的基質(zhì)膠內(nèi)，然后植入小鼠的皮下。在植入后10天檢查基質(zhì)膠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，bFGF誘導(dǎo)的血管形成被sMDA-7所抑制(圖25A)?；|(zhì)膠內(nèi)血紅蛋白含量的測定結(jié)果表明與不含bFGF的、只含bFGF的以及含重組人內(nèi)皮抑制素的對照相比，sMDA-7可明顯抑制bFGF誘導(dǎo)的血管形成(p＝0.0001)(圖25B)。尤其令人吃驚的是，sMDA-7導(dǎo)致的血紅蛋白含量減少比無bFGF的對照組還要明顯。實施例25分泌MDA-7的293-MDA7細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)混合可抑制皮下的人肺癌異種移植物通過實施例19描述的體內(nèi)混合試驗檢測sMDA-7抑制腫瘤生長的能力。A549腫瘤細(xì)胞與親本293細(xì)胞或293-mda-7細(xì)胞混合(1∶1的比例)后注射到小鼠右下腹部的皮下。在可觸摸到腫瘤時開始測量腫瘤的大小。與注射A549細(xì)胞和親本293細(xì)胞混合物的動物相比，注射A549細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞混合物的動物體內(nèi)的腫瘤生長明顯受到抑制(p＝0.001)(圖26A)。裸鼠體內(nèi)單獨注射293細(xì)胞或293-mda-7細(xì)胞不能形成腫瘤。移植后22天處死動物，取出腫瘤進行下一步的試驗。Western印跡分析表明MDA-7蛋白在含A549腫瘤細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞混合物的腫瘤內(nèi)的表達水平與含A549腫瘤細(xì)胞和293細(xì)胞混合物的腫瘤內(nèi)的表達水平一樣(圖26B)。腫瘤組織的組織病理學(xué)檢測表明對照組和試驗組動物的腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)或腫瘤細(xì)胞的浸潤沒有顯著區(qū)別(圖26C)。但是，通過CD31染色發(fā)現(xiàn)含293-mda-7細(xì)胞的腫瘤血管化水平比含293細(xì)胞的對照腫瘤明顯減少(圖26C)。腫瘤血管化的降低與腫瘤內(nèi)血紅蛋白含量的下降成正相關(guān)關(guān)系，接受A549腫瘤細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞混合物的動物與接受A549腫瘤細(xì)胞和親本293細(xì)胞混合物的動物相比所收獲的腫瘤內(nèi)血紅蛋白的含量減少(圖26D)。試驗組動物腫瘤組織的TUNEL染色顯示內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞周圍的腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡，如棕色區(qū)域所顯示(圖26C)。而對照組的腫瘤組織沒有出現(xiàn)TUNEL陽性染色。實施例26包裹分泌MDA-7的293細(xì)胞的基質(zhì)膠可抑制皮下人肺癌移植物的生長如實施例19所描述，在小鼠右下腹部皮下接種A549細(xì)胞。當(dāng)腫瘤長到50mm3時，將產(chǎn)生sMDA-7的293細(xì)胞(293-mda-7)或親本293細(xì)胞(對照)包裹到基質(zhì)膠中，然后皮下植入到離腫瘤較遠(yuǎn)的位置(右上腹部)，監(jiān)測腫瘤的生長情況。與對照組相比，分泌MDA-7的293細(xì)胞可顯著抑制A549肺癌異種移植物的生長(p＝0.001)(圖27A)。與對照組相比，植入包裹的分泌MDA-7蛋白的293細(xì)胞可使腫瘤的生長抑制到50％。為了確定抑制效應(yīng)來自于sMDA-7，取動物的血清樣品通過Western印跡和ELISA檢測血清內(nèi)的MDA-7蛋白。通過Western印跡分析發(fā)現(xiàn)植入分泌MDA-7的293細(xì)胞的動物血清在40Kd處出現(xiàn)sMDA-7的致密條帶(圖27A)。而對照組只出現(xiàn)很淺的條帶，這些條帶可能是與血清蛋白的交叉反應(yīng)造成。通過ELISA檢測到sMDA-7的血清水平約為50ng/ml。在試驗結(jié)束時，收獲腫瘤和含293-mda-7細(xì)胞的基質(zhì)膠，然后進行染色。利用抗MDA-7的單克隆抗體對來源于接受293-mda-7細(xì)胞的動物的基質(zhì)膠進行免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有MDA-7蛋白的表達，這些區(qū)域呈棕色(圖27B)。而接受親本293細(xì)胞的動物來源的基質(zhì)膠中沒有檢測到MDA-7蛋白的表達(圖27B)。另外，通過CD31染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)293-mda-7處理的腫瘤與親本293細(xì)胞處理的腫瘤相比血管化程度降低(圖27B)。腫瘤組織的組織病理學(xué)檢測表明接受293細(xì)胞的動物與接受293-mda-7細(xì)胞的動物相比沒有明顯差異(圖27B)。實施例27AD-MDA7通過細(xì)胞內(nèi)的MDA-7蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性的生長停滯和凋亡為了確定MDA-7的亞細(xì)胞定位對其功能的影響，構(gòu)建能表達靶向性MDA-7蛋白的腺病毒載體。購自Invitrogen的靶向性腺病毒載體經(jīng)改造后可以使其表達的MDA-7定位到胞漿、線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)。每種載體都在表達的蛋白C末端添加一個myc尾巴。能將蛋白定位到胞漿的載體含有一個標(biāo)準(zhǔn)的表達骨架，能將蛋白定位到線粒體和ER的載體除了含有與胞漿載體一樣的骨架外，還含有與其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相適應(yīng)的信號序列。線粒體靶向性載體帶有一個N端線粒體靶向性信號，而ER靶向性載體帶有一個N端ER信號肽序列和一個C端固位序列。全長mda-7cDNA經(jīng)PCR刪除終止密碼子和作為分泌信號的前48位氨基酸編碼序列后亞克隆到這些載體內(nèi)。PCR還可用于提供與Invitrogen靶向性載體相匹配的限制性酶切位點，這些位點與載體內(nèi)的C端尾巴處于同一框架內(nèi)。上游PCR引物(含SalI位點)為ttttttGTCGACatggcccagggccaagaattcc(SEQIDNO3)，下游PCR引物(含NotI位點)為ttttttGCGGCCGCgagcttgtagaatttctgc(SEQIDNO4)。這些質(zhì)粒已被證明可以將MDA-7蛋白成功地定位到適當(dāng)?shù)膩喖?xì)胞結(jié)構(gòu)。用限制性內(nèi)切酶PmlI和XbaI從這些靶向性質(zhì)粒中切下mda-7基因及其信號序列，這兩個序列為腺病毒構(gòu)建體，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法將其亞克隆到腺病毒穿梭載體內(nèi)。MDA-7蛋白最初被認(rèn)為是核蛋白(Jiang等)。通過對預(yù)測的一級序列的分析發(fā)現(xiàn)MDA-7蛋白含有一個信號序列，這個信號序列可能負(fù)責(zé)蛋白的分泌。翻譯的蛋白產(chǎn)物表明其在N端有一個強疏水區(qū)(圖28)。據(jù)預(yù)測MDA-7蛋白可在48位氨基酸處裂解，含49-206位氨基酸的剩余蛋白產(chǎn)物可從細(xì)胞內(nèi)分泌出來。為了進一步分析分泌型MDA-7蛋白產(chǎn)物，利用HEK293細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達mda-7的細(xì)胞系。這些細(xì)胞的培養(yǎng)上清液在約40kD處有一條明顯的免疫應(yīng)答性MDA-7條帶(圖28)。將主要的分泌型MDA-7蛋白條帶測序，結(jié)果表明49位的氨基酸是胞外蛋白的第一個氨基酸。用Ad-mda7處理細(xì)胞可是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌MDA-7蛋白。Ad-mda7處理后，MDA-7從腫瘤細(xì)胞中釋放的動力學(xué)要稍遲于胞內(nèi)MDA-7表達的動力學(xué)。但是，腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)的釋放動力學(xué)稍有不同。腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時內(nèi)就可以分泌MDA-7蛋白，而正常細(xì)胞中MDA-7蛋白的釋放要緩慢一些。然而腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞所釋放的MDA-7的絕對水平是一樣的。已知Ad-mda7的存在可以活化應(yīng)激基因(圖29A)。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299用Ad-mda7或Ad-Luc(500vp/cell或1000vp/cell)，然后通過Western印跡分析應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達情況。圖29A顯示Ad-mda7可引起應(yīng)激蛋白BiP/GRP78、GADD34、PP2A和胱冬酶7的顯著增加。這些應(yīng)激蛋白參與哺乳動物應(yīng)激反應(yīng)的活化，被稱為解折疊蛋白效應(yīng)(UPR)。為了確證這一結(jié)果，進一步分析了UPR通路中的其他成員，包括胱冬酶7、12和XBP-1。如圖29B所示，這些UPR相關(guān)蛋白也可因Ad-mda7的轉(zhuǎn)導(dǎo)而上調(diào)，說明UPR是MDA-7殺傷腫瘤細(xì)胞的機制。另一種UPR活化的特征性蛋白PERK的表達也進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H1299細(xì)胞內(nèi)沒有檢測到PERK。以前的試驗表明PERK只表達于分泌型的細(xì)胞，如胰島β細(xì)胞。因此，NSCLC細(xì)胞內(nèi)缺乏PERK的表達是不奇怪的。免疫組化試驗表明Ad-mda7也可以阻斷鈣離子流、破壞線粒體的穩(wěn)定性(圖30)。分析試驗在Ad-mda7或Ad-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的H1299腫瘤細(xì)胞上進行。通過共聚焦顯微鏡觀察鈣離子流和線粒體的完整性。如圖30所示，Ad-mda7的轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起線粒體內(nèi)鈣離子濃度增加，從而破壞了線粒體的穩(wěn)定性。這種不穩(wěn)定性與幾種應(yīng)激蛋白的升高一起可以解釋為何存在Ad-mda7時會導(dǎo)致凋亡增加。實施例28MDA-7是高度糖基化的如圖28所示，分泌型MDA-7蛋白的分子量較高，這說明它是糖基化的，與以前所預(yù)測的MDA-7序列中存在3個N糖基化位點相一致。用不同的糖苷酶如糖肽酶F(glycoF)、唾液酸酶和內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)處理穩(wěn)定表達分泌型MDA-7蛋白的293-mda7細(xì)胞，如圖31B所示，用能裂解糖-蛋白質(zhì)鍵的glycoF消化分泌型蛋白可使MDA-7的分子量下降。用唾液酸酶和EndoH消化可得到同樣的結(jié)果，只是分子量下降的程度較小。這種結(jié)果可被各種組合的去糖苷酶試驗所證實(圖31B)。另外，試驗結(jié)果還表明分泌型MDA-7蛋白有各種形式的糖基化，因為未處理的樣品能出現(xiàn)多個條帶，而去糖基化的蛋白出現(xiàn)的條帶要少的多。實施例29分泌型MDA-7不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡由于糖基化的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)被加工的過程中通常需要糖，因此我們評價了糖基化及分泌抑制因子對MDA-7在胞內(nèi)的處理和分泌的影響。衣霉素可抑制蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)添加糖鏈，而布雷菲德菌素A可抑制蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運。二者都可阻斷蛋白的分泌。在這些糖基化及分泌抑制因子存在的條件下評價了Ad-mda7所引起的細(xì)胞毒性。不斷增加衣霉素和布雷菲德菌素A的水平直到MDA-7蛋白分泌的抑制可被檢測到。如圖26A和26B所示，用2μg/ml衣霉素處理H1299細(xì)胞就可以完全阻斷MDA-7蛋白的分泌，而1μg/ml以下的布雷菲德菌素A就可以達到這種效應(yīng)。值得注意的是用任何一種藥物阻斷分泌都可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA-7蛋白的積聚。但是用臺盼藍(lán)染色分析細(xì)胞毒性時卻發(fā)現(xiàn)糖基化抑制因子不會抑制Ad-mda7的細(xì)胞殺傷活性。雖然2μg/ml衣霉素不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但是Ad-mda7和2μg/ml衣霉素聯(lián)合使用時可導(dǎo)致細(xì)胞死亡的增加。這種死亡的增加可能是由于衣霉素可使細(xì)胞對凋亡敏感而造成的。值得注意的是Ad-Luc/衣霉素對照樣品與Ad-Luc和衣霉素處理樣品表現(xiàn)出相似的細(xì)胞毒性。因此，分泌型MDA-7蛋白不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，不是Ad-mda7介導(dǎo)的凋亡并最終殺傷腫瘤細(xì)胞所必須的(圖32B)。這個結(jié)果說明是胞內(nèi)MDA-7而不是分泌型MDA-7主要負(fù)責(zé)激發(fā)細(xì)胞死亡。這個假說可通過在腫瘤細(xì)胞內(nèi)加入分泌型MDA-7并檢測細(xì)胞死亡來進一步確證。初步試驗表明加入Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的上清液可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡；但是，仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的死亡是由培養(yǎng)上清液中殘存的Ad-mda7引起的。如果培養(yǎng)上清液經(jīng)處理后使Ad-mda7的污染降到最低，則含MDA-7的上清液所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是可以忽略的。將293細(xì)胞的上清液加到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中只觀測到很低水平的細(xì)胞死亡(約在背景水平之上10-15％)，這說明分泌型MDA-7至少在這些細(xì)胞所釋放的濃度上不足以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的實質(zhì)性死亡。同時給予抗MDA-7抗體可抑制MDA-7引起的細(xì)胞死亡，而對照的IgG沒有這種作用。當(dāng)抗MDA-7抗體加入到Ad-mda7感染培養(yǎng)物中，只觀察到很微弱的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，說明Ad-mda7處理培養(yǎng)物所產(chǎn)生的殺傷效應(yīng)主要來自胞內(nèi)蛋白。實施例30細(xì)胞混合旁觀者分析以前的研究發(fā)現(xiàn)Ad-mda7在H460細(xì)胞內(nèi)有很強的旁觀者效應(yīng)(Mhashilkar等，2001)。在這個試驗中，H460細(xì)胞用Ad-mda7轉(zhuǎn)染，然后用抗MDA-7抗體和AnnexinV進行免疫染色。在共聚焦顯微鏡下可觀察到有些細(xì)胞是AnnexinV陽性的，但是卻不表達MDA-7。AnnexinV陽性/MDA-7陰性細(xì)胞發(fā)生的幾率很低，在許多細(xì)胞系中都沒有觀察到。因此，為了進一步評價分泌型MDA-7對臨近細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響，進行了一系列的旁觀者試驗。Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與Ad-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然細(xì)胞混合，分析GFP陽性細(xì)胞的凋亡情況。發(fā)生凋亡的GFP陽性細(xì)胞很少。這些結(jié)果進一步說明分泌型MDA-7不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生如Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞那樣的高水平凋亡，還說明細(xì)胞-細(xì)胞的接觸不能增強旁觀者效應(yīng)。實施例31MDA-7的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)靶向性如果MDA-7的分泌不是Ad-mda7介導(dǎo)的凋亡所必須的，那么MDA-7的表達怎么導(dǎo)致細(xì)胞死亡呢？這個問題可以通過將MDA-7蛋白靶向性地定位到不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中并且分析對MDA-7介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響來回答。還有一個需要解答的問題是Ad-mda7感染細(xì)胞內(nèi)上述生理表達期間釋放到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的MDA-7是否負(fù)責(zé)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。為了了解MDA-7的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位對細(xì)胞存活能力的影響，構(gòu)建了能使其表達的MDA-7靶向性地定位到不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表達載體。在構(gòu)建這些載體的過程中，首先刪除了mda-7cDNA上的分泌信號序列。如圖33A所示，細(xì)胞核靶向性載體含有三個細(xì)胞核定位信號，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向性載體含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號序列和定位信號，細(xì)胞漿靶向性載體不含靶向性信號，蛋白質(zhì)默認(rèn)表達在細(xì)胞漿內(nèi)。全長質(zhì)粒使用細(xì)胞漿靶向性載體骨架但是含有全長的mda-7cDNA。這些質(zhì)粒表達的所有蛋白在其C端都含有一個myc尾巴。圖33B顯示每個載體都可以成功地促進細(xì)胞內(nèi)的MDA-7蛋白的表達，而只有包含N端分泌信號的全長mda-7cDNA可以使MDA-7蛋白分泌到培養(yǎng)基中。蛋白印跡試驗用于檢測H1299細(xì)胞的裂解物和上清液中MDA-7蛋白的表達，H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染了圖33A所示的各種mda-7構(gòu)建體。添加myc尾巴不會影響MDA-7蛋白的穩(wěn)定性，因為全長mda-7對照表達質(zhì)粒(無myc尾巴)可以表達相同水平的MDA-7蛋白。myc尾巴也不會干擾蛋白的處理或分泌，因為含myc尾巴的全長蛋白與全長質(zhì)?；駻d-mda7表達的全長MDA-7蛋白一樣出現(xiàn)兩條帶，這兩條帶中較大的一條是由于myc尾巴(圖33B)。含myc尾巴的MDA-7蛋白與全長MDA-7和Ad-mda7處理細(xì)胞來源天然MDA-7一樣是分泌型的并且是糖基化的。實施例32MDA-7的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位影響其細(xì)胞毒性將載體瞬時轉(zhuǎn)染到H1299細(xì)胞內(nèi)，然后利用免疫組化試驗確定蛋白表達的靶向性。如圖34所示，每個載體都可以成功地將表達的MDA-7靶向性定位到預(yù)定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)。全長質(zhì)粒所表達的MDA-7蛋白可見于細(xì)胞內(nèi)的分泌顆粒，與Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)后所觀察到的結(jié)果一致。通過與其他已知的定位于這些細(xì)胞器的分子的表達模式比較可以確定這些靶向性質(zhì)粒的精確亞細(xì)胞定位。例如，全長MDA-7顯示共同定位于分泌小泡內(nèi)。細(xì)胞核靶向性MDA-7與Hoescht共同定位，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向性MDA-7與BiP共同定位。分析靶向性MDA-7蛋白的抗腫瘤效應(yīng)以確定其對細(xì)胞存活能力的影響。這可以通過克隆形成試驗進行分析。如圖35所示，細(xì)胞核或細(xì)胞漿mda-7表達構(gòu)建體對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子克隆的形成都沒有影響。但是，全長的分泌型MDA-7蛋白和靶向性定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的MDA-7蛋白都可以導(dǎo)致形成的克隆減少，說明MDA-7在這些環(huán)境中具有致死性。如圖36所示利用試驗進一步分析Ad-mda7對細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。H1299細(xì)胞用mda-7靶向性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并用活細(xì)胞/死細(xì)胞試驗來檢測。靶向性定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的MDA-7蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，因為可以看到死細(xì)胞數(shù)量增加(紅色，溴乙啶染色)。對照蛋白、細(xì)胞漿靶向性MDA-7以及細(xì)胞核靶向性MDA-7蛋白的細(xì)胞殺傷活性很弱。另外，利用Hoescht染色來評價靶向性MDA-7表達的細(xì)胞毒效應(yīng)(圖37)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核活細(xì)胞漿表達的MDA-7對細(xì)胞核的形態(tài)沒有影響。但是，含分泌型或ER定位的MDA-7蛋白的細(xì)胞其細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)變化，顯示發(fā)生了凋亡。實施例33線粒體靶向性MDA-7的亞細(xì)胞定位PC3前列腺癌細(xì)胞分別用編碼GFP對照、全長MDA-7或線粒體靶向性MDA-7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，分析其克隆形成能力。與對照組相比，全長MDA-7可使形成的克隆減少35％，而線粒體靶向性MDA-7還可以使形成的克隆及PC細(xì)胞的存活能力進一步降低。因此，靶向性定位到線粒體的MDA-7還可以增強其抗腫瘤效應(yīng)和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)(圖38)。實施例34抑制AD-MDA7介導(dǎo)的NF-KB活化可在人肺癌細(xì)胞中產(chǎn)生協(xié)同治療效應(yīng)利用試驗來確定轉(zhuǎn)基因MDA-7的表達是否能導(dǎo)致NF-κB的活化，以及分析NF-κB在保護腫瘤細(xì)胞以免發(fā)生MDA-7誘導(dǎo)的凋亡中的作用。mda-7基因的腺病毒表達載體(Ad-mda7)轉(zhuǎn)染兩株NSCLC細(xì)胞系(H1299和A549)可導(dǎo)致NF-κB的活化，這可被電子流動性漂移試驗(EMSA)確定(圖39A)。用Ad-mda7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后20-36小時可以觀察到NF-κB的明顯活化，而用PBS處理的對照細(xì)胞或用Ad-luc(表達熒光素酶的載體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有觀察到NF-κB的活化(圖39A)。另外，NF-κB的活化是劑量依賴性的，增加Ad-mda7的濃度可使活化的NF-κB增多。NF-κB的活化與NF-κB抑制因子(I-κBα)的降解相一致。與Ad-luc轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞相比，用過量表達決定域負(fù)突變I-κB的腺病毒載體(Ad-mIkB)轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞可顯著抑制Ad-mda7誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄及其DNA結(jié)合活性，導(dǎo)致凋亡的腫瘤細(xì)胞增多(圖39B)。另外，利用非甾體抗炎藥舒林酸抑制MDA-7介導(dǎo)的NF-κB活化可產(chǎn)生協(xié)同治療效應(yīng)(圖40)。舒林酸而不是吲哚美辛可抑制NF-κB通路的活化。舒林酸可以劑量依賴的方式抑制TNF介導(dǎo)的NF-κB活化(圖41)。另外，Ad-mda7可與舒林酸協(xié)同誘導(dǎo)H1299細(xì)胞的凋亡(圖42)。利用舒林酸和Ad-mda7聯(lián)合治療可顯著增加處于亞G1期的細(xì)胞群(圖43)。這些結(jié)果說明MDA-7在肺癌細(xì)胞內(nèi)的表達可誘導(dǎo)NF-κB的活化，利用Ad-mIkB或舒林酸抑制其活化可增強治療效果(圖44)。實施例35AD-MDA-7可活化晚期腫瘤患者的免疫系統(tǒng)在正在進行的劑量升級I期臨床試驗中，利用非復(fù)制型腺病毒構(gòu)建體(Ad-mda7)將mda-7導(dǎo)入到晚期腺癌患者的腫瘤內(nèi)?；颊呓?jīng)組織學(xué)檢測確定是腺癌，至少有一個腫瘤可進行針頭注射，該腫瘤可通過手術(shù)切除，Karnofsky表現(xiàn)狀況≥70％，血液學(xué)指標(biāo)、腎功能及肝功能指標(biāo)都合適。存在活動的CNS轉(zhuǎn)移瘤的患者、長期使用免疫抑制劑的患者、或者已經(jīng)使用過腺病毒治療的患者都排除在本試驗之外。手術(shù)切除晚期腫瘤的患者在瘤內(nèi)單次注射2×1010到2×1012病毒顆粒(vp)(圖45)。到目前為止已經(jīng)完成了8個試驗(18個患者)。為了確定瘤內(nèi)注射MDA-7的治療效果，通過檢測血清細(xì)胞因子的濃度和淋巴細(xì)胞亞群的含量來分析對Ad-mda7的全身免疫應(yīng)答。大多數(shù)患者都出現(xiàn)全身細(xì)胞因子的瞬時升高(18個患者中有14個出現(xiàn)IL-6升高、15個出現(xiàn)IL-10升高、8個出現(xiàn)γIFN升高、10個出現(xiàn)TNFα升高)(圖46，圖47)。注射高劑量病毒的某些患者其瘤內(nèi)的IL-6、IFN和IL-10mRNA表達水平也有升高。另外，在mda-7處理后15天CD3+CD8+T細(xì)胞增加30+13％(圖48，圖49)。這些結(jié)果說明MDA-7可增加全身TH1細(xì)胞因子的產(chǎn)生、動員CD8+T細(xì)胞。圖46表明注射Ad-mda7后，循環(huán)中的IL-6、IFN-γ、IL-10和TNF-α顯著升高，然后在30天時回落到基線水平。細(xì)胞因子的升高與CD+T細(xì)胞的增多和CD4/CD8比例的反轉(zhuǎn)相一致。因此，這些結(jié)果表明Ad-mda7可活化免疫，并且與rhMDA-7在培養(yǎng)物中的原TH1活性相一致。實施例36分泌型Mda-7抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化和遷移材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞A549(腺癌)和人胚胎腎細(xì)胞(293)得自美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC；Rockville，MD)，用添加10％胎牛血清(GIBCO-BRL，GrandIsland，NY)的Hams/F12培養(yǎng)基(A549)和DMEM(293)培養(yǎng)基培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人皮膚毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)購自Clonetics(Walkerville，，MD)，用添加5％胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，再添加廠商提供的“彈頭試劑盒”內(nèi)的試劑。本試驗中所用的內(nèi)皮細(xì)胞是3-9代的細(xì)胞。2.分泌型MDA-7蛋白的制備和純化通過攜帶全長mda-7cDNA的真核表達載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞制備MDA-7蛋白。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在潮霉素(0.4μg/ml)中篩選14天。穩(wěn)定表達的細(xì)胞系(293-mda-7)通過Western印跡試驗和ELISA來檢測其產(chǎn)生可溶性MDA-7的情況。通過ELISA分析發(fā)現(xiàn)以每孔1×106細(xì)胞接種后24小時，293-mda-7細(xì)胞大約可產(chǎn)生30-50ng/mlsMDA-7。為了大規(guī)模純化MDA-7蛋白，使293-mda-7細(xì)胞在150mm組織培養(yǎng)板中生長到90％的細(xì)胞匯合。收集組織培養(yǎng)上清液，用以前所描述的親和層析方法純化蛋白(Blumberg等，2001)。sMDA-7蛋白的大小和純度通過銀染凝膠電泳和Western印跡分析確定。3.內(nèi)皮細(xì)胞分析內(nèi)皮細(xì)胞分化(微管形成)分析利用體外血管形成分析試劑盒(Chemicon，Temecula，CA)完成。簡言之，HUVEC和HMVEC細(xì)胞生長到80％匯合后，收集細(xì)胞，重懸到生長介質(zhì)中，然后以每孔2×104細(xì)胞的量接種到包被基質(zhì)膠的96孔板內(nèi)(Chemicon，Temecula，CA)。在孔內(nèi)加入不同濃度的MDA-7蛋白，37℃孵育24小時。以未加MDA-7蛋白的孔作為陰性對照。通過在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)微管的數(shù)目來確定sMDA-7抑制微管形成的能力。所有的樣品都設(shè)雙復(fù)孔。以MDA-7和內(nèi)皮抑制素(Calbiochem)作為對照試驗，細(xì)胞按照上述方法接種并用各種濃度的蛋白處理。微管形成分析前24小時，進行中和試驗的HUVEC細(xì)胞在6孔板內(nèi)用IL-22R中和抗體(5ng/ml)預(yù)處理。其他所有的試驗過程都與上面所描述的一樣。4.內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗用HUVEC細(xì)胞進行遷移試驗。細(xì)胞在含5％胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中饑餓過夜，然后收集細(xì)胞并重懸于同樣的培養(yǎng)基中，以每孔1×105個細(xì)胞的濃度接種到帶8μm濾膜(Millipore，Cambridge，MA)的24孔穿孔插入物的上表面。將插入物放到6孔板中，6孔板的孔中含有添加VEGF(100ng/ml)或VEGF+MDA-7(10ng/ml)的培養(yǎng)基。含穿孔(transwell)的培養(yǎng)板在37℃孵育過夜使細(xì)胞遷移。在后面的時間中，拆開孔，膜用結(jié)晶紫固定，遷移到孔的下層的細(xì)胞在高倍顯微鏡(×40)下計數(shù)。5.檢測產(chǎn)生的IP-10和IFN-γHUVEC細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)(每孔1×106個細(xì)胞)并用sMDA-7(10ng/ml)處理。在處理后6、24和48小時分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1200rpm理性，然后用購買的ELISA試劑盒分析其中的IP-10和IFN-γ蛋白。試驗按照廠商(R&DSystems，Minneapolis，MN)的說明書進行。以重組IFN-γ處理的細(xì)胞作為IP-10的陽性對照，以Ad-mda7(3000vp/cell)處理的細(xì)胞作為IFN-γ的陽性對照，未處理的細(xì)胞作為本試驗的陰性對照。樣品設(shè)四復(fù)孔，對于每個濃度的sMDA-7來說，數(shù)據(jù)為四復(fù)孔的平均值。6.Western印跡分析為了確定加入sMDA-7后pSTAT-3表達的變化，按照以前描述的方法進行Western印跡分析(Wang等，2002)。簡言之，胰酶消化后收集細(xì)胞，重懸到裂解緩沖液中(62.5mMTris-HCl、2％SDS、10％甘油、4M尿素)。每種蛋白樣品(50μg)都稀釋到20μl含5％2-巰基乙醇(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)的裂解緩沖液中，在95℃的水浴中加熱5分鐘。蛋白提取物通過在垂直板凝膠電泳儀(Bio-Rad)上進行10％SDS-PAGE而分開。分開的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Hybond-ECL；AmershamPharmaciaBiotech，Buckinghamshire，England)上，然后用封閉液(5％奶粉和0.3％Tween20，溶于PBS中)封閉1小時。膜與抗pSTAT-3的一抗(1∶1000)和抗β-肌動蛋白的一抗(1∶10000)共孵育，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Amersham)共孵育。最后，利用Amersham的增強型化學(xué)發(fā)光蛋白印跡檢測系統(tǒng)在增強型化學(xué)發(fā)光膠片(Hyperfilm，Amersham)上觀察蛋白。7.免疫熒光分析利用免疫熒光分析試驗檢測STAT-3的活化。HUVEC接種到雙孔波片上，每孔1×104個細(xì)胞，然后用sMDA-7(10ng/ml)處理4小時，PBS洗滌，與冷乙酸混合，然后用圖抗人pSTAT-3抗體(1∶1000，CellSignalingTechnology，Beverly，MA)和羅丹明標(biāo)記的抗兔二抗(1∶5000；MolecularProbes，Eugene，OR)染色以檢測磷酸化的STAT-3(pSTAT-3)。波片用抗褪色的計數(shù)試劑(VectorLaboratories)計數(shù)。染色后1-2小時用熒光顯微鏡拍照。8.利用基質(zhì)膠和測定法分析體內(nèi)的血管形成為了確定sMDA-7的抗血管形成活性，進行體內(nèi)血管形成試驗。簡言之，sMDA-7和bFGF與500μl基質(zhì)膠(BecktonandDickenson)在冰上混合，然后注射到無胸腺裸鼠的皮下。注射只含bFGF(60ng)的基質(zhì)膠的動物作為陽性對照，注射不含生長因子的基質(zhì)膠的動物作為陰性對照。每組5只動物。試驗在第10天終止，收獲基質(zhì)膠，拍照后按照以前描述的方法進行血紅蛋白分析(Caudel等，2002)9.體內(nèi)試驗在試驗開始前，將106親本293細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞注射到裸鼠皮下以觀察其在體內(nèi)形成腫瘤的能力，觀察期為1個月。以這種濃度的細(xì)胞接種沒有觀察到腫瘤形成。為了進行體內(nèi)混合試驗，人肺癌細(xì)胞(A549)生長到90％匯合時收集起來，重懸到無菌PBS中，濃度為5×106個細(xì)胞/毫升。這些腫瘤懸液與等量的親本293細(xì)胞或293-mda-7細(xì)胞(5×106個細(xì)胞/毫升)混合，溫和振蕩后注射到無胸腺的BALB/c雌裸鼠皮下(每只動物注射106個細(xì)胞)。每組含8只動物。如前所述監(jiān)測和測量腫瘤的生長情況(Maheshwari等，1991)。試驗結(jié)束時通過CO2吸入麻醉動物，取出腫瘤進行下一步的試驗。為了評價sMDA-7對遠(yuǎn)端腫瘤的影響，在裸鼠右下腹部皮下注射A549腫瘤細(xì)胞(5×106細(xì)胞)以建立皮下腫瘤。當(dāng)腫瘤長到50-60mm3時，將動物分成兩組(每組10只)。一組接受含親本293細(xì)胞(1×106)的基質(zhì)膠，一組接受293-mda-7細(xì)胞(1×106)。將含細(xì)胞的基質(zhì)膠皮下注射到荷瘤小鼠的右上腹部。按照上面描述的方法測量腫瘤，觀察sMDA-7對腫瘤生長的影響。在試驗結(jié)束時麻醉動物，取出腫瘤進行下一步的試驗。10.免疫組化分析按照以前描述的方法(Wang等，2002)將組織染色以檢測CD31和TUNEL。陰性對照是不用一抗染色或用同型抗體染色的組織切片。組織切片進行定量分析，用雙盲的方式解釋結(jié)果。11.統(tǒng)計學(xué)分析斯氏t-檢驗用于計算試驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義。實施例37分泌型MDA-7(SMDA-7)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化分泌型MDA-7(sMDA-7)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化。用HUVEC細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞評價sMDA-7抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力(圖22A)。加入sMDA-7蛋白可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管的形成。抑制效應(yīng)是劑量依賴性的，在10ng/ml時可完全抑制微管的形成(圖22A)。而未處理的細(xì)胞沒有出現(xiàn)對微管形成的抑制(圖22A)。去除試驗表明所觀察到的對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成的抑制是由于sMDA-7蛋白而不是制備物中不相關(guān)的蛋白。在與HUVEC細(xì)胞接觸前利用免疫方法使sMDA-7的活性喪失會導(dǎo)致對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成的抑制功能丟失(圖22B)。而且，相同濃度的sMDA-7對HUVEC細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞的抑制效應(yīng)是重組人血管他丁的25倍(圖22A)。sMDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞微管形成的這種抑制活性說明sMDA-7具有較高的抗血管形成活性。為了確定sMDA-7是否能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)存在的條件下進行遷移試驗。sMDA-7(10ng/ml)可阻斷血管形成誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，而在對照組中沒有觀察到抑制效應(yīng)(圖22C)。這種抑制作用是劑量依賴性的，濃度為50ng時達到最大抑制效應(yīng)。利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)作為誘導(dǎo)因子也可以觀察到相似的抑制活性。利用試驗來驗證sMDA-7對血管形成的抑制是否是通過IFN-γ和IP-10的產(chǎn)生來介導(dǎo)的。在不同時間點收集sMDA-7處理的HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測IFN-γ和IP-10的含量。IP-10而不是IFN-γ可被sMDA-7誘導(dǎo)。但是所產(chǎn)生的IP010量(15-32pg/ml)沒有顯著增加，不足以解釋sMDA-7所產(chǎn)生的顯著抑制效應(yīng)。實施例38SMDA-7活化內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)STAT-3的表達sMDA-7與內(nèi)皮細(xì)胞接觸后所激發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制用實施例1所描述的材料和方法進行研究。利用Western印跡來分析HUVEC細(xì)胞和HMVEC細(xì)胞內(nèi)STAT-3的活化(圖23A)。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入sMDA-7可使磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白表達顯著升高，最早在加入sMDA-74小時后就可以觀察到。pSTAT-3表達的增加是時間依賴性的，在處理后24小時達到最高值(圖23A)。經(jīng)sMDA-7處理后HUVEC細(xì)胞內(nèi)定位到細(xì)胞核內(nèi)的pSTAT-3蛋白增多，而未處理的細(xì)胞未出現(xiàn)這種變化也說明了sMDA-7對pSTAT-3的激活作用(圖23B)。實施例39MDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞分化成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)(微管形成)的抑制作用是由STAT-3的活化介導(dǎo)的，并且可通過阻斷IL-22R1部分恢復(fù)sMDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)是受體介導(dǎo)的。利用實施例19的材料和方法進行試驗以確定sMDA-7對內(nèi)皮細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)是否是由受體介導(dǎo)的，試驗方法是在sMDA-7存在或不存在的情況下加入抗白細(xì)胞介素22的受體1(IL-22R1)的封閉抗體(圖24)。與對照組相比，經(jīng)sMDA-7(5ng)處理的HUVEC細(xì)胞微管形成能力被完全抑制(圖24)。但是，用IL-22R1封閉抗體預(yù)處理HUVEC細(xì)胞可完全消除MDA-7對微管形成的抑制效應(yīng)(圖24)。IL-22R1抗體的這種消除作用是劑量依賴性的。加入1ng封閉抗體(1∶5的比例)只能部分恢復(fù)細(xì)胞的微管形成能力(＜60％，圖24)，而加入5ng封閉抗體(1∶1的比例)就可以完全恢復(fù)HNVEC細(xì)胞的微管形成能力(＞90％，圖24)。加入中和性抗體對HUVEC細(xì)胞的微管形成能力沒有顯著影響(圖24)。為了進一步確定IL-22R1抗體的特異性，利用抗IL-10受體(IL-10R)的中和性抗體進行下一步的試驗。在存在IL-10R中和性抗體的情況下，未處理的對照組與sMDA-7處理組一樣可以抑制HUVEC細(xì)胞形成的微管(圖24)。這些結(jié)果說明sMDA-7通過IL-22R1介導(dǎo)對內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抑制效應(yīng)。半定量分析試驗表明與對照組相比，sMDA-7可顯著抑制sMDA-7/IL-24和IL-22R1抗體處理細(xì)胞所形成的微管數(shù)量(p＝0.001)(圖24)。HUVEC細(xì)胞內(nèi)pSTAT-3蛋白表達的活化也可以證明sMDA-7的抑制效應(yīng)是由受體介導(dǎo)的。加入sMDA-7后HUVEC細(xì)胞內(nèi)的磷酸化形式的STAT-3(pSTAT-3)蛋白的表達明顯增高(圖24)。但是在存在IL-22R1抗體的情況下sMDA-7不能介導(dǎo)pSTAT-3表達的增高(圖24)。這些結(jié)果說明sMDA-7的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性是由IL-22R1介導(dǎo)的。實施例40包裹SMDA-7蛋白的基質(zhì)膠可抑制體內(nèi)的血管生成為了確定sMDA-7是否能在體內(nèi)抑制血管形成，按照實施例19所描述的方法進行基質(zhì)膠分析試驗。SMDA-7蛋白(10ng)包裹到含bFGF的基質(zhì)膠內(nèi)，然后植入小鼠的皮下。在植入后10天檢查基質(zhì)膠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，bFGF誘導(dǎo)的血管形成被sMDA-7所抑制(圖25A)。基質(zhì)膠內(nèi)血紅蛋白含量的測定結(jié)果表明與不含bFGF的、只含bFGF的以及含重組人內(nèi)皮抑制素的對照相比，sMDA-7可明顯抑制bFGF誘導(dǎo)的血管形成(p＝0.0001)(圖25B)。尤其令人吃驚的是，sMDA-7導(dǎo)致的血紅蛋白含量減少比無bFGF的對照組還要明顯。實施例40分泌MDA-7的293-MDA7細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)混合可抑制皮下的人肺癌異種移植物。通過實施例19描述的體內(nèi)混合試驗檢測sMDA-7抑制腫瘤生長的能力。A549腫瘤細(xì)胞與親本293細(xì)胞或293-mda-7細(xì)胞混合(1∶1的比例)后注射到小鼠右下腹部的皮下。在可觸摸到腫瘤時開始測量腫瘤的大小。與注射A549細(xì)胞和親本293細(xì)胞混合物的動物相比，注射A549細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞混合物的動物體內(nèi)的腫瘤生長明顯受到抑制(p＝0.001)(圖26A)。裸鼠體內(nèi)單獨注射293細(xì)胞或293-mda-7細(xì)胞不能形成腫瘤。移植后22天處死動物，取出腫瘤進行下一步的試驗。Western印跡分析表明MDA-7蛋白在含A549腫瘤細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞混合物的腫瘤內(nèi)的表達水平與含A549腫瘤細(xì)胞和293細(xì)胞混合物的腫瘤內(nèi)的表達水平一樣(圖26B)。腫瘤組織的組織病理學(xué)檢測表明對照組和試驗組動物的腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)或腫瘤細(xì)胞的浸潤沒有顯著區(qū)別(圖26C)。但是，通過CD31染色發(fā)現(xiàn)含293-mda-7細(xì)胞的腫瘤血管化水平比含293細(xì)胞的對照腫瘤明顯減少(圖26C)。腫瘤血管化的降低與腫瘤內(nèi)血紅蛋白含量的下降成正相關(guān)關(guān)系，接受A549腫瘤細(xì)胞和293-mda-7細(xì)胞混合物的動物與接受A549腫瘤細(xì)胞和親本293細(xì)胞混合物的動物相比所收獲的腫瘤內(nèi)血紅蛋白的含量減少(圖26D)。試驗組動物腫瘤組織的TUNEL染色顯示內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞周圍的腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡，如棕色區(qū)域所顯示(圖26C)。而對照組的腫瘤組織沒有出現(xiàn)TUNEL陽性染色。實施例41包裹分泌MDA-7的293細(xì)胞的基質(zhì)膠可抑制皮下人肺癌移植物的生長如實施例19所描述，在小鼠右下腹部皮下接種A549細(xì)胞。當(dāng)腫瘤長到50mm3時，將產(chǎn)生sMDA-7的293細(xì)胞(293-mda-7)或親本293細(xì)胞(對照)包裹到基質(zhì)膠中，然后皮下植入到離腫瘤較遠(yuǎn)的位置(右上腹部)，監(jiān)測腫瘤的生長情況。與對照組相比，分泌MDA-7的293細(xì)胞可顯著抑制A549肺癌異種移植物的生長(p＝0.001)(圖27A)。與對照組相比，植入包裹的分泌MDA-7蛋白的293細(xì)胞可使腫瘤的生長抑制到50％。為了確定抑制效應(yīng)來自于sMDA-7，取動物的血清樣品通過Western印跡和ELISA檢測血清內(nèi)的MDA-7蛋白。通過Western印跡分析發(fā)現(xiàn)植入分泌MDA-7的293細(xì)胞的動物血清在40Kd處出現(xiàn)sMDA-7的致密條帶(圖27A)。而對照組只出現(xiàn)很淺的條帶，這些條帶可能是與血清蛋白的交叉反應(yīng)造成。通過ELISA檢測到sMDA-7的血清水平約為50ng/ml。在試驗結(jié)束時，收獲腫瘤和含293-mda-7細(xì)胞的基質(zhì)膠，然后進行染色。利用抗MDA-7的單克隆抗體對來源于接受293-mda-7細(xì)胞的動物的基質(zhì)膠進行免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有MDA-7蛋白的表達，這些區(qū)域呈棕色(圖27B)。而來源于接受親本293細(xì)胞的動物的基質(zhì)膠中沒有檢測到MDA-7蛋白的表達(圖27B)。另外，通過CD31染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)293-mda-7處理的腫瘤與親本293細(xì)胞處理的腫瘤相比血管化程度降低(圖27B)。腫瘤組織的組織病理學(xué)檢測表明接受293細(xì)胞的動物與接受293-mda-7細(xì)胞的動物相比沒有明顯差異(圖27B)。********************本說明書和權(quán)利要求書中所描述的和所要求的所有組合物和方法按照本說明書的描述通過適當(dāng)?shù)脑囼灦伎梢灾苽浜蛯嵤?。雖然本發(fā)明的組合物和方法是以某些實施方案的形式來描述的，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的概念、精神和范圍內(nèi)，可對本發(fā)明的組合物和方法，或者本文所描述的方法的步驟以及步驟的順序作出調(diào)整。另外，某些化學(xué)和生理相關(guān)的試劑可替代本文所描述的試劑，也可以得到相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的這些相似的替代或調(diào)整都被認(rèn)為是包含在權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻下面的參考文獻為本文的描述提供了某種程度的可模仿的方法或者提供了一些其他的細(xì)節(jié)，本文已特地納入作為參考。美國專利4,367,110美國專利4,452,901美國專利4,554,101美國專利4,797,368美國專利5,028,592美國專利5,139,941美國專利5,221,605美國專利5,238,808美國專利5,310,687美國專利5,399,363美國專利5,466,468美國專利5,543,158美國專利5,552,293美國專利5,641,515美國專利5,739,169美國專利5,801,005美國專利5,824,311美國專利5,830,880美國專利5,846,225美國專利5,846,233美國專利5,846,945美國專利6,132,980美國專利6,177,074美國專利6,204,022美國專利6,207,145美國專利6,250,469美國專利6,326,466美國專利6,331,525美國專利6,350,589美國專利6,372,218美國專利6,379,701WO0026368WO0005356WO9828425WO9807408Allen，G.；Fantes，K.H.，Nature287408-411，1980。Aksentijevich等，HumGeneTher7(9)1111-22，1996。Albert等，1998。Angel等，Cell49(6)729-39，1987。Angel等，MolCellBiol7(6)2256-66，1987。Ariizumi，1995。Aringer等，LifeSci642173-86，1999。Ashkenazi等，Science2811305-8，1998。Atchison等，Cell46(2)253-62，1986。Atchinson和Perry，1986。Austin-Edward等，1998。Ausubel編，Currentprotocolsinmolecularbiology，NewYork，JohnWiley&Sons，1996。Baichwal，VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAvirusesTransientandstableexpressionoftransferredgenes.GeneTransfer.R.Kucherlapate.NewYork，PlenumPress117-148，1986。Baier等，NucleicAcidsRes.214830-4835，1993。Bakhshi等，Cell41(3)899-906，1985。Balachandran，S.，Kim，C.N.，Yeh，W-C.，Mak，T.W.，Bhalla，K.和Barber，G.N.ActivationofthedsRNA-dependentproteinkinase，PKR，inducesapoptosisthroughFADD-mediateddeathsignaling.EMBOJ.，176888-6902，1998。Banerji等，Cell27(2Pt1)299-308，1981。Banerji等，Cell33(3)729-40，1983。Barany和Merrifield，1979。Beretta等，1996.Berkhout等，JVirol63(12)5501-4，1989。BerrieCP，ExpertOpinInvestigDrugs10(6)1085-98，2001。Blanar等，EmboJ8(4)1139-44，1989。Blumberg等，Cell1049-19，2001。Bodine等，EmboJ6(10)2997-3004，1987。Boshart等，Cell41(2)521-30，1985。Bosze等，EmboJ5(7)1615-23，1986。Braddock等，Cell58(2)269-79，1989。Bukowski等，ClinCancerRes4(10)2337-47，1998。Bulla等，JVirol62(4)1437-41，1988。Caley等，JVirol71(4)3031-8，1997。Campbell等，MolCellBiol8(5)1993-2004，1988。Camper等，Biotechnology1681-7，1991。Campo等，Nature303(5912)77-80，1983。Caudel等，JImmunol，inpress2002。Caux，1994。Cavallaro等，CancerLett176(2)123-8，2002。Celander等，JVirol61(2)269-75，1987。Celander，D.，B.L.Hsu等，JVirol62(4)1314-22，1988。Chang等，MolCellBiol9(5)2153-62，1989。Chang，Hepatology14134A，1991。Chattergoon等，2000。Chatterjee等，ProcNatlAcadSciUSA86(23)9114-8，1989。Chen等，2001。Chol等，EurJBiochem239(3)579-87，1996。Christodoulides等，1998。Clark等，HumGeneTher6(10)1329-41，1995。Cleary等，Cell47(1)19-28，1986。Cleary等，ProcNatlAcadSciUSA82(21)7439-43，1985。Clake等，NucleicAcidsRes.19243-248(1991)。Coffin，Retroviridaeandtheirreplication.FieldsVirology.Fields.NewYork，RavenPress1437-1500，1990。Cohen等，JCellPhysiolSupplSuppl575-81，1987。Costa等，MolCellBiol8(1)81-90，1988。Couch，Am.Rev.Resp.Dis.88394-403，1963。Coupar等，Gene68(1)1-10，1988。Cripe等，EmboJ6(12)3745-53，1987。Cross等，Science2671353-6，1995。Cryns等，GenesDev121551-70，1998。Cuddihy，A.R.，Li，S.，Tam，N.W.N.，Wong，A.H-T.，Taya，Y.，Abraham，N.，Bell，J.C.和Koromilas，A.E.Double-stranded-RNA-activatedproteinkinasePKRenhancestranscriptionalactivationbytumorsuppre4ssorp53.Mol.Cell.Biol.，192475-2484，1999。Culotta等，MolCellBiol9(3)1376-80，1989。Dagon等，Oncogene208045-56，2001。D’Amico等，JBiolChem275(42)32649-57，2000。Dandolo等，JVirol47(1)55-64，1983。Davidson等，JImmunother21(5)389-98，1998。Davis等，JVirol70(6)3781-7，1996。Deb，A.，Haque，S.J.，Mogensen，T.R.，Silverman，R.H.和Williams，B.R.G.RNA-dependentproteinkinasePKRisrequiredoractivationofNF-κBbyIFN-γinaSTAT1-independentpathway.J.Immunol，1666170-6180，2001。Der，S.D.，Yang，Y.L.，Weissman，C.和Williams，B.R.AdsRNA-activatedproteinkinase-dependentpathwaymediatingstress-inducedapoptosis.Proc.Natl.Acad.Sci.，943279-3283，1997。Deschamps等，Science230(4730)1174-7，1985。Dumoutier等，JImmunol1673545-49，2001。Easwaran等，JBiolChem274(23)16641-5，1999。Edbrooke等，MolCellBiol9(5)1908-16，1989。Edery等，Cell56303-312，1989。Edlund等，Science230(4728)912-6，1985。Ekmekcioglu等，Intl.J.Cancer.94(1)，54-59，2001。Ellerhorst等，JClinOncol201069-74，2002。Enk，1992。el-Kareh等，CritRevBiomedEng25(6)503-71，1997。Erlandsson，CancerGenetCytogenet104(1)1-18，1998。Felgner等，ProcNatlAcadSciUSA84(21)7413-7，1987。Feng等，Nature334(6178)165-7，1988。FengG.等，IndentificationofDouble-StrandedRNA-BindingDomainsintheInterferon-InducedDouble-StandedRNA-Activatedp68Kinase，PNASUSA，vol.89，No.12，Jun.15，1992，pp5447-5451。Fickenscher等，TrendsImmunol2389-96，2002。Firak等，MolCellBiol6(11)3667-76。Flotte等，AmJRespirCe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110LeuGluPheTyrLeuLysThrValPheLysAsnTyrHisAsnArgThr115120125ValGluValArgThrLeuLysSerPheSerThrLeuAlaAsnAsnPhe130135140ValLeuIleValSerGlnLeuGlnProSerGlnGluAsnGluMetPhe145150155160SerIleArgAspSerAlaHisArgArgPheLeuLeuPheArgArgAla165170175PheLysGlnLeuAspValGluAlaAlaLeuThrLysAlaLeuGlyGlu180185190ValAspIleLeuLeuThrTrpMetGlnLysPheTyrLysLeu195200205<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成引物<400>3ttttttgtcgacatggcccagggccaagaattcc34<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成引物<400>4ttttttgcggccgcgagcttgtagaatttctgc3權(quán)利要求1.一種免疫原性組合物，該組合物含有(a)免疫原性分子或編碼免疫原性分子的核酸；以及(b)重組MDA-7多肽或表達MDA-7多肽的游離核酸。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物存在于藥用稀釋液中。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述免疫原性分子是抗原。4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述抗原是腫瘤抗原。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述腫瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。6.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述抗原是微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原。7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述免疫原性分子至少是一種多肽。8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述免疫原性分子是T細(xì)胞活化分子。9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述MDA-7多肽含有SEQIDNO2的49到206位氨基酸。10.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述MDA-7多肽含有SEQIDNO2的序列。11.如權(quán)利要求1所述的組合物，該組合物含有重組MDA-7多肽。12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述核酸分子是表達載體。13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述表達載體是病毒載體。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述病毒載體是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、甲病毒載體、彈狀病毒載體或皰疹病毒載體。15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述MDA-7多肽含有分泌信號。16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有膠體載體。17.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還含有細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的游離核酸。18.一種促進患者免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予患者有效量的MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸，其中，所述MDA-7多肽可促進患者的免疫應(yīng)答。19.如權(quán)利要求18所述的方法，該方法還包括給予患者免疫原性分子或編碼免疫原性分子的核酸。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答是抗免疫原性分子的免疫應(yīng)答。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫原性分子是抗原。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗原是腫瘤抗原。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述腫瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，i)免疫原性分子和ii)MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸是在化療、放療或手術(shù)前給予患者的。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述免疫原性分子和MDA-7多肽是在化療、放療或手術(shù)過程中給予患者的。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述免疫原性分子和MDA-7多肽是在化療、放療或手術(shù)后給予患者的。27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗原是微生物抗原、病毒抗原或真菌抗原。28.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫原性分子至少含有一種多肽。29.如權(quán)利要求18所述的方法，該方法還包括確定需要促進免疫應(yīng)答的患者。30.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述MDA-7是通過給予含編碼MDA-7多肽的游離核酸的載體而提供給患者的。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述載體是表達載體。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述表達載體是病毒載體。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述病毒載體是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、甲病毒載體、彈狀病毒載體或皰疹病毒載體。34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述載體還含有編碼免疫原性分子的核酸序列。35.如權(quán)利要求18所述的方法，所述方法還包括檢測免疫應(yīng)答。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括提高T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的活性。37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括提高患者體內(nèi)細(xì)胞因子濃度或誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞因子是干擾素或白細(xì)胞介素。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述干擾素是IFN-α、IFN-β或IFN-γ。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述白細(xì)胞介素是IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10或IL-12。41.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述MDA-7多肽含有SEQIDNO2的49到206位氨基酸。42.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述MDA-7多肽含有SEQIDNO2的序列。43.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述MDA-7多肽還含有分泌信號。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述分泌信號還被定義為與一個疏水核相連的帶正電荷的N末端區(qū)域。45.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述MDA-7多肽通過持續(xù)灌注或靜脈注射全身性給予患者。46.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述MDA-7多肽被直接注射到免疫應(yīng)答減弱的部位。47.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述免疫原性分子是結(jié)核桿菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性調(diào)節(jié)素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外殼-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨針抗原、風(fēng)疹抗原、流行性腮腺炎抗原、α甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETSG250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2或WT1。48.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述編碼免疫原性分子的核酸序列還包括表達載體。49.一種治療腫瘤患者的方法，所述方法包括給予患者腫瘤抗原；以及有效量的MDA-7多肽，其中，所述MDA-7多肽為患者提供治療效果。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述腫瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。51.一種治療腫瘤患者的方法，所述方法包括(a)給予患者免疫原性分子以誘導(dǎo)抗該免疫原性分子的免疫應(yīng)答；以及(b)給予患者有效量的MDA-7多肽，其中，與單獨使用免疫原性分子治療相比，所述MDA-7多肽可增強所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答并可抑制腫瘤生長。52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述免疫原性分子是腫瘤抗原。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述腫瘤抗原是PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-abl、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE或PMSA。54.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述抑制是腫瘤大小的下降或腫瘤生長速度的降低。55.一種治療性組合物，所述組合物含有重組MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的游離核酸以及至少一種細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的游離核酸。56.如權(quán)利要求55所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞因子被進一步限定為干擾素α、β或γ。57.如權(quán)利要求56所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞因子被進一步限定為干擾素γ。58.如權(quán)利要求55所述的組合物，其特征在于，所述MDA-7多肽的氨基酸序列是SEQIDNO2的序列。59.如權(quán)利要求55所述的組合物，其特征在于，所述MDA-7多肽的氨基酸序列由SEQIDNO2的49到206位氨基酸組成。60.如權(quán)利要求55所述的組合物，其特征在于，所述編碼MDA-7多肽的核酸的核苷酸序列是SEQIDNO1的核苷酸序列。61.一種增強抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括(a)給予患者一種含有免疫原氨基酸序列的多肽；以及(b)給予患者有效量的第一組合物和第二組合物，其中，所述第一組合物含有MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸，第二組合物含有干擾素或編碼干擾素的核酸。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述干擾素是干擾素α、β或γ。63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述干擾素是干擾素γ。64.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述第一和第二組合物包含在同一個藥物制劑中。65.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述第一和第二組合物包含在不同的藥物制劑中。66.一種在患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生抗血管形成作用的方法，所述方法包括給予患者體內(nèi)的IL-22受體陽性細(xì)胞有效量的MDA-7多肽，該多肽可與IL-22受體結(jié)合并誘導(dǎo)腫瘤的抗血管形成作用。67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述IL-22受體陽性細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)皮細(xì)胞不是臨近腫瘤的。69.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述MDA-7多肽是分泌型MDA-7多肽，并且是糖基化的。70.一種誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡的方法，所述方法包括獲得MDA-7靶向性構(gòu)建體，其中，所述MDA-7靶向性構(gòu)建體包含一個編碼MDA-7多肽的核酸和一個啟動子控制下的靶向性序列，并使細(xì)胞與一定量的MDA-7靶向性構(gòu)建體接觸以使MDA-7靶向性構(gòu)建體進入細(xì)胞內(nèi)，其中，細(xì)胞的死亡被誘導(dǎo)。71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述靶向性構(gòu)建體包含編碼MDA-7的DNA，其中，所述DNA不編碼功能性MDA-7信號序列。72.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述靶向性構(gòu)建體包含編碼MDA-7的DNA和核定位信號肽。73.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述靶向性構(gòu)建體包含編碼MDA-7的DNA和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽。74.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述靶向性構(gòu)建體包含編碼MDA-7的DNA和線粒體信號肽。75.一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡的方法，所述方法包括給予細(xì)胞i)MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸以及ii)NF-κB、COX-2、Hsp90或蛋白激酶的抑制劑。76.一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括給予細(xì)胞i)MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸以及ii)抗炎劑。全文摘要本發(fā)明涉及通過間接活化PKR來增強或誘導(dǎo)抗免疫原性分子的免疫應(yīng)答的組合物和方法。更具體地說，通過共注射MDA－7多肽和免疫原性分子來提高免疫治療的效果，其中的免疫原性分子是為了獲得抗該分子的免疫應(yīng)答。這種免疫治療包括腫瘤疫苗及其組合物。文檔編號A61K48/00GK1819841SQ03809886公開日2006年8月16日申請日期2003年3月3日優(yōu)先權(quán)日2002年3月5日發(fā)明者S·查達,A·帕塔爾,R·拉梅西,A·馬西爾卡,J·羅斯,S·斯維舍爾申請人:得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會,印屈根治療學(xué)股份有限公司